مقالة منهجية

تصور أحادي الكربوكسيل والمستقلبات الأخرى ذات الصلة في دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار مشفرة وراثيا

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65846

⸱

أكتوبر 27, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لتصور انتقال أحادي الكربوكسيل والجلوكوز و ATP في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا في تحضير دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي .

الملخص

تعد متطلبات الطاقة العالية للأدمغة بسبب النشاط الكهربائي واحدة من أكثر سماتها المميزة. يتم تلبية هذه المتطلبات من خلال إنتاج ATP من الجلوكوز ومستقلباته ، مثل أحادي الكربوكسيل اللاكتات والبيروفات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العملية أو من هم اللاعبون الرئيسيون ، لا سيما في ذبابة الفاكهة.

باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا ، نقدم طريقة بسيطة لقياس انتقال أحادي الكربوكسيلات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في تحضير يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي . يصف البروتوكول كيفية تشريح ولصق دماغ اليرقات الذي يعبر عن أحد المستشعرات إلى غطاء زجاجي.

نقدم نتائج تجربة كاملة تم فيها قياس نقل اللاكتات في أدمغة اليرقات عن طريق هدم ناقلات الكربوكسيل أحادية الكربوكسيل التي تم تحديدها سابقا في الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، نوضح كيفية زيادة النشاط العصبي بسرعة وتتبع تغيرات الأيض في الدماغ النشط. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة ، والتي توفر جميع المعلومات اللازمة ، لتحليل الأنسجة الحية الأخرى في ذبابة الفاكهة .

المقدمة

الدماغ لديه متطلبات طاقة عالية بسبب التكلفة العالية لاستعادة التدرجات الأيونية في الخلايا العصبية الناتجة عن توليد الإشارات الكهربائية العصبية ونقلها ، وكذلك النقل المشبكي 1,2. يعتقد منذ فترة طويلة أن هذا الطلب المرتفع على الطاقة يتم تلبيته من خلال الأكسدة المستمرة للجلوكوز لإنتاج ATP3. تنقل ناقلات محددة عند الحاجز الدموي الدماغي الجلوكوز في الدم إلى الدماغ. تضمن مستويات نسبة السكر في الدم الثابتة أن يتلقى الدماغ إمدادات ثابتة من الجلوكوز4. ومن المثير للاهتمام ، أن الأدلة التجريبية المتزايدة تشير إلى أن الجزيئات المشتقة من استقلاب الجلوكوز ، مثل اللاكتات والبيروفات ، تلعب دورا مهما في إنتاج طاقة خلايا الدماغ 5,6. ومع ذلك ، لا يزال هناك بعض الجدل حول مدى أهمية هذه الجزيئات لإنتاج الطاقة والخلايا في الدماغ التي تنتجها أو تستخدمها 7,8. إن الافتقار إلى الأدوات الجزيئية المناسبة ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية المطلوبة لهذه المهمة هو قضية مهمة حالت دون حل هذا الجدل تماما.

أدى تطوير وتطبيق العديد من أجهزة الاستشعار الأيضية الفلورية المهندسة إلى زيادة ملحوظة في فهمنا لمكان وكيفية إنتاج المستقلبات واستخدامها ، وكذلك كيفية حدوث التدفقات الأيضية أثناء النشاط العصبي القاعديوالعالي 9. ساهمت المستشعرات الأيضية المشفرة وراثيا القائمة على الفحص المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) ، مثل ATeam (ATP) و FLII12Pglu700μδ6 (الجلوكوز) و Laconic (اللاكتات) و Pyronic (البيروفات) ، في فهمنا لعملية التمثيل الغذائي لطاقة الدماغ10،11،12،13. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع التكاليف والمعدات المتطورة اللازمة لإجراء التجارب على أو الأنسجة الحية ، لا تزال النتائج في نماذج الفقاريات تقتصر في المقام الأول على مزارع الخلايا (الخلايا الدبقية والخلايا العصبية).

كشف الاستخدام الناشئ لنموذج ذبابة الفاكهة للتعبير عن هذه المستشعرات أن السمات الأيضية الرئيسية محفوظة عبر الأنواع ويمكن معالجة وظيفتها بسهولة باستخدام هذه الأداة. والأهم من ذلك ، أن نموذج ذبابة الفاكهة قد ألقى الضوء على كيفية نقل الجلوكوز واللاكتات / البيروفات واستقلابهما في دماغ الذبابة ، والعلاقة بين استهلاك أحادي الكربوكسيل وتكوين الذاكرة ، والعرض التوضيحي الرائع لكيفية تداخل الزيادات في النشاط العصبي والتدفق الأيضي14،15،16،17. الطريقة المعروضة هنا لقياس مستويات الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز و ATP باستخدام مستشعرات FRET المشفرة وراثيا المعبر عنها في دماغ اليرقات تسمح للباحثين بمعرفة المزيد حول كيفية استخدام دماغ ذبابة الفاكهة للطاقة ، والتي يمكن تطبيقها على أدمغة الأخرى.

نظهر أن هذه الطريقة فعالة للكشف عن اللاكتات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية ، وأن ناقل أحادي الكربوكسيلات (Chaski) يشارك في استيراد اللاكتات إلى الخلايا الدبقية. نوضح أيضا طريقة بسيطة لدراسة تغيرات الأيض أثناء زيادة النشاط العصبي ، والتي يمكن أن تحدث بسهولة عن طريق تطبيق حمام لمضادات مستقبلات GABAA . وأخيرا، نوضح أنه يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس انتقال الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز في الأنسجة الأخرى ذات الأهمية الأيضية، مثل الأجسام الدهنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. صيانة سلالة الذباب وتزامن اليرقات

  1. لإجراء هذه التجارب ، استخدم مزارع الذباب التي يتم تربيتها عند 25 درجة مئوية على طعام ذبابة الفاكهة القياسي المكون من 10٪ خميرة ، 8٪ جلوكوز ، 5٪ دقيق قمح ، 1.1٪ أجار ، 0.6٪ حمض البروبيونيك ، و 1.5٪ ميثيل بارابين.
  2. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الأسطر التالية: w1118 (خلفية التحكم التجريبي) ، OK6-GAL4 (برنامج تشغيل الخلايا العصبية الحركية) ، repo-GAL4 (برنامج تشغيل لجميع الخلايا الدبقية) ، CG-GAL4 (سائق الأجسام الدهنية) ، UAS-Pyronic (مستشعر البيروفات) ، UAS-FLII12Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) ، UAS-Laconic (مستشعر اللاكتات) ، UAS-GCaMP6f (مستشعر الكالسيوم) ، UAS-AT1.03NL (مستشعر ATP) و UAS-Chk RNAi GD1829. جميع الخطوط التي تعبر عن أجهزة الاستشعار أو RNAi موجودة في الخلفية الجينية w1118 .
  3. للحصول على يرقات متجولة ثالثة متزامنة ، ضع 300 ذبابة (3-5 أيام ، 100 ذكر ، 200 أنثى عذراء) من التهجين الجيني المطلوب في غرفة وضع البيض ، والتي تحتوي على طبق بتري 60 مم مغطى بأغاروز 1٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). ضع قطرة من الخميرة السائلة / الكريمية (قطرها 1.5 سم) في وسط اللويحة لتشجيع الذباب على وضع البيض (الشكل 1).
  4. احتفظ بالذباب عند 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع استبدال طبق بتري الأغاروز بآخر طازج وخميرة مذابة طازجة مرتين يوميا.
  5. اسمح للذباب بوضع البيض لمدة 4 ساعات في اليوم الرابع قبل تغيير طبق بتري. قم بإزالة هذه اللوحة. ثم ، لمدة 3 ساعات ، اسمح للذباب بوضع البيض في لوحة أغاروز جديدة مع خميرة مذابة حديثا. استخدم هذه اليرقات في التجارب.
  6. بعد 3 ساعات ، قم بإزالة اللويحة التي تحتوي على البيض وضعها في حاضنة 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  7. اجمع 50 إلى 100 يرقة حديثة الفقس من هذه اللوحة (0 ساعة بعد فقس اليرقات) وضعها في قنينة بلاستيكية تحتوي على طعام قياسي. للسماح لليرقات بالتغذية بشكل صحيح ، تأكد من أن الطعام مطحون وناعم. استخدم اليرقات بعد 96 ساعة من النقل.

2. جعل أغطية الزجاج مع بولي L- ليسين

  1. نفذ هذه الخطوة 1 ساعة قبل تشريح اليرقات. في لوحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار ، ضع أغطية زجاجية مقاس 25 مم (يعتمد قطر الأغطية المستخدمة على غرفة التسجيل المتوفرة في المجهر).
  2. ضع قطرة (300 ميكرولتر) من بولي-إل-ليسين في وسط كل غطاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل كل غطاء 3x بالماء المقطر ، ثم 2x بمحلول ملحي خال من Ca2+ (نفس المحلول المستخدم لتشريح اليرقات ، انظر الخطوة 3.2). قم بتثبيت الأغطية في غرفة التسجيل واملأها بمحلول ملحي خال من الكالسيوم2+.
    ملاحظة: على الرغم من أن دماغ اليرقات يمكن أن يلتصق مباشرة بأغطية الزجاج ، إلا أن الالتصاق ضعيف ، ويتحرك الدماغ أحيانا أو يزيح أثناء التجربة بسبب التدفق المستمر للمحلول الملحي. تقلل إضافة خطوة poly-L-lysine من خطر الحركات أو حتى فقدان الدماغ نتيجة للغسل.

3. تشريح الحبل العصبي البطني (VNC) والأجسام الدهنية (FBs)

  1. اجمع اليرقات الثالثة المتجولة من التهجين الجيني المطلوب (من الخطوة 1.7) واغسلها جيدا 3 مرات بالماء المقطر.
  2. ضع اليرقات في طبق تشريح زجاجي يحتوي على 750 ميكرولتر من محلول ملحي مثلج بارد صفري اسميا يتكون من 128 mM NaCl و 2 mM KCl و 4 mM MgCl2 و 5 mM trehalose و 5 mM HEPES و 35 mM سكروز (الرقم الهيدروجيني = 6.7 ، يقاس بمقياس الأس الهيدروجيني ويتم تعديله باستخدام 1 M NaOH و HCl 37٪ v / v).
    ملاحظة: يعد ضبط الأس الهيدروجيني على 6.7 أمرا بالغ الأهمية لأنه ، كما لوحظ سابقا ، يعتمد النقل أحادي الكربوكسيل بشكل كبير على الرقم الهيدروجيني للمحلول. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق 6.7 مع الرقم الهيدروجيني في الدملمف ليرقة ثالثة17,18.
  3. ضع اليرقة تحت المجهر المجسم وقم بعمل قطع عرضي عبر الجزء الخلفي من البطن باستخدام زوج من الملقط.
  4. ادفع الفك بالملقط أثناء قلب اليرقات من الداخل للخارج.
  5. راقب الحبل العصبي البطني (VNC) بجوار الفك. قم بإزالة الأقراص الوهمية والأنسجة الذيلية المتبقية في الدماغ بعناية.
  6. افصل VNC مع الدماغ المركزي والفصوص البصرية عن بقية الأنسجة عن طريق قطع الأعصاب. انقل VNC ، والتقاطه بالملقط من الأعصاب المتبقية ، ووضعه في غرفة التسجيل التي تحتوي على محلول التسجيل الخالي من الكالسيوم2+ (نفس الحل من الخطوة 3.2). سوف تلتزم VNCs على الفور بأغطية الغطاء.
  7. لتجنب التداخل من الأعصاب المتبقية ، قم بتثبيتها في الجزء السفلي من غطاء الغطاء باستخدام ملقط (ستكون الأعصاب أيضا فلورية اعتمادا على خط السائق المستخدم) (الشكل 2).
  8. لإجراء تجارب على الأجسام الدهنية (FBs) لقياس نقل الجلوكوز أو أحادي الكربوكسيل في مجموعة أخرى من التجارب ، تابع عزل الأنسجة باتباع الخطوات 3.1-3.4. بمجرد قلب اليرقات من الداخل إلى الخارج ، لاحظ أن FB عبارة عن نسيج أبيض ثنائي مسطح.
  9. ضع FBs المعزولة التي تعبر عن مستشعرات FRET (التي تم الحصول عليها من تقاطع جيني باستخدام برامج التشغيل المناسبة) في غرفة التسجيل التي تحتوي على محلول التسجيل بدون Ca2+.
    ملاحظة: FB كاره للماء للغاية (يميل إلى الطفو على سطح المحلول) وعرضة للغاية للتلاعب بالملقط ، ويجب التعامل معه بحذر. أي معالجة تقريبية لهذا النسيج ستؤدي إلى خلايا ميتة في وقت لاحق (مع انخفاض مضان أجهزة الاستشعار).
  10. ضع حجرة التسجيل التي تحتوي على VNCs / FBs على مرحلة المجهر.

4. تصوير الخلايا الحية

  1. للحصول على صور لأجهزة استشعار التعبير عن الأنسجة ، استخدم مجهرا مضانا مستقيما مقترنا بنظام تقسيم الانبعاثات وكاميرا CCD. قم بتشغيل نظام الإضاءة للمجهر قبل 30 دقيقة من بدء أي تجربة.
    ملاحظة: هنا نستخدم مجهر مضان القرص الدوار المجهز بهدف غمر الماء 20x / 0.5 لمراقبة كل من VNCs و FBs. يوضح الشكل 2 أيضا استخدام هدف الغمر في الماء 40x / 0.8.
  2. لتصور مضان GCaMP6f ، اضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث عند 488 نانومتر و 540 نانومتر على التوالي. بالنسبة لأجهزة استشعار مقتضبة / بيرونيك / ATP / الجلوكوز ، اضبط الطول الموجي للإثارة على 440 نانومتر والأطوال الموجية للانبعاث عند 488 نانومتر (mTFP ، CFP) و 540 نانومتر (كوكب الزهرة ، YFP).
  3. احصل على صور بحجم 512 × 512 بكسل كل 2 ثانية ل GCaMP6f وكل 10-30 ثانية لأجهزة استشعار مقتضبة / بيرونيك / ATP / جلوكوز. تحديد التعرض الأمثل لمصدر الضوء مع مراعاة جودة الصورة التي تم الحصول عليها. لاتباع هذا البروتوكول ، تأكد من أن الصور من التعرض 300 مللي ثانية لأجهزة الاستشعار Laconic و Pyronic و 100-150 مللي ثانية لأجهزة استشعار الجلوكوز و ATP .
    ملاحظة: يمكن أن يختلف التعرض اعتمادا على استخدام مجهر مضان متحد البؤر أو عادي.
  4. بمجرد تثبيت غرفة التسجيل في مرحلة المجهر ، ضع هدف الغمر في الماء بعناية وتأكد من أن الهدف يظل مغمورا طوال التجربة. حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 25 درجة مئوية.
  5. قم بتوصيل غرفة التسجيل بنظام التروية وحافظ على الأنسجة مغمورة في محلول التسجيل الذي يحتوي على 128 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مللي مول KCl ، 1.5 مللي متر CaCl2 ، 4 mM MgCl2 ، 5 mM trehalose ، 5 mM HEPES ، و 35 mM السكروز ، الرقم الهيدروجيني 6.7 (يقاس بمقياس الأس الهيدروجيني ويتم تعديله باستخدام NaOH و HCl).
  6. حافظ على تدفق مستمر قدره 3 مل / دقيقة من محلول التسجيل عبر الأنسجة باستخدام الجاذبية ، مقترنا بمضخة تمعجية منخفضة التدفق لاستخراج السائل من الغرفة مع الحفاظ على الحجم ثابتا. لتحقيق التدفق المطلوب ، ضع الأنابيب المحتوية على المحلول (أنابيب بلاستيكية سعة 50 مل) على ارتفاع 25 سم فوق مرحلة المجهر.
    ملاحظة: يستخدم هذا التدفق المدفوع بالجاذبية لمنع حركة الأنسجة الناتجة عن المضخات التمعجية ، مما يسمح بتحليل أكثر دقة للصور لاحقا.
  7. قبل أي تحفيز ، حافظ على تدفق محلول التسجيل لمدة 5-10 دقائق للحصول على خط أساس ثابت من التألق من المستشعرات. قم بتغيير المدة حسب الضرورة للحصول على خط الأساس هذا.
  8. استبدل المحلول المتدفق بمحلول التحفيز لمدة 5 دقائق لتحفيز VNC / FBs (مع الجلوكوز أو البيروفات أو اللاكتات بالتركيز الموصوف لكل تجربة مذابة في محلول ملحي ؛ انظر كل شكل).
    ملاحظة: يمكن أن تختلف مدة التحفيز وفقا لاحتياجات التجربة (على سبيل المثال ، يمكن زيادة نبضات الجلوكوز إلى 10 دقائق للوصول إلى هضبة في الخلايا العصبية ، كما ورد سابقا16).
  9. للحفاظ على الأسمولية في محلول التحفيز ، قم بتصحيح تركيز السكروز (كربوهيدرات غير قابلة للاستقلاب بواسطة دماغ ذبابة الفاكهة ) وفقا لتركيز أحادي الكربوكسيل أو الجلوكوز المضاف.
  10. قم بتغيير الحلول باستخدام نظام بسيط من الصمامات. احرص على عدم تحريك مرحلة المجهر.
  11. تعريض VNC إلى 80 ميكرومتر بيكروتوكسين (PTX ، يتدفق باستمرار) لتحفيز النشاط العصبي. يزيد هذا الإجراء من تواتر تذبذبات الكالسيوم2+ ، مما يجعل من الممكن ملاحظة التغيرات في الجزيئات ذات الصلة بالتمثيل الغذائي (على سبيل المثال ، ATP داخل الخلايا).
  12. في نهاية أي تجربة ، اغسل نظام التدفق الكامل جيدا ، بما في ذلك الأنابيب وغرفة التسجيل ، لمدة 10 دقائق على الأقل بالمحلول الملحي و 10 دقائق أخرى بالماء المقطر للتخلص من أي أثر للحلول المستخدمة.

5. معالجة الصور وتحليل البيانات

  1. لمعالجة الصور التي تم الحصول عليها ، تابع الخطوات الموضحة في الشكل 3.
  2. استيراد الصورة (مقتضب) إلى برنامج ImageJ. تحتوي الصورة على عرضين للعينة: الصورة اليسرى هي إشارة mTFP والأخرى الموجودة على اليمين هي إشارة الزهرة. حدد منطقة تتضمن الخلايا المراد تحليلها وافصل هذه الصور (mTFP والزهرة) في نافذة جديدة. تأكد من أن هذه الصور تحتوي على نفس المنطقة بالضبط.
  3. افتح المكون الإضافي للتسجيل وقم بتصحيح الانجراف الصغير للأنسجة الذي يتم ملاحظته عادة في التجربة مع وظيفة الجسم الصلب. قم بإجراء ذلك في كلتا الصورتين (mTFP والزهرة).
  4. حدد ما لا يقل عن 10 مناطق ذات أهمية (ROIs) في السيتوسول للخلايا العشر المقابلة في إشارة mTFP (488 نانومتر) وانقل التحديدات إلى صورة كوكب الزهرة (540 نانومتر).
  5. حدد اثنين أو ثلاثة من عائد الاستثمار بالقرب من الخلايا التي يتم تحليلها ولكن بدون إشارة واضحة (دائما داخل VNC أو الأنسجة التي تم تحليلها ، انظر الشكل 3). هذه هي عائد الاستثمار في الخلفية.
  6. مع تحديد عائد الاستثمار في كلتا الصورتين ، احصل على متوسط القيمة الرمادية لكل إشارة باستخدام مقياس الوظيفة. انقل البيانات إلى ورقة بيانات واطرح متوسط قيمة الخلفية لكل إشارة.
  7. تحديد نسبة مضان mTFP على كوكب الزهرة (للمقتضب والبيرونيك). يتم حساب هذه القيمة بشكل مختلف عن مستشعرات FRET الأخرى الموصوفة هنا (حيث تكون النسبة عادة YFP / CFP) لأنه عند ربطها بالركائز الخاصة بكل منها ، يقلل كل من Laconic و Pyronic من كفاءة FRET الخاصة بهما.
  8. تطبيع البيانات بقسمة كل قيمة مسجلة على خط الأساس. في ورقة بيانات منفصلة ، احسب خط الأساس بأخذ القيمة المتوسطة لنسبة mTFP / Venus خلال 2 دقيقة قبل التحفيز.
  9. بالنسبة لقياسات الجلوكوز و ATP باستخدام أجهزة الاستشعار المستندة إلى FRET ، احسب نسبة YFP / CFP ، وقم بتطبيع البيانات كما هو موضح في الخطوة 5.8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لمدة تصل إلى 1 ساعة ، يسمح هذا الإجراء بقياس سهل للتغيرات داخل الخلايا في مضان مستشعرات أحادي الكربوكسيل والجلوكوز. كما هو موضح في الشكل 4 ، تستجيب المستشعرات المقتضبة في كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الحركية لاكتات 1 mM بمعدل مماثل في بداية النبضة ، لكن الخلايا العصبية الحركية تصل إلى زيادة أعلى عن خط الأساس خلال نبضة 5 دقائق ، كما هو موضح سابقا17. تم اختيار تركيز اللاكتات هذا لأنه يمكن مقارنته بالمستويات الموجودة في الدملمف من يرقات الطور الثالث. وبالمثل ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة استقلاب الدماغ جديدا نسبيا26 ، وقد ثبت أنه يشترك في خصائص أكثر مع استقلاب الثدييات مما كان متوقعا ، والذي تمت دراسته بشكل أساسي في المختبر في مزارع الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ. تتفوق ذبابة الفاكهة في التجارب في الجسم الحي بفضل بطارية الأدوات الوراثية وأجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا المتاحة التي تسمح للباحثين بتصور التغيرات الأيضية الناجمة عن النشاط المستحث أو حتى استجابة لمحفز حسي في الوقت الفعلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يعلن المؤلفون عن أي مصالح منافسة أو مالية.

شكر وتقدير

نشكر جميع أعضاء مختبر سييرالتا. وحظي هذا العمل بدعم من 11200477 المؤسسة الوطنية للإحصاء (إلى AGG) و FONDECYT 1210586 العادية (إلى JS). تم التبرع ب UAS-FLII12Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) من قبل بيير إيف بلاسايس وتوماس بريات ، CNRS-Paris.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseSigmaA9539
CaCl2< / sub>SigmaC3881
CCD Camera ORCA-R2Hamamatsu-Cell-R
Software
Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Center7011سائق الجسم السمين
Dumont # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-30
نظام تقسيم الانبعاثات DV2القياسات الضوئية-
أغطية زجاجية (قطر 25 مم)Marienfeld111650ألمانيا
GlucoseSigmaG8270
GraphPad PrismGraphPad الإصدار8،0،2
HEPESSigmaH3375
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةالإصدار 1،53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x / 0.8 هدف الغمر في الماءأوليمبوس-ميثيل
بارابينسيجماH5501
MgCl2< / sub>SigmaM1028
NaClSigmaS7653
OK6-GAL4بلومنجتون ذبابة الفاكهة مركزمحرك محرك الخلايا العصبية
PicrotoxinSigmaP1675SCAUTION-قاتل إذا ابتلع< / قوي>
Poly-L-lysineSigmaP4707
حمض البروبيونيكSigmaP1386
Repo-GAL4Bloomington ذبابة الفاكهة الأسهم مركز7415سائق الخلايا الدبقية (الكل)
لاكتات الصوديومسيجما71718
بيروفات الصوديومسيجماP2256
الغزل المجهر الفلوري BX61WIأوليمبوسالسكروز
سيجماS0389
تريهالوزالولايات المتحدة البيولوجيةT8270
UAS-AT1.03NL   ؛مركز كيوتو ذبابة الفاكهة117012مستشعر ATP
UAS-Chk RNAi GD1829مركز موارد ذبابة الفاكهة في فييناv37139Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة93452مستشعر الجلوكوز
UAS-GCaMP6f مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة42747مستشعر الكالسيوم
UAS-LaconicSierraltaLab-Lactateمستشعر
UAS-PyronicPierre Yves Placais / Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x / 0.5 هدف الغمر في الماءأوليمبوس-
Olympus-CG-GAL4 برنامج الأسهم قرص

المراجع

  1. Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
  2. Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
  3. Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
  4. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  5. Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
  6. Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
  7. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
  8. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  9. Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
  10. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  11. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  12. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
  13. San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
  14. Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  15. Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
  16. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
  17. Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
  18. Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
  19. Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
  20. McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
  21. Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  22. Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
  23. Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
  24. Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
  25. Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
  26. De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
  27. Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).
  28. Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
  29. Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
  30. Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FRET

مقالات ذات صلة