مقالة منهجية

قياس كمية الكالوز في أنسجة النباتات بواسطة اختبار التغذية المناعية المرتبطة بالإنزيمات/ القياس الطيفي بالفلورية المناعية

DOI:

10.3791/65833

⸱

مايو 22, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم هذا البروتوكول بقياس الكالوز في أنسجة النبات باستخدام الطريقة الخاصة بالكالوز، وهي القياس الطيفي الفلوري المناعي (ELISA)، والتي تعتمد على ارتباط الكالوز في عينات النبات بالأجسام المضادة الخاصة بالكالوز الخاص بالكالوز تليها قياس كمية الكالوز المرتبط عبر الأجسام المضادة الموسومة بالإنزيمات عن طريق قياس النشاط الإنزيمي الناتج.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشمل الطرق الحالية لقياس الكالوز من أنسجة النبات المجهر فوق التألق، والقياس الطيفي الفلوري، والمجهر المناعي الفلوري، والتقييم غير المباشر لكل من أنشطة إنزيم الكالوز سينثاز و β-(1,3)-جلوكاناز. ومع ذلك، فإن بعض هذه الطرق لها قيود كبيرة، منها كونها تستغرق وقتا طويلا، وغير محددة بالنسبة للخشن، وتتطلب جهدا كبيرا، وذاتية، وتوهج ذاتي عالي، وحساسية منخفضة، وكونها أكثر نوعية بدلا من كمي، وتتطلب اكتساب موارد برمجية ومهارات تقنية. لذلك، هناك حاجة ملحة لاستكشاف طرق بديلة لقياس كمية الكالوز في أنسجة النبات. كان يفترض أن مطيافية الفلورية المناعية أو اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA) الذي يستخدم الأجسام المضادة الخاصة بالجلد الصلب يمكن أن يتغلب على بعض قيود طرق قياس الكالوز الحالية. تم إعطاء الإجهاد البيوتي عن طريق تلقيح نباتات الموز المشتقة من زراعة الأنسجة ب Xanthomonas vasicola pv. بكتيريا الموسياروم (Xvm) التي تحفز إنتاج الكالوز. تم جمع عينات من أنسجة الكورم الموز بعد 14 يوما من التطعيم (DPI) لقياس كمية الكالوز باستخدام طريقة القياس الطيفي الفلورية المناعية الجديدة. تفاوت إنتاج الكالوز في الشوط في مجموعات المطعمة ب Xvm والمجموعات الضابطة بشكل كبير في كل من الأنماط الجينية للموز (اختبار t العينة المستقل، p < 0.05). يمكن تطبيق طريقة مطيافية الفوتوفوتومترية المناعية الموصوفة هنا لقياس كمية الكالوز في أنسجة نباتية مختلفة ذات تخصص عالي للمسامير الصلبة، وحساسيتها، وموثوقيتها، وقابلية التكرار. بالإضافة إلى ذلك، يجعل استخدام صفيحة بسعة 96 بئر هذه الطريقة مناسبة لدراسات قياس كمية الكالوز عالية الإنتاجية مع انحيازات عينة وتحليلية قليلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكالوز هو عديد السكريات يحتوي على β-1,3-جلوكان، وهو مركب طبيعي يوجد في جدران خلايا مجموعة متنوعة من النباتات العليا. يتم تصنيع الكالوز بواسطة سينثازات الكالوز (CalS) ويتحلل بواسطة β-(1,3)-جلوكاناز 1,2,3. يشارك في عدة عمليات بيولوجية، بما في ذلك النمو والتطور والاستجابة للإجهادات اللاأحيائيةوالحيوية 4,5,6. أثناء العدوى بالممرض، يساعد زيادة ترسيب الكالوز في الحليمات على منع المزيد من الاستعمار الميكروبي، حيث يعمل كحاجز نفاذية بين الخلايا النباتية المجاورة 2,4,7,8,9,10,11,12 . من خلال إبطاء غزو الممرضات في الأنسجة المصابة، يسمح ترسيب الكالوز بوقت لتحفيز استجابات دفاعية إضافية13. يعد القياس الدقيق للكالوز في أنسجة النبات في الوقت المكاني والزماني ضروريا لفهم دوره في العمليات الفسيولوجية المختلفة. ومع ذلك، فإن الطرق الحالية لقياس الكالوز من أنسجة النبات، والتي تشمل المجهر الفلوري، والمجهر المناعي الفلوري، والتحليل الطيفي بالفلورة، تحمل محدوديات كبيرة وتحديات في التكميم. لذلك، هناك حاجة ملحة لاستكشاف طرق بديلة لقياس الكالوز لتجاوز هذه العيوب. تم افتراض أن مطيافية الفلورية المناعية أو اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA) يمكن أن يوفر طريقة أكثر كفاءة لقياس الكالوز في عينات النباتات، والتي تشمل خصوصية عالية، وحساسية، وموثوقية، وقابلية للتكرار، وتوفر طريقة عالية الإنتاجية.

تتضمن الطريقة القياسية الذهبية لقياس الكالوز تصوير جزيئات الكالوز المصبوغة بالأنيلين الأزرق باستخدام مجهر التألق 14,15,16,17. يظهر الكالوز المصبوغ بالأنيلين باللون الأزرق عند تعرضه لإثارة الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية كجزيئات فلورية صفراء، يمكن عدها يدويا لعدد جسيمات الكالوز المتوهجة14,15 أو عدها بواسطة برنامج عد الكالوز الآلي. العد اليدوي لجزيئات الكالوز مرهق ويستغرق وقتا طويلا وذاتيا للباحث، بينما يتطلب العد الآلي اكتساب موارد برمجية ومهارات تقنية كبيرة. بعض البرامج المستخدمة في العد الآلي للكالوز تشمل ImageJ 19,20,21,22، فوتوشوب 23، CalloseMeasurer24، Icy18,25 وIlastik26. يمكن أيضا قياس الكالوز المصبوغ بالأنيلين باستخدام القياس الطيفي الفلوري 17,19,27,28,29. ومع ذلك، فإن ارتفاع الخلفية والتوهج الذاتي المرتبط بمجهر التألق الفوق الفلوري ومطيافية الفلورية يجعل هذه الطرق صعبة وغير موثوقة بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء26. علاوة على ذلك، يمكن للأنيلين الأزرق أن يصبغ أنواع أخرى من β-1,3-جلوكان إلى جانب الكالوز30، مما يجعل كلا من طرق المجهر الفلورية ومطيافية الفلورية للكشف عن الكالوز وقياسها غير محددة وغير موثوقة. تم أيضا استخدام طريقة المجهر المناعي الفلوري لقياس الكالوز، والتي تعتمد على الأجسام المضادة الخاصة بالكالوز، في عدة دراسات 31,32,33. على الرغم من أن هذه الطريقة تشترك في بعض العيوب مع المجهر فوق الفلوري للمسمار الأنيلين المصبوغ بالأزرق، إلا أنها تتميز بكونها خاصة بالتالف بسبب الأجسام المضادة المستخدمة هنا. كما تم إجراء قياس كمية الكالوز باستخدام طرق قائمة على نشاط الإنزيمات. تشمل الطرق القائمة على نشاط الإنزيمات لقياس كمية الكالوز تقييم أنشطة الكالوز سينثاز (CalS)20,33 وأنشطة β-(1,3)-جلوكاناز34,35. للطرق المعتمدة على نشاط الإنزيمات عدة عيوب مقارنة بالمجهر الفلوري، والمجهر المناعي الفلوري، ومطيافية الفلورية. تشمل هذه التقديرات غير المباشرة للكالوز، وصعوبة استخراج الإنزيمات واختبارات نشاط الإنزيمات، وعدم توزيع الكالوز بشكل متساو في أنسجة النبات.

نظرا لعيوب الطرق الحالية لقياس الكالوز التي تشمل المجهر الفلوري، والمجهر المناعي الفلوري، والتحليل الطيفي الفلوري، واختبار CalS و β-(1,3)-جلوكاناز، كان هناك حاجة لابتكار طريقة جديدة لقياس الكالوز تقدم عددا من المزايا التي تشمل: 1) الخصوصية العالية، والحساسية، والموثوقية، وقابلية التكرار، و2) القياس الأسهل للكالوز مع القدرة على الإنتاجية العالية. لم يتم استكشاف استخدام القياس الطيفي الفلوري المناعي لقياس الكالوز. هنا، تم الإبلاغ عن طريقة جديدة لقياس الكالوز تعتمد على القياس الطيفي بالفلورة المناعية، وتحديدا اختبار التغذية المناعية المرتبط بالإنزيم (ELISA). يمكن تحسين الطريقة لقياس كمية الكالوز في نباتات مختلفة أو أنسجتها بدرجة جيدة من الخصوصية في الكالوز، والدقة، وقابلية التكرار، والقدرة على التجربة عالية الإنتاجية. يمكن أيضا تعديل هذه الطريقة لقياس أي محلل نباتي إذا كان الجسم المضاد ضد ذلك المحلل متوفرا. لضمان توزيع دقيق وفعال وموثوق للكالوز في أنسجة النباتات، يوصى باستخدام طرق مختلفة لقياس الكالوز في نفس الوقت تشمل المجهر، والقياس الطيفي، وطرق النشاط الإنزيمي. وبالتالي، سيسمح ذلك بدقة وكفاءة بفهم دور الكالوز في مختلف الاستجابات الفسيولوجية والإجهادية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تلقيح النباتات التجريبية

  1. عزل وتحضير وتأكيد لقاح Xvm باستخدام الإجراءات القياسية36,37. اختر عشوائيا 10 نباتات مشتقة من زراعة الأنسجة وموسى بالبيسيانا ومبوازيروم وقم بتلقيح الجانب الظهري لأصغر عروق أوراق مفتوحة بالكامل ب 200 ميكرولتر (1 ×10 8 خلايا) من لقاح Xvm المؤكد من قبل PCR (الشكل 1)38.
  2. وبالمثل، اختر عشوائيا 10 نباتات موز Musa balbisiana وMbwazirume وتلقيحها ب 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم (SDW).
  3. حافظ على نباتات الموز المحصنة ب Xvm وتحكم في ظروف مشابهة في غرفة المراقبة مع فترة ضوء 12 ساعة ضوء / 12 ساعة مظلمة عند 25 درجة مئوية، مع ريها كل 3 أيام.
    ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول 1 لقائمة المواد والمعدات ووصفة المخازن على التوالي.

2. أخذ عينات من أنسجة الكورم وتحضير العينة

  1. إجراء عينات مدمرة للحصول على عينات كورم من المصانع التجريبية (الشكل 1).
  2. قم باستئصال حوالي 2 جرام من عينات الكورم بسرعة باستخدام شفرات جراحية معقمة بعد 14 يوما من التطعيم (DPI) ووضعها بشكل فردي في أنابيب 50 مل معنونة بحجم 50 مل. قم بذلك لجميع العينات العشر التي تم جمعها من النباتات الملقحة ب Xvm والنباتات الضابطة.
  3. اغمر فورا أنابيب 50 مل التي تحتوي على العينات في النيتروجين السائل.
  4. نقل العينات إلى المختبر وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة للانطلاق. تخزين العينات عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة أو أكثر مع دورات تجمد ذوبان قليلة.
  5. تجفيف العينات بالتجميد لمدة 72 ساعة باستخدام مجفف بالتجميد (الشكل 1).
  6. ضع بالضبط 30 ملغ من العينات المجففة بالتجميد في أنابيب سعة 2 مل تحتوي على خرزتين فولاذيتين من الدراجة وطحنها إلى مسحوق ناعم، مع ضبط السرعة على 5 لمدة دقيقة واحدة (الشكل 1).
  7. تخزين العينات المطحونة في بيئة باردة وجافة في درجة حرارة الغرفة، محكمة الإغلاق حتى تكون جاهزة للمضي قدما. تخزين العينات المطحونة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 أشهر أو عند −80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة مع دورات تجمد ذوبان قليلة39,40.

3. استخراج الكالوز وتحضير معايير اللامينارين والفراغ

  1. لاستخراج الكالوز من 30 ملغ من عينة الكورم المطحونة، أضف 800 ميكرولتر من 1 M NaOH وحضن لمدة 30 دقيقة عند 80 درجة مئوية في حمام مائي، مع دوامات متقطعة بعد كل 10 دقائق27.41 (الشكل 1، الخطوة 6).
  2. اترك العينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق) ثم استخدم الطرد المركزي عند 15,294 x g لمدة 5 دقائق.
  3. انقل المادة الفائقة (مستخلص الكالوز) إلى أنبوب معقم بسعة 2 مل وتخفيفه باستخدام المخزن الحاجب (الجدول 1) بنسبة 1:2.
    ملاحظة: اختر عامل التخفيف بناء على التجارب الأولية والتحسين. قد يكون تخفيف مستخلص الكالوز ضروريا أو لا. عند الحاجة، يجب إجراء التخفيف في مخزن الحجب وتحسين نسبة التخفيف لأنواع العينات المختلفة لتقع ضمن نطاق المنحنى القياسي.
  4. خزن مستخلصات الكالوز عند -20 درجة مئوية حتى تكون جاهزا للتقدم. خزن مستخلص الكالوز لمدة تصل إلى 6 أشهر مع دورات تجميد وإذابة قليلة.
  5. جهز مخزونا مركزا من معيار اللامينارين بمقدار 100 ملغ/مل في 1 مليون NaOH 6,42,43,44,45.
    ملاحظة: اللامينارين هو بوليمر 1-3-β-غلوكان ويمكن استخدامه كمعيار لنظائر الكالوز في التحليل الطيفي المناعي الفلوري.
  6. حضن تعليق المعيار الناتج عند درجة حرارة 80 درجة مئوية في حمام ماء، مع هزه بلطف على فترات حتى يذوب كل اللامينارين بالكامل (حوالي 20-40 دقيقة).
  7. برد المعيار المذاب إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 10 دقائق).
  8. تحضير معايير اللامينارين بتركيزات 80 ملغ/مل، 60 ملغ/مل، 40 ملغ/مل، 20 ملغ/مل، 10 ملغ/مل، 1 ملغ/مل، 0.5 ملغ/مل، 0.1 ملغ/مل، و0.01 ملغ/مل باستخدام عازل الحجب، بدءا من المخزون المركز 100 ملغ/مل.
  9. جهز الفراغات عن طريق خلط 1 M NaOH مع المخزن الحاجب بنسبة 1:2. إذا كان هناك حاجة للتخفيف، استخدم نفس نسبة التخفيف المستخدمة لتحضير مستخلص الكالوز.
  10. تخزين معايير اللامينارين والقطع الفارغة عند −20 درجة مئوية. تخزين المعايير والفارغات لمدة تصل إلى 6 أشهر مع دورات تجميد ذوبان قليلة جدا.

4. قياس الكالوز بواسطة القياس الطيفي المناعي الفلوري

  1. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (1-3-β-IgG الفأر الموجه بالجلوكان) المحضر باستخدام مخزن الطلاء (الجدول 1) إلى كل من 96 بئر في ألواح ELISA البوليسترين (الشكل 2).
  2. أغلق الطبق بإحكام بطبقة بارافين واحتضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة.
  3. في اليوم التالي، ضع الطبق على المقعد ودعه يصل إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 10 دقائق).
  4. اغسل الطبق باستخدام إجراءات الغسل والتنظيف القياسية46. باختصار، أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل (الجدول 1) إلى الآبار، ثم قم بدورانها بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام هزاز رقمي وصبغ على ورق المناديل. كرر عملية الغسل مرتين (الشكل 2). تأكد من أن الآبار لا تجف تماما واستخدم رأس ميكروبايبت معقم لإزالة أي فقاعات في الآبار دون لمس قاعدة وجدران الآبار.
  5. أضف 200 ميكرولتر من حاجز العزل إلى كل بئر (الشكل 2) وأغلق اللوح بإحكام بفيلم البارافين. حضنها لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. اغسل الطبق كما ذكر أعلاه (الشكل 2).
  6. أضف 100 ميكرولتر من مستخلص الكالوز من 10 محطات متلقحونة ب Xvm و10 محطات تحكم إلى الآبار المخصصة. أضف 100 ميكرولتر من معايير اللامينارين إلى آبار أخرى. أضف 100 ميكرولتر من الفراغ إلى آبار أخرى (الشكل 2).
  7. أغلق الطبق بإحكام بطبقة من البارافين وحضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة. اغسل الطبق مرة أخرى كما ذكر أعلاه (الشكل 2).
  8. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (1-3-β موجه للفأر IgG) المحضر باستخدام المخزن الحاجب إلى كل بئر (الشكل 2).
  9. أغلق اللوح بإحكام بطبقة بارافين واحتضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية، ثم اغسل اللوح كما هو موضح أعلاه (الشكل 2).
  10. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي لمضاد الفئران IgG-الفوسفاتاز القلوي إلى كل بئر46,47 (الشكل 2).
  11. أغلق الطبق بإحكام بفيلم البرافين وحضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة. ثم اغسل الطبق كما هو موضح أعلاه (الشكل 2).
  12. أضف 100 ميكرولتر من محلول فوسفات بارا-نيتروفينيل (pNPP) الطازج بتركيز 1 ملغ/مل (الجدول 1) إلى الآبار (الشكل 2)
  13. حضن الطبق على المقعد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقةو48 دقيقة.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة حسب عينات النبات والمعيار المستخدم. في هذه الدراسة، كان للامينارين أفضل قراءة بعد 30 دقيقة.
  14. أنهي التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من محلول التوقف الجاهز حديثا (0.5 مليون مليون نيوم أوهو) إلى كل من البئر48 (الشكل 2).
  15. انقل اللوح إلى قارئ الميكرولوح (متوازن إلى 37 درجة مئوية)، ثم هزه بسرعة متوسطة لمدة دقيقة واحدة، واقرأ الامتصاص عند 405 نانومتر48 (الشكل 1، الشكل 2).

5. تحليل البيانات

  1. قم بإجراء انحدار خطي بسيط لامتصاص اللامينارين عند 405 نانومتر مقابل تركيز اللامينارين (ميكروغرام/مل) للحصول على المنحنى القياسي. معادلة المنحنى القياسي هي
    Y = β1X + β0
    حيث Y يمثل امتصاص اللامينارين عند 405 نانومتر، β1 هو ميل خط الانحدار (معامل ارتباط بيرسون)، X هو لوغاريتيم10 (تركيز اللامينارين بميكروغرام/مل) و β0 هو تقاطع y.
  2. احسب تركيزات الكالوز في عينات الكورم عن طريق طرح امتصاص الفراغ من امتصاص العينات. ثم استخدم المنحنى القياسي لتقدير تركيز الكالوز بوحدة ميكروغرام/ملليتر كمكافئ لللامينارين (LE).
  3. افحص جميع البيانات للتأكد من طبيعية التوزيع باستخدام اختبار شابيرو-ويلك وتحقق من تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين (α > 0.05).
  4. استخدم اختبار t العينة المستقل لمقارنة إنتاج الكالوز بين المجموعتين الملقحتين ب Xvm والمجموعات الضابطة (p≤ 0.05).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحليل تركيزات معايير اللامينارين المعروفة من خلال القياس الطيفي الضوئي وتم تسجيل قيم الامتصاص المقابلة لها. باستخدام هذه البيانات، تم إنشاء مخطط بير-لامبرت عن طريق رسم تركيزات معايير اللامينارين على المحور x والامتصاص على المحور y. كانت معادلة خط الانحدار y = 0.5079x − 0.04534 (الشكل 3)49. أعطى مخطط بير-لامبرت معامل ارتباط عالي (r) بقيمة 0.9988 ومعامل تحديد (r2) مقداره 0.9975، مما يشير إلى وجود علاقة خطية قوية بين التركيز والامتصاص، وحتى 0.9975 من التباين في المتغير التابع (الامتصاص) تم تفسيره بواسطة المتغير المستقل (التركيز؛ الشكل 3؛ ص<0.0001). لذلك، كان هذا النموذج مناسبا ودقيقا وموثوقا للتنبؤ بتركيز اللامينارين والكالوز. تم تحديد تركيز الكالوز في عينات كورم الموز عن طريق قياس امتصاص عينات الكورم عبر القياس الطيفي الضوئي واستخدام قيم الامتصاص لحساب تركيزات الكالوز باستخدام المعادلة.

أظهر اختبار التحليل الطيفي بالفلورية المناعية زيادة ملحوظة في كمية الكالوز المستحث في النباتات الملقحة ب Xvm مقارنة بالمجموعة الضابطة في كل من الأنماط الجينية للموز (اختبار t العينة المستقل، p < 0.05؛ الشكل 4). كان إنتاج الكالوز في مصانع التحكم عند 14 نقطة في البوصة 1474.34 ملغ/مل و1037.11 ملغ/مل لمبوازيروم وم. بالبيسيانا على التوالي (الشكل 4). أدى تطعيم النباتات ب Xvm إلى 4190.78 ملغ/مل و1996.07 ملغ/مل من الكالوز في أقواس نباتات مبوازيروم وم. بالبيسيانا المتلقيح ب Xvm عند 14 نقطة في البوصة (الشكل 4). تسبب تطعيم Xvm في زيادة إنتاج الكالوز بمقدار 1.9 إلى 2.8 ضعف مقارنة بمحطات التحكم (اختبار t العينة المستقل، p < 0.001؛ الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: توضيح تخطيطي للخطوات الرئيسية المتضمنة في قياس الكالوز باستخدام طريقة التحليل الطيفي الفوتوفوتومتري المناعي الجديد. يوضح هذا الشكل الخطوات الرئيسية المتضمنة في قياس الكالوز من أنسجة الموز والتي تشمل رفع النباتات المستخرجة من ثقافة الأنسجة، التلقيح ب Xvm، أخذ عينات مدمرة لأنسجة الكورم، تجفيف العينات بالتجميد، استخراج الكالوز وقياس كمية الكالوز باستخدام طريقة التحليل الطيفي الفلوري المناعي الجديد. وقد أعيد طباعة هذا الرقمبمقدار 50. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: توضيح تخطيطي مفصل لطريقة مطيافية الفلورية المناعية لقياس الكالوز. يقدم هذا الشكل عرضا مفصلا لطريقة التحليل الطيفي المناعي الفلوري لقياس الكالوز، موضحا كيف يتم تحميل لوحة ELISA بالمكونات المختلفة وكيف يتم قياس الكالوز أخيرا بواسطة القياس الطيفي الضوئي. وقد أعيد طباعة هذا الرقمبمقدار 50. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: قياس البروتين. يعتمد مخطط بير-لامبرت على معايير اللامينارين للتركيزات المعروفة وقراءات الامتصاص (عند 405 نانومتر) المستخدمة لحساب تركيزات الكالوز (كمكافئات للامينارين، LE) من قراءات امتصاص عينات الكورم. وقد أعيد طباعة هذا الرقم49. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: مقارنة تركيز الكالوز. مقارنة متوسط تركيزات الكالوز (المتوسط ± SEM، n = 9) في أقلام نباتات الموز M. balbisiana وMbwazirume التي تم تلقيحها ب Xvm كما تم تحديدها بواسطة طريقة القياس الطيفي المناعي الفلوري الجديدة (اختبار t العينة المستقلة، α ≤ 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المخزن المؤقتالتكوينالتخزين
مخزن الحجب10 جرام من ألبومين مصل البقر (BSA؛ 1٪ بدون ضبط)، مذاب في 1 لتر من PBS.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر
مخزن الطلاء1.59 جرام من كربونات الصوديوم (Na2CO3)، 2.93 جرام من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3)، 0.2 جرام من أزيد الصوديوم (NaN3)، تذوب في 1 لتر من H2O،pH 9.6.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا
المخزن المزدوج2 جرام من PVP (2٪ w/v)، مذابة في 1 لتر من حاجز الحاجز.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر
محلول البارا-نيتروفينيل فوسفات (pNPP)إذابة بارا-نيتروفينيل فوسفات (pNPP) في مخزن الركيزة إلى تركيز عمل 1 ملغ/مل-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)8.0 جرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 0.2 جرام من فوسفات البوتاسيوم أحادي الأساس (KH2PO4)، 1.15 جرام من فوسفات الصوديوم ثنائي الأساس (Na2HPO4)، 0.2 جرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl)، 0.2 جرام من أزيد الصوديوم (NaN3)، مذاب في 1 لتر منH2O، بدرجة حموضة 7.4.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا
الأجسام المضادة الأساسية في الحاجزأعد تكوين الجسم المضاد الأساسي المحمول لليوفيليا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على المخزون المركز. قم بتخفيف مخزون الأجسام المضادة الأولية المعاد تشكيله في حاجز العزل إلى تركيز عمل 2 ميكروغرام/مل.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر
الجسم المضاد الأساسي في مخزن الطلاءأعد تكوين الجسم المضاد الأساسي المحمول لليوفيليا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للحصول على المخزون المركز. يتم تخفيف مخزون الأجسام المضادة الأولية المعاد تشكيله في مخزن الطلاء إلى تركيز عمل 2 ميكروغرام/مل.-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر
الأجسام المضادة الثانويةتركيز الأجسام المضادة الثانوية 1:1000: المخزن المزدوج-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر
مخزن الركيزة97 مل من ثنائي الإيثانولامين، 0.2 جرام من أزيد الصوديوم (NaN3)، تذوب في 1 لتر من H2O منزوع الأيون، بدرجة حموضة 9.8-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا
مخزن الغسيل0.5 مل من Tween 20 (0.05٪ v/v)، مذاب في 1 لتر من PBS، pH 7.5-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا

الجدول 1: وصفة للمخازن.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق طريقة مطيافية الفوتوفوتومترية المناعية لأول مرة في قياس الكالوز في أقلام الموز. يعتمد على اختبار إنزيم المناعة (EIA)، المستخدم لقياس الكالوز في مستخلص الموز الخام بسعة 1 مليون NaOH باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالثروة 47,51,52. باختصار، تضمن هذا الاختبار الجديد القائم على الفلورية المناعية المعتمدة على القياس التفصيلي التفصيلي الخاص بالثروة تغطية الصفيحة بجسم مضاد خاص بالزعنف، والذي يرتبط بعد ذلك بالكالوز في مستخلص النبات، يليه جسم مضاد ثانوي خاص أيضا بالكالوز. ثم يضاف اكتشاف جسم مضاد مرتبط بإنزيم (الفوسفاتاز القلوي) ويشكل مركبا مع الجسم المضاد الثانوي. ثم يضاف ركيزة، وهي بارا-نيتروفينيل فوسفات (pNPP). يعتمد قياس كمية الكالوز في العينة على قدرة الفوسفاتاز القلوي على شق مجموعات الفوسفات من جزيئات pNPP، مما يؤدي إلى تكوين مركب أصفر اللون (p-نيتروفينول). تم اكتشاف شدة اللون الأصفر باستخدام مقياس طياف ضوئي عند 405 نانومتر، ثم تم ربط الامتصاص بنشاط الفوسفاتاز القلوي الذي كان متناسبا طرديا مع تركيز الكالوز الموجود في العينة. تم إيقاف التفاعل بزيادة الرقم الهيدروجيني بإضافة 0.5 M NaOH، مما منع المزيد من نشاط الفوسفاتاز القلوية.

على النقيض من ذلك، فإن الطريقة القياسية للذهب لتحديد وقياس الكالوز هي طريقة المجهر الفلوري، وهي طريقة معروفة تعتمد على تلوين الكالوز بفلوروكروم أزرق أنيلين53. باختصار، تعتمد هذه الطريقة على ارتباط خاص لصبغة الأنيلين الزرقاء مع بيتا-1,3-غلوكان (الكالوز) لتشكيل مركب. ثم يتم إثارة اللون الأزرق الأنيليني في هذا المجمع باستخدام الضوء فوق البنفسجي (طول موجي بين 365-375 نانومتر). عندما يتم تحفيز صبغة الأنيلين الزرقاء، تصدر فلورة زرقاء تلتقط للسماح برؤية محددة للكالوز في أنسجة النبات53. تتبع كمية الكالوز المصبوغ بالأنيلين باللون الأزرق سلسلة من تقنيات التصوير التي تقيس كمية الفلورة القادمة من أنسجة النبات. الفلورة تتناسب مع كمية الكالوز المتوفرة في أنسجة النبات. تم استخدام المجهر الفلوري في تصوير وقياس الكالوز في الإجهاد الحيوي54.

في دراسة منفصلة، تم تحديد ترسيب الكالوز باستخدام كل من المجهر فوق التألقي ومطيافية الفوتوفوتومترية المناعية49. بينما لوحظت بعض الفروقات في البيانات، أظهر التحليل الإحصائي إلى حد كبير توافقا بين المجهر الفلوري وبيانات القياس الطيفي الفلوري المناعي، مما يشير إلى الاتساق في طريقتي كشف الكالوز49. بينما كانت نتائج الطريقتين متطابقة إلى حد كبير، من المستحسن أن يكمل كل من المجهر فوق التألق والتحليل الطيفي الفلوري المناعي لتقييم أكثر موثوقية. على الرغم من أن الطريقة المبنية على ELISA محددة للكثرة الثقبية، وحساسة، وموثوقة، إلا أنها تستغرق في البداية وقتا طويلا أثناء تحسين البروتوكول والحصول على منحنى قياسي متوافق يتناسب مع جميع التركيزات والامتصاصات.

بعض طرق قياس الكالوز تتطلب جهدا كبيرا 17,32,55، ويستغرق وقتا طويلا 26,56، وليست خاصة بالكالوز لأن الأنيلين الأزرق يمكنه تلوين β-1,3-جلوكان أخرى غير الكالوز30، وتتطلب برامج عد الكالوز مكلفة ومتقدمة 23,24,26، يتطلب مستوى جيد من المهارات التقنية، والخلفية العالية والتوهج الذاتي المرتبط بمطيافية الفلورة تجعل من الصعب وغير الموثوق26. تتطلب طرق قياس الكالوز المبنية على سير عمل تحليل الصور الآلي مثل برنامج ImageJ تدريبا مناسبا على إضافة تحليل الصور مثل تقسيم Weka القابل للتدريب (TWS) لبرنامج ImageJ، وهذا مرهق جدا57.

تحاليل التحليل المعتمدة على التحليل الطيفي الفوتوفوتومتري المناعي مفضلة للغاية بسبب تخصصها وحساسيتها وسهولة استخدامها وقابليتها للتكرار. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن نظام الكشف وحساسيته قد تختلف حسب بروتوكول الفحص المحدد والمعدات المستخدمة.

هنا، يتم وصف طريقة جديدة لقياس الكالوز تعتمد على القياس الطيفي بالفلورية المناعية. يمكن تطبيق الطريقة الموصوفة هنا لقياس كمية الكالوز في أنسجة وأنواع نباتية مختلفة بمستوى مناسب من الخصوصية للكالوز، ودقة عالية وقابلية للتكرار. تعد هذه الطريقة إضافة إلى طرق قياس الكالوز المختلفة ويمكن استخدامها لمراقبة التغيرات في مستويات الكالوز أثناء النمو والتطور في النباتات واستجابة لمختلف المحفزات أو العلاجات. علاوة على ذلك، يقلل استخدام صفيحة 96 بئر من أخذ العينات والتحليل الذاتي، مما يجعل الطريقة مناسبة لقياس كمية الكالوز عالية الإنتاجية. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من إمكانية استخراج الكالوز بسهولة من أنسجة النباتات الطازجة 17,27,55، فإن خطوة تحضير العينة التي تتضمن التجفيف بالتجميد المدرجة بموجب هذا البروتوكول الجديد توفر قوة للحفاظ على العينات لفترة طويلة جدا (حتى سنة واحدة) وتسمح بتخزين وشحن العينات البيولوجية القابلة للتلف بين المختبرات البعيدة في درجات الحرارة المحيطة. هذا يسمح بتكرار استخراج الكالوز دون الحاجة إلى إعداد التجربة كاملة لجمع عينات جديدة بشكل متكرر.

يوصى بقياس الطيف بالفلورية المناعية لتجارب قياس الكالوز عالية الإنتاجية، بينما يمكن استخدام المجهر الفلوري فوق الفلوري والميكروسكوب المناعي الفلوري لكل من قياس الكالوز وتحديد الموقع النسيجي للكالوز في أنسجة النبات. لضمان توزيع دقيق وفعال وموثوق للكالوز في أنسجة النباتات، يوصى باستخدام طرق مختلفة لقياس الكالوز في نفس الوقت تشمل المجهر، والقياس الطيفي، وطرق النشاط الإنزيمي. وبالتالي، سيسمح ذلك بدقة وكفاءة بفهم دور الكالوز في مختلف الاستجابات الفسيولوجية والإجهادية. يمكن للأبحاث المستقبلية تقييم شامل وفي الوقت نفسه عدة طرق لقياس الكالوز والتي تشمل المجهر الفلوري، المجهر المناعي الفلوري، القياس الطيفي الفلوري، القياس الطيفي للفلورة المناعية، والتحليل الطيفي للضوء المناعي، والطرق القائمة على النشاط الإنزيمي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة بيل & ميليندا غيتس، رقم المنحة INV 009894/OPP1134098. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة؛ في جمع البيانات أو تحليلها أو تفسيرها؛ في كتابة المخطوطة؛ أو في قرار نشر النتائج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رقائق الألمنيوم كيم-فاي EA المحدودة، نيروبي، كينيا
التوازن التحليلي  شركة ميتلر-توليدو AG، غرايفينزي، سويسراML204/01
بيدبيتر 96شركة BioSpec Products Inc.، بارتلسفيل، أوكلاهوما، الولايات المتحدة الأمريكية1001 يورو
ورق الطلاء  كيم-فاي EA المحدودة، نيروبي، كينيا
مصل البقر الألبومين (BSA) ثيرمو فيشر ساينتيفيك، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةB14
جهاز الطرد المركزي، 5425Rإبندورف، هامبورغ، ألمانيا5406000240
ثلاجة وفريزر مركبة (4 فوه؛ C و & 20 ودرجة مئوية؛ ج) شركة هاير الطبية والمختبرات المحدودة، تشينغدا، الصينHYCD-282
دي إيثانولامين PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا191287
ديجيتال شاكر، ميكس ميتإبندورف، هامبورغ، ألمانيا5353000529
فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141679
ألواح ELISA، 96-بئر، قاعدة مسطحة، شفافة، بوليسترين، عالية الارتباطسارستيدت إيه جي & السرية KG، Nü مبرخت، ألمانيا82.1581.200
فلتر لقارئ الميكروبليت iMark، iMark 680، 405 نانومترشركة لاسيك إنترناشونال المحدودة، كيب تاون، جنوب أفريقياBRD1681011
Freeze-drier, VirTis— منصة البنش توب " K” السلسلة؛ الطراز: 4KBTXLلاب رينش، كندا، الولايات المتحدة448053
حمض الهيدروكلوريك (HCl) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141020
حاضنة الحمل الحراري المتساوي الحراري، IFA-54-8مجموعة إيسكو لايف ساينسز، سنغافورة2100002
Laminarin ألفا إيسار، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةJ66193
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملم إبندورف، هامبورغ، ألمانيا022363204
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 2 مل & nbsp;شركة جينيسي العلمية، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية24– 283
ميكروبايبت (30– 300 μ L)، 12 قناة، 2100 سلسلة وغير متوقع؛إبندورف، هامبورغ، ألمانياEP-12-300R
أطراف الميكروبايبت epT.I.P.S.  الأغاني المنفردةإبندورف، هامبورغ، ألمانيا022363204
الميكروبايبتات (0.5– 1000 μ L)، البحث والنشر؛ زائدإبندورف، هامبورغ، ألمانيا3123000900
قارئ امتصاص الميكرولوحة، iMarkمختبرات بيو-راد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية1681135EDU
برنامج مايكروبليت مانجر 6 الإصدار 6 مختبرات بيو-راد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية1689520
بارافيلمبول مارينفيلد GmbH & السرية KG، لاودا-ك&أومل؛ نيغشوفن، ألمانيا740751
فوسفات بارا-نيتروفينيل (pNPP)ميرك KGaA، دارمشتات، ألمانيا20-106
مقياس الرقم الهيدروجيني، HI9126هانا إنسترومنتس، وونسوكيت، رود آيلاند، الولايات المتحدة الأمريكية02310048991
بولي فينيل بيروليدون (PVP) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانياA2260
كلوريد البوتاسيوم (KCl)PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانياA2939
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجين (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141509
حمام ماء دقيق، GP10شركة ثيرمو فيشر العلمية، نيوينتون، كونيتيكت، الولايات المتحدة الأمريكيةTSGP10
الجسم المضاد الأولي (1-3-&بيتا؛ IgG الجريء الموجه للجلوكان) اللوازم البيولوجية تدعم شركة أستراليا المحدودة، ملبورن، أستراليا400-2
خزانات الكواشف  شركة ثيرمو فيشر العلمية، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية15075
الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بفوسفاتاز قلوي (مضاد للفئران IgG-فوسفاتاز قلوي) سيغما لايف ساينسز، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةA5153
أزيد الصوديوم (NaN3) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانياA1430
كربونات الصوديوم (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141648
كلوريد الصوديوم (NaCl) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانياA2942
كربونات هيدروجين الصوديوم (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141638
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)PanReac AppliChem ITW Recopants, Quí ميكا SLU، برشلونة، إسبانيا141687.1210
توين-20شركة بيوماتيك، أونتاريو، كنداA4031
الماء المقطر فائق النقاءثيرمو فيشر ساينتيفيك، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية10-977-015

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة