Home
JoVE Journal
Biology
ألياف عضلية هيكلية قصيرة ومتوسطة وطويلة سليمة تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لست عضلات خ...

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

ألياف عضلية هيكلية قصيرة ومتوسطة وطويلة سليمة تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لست عضلات خلفية للفئران: Beyond Flexor digitorum brevis

DOI: 10.3791/65851

December 1, 2023

, , , , ,

1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine,University of Antioquia

Cite Watch Download PDF Download Material list
AI Banner

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

وصفنا بروتوكولا للحصول على ألياف منفصلة إنزيميا بأطوال وأنواع مختلفة من ست عضلات للفئران البالغة: ثلاثة منها موصوفة بالفعل (flexor digitorum brevis ، extensor digitorum longus ، soleus) وثلاثة منها انفصلت بنجاح لأول مرة (الباسطة الهلوسة الطويلة ، peroneus longus ، peroneus digiti quarti).

Abstract

ألياف العضلات الهيكلية التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لعضلات الماوس هي نموذج مفيد للتجارب الفسيولوجية. ومع ذلك ، فإن معظم الأوراق تتعامل مع الألياف القصيرة من flexor digitorum brevis (FDB) ، والتي تقيد نطاق النتائج التي تتعامل مع أنواع الألياف ، وتحد من كمية المواد البيولوجية المتاحة ، وتعيق وجود صلة واضحة بين الظواهر الفسيولوجية الخلوية والمعرفة البيوكيميائية والديناميكية السابقة التي تم الحصول عليها في العضلات الأخرى.

تصف هذه الورقة كيفية الحصول على ألياف سليمة من ست عضلات ذات ملامح وأطوال مختلفة من نوع الألياف. باستخدام الفئران البالغة C57BL / 6 ، نعرض تشريح العضلات وبروتوكول عزل الألياف ونوضح مدى ملاءمة الألياف للدراسات العابرة Ca2+ وتوصيفها المورفومتري. كما يتم تقديم تكوين نوع الألياف للعضلات. عند الانفصال ، تصبح جميع العضلات سليمة ، والألياف الحية التي تنقبض بسرعة لأكثر من 24 ساعة. أعطى FDB قصيرة (<1 مم) ، Peroneus digiti quarti (PDQA) و peroneus longus (PL) أعطت وسيطة (1-3 مم) ، بينما الباسطة digitorum longus (EDL) ، الهلوسة الباسطة الطويلة (EHL) ، والعضلات الوحيدة تطلق أليافا طويلة (3-6 مم).

عند تسجيلها باستخدام الصبغة السريعة Mag-Fluo-4 ، أظهرت عابرات Ca2+ من ألياف PDQA و PL و EHL الحركية السريعة والضيقة التي تذكرنا بالنوع المورفولوجي II (MT-II) ، المعروف أنه يتوافق مع ألياف النوع IIX و IIB. هذا يتوافق مع حقيقة أن هذه العضلات لديها أكثر من 90 ٪ من الألياف من النوع الثاني مقارنة مع FDB (~ 80 ٪) و soleus (~ 65 ٪). بالانتقال إلى ما بعد FDB ، نظهر لأول مرة تفكك العديد من العضلات ، مما يجعل الألياف تمتد على نطاق من الأطوال بين 1 و 6 مم. هذه الألياف قابلة للحياة وتعطي عابرات Ca2+ سريعة ، مما يشير إلى أنه يمكن تعميم MT-II على ألياف IIX و IIB السريعة ، بغض النظر عن مصدر عضلاتها. تزيد هذه النتائج من توافر نماذج لدراسات العضلات الهيكلية الناضجة.

Introduction

العضلات الهيكلية الناضجة للثدييات هي نسيج متعدد الوظائف. ينظم بشكل كبير عملية التمثيل الغذائي ، وهو المصدر الرئيسي لإنتاج الحرارة ، وتمنحه خصائصه الديناميكية دورا رئيسيا في التنفس أو حركة أجزاء الجسم أو الإزاحة من نقطة إلىأخرى 1،2،3. العضلات الهيكلية ذات صلة أيضا بالفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض ، بما في ذلك الحالات الوراثية والمزمنة ، مثل الاعتلالات العضلية أو الحثل أو ساركوبينيا ، بالإضافة إلى العديد من الحالات المزمنة غير العضلية ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية3،4،5،6،7،8.

كانت الدراسة خارج الجسم الحي للخصائص الهيكلية والوظيفية للعضلات الهيكلية الناضجة في سياق الصحة والمرض ممكنة بشكل رئيسي من خلال نموذجين تجريبيين: العضلات الكاملة والألياف المعزولة. فيالقرن 20 ، استغل الباحثون خصائص العضلات الكاملة ، الباسطة الكاملة والسليمة للعضلات الطويلة (EDL) ، والعضلات النعلية ، والظنبوب الأمامية ، وعضلات الساق من الأنواع الصغيرة المختلفة كنماذج محورية للتعرف على الوحدات الحركية وأنواع الألياف والخصائص الديناميكية مثل القوة وحركية الانكماش والاسترخاء9،10،11،12،13،14،15 ،16. ومع ذلك ، فإن ظهور دراسات بيولوجيا الخلية الأكثر دقة نقل المنطقة نحو دراسة ألياف العضلات المفردة. ثم مكن العمل الرائد من عزل ألياف ديجيتوروم بريفيس المثنية السليمة (FDB) للفئران عن طريق التفكك الأنزيمي للتوصيف اللاحق17،18،19. على الرغم من أنه يمكن أيضا الحصول على ألياف FDB عن طريق التشريح اليدوي20 ، إلا أن سهولة وإنتاجية عالية من التفكك الأنزيمي لعضلات الفئران ، بالإضافة إلى ملاءمتها لمجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية ، جعلت النموذج الأخير يستخدم على نطاق واسع خلال العقدين الماضيين.

ألياف FDB القصيرة مناسبة للدراسات الفيزيولوجية الكهربية وغيرها من الدراسات الفيزيائية الحيوية ، والتحليلات الكيميائية الحيوية ، والأيضية ، والدوائية ، وتجارب الفحص المجهري الإلكتروني والفلوري ، ونقل نهج بيولوجيا الخلية ، أو كمصدر للخلايا الجذعية في دراسات تكوين العضلات5،21،22،23،24،25،26،27،28 ، 29،30،31،32. ومع ذلك ، فإن استخدام ألياف FDB فقط في تجارب العضلات يضيق نطاق البحث الذي يتعامل مع أنواع الألياف ويحد من كمية المواد البيولوجية المتاحة لبعض التقنيات المنهجية أو للحصول على مزيد من المعلومات من واحد. تعيق هذه القيود وجود علاقة واضحة بين الظواهر الفسيولوجية الخلوية والدراسات البيوكيميائية والديناميكية السابقة التي أجريت في عضلات مختلفة كاملة وسليمة (على سبيل المثال ، EDL ، soleus ، peronei).

للتغلب على هذه القيود ، نجحت بعض المجموعات في فصل عضلات EDL الأطولوالعضلات الوحيدة 24،33،34،35،36،37،38،39،40 ، مما فتح الباب لتوسيع الطريقة لتشمل العضلات الأخرى ذات الصلة. ومع ذلك، لا يزال استخدام الألياف الخطية والألياف النعلية نادرا، ويرجع ذلك على الأرجح إلى عدم وجود تفاصيل منهجية للحصول عليها كألياف سليمة. هنا ، نصف بالتفصيل كيفية عزل الألياف ذات الأطوال والأنواع المختلفة من ست عضلات: ثلاثة منها موصوفة بالفعل (FDB و EDL و soleus) وثلاثة منها انفصلت بنجاح لأول مرة (الهلوسة الباسطة الطويلة [EHL] ، peroneus longus [PL] ، و peroneus digiti quarti [PDQA]). تؤكد نتائج العمل الحالي أن نموذج الألياف المنفصلة إنزيميا مناسب لمجموعة واسعة من الدراسات والارتباطات المستقبلية مع البيانات المنشورة سابقا ، مما يزيد من توافر نماذج لدراسات العضلات الهيكلية الناضجة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في التجارب مع بجامعة أنتيوكيا (UdeA) (المحضر 104 المؤرخ 21 يونيو 2016 و 005 المؤرخ 15 أبريل 2021) ، وفقا للقانون 84 لعام 1989 والقرار 8430 لعام 1993 الصادر عن الحكومة الكولومبية وتم إجراؤها والإبلاغ عنها وفقا للبحوث الحيوانية: إرشادات إعداد التقارير في تجارب الجسم الحي (ARRIVE)41. جميع النتائج المعروضة هنا تأتي من الفئران السليمة ، التي تتراوح أعمارها بين 7 و 13 أسبوعا ، و 20-26 جم ، و C57BL / 6 ذكور. يوضح الشكل 1 التصميم العام لهذه الدراسة وترتيب الإجراءات. يتم سرد جميع تفاصيل الكواشف والمواد والمعدات في جدول المواد.

1.

  1. يضم ستة فئران كحد أقصى لكل قفص أكريليك وشفاف ومستطيل ، مع فراش مشتق من الخشب ، في ظل ظروف درجة الحرارة الخاضعة للرقابة (21 ± 2 درجة مئوية) ودورات الضوء: الظلام (12:12 ساعة).
  2. امنح حرية الوصول إلى الغذاء ومياه الصنبور في مرافق حيوانية محددة خالية من مسببات الأمراض دون إثراء بيئي.

2. تشريح

  1. الحلول والمواد والكواشف
    1. تحضير وتصفية (0.22 ميكرومتر) حلول العمل بالتركيب التالي (جميع التركيزات في mM):
      1. التيرود: 5.4 كيلو كلوريد ، 1 MgCl2 ، 140 كلوريد الصوديوم ، 0.33 NaH2PO4 ، 2 CaCl2 ، 10 جلوكوز ، 10 HEPES ، درجة الحموضة 7.3
      2. التفكك: 2.7 كيلو كلوريد ، 1.2 KH2PO4 ، 0.5 MgCl2 ، 138 كلوريد الصوديوم ، 0.1 Na2HPO4 ، 1 CaCl2 ، درجة الحموضة 7.4
      3. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 كلوريد الصوديوم ، 8.6 Na2HPO4 ، 2.8 KH2PO4 ، درجة الحموضة 7.34
    2. إعداد غرفتين تشريح. مجسم. مقص التشغيل مقص ناعم ملقط ناعم وقوارير زجاجية نظيفة وشفافة وغير مخروطية بعرض 1-1.5 سم بحجم إجمالي 3-4 مل مع أغطية. رتب نظاما لتحفيز العضلات كهربائيا في غرف التشريح.
    3. قم بإعداد ماصات زجاج باستور المصقول بالنار بأطراف عرض مختلفة: 5 و 4 و 3 و 2 و 1 مم.
    4. اضبط حمام الماء على 37 درجة مئوية. وزن القسامات من 3 ملغ من نوع كولاجيناز 2.
  2. إجراء
    1. التضحية بالماوس باستخدام الطرق المعتمدة من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية. يوصى بخلع عنق الرحم لأنه سريع وأقل إجهادا ويتجنب التعرض للأدوية التي قد تؤثر على الأنسجة العضلية (مثل CO2 أو بعض مواد التخدير). ابدأ التشريح على الفور للحصول على نتائج أفضل.
    2. ضع الماوس على سطح رغوي وشريط أو دبوس الأطراف الأمامية. اقطع كلا الطرفين الخلفيين على الركبتين بمقص التشغيل ، وانقل كل منهما إلى غرفة تشريح منفصلة ، وأضف Tyrode البارد (10-20 درجة مئوية) لتغطية الأنسجة.
      ملاحظة: سيعطي كل طرف خلفي ست عضلات مختلفة بالترتيب التالي: FDB و soleus و EDL و EHL و PL و PDQA. ترد مراجع تشريحية مفصلة لتشريح العضلات الست سليمة من الوتر إلى الوتر في الشكل 2 وفي أماكن أخرى42.
    3. قم بتثبيت الطرف الخلفي الأول في غرفة التشريح في وضع يكون فيه الوجه الخلفي للساقين مرئيا. إزالة الجلد تحت التكبير ؛ ثم فضح وإزالة FDB (الشكل 2). قم بتخزينه في قنينة زجاجية واحدة تحمل علامة 1 مل من محلول Tyrode.
      ملاحظة: يلزم التكبير المناسب والتدريب السابق لتجنب أي قطع غير مرغوب فيه في الأنسجة العضلية.
    4. فضح النعل وإزالته وتخزينه في قنينة منفصلة مع 1 مل من التيرودي. استخدم مقصا دقيقا لفصل الساق أولا ثم لإزالة النعل ، كما هو موضح في الشكل 2.
    5. كشف الوجه الأمامي للساق ، وإزالة الجلد ، وتحديد الأوتار البعيدة للظنبوب الأمامي وعضلات EDL في الكاحل. إزالة وتجاهل الظنبوب. ثم قطع الأوتار البعيدة ل EDL (الشكل 2). استمر في التشريح حتى إزالة EDL وضعه في قنينة زجاجية منفصلة مع 1 مل من Tyrode.
    6. قم بإزالة عضلة EHL ، التي تقع فقط خلف ووسط EDL. ابدأ التشريح بتحديد الوتر ومتابعتهإلى الرقم الأول ، كما هو موضح في اللوحة المقابلة من الشكل 2. الحفاظ على العضلات في قارورة زجاجية منفصلة مع 1 مل من التيرودي.
    7. تحديد واتباع الوتر الخارجي للبيروني لقطعه وإزالة عضلة PL (الشكل 2). ضع العضلات في قنينة زجاجية منفصلة مع 1 مل من التيرود.
    8. تحديد ومتابعة الوترإلى الرقم 4 ؛ قصها وإزالة عضلة PDQA (الشكل 2). ضعه في قنينة زجاجية منفصلة مع 1 مل من التيرودي.
    9. كرر الإجراء مع الطرف الخلفي الثاني.
    10. اجمع كلا العضلات من نفس النوع في قارورة زجاجية واحدة أو طبق بتري صغير بمحلول Tyrode.
      ملاحظة: إذا كان من المخطط تشريح أكثر من زوجين من العضلات أثناء جلسة العمل ، فقم بتعيين باحثين لإجراء التشريح.

3. بروتوكول عزل الألياف العضلية

  1. تجديد حل Tyrode في غرف التشريح لإزالة الحطام وفراء الفأر. صب عضلات FDB في غرفة تشريح واحدة ، وتحقق من سلامتها ، وانقلها إلى قارورة زجاجية جديدة مع 1 مل من محلول التفكك. كرر هذا الإجراء مع عضلات EHL و PL و PDQA.
    ملاحظة: إذا بدت العضلة مفرطة الانقباض أو مقطوعة أو لا تستجيب للتحفيز الكهربائي ، فلا تستمر في خطوة البروتوكول التالية. بدلا من ذلك ، قم بتحسين بروتوكول التشريح من خلال التحقق من جودة المحاليل (درجة الحموضة ، التلوث ، الأسمولية) واكتساب المزيد من مهارات التشريح (الشكل 1C والفيديو التكميلي S1).
  2. إجراء تخفيضات طولية أو قطرية للعضلات النعلية و EDL ، باتباع اتجاه الألياف (الشكل 2). بالنسبة للنعل ، اتبع الوتر المركزي ، وقطع ~ 80٪ من طوله. بالنسبة ل EDL ، ما عليك سوى اتباع وتر واحد أو اثنين وقص نفس طول النعل. ضع كل زوج من العضلات في قوارير زجاجية مع 1 مل من محلول التفكك.
    ملاحظة: هذا الإجراء يجعل EDL و soleus أصغر ويسمح للكولاجيناز بدخول الأنسجة بشكل أفضل. التكبير الكافي (40-50x) ، وكذلك المقص والملقط الناعم ، إلزامي. تحقق دائما من سلامة العينة عن طريق الفحص البصري والتحفيز الكهربائي قبل المتابعة إلى الخطوة التالية من بروتوكول التفكك.
  3. أضف 3 ملغ من كولاجيناز النوع 2 (مع نشاط 250-300 وحدة / ملغ) إلى كل قارورة تحتوي على 1 مل من محلول التفكك وزوج من العضلات. توحيد الكمية الدقيقة من كولاجيناز من خلال النظر في نشاط دفعة الإنزيم المستخدمة.
  4. احتضان أزواج العضلات في حمام مائي لمدة 65-90 دقيقة عند 36.8-37 درجة مئوية ، مع هز لطيف.
    ملاحظة: كن صارما مع التحكم في درجة الحرارة. توحيد الإجراء بحيث لا تبقى العضلات في كولاجيناز لأكثر من 100 دقيقة لتجنب الضرر.
  5. تحقق من القوارير تحت تكبير المجسمة كل 5 دقائق بعد 65دقيقة من الحضانة. عندما تبدو العضلات متموجة قليلا وخشنة وفضفاضة ، هز القارورة برفق وتحقق مما إذا كانت بعض الألياف تبدأ في الانفصال بسهولة. إذا كانت هذه هي الحالة ، اغسل العضلات باستخدام Tyrode في درجة حرارة الغرفة لتعطيل وإزالة الكولاجيناز.
    ملاحظة: يجب أن يتم الغسيل بعناية ، دون لمس العضلات بالماصات. ابدأ بإضافة 0.8 مل من التيرود ثم أزل 0.8 مل من المحلول. كرر هذا الإجراء 4-5x وتحقق من أن الحل يصبح شفافا تماما.
  6. افصل المزيد من الألياف عن الجزء الأكبر من العضلات باستخدام تثليج لطيف للغاية في Tyrode بمساعدة مجموعة ماصات باستور المصقولة بالنار. ابدأ بتحريك المحلول حول العضلات باستخدام أوسع ماصة (طرف 5 مم) ثم اسحب العضلات برفق لأعلى داخل وخارج الماصة 3-4x. عندما تبدأ العضلات في إطلاق الألياف وتصبح أرق ، كرر الإجراء باستخدام الماصة التالية (طرف 4 مم).
    ملاحظة: تظل الألياف المقدمة من خلال هذا الإجراء قابلة للإثارة وتتقلص بسرعة لأكثر من 24 ساعة ، كما هو موضح باستخدام ألياف PL و EDL و EHL والألياف النعلية في الفيديو التكميلي S2 والفيديو التكميلي S3 والفيديو التكميلي S4 والفيديو التكميلي S5.

4. الإجراءات التجريبية

ملاحظة: تم استخدام الألياف المعزولة لتقديرات تركيز الساركوبلازم Ca2+ ، والقياسات المورفومترية ، ودراسات تعبير سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC).

  1. قياس الكالسيوم الساركوبلازمي2+ التركيز أثناء نشل
    1. قم بتركيب شريحة زجاجية نظيفة على غرفة الحمام التجريبية. قم بتغطية الشريحة ب 2-3 ميكرولتر من اللامينين واتركها تجف لمدة 30 ثانية قبل صب ~ 400 ميكرولتر من تعليق الألياف على الشريحة. اترك الألياف تلتصق بالصفيحة لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بتركيب الغرفة التجريبية على مرحلة المجهر المقلوب المجهز للتألق (الشكل 3 أ).
    3. استحضر تشنجات مفردة للتحقق من صلاحية الألياف عن طريق تطبيق نبضات تيار مستطيلة (0.8-1.2 مللي ثانية) من خلال قطبين من البلاتين الموضوعين على جانبي الغرفة التجريبية. حتى عند التعلق بالصفيحة ، لا يزال تقلص الألياف مرئيا بشكل رئيسي في أقصى الحدود.
    4. قم بتحميل الألياف ب 3.5-4.5 ميكرومتر من صبغة Ca2+ السريعة Mag-Fluo-4 ، AM لمدة 4-5 دقائق في محلول Tyrode. بعد هذا الوقت ، اغسل بلطف باستخدام Tyrode لإزالة الصبغة خارج الخلية. اسمح بإزالة أسترة الصبغة داخل الخلايا لمدة ~ 15-20 دقيقة في ظل الظروف المظلمة. حافظ دائما على درجة الحرارة أقل من 22 درجة مئوية لتجنب تجزئة الصبغة.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزون من Mag-Fluo-4 ، AM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) فقط ، بحيث يكون التركيز النهائي ل DMSO في محلول Tyrode للتحميل أقل من 0.5٪.
    5. قم بإضاءة الألياف باستخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء الأبيض (LED) ومجموعة مرشح بأطوال موجية التالية للإثارة / ثنائي اللون / الانبعاث: 450-490 / 510/515 نانومتر (الشكل 3 أ).
      ملاحظة: تشمل المصادر البديلة للإثارة مصابيح مضان الزئبق والزينون. استخدم أقل كثافة وحجم ممكن لبقعة الإثارة لتجنب التبييض الضوئي للصبغة وتلف الخلية.
    6. استحضر استجابة Ca2+ للألياف (عابرة SarcoplasmicCa 2+ ) عن طريق تطبيق نبضات تيار مستطيلة (0.8-1.2 مللي ثانية) من خلال قطبين بلاتينيين موضوعين على جانبي غرفة التجارب عند 20-22 درجة مئوية.
    7. اجمع إشارات الضوء واحفظها باستخدام هدف لمسافات طويلة 40x بغمر الزيت مناسب للتألق وأنبوب مضاعف ضوئي (PMT) متصل بجهاز تحويل رقمي (الشكل 3A والفيديو التكميلي S6). تأكد من مقياس في برنامج الاستحواذ من 0-200 وحدة تعسفية (AU) واضبط مضان الراحة (F rest) للتجربة على 10 AU على هذا المقياس عن طريق تعديل حجم بقعة الإثارة وكسب PMT. بمجرد توحيد الإجراء ، احتفظ بالكسب دون تعديل من تجربة إلى أخرى واضبط المقياس فقط من خلال تعديلات طفيفة في حجم البقعة.
      ملاحظة: في حالة ظهور عناصر حركية ، استخدم 20-30 ميكرومتر N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) في محلول Tyrode.
    8. تحليل ومعايرة الإشارات على النحو التالي:
      1. Lowpass تصفية التتبع كله عند 1 كيلو هرتز.
      2. احسب بقية F في 1 ثانية من التتبع ، واضبط بقية F على 0 ، وقم بقياس سعة الذروة الساركوبلازمية Ca2+ العابرة (F peak). قدم السعة كما في المعادلة (1):
        صيغة نسبة شدة التألق ΔF / F = Fpeak / Frest ، معادلة رياضية.(1)
      3. احسب ذروة تركيز Ca2+ ([Ca2+] ، μM) باستخدام المعادلة (2) 26 والمعلمات التالية: ثابت التفكك في الموقع (Kd) = 1.65 ×10 5 μM2 ، الحد الأقصى للتألق (Fmax) 150.9 AU ، الحد الأدنى من التألق (Fmin) من 0.14 AU ، تركيز Mag-Fluo-4 [D] T من 229.1 μM26. تم الحصول على ذروة F بالفعل في الخطوة 4.1.8.2.
        صيغة حساب تركيز الكالسيوم في التحليل الكيميائي الحيوي ، تظهر معادلة التوازن.(2)
      4. قم بقياس وقت الارتفاع من 10٪ إلى 90٪ من السعة (RT ، ms) ، والمدة بنصف الحد الأقصى (HW ، ms) ، ووقت الاضمحلال من 90٪ إلى 10٪ من السعة (DT ، ms). بعد ذلك ، قم بتقدير حركية الاضمحلال وفقا لتناسب الدالة الأسية الثنائية (المعادلة 3):
        صيغة الاضمحلال الأسي ، الرسم البياني ، تحليل ملاءمة البيانات ، نمذجة الديناميكيات العابرة.(3)
      5. احفظ قيم الثوابت الزمنية للاضمحلال τ1 و τ2 (مللي ثانية) والسعات A1 و A226.
  2. القياسات المورفومترية
    1. قم بتركيب شريحة زجاجية نظيفة على غرفة الحمام التجريبية. قم بتغطية الشريحة ب 2-3 ميكرولتر من اللامينين واتركها تجف لمدة 30 ثانية قبل صب ~ 400 ميكرولتر من تعليق الألياف على الشريحة. اترك الألياف تلتصق بالصفيحة لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. استحضر تشنجات مفردة للتحقق من صلاحية الألياف عن طريق تطبيق نبضات تيار مستطيلة (0.8-1.2 مللي ثانية) من خلال قطبين من البلاتين الموضوعين على جانبي الغرفة التجريبية. حتى عند التعلق بالصفيحة ، لا يزال تقلص الألياف مرئيا بشكل رئيسي في أقصى الحدود.
    3. احصل على صور للألياف الحية باستخدام أهداف 10x و 20x وكاميرا لا تقل عن 5 ميجابكسل مثبتة على مجهر مضان مقلوب. قم بتخزين الصور في . تنسيق TIFF للتحليلات غير المتصلة بالإنترنت.
      ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى مجموعة من الصور ~ 2-6 لالتقاط ألياف طويلة تماما.
    4. قم بتصوير مسطرة معايرة ميكرومتر مجهري تحت نفس التكبير. قم بتخزين الصور في . تنسيق TIFF للتحليلات غير المتصلة بالإنترنت.
    5. قم بقياس أطوال وأقطار الألياف باستخدام أداة المعايرة الخاصة بالبرمجيات الحرة لتحليل الصور على النحو التالي:
      1. قم بإنشاء علاقة بين وحدات البكسل والمسافة المعروفة (ميكرومتر) في الصور بمساعدة مسطرة معايرة ميكرومتر المجهر باستخدام أداة تحليل / تعيين المقياس كما هو موضح في الشكل التكميلي S1.
      2. قم بقياس الأطوال مرة واحدة من طرف إلى آخر من الألياف والأقطار في 2-6 أماكن مختلفة على طول الألياف (1-2 قياسات لكل صورة ، اعتمادا على طولها) ، كما في الشكل التكميلي S1.
      3. أبلغ عن قيمة الطول (ميكرومتر أو مم) ومتوسط جميع الأقطار (ميكرومتر) المقاسة لكل ألياف.
  3. دراسات التعبير عن سلسلة الميوسين الثقيلة
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول تحديد MHC بواسطة التألق المناعي43 وثنائي الصوديوم كبريتات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE)33،44،45،46 في العضلات الكاملة ، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1. بروتوكول كتابة الألياف عن طريق تحديد التألق المناعي ل MHC في تعليق الألياف المعزولة FDB هو كما يلي:
    1. قم بتغطية كل شريحة من خمس شرائح زجاجية نظيفة ب 2-3 ميكرولتر من اللامينين واتركها تجف لمدة 30 ثانية قبل صب ~ 300 ميكرولتر من تعليق الألياف على كل شريحة. اسمح للألياف بالالتصاق بالصفيحة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    2. ثبت المستحضرات باستخدام الأسيتون المبرد بالمجمد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. يغسل بلطف 3x مع برنامج تلفزيوني.
    4. تتخلل أغشية الخلايا مع برنامج تلفزيوني مكمل ب 0.7٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. اغسل بلطف 3 مرات مع PBS المكمل ب 0.2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 0.04٪ Triton X-100 ، ثم قم بحظره باستخدام PBS مع 2٪ BSA و 2٪ مصل الماعز و 0.4٪ Triton X-100 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. اغسل بلطف 3x مع PBS المكمل ب 0.2٪ BSA و 0.04٪ Triton X-100 واحتضانه بالأجسام المضادة الأولية على النحو التالي:
      1. قم بتخفيف كل جسم مضاد أولي مضاد ل MHC في قنينة منفصلة في PBS مع 1٪ BSA و 0.04٪ Triton X-100: anti-I (1: 1,500) ، anti-II (1: 600) ، anti-IIA (استخدم وسائط مكيفة بالكامل من الورم الهجين) ، ومضاد IIB (1: 500).
      2. احتضان كل شريحة بجسم مضاد واحد والشريحة المتبقية مع برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم لمدة 12-16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: في هذا البروتوكول ، ظلت الألياف من النوع IIX غير مصنفة في جميع العينات.
    7. اغسل بلطف 3x باستخدام برنامج تلفزيوني واحتضن جميع الشرائح بالجسم المضاد الثانوي (1: 800) مقترنا بجزيء أخضر فلوري لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. صبغ النوى ب 1 ميكروغرام / مل Hoechst لمدة 15 دقيقة.
    9. اغسل بلطف 3x باستخدام PBS ، وأضف بعناية 20-40 ميكرولتر من وسط التركيب ، وضع غطاء الغطاء.
      ملاحظة: يضمن تبادل المحلول اللطيف والغسيل بقاء عشرات الألياف ملتصقة بالشريحة ، مما يجعل التجربة سليمة إحصائيا.
    10. تصور كل شريحة باستخدام هدف 10x مناسب للتألق ومجموعة مرشح بأطوال موجية التالية للإثارة / ثنائي اللون / الانبعاث: 450-490 / 510/515 نانومتر وعد جميع الألياف الإيجابية والسالبة. بدلا من ذلك ، احصل على صور مضان باستخدام نفس الشروط التقنية وكاميرا لا تقل عن 5 ميجابكسل مثبتة على مجهر مضان مقلوب وتخزينها في . تنسيق TIFF للتحليلات غير المتصلة بالإنترنت.
    11. سجل الألياف الموجبة والسالبة لكل شريحة في قاعدة بيانات واحسب النسب المئوية للألياف الموجبة I و IIA و IIB وإجمالي II بناء على إجمالي عدد الألياف الموجودة في الشريحة المقابلة. احسب النسبة المئوية لألياف IIX بطرح مجموع IIA + IIB من النسبة المئوية لإجمالي ألياف II. قم بتقدير النسبة المئوية للألياف الهجينة I / IIA بطرح مجموع I + II من قيمة 100٪. وأخيرا، اطرح النسبة المئوية للخلايا الهجينة من إجمالي النوعين الأول والثاني للحصول على الألياف النقية من النوعين الأول والثاني.
      ملاحظة: في دراسات تكوين MHC ، يتم تعيين أنواع الألياف بحرف كبير بينما يتم تعيين الأشكال المتساوية بحرف صغير46.
  4. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين
    1. قم بتغطية شريحة زجاجية نظيفة ب 2-3 ميكرولتر من اللامينين واتركها تجف لمدة 30 ثانية قبل صب ~ 300 ميكرولتر من تعليق الألياف على الشريحة. اسمح للألياف بالالتصاق بالصفيحة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    2. ثبت المستحضر بمحلول كارنوي (60٪ إيثانول مطلق ، 30٪ كلوروفورم ، 10٪ حمض أسيتيك) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان مع الهيماتوكسيلين لمدة 90 ثانية.
    4. اغسل بلطف 3 مرات بماء الصنبور.
    5. احتضان مع 1 ٪ eosin Y أعدت في 70 ٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية.
    6. اغسل بلطف 3 مرات بماء الصنبور.
    7. اغمر 3x في الإيثانول المطلق.
    8. احتضان في زيلول لمدة 60 ثانية.
    9. أضف 20-40 ميكرولتر من وسيط التركيب وتصور باستخدام المجهر التقليدي. احصل على صور بالتكبير المطلوب باستخدام كاميرا ملونة لا تقل عن 5 ميجابكسل.

5. التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية

ملاحظة: الوحدة التجريبية عبارة عن ألياف عضلية.

  1. التعبير عن النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري وحساب فترات الثقة 95٪ (CI95٪) لبعض التحليلات.
  2. لمقارنة الطول والقطر وحركية عابري Ca2+ بين المجموعات ، قم بإجراء تحليل التباين (ANOVA) والاختبارات اللاحقة مع تصحيح Bonferroni.
  3. قم بتقييم المساواة في الحالة الطبيعية والتباين باستخدام اختبارات Shapiro-Wilk و Levene ، على التوالي.
  4. ضع في اعتبارك الاختلافات المهمة عندما < p 0.05.

Representative Results

تركيز الساركوبلازمCa 2+ أثناء الارتعاش
لإثبات جدوى التجارب الفسيولوجية في مجموعة الألياف المنفصلة ولتوسيع نتائجنا السابقة حول اقتران الإثارة والانكماش (ECC) وأنواع الألياف ، تم الحصول على Ca2+ transients في الألياف من جميع العضلات. أولا ، أظهر FDB (n = 5) و EDL (n = 7) حركية Ca2+ المعروفة باسم النوع المورفولوجي II (MT-II). هذه إشارات سريعة وشائكة ، تدوم RT ~ 1 مللي ثانية ؛ يمكن تزويد طور اضمحلالها بدالة ثنائية الأس مع المكون الأول (A1) أكبر من 30٪ من السعة الكلية ، وذروتها [Ca2+] تتراوح بين 15 و 30 ميكرومتر33,47 (الشكل 3B). يتم تجميع نتائجهم (n = 12) في العمود الأول من الجدول 1 ، بينما يتم عرض نتائج العابرين Ca2+ (n = 6) في العمود الثاني من الجدول 1. تم تصنيف إشارات النعل على أنها نوع مورفولوجي من النوع الأول (MT-I ، الشكل 3B) - أوسع ، مع RT أكثر من 1.2 مللي ثانية ، A1 أقل من 30٪ ، وذروة [Ca2+] بين 7 و 13 ميكرومتر33,47. تم اعتبار هذين العمودين كمراجع لمقارنة عابرات الكالسيوم2+ للعضلات الجديدة. نظرا لأن جميع الألياف من PDQA (n = 4) و PL (n = 6) و EHL (n = 4) تشترك في MT-II (الشكل 3B) ، يتم تجميع بياناتها (n = 14) في العمود الثالث من الجدول 1. أظهرت هذه الإشارات متوسط RT ~ 1 مللي ثانية ، A1 ~ 45٪ ، ذروة [Ca2+] أكثر من 15 ميكرومتر ، وتقارن جيدا بالنتائج المعروضة في العمود الأول ولكنها تختلف بوضوح عن تلك الموضحة في العمود الثاني ، كما أكد التحليل الإحصائي (الجدول 1). جاءت أسرع إشارة للعينة بأكملها من ألياف EHL ، مع ΔF / F من 0.66 ، [Ca2+] من 16.99 μM ، RT من 0.85 مللي ثانية ، HW من 2.42 مللي ثانية ، و DT من 10.56 مللي ثانية. كانت τ1 و τ2 1.63 و 7.21 مللي ثانية على التوالي ، بينما كانت قيم A1 و A2 56.60٪ و 43.40٪. جاءت أبطأ إشارة من الألياف النعلية ، مع ΔF / F من 0.41 ، [Ca2+] من 9.76 μM ، RT من 1.56 مللي ثانية ، HW من 9.43 مللي ثانية ، و DT من 31.88 مللي ثانية. كانت τ1 و τ2 2.81 و 96.42 مللي ثانية على التوالي ، بينما كانت قيم A1 و A2 19.55٪ و 80.45٪. 

بطارية من الألياف القصيرة والمتوسطة والطويلة
مكنت ملاحظة الاختلافات الواضحة بين الألياف وفقا لمصدر عضلاتها من توصيف مورفومتري أكثر اكتمالا. توضح الرسوم البيانية في الشكل 4 اختلافات مذهلة في أطوال الألياف عبر جميع العضلات. يتم تسليط الضوء على ذلك عند مقارنة أقصر ألياف من FDB (227.06 ميكرومتر) مع أطول ألياف من النعل (5.69 مم). ويرد في الجدول 2 موجز لقيم متوسط الطول. كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (p < 0.01). تسمح هذه النتائج بتصنيف ألياف FDB على أنها قصيرة (<1 مم) ؛ PDQA و PL كوسيط (1 إلى 3 مم) ؛ و EDL و EHL و soleus بطول (>3 مم) (الشكل التكميلي S2).

على العكس من ذلك ، لوحظت اختلافات طفيفة في متوسط أقطار ألياف جميع العضلات (الجدول 2) وتوزيع القيم (الشكل 4). ومع ذلك ، كانت هناك فروق إحصائية ذات دلالة إحصائية بين المجموعات (ص < 0.01). عند تقييمها بالتفصيل ، كانت هناك اختلافات بين FDB والعضلات الأخرى وبين FDB (FDB 38.40 ± 9.40 μm ، n = 370) ومجموعة الألياف المتوسطة والطويلة (45.07 ± 9.99 ميكرومتر ، n = 422 ، p < 0.05). أنحف خلية في العينة بأكملها بقياس 18.42 ميكرومتر (FDB) وسمكها وصل إلى 82.79 ميكرومتر (PDQA).

أنواع الألياف المستخدمة في التجارب الفسيولوجية
أولا ، تم تحديد أنواع الألياف الموجودة في كل عضلة كاملة عن طريق التألق المناعي. باستثناء النعل ، أظهرت العضلات غلبة أكثر من 76 ٪ من ألياف النوع الثاني (الشكل التكميلي S3 ، الجدول 3 ، والجدول 4). EHL و PL و PDQA هي عضلات سريعة بشكل خاص ، مع أكثر من 90٪ من الألياف السريعة وما يصل إلى 58.8٪ من ألياف النوع IIB ، كما هو موجود في PDQA. كانت EHL و PDQA خالية تقريبا من ألياف النوع الأول. كانت ألياف I / IIA الهجينة موجودة في جميع العضلات بنسب منخفضة. كما هو متوقع ، شكلت ألياف النوع الأول و IIA أكثر من 82 ٪ من إجمالي ألياف النعل. هذه العضلات خالية تقريبا من أسرع ألياف IIB. وفقا لملف تعريف أنواع الألياف ، فإن النعل هو الأبطأ و PDQA هو أسرع عضلة من بين العضلات الستة التي تم تحليلها.

بعد ذلك ، ولأنه أكثر صلة بالتجارب الفسيولوجية أحادية الألياف ، تم تناول مسألة أنواع الألياف التي تظهر في تعليق الخلية المشتق من FDB المنفصل. وجد أن ملف تعريف الألياف في تعليق الخلية يعكس تكوين الألياف الموجودة في عمليات التجميد بالتبريد: ثلاثة من أصل أربعة ألياف منفصلة كانت من النوع الثاني (الشكل 5 والجدول 3).

أخيرا ، تم تأكيد تكوين العضلات عن طريق فصل أشكال MHC من خلال SDS-PAGE. كانت النتائج متسقة مع النمط العام الذي لوحظ في مقايسات التألق المناعي. تم إثراء النعل في MHC IIa و I ، بينما تم إثراء EDL و EHL و peronei في MHC IIx و IIb ولكنها كانت خالية من I (الشكل التكميلي S4).

إعداد الفحص المجهري والفيزيولوجيا الكهربية مع تشريح الحشرات للتحليل العصبي والتصوير الفلوري.
الشكل 1: تصميم الدراسة. (أ) المعدات والحلول التي يجب إعدادها قبل البدء في إجراء التشريح. 1. المجسمة رقم واحد. 2. من الأسفل إلى الأعلى: مجموعة من خمس ماصات مصقولة بالنار وأدوات تشريح وقوارير كولاجيناز داخل مبرد محمول (علبة صفراء). 3. حالة التصفية ، غرفة التشريح ، قوارير زجاجية موسومة بغطاء ، رف مع حلول مفلترة. 4. أدوات التشريح. 5. مجسمة مع غرفة تشريح أرقام اثنين مقترنة بكاميرا ومحفز كهربائي. ب: إجراء تشريح مجموعة من ست عضلات خلفية للفئران كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الشكل 2. (ج) بعد التشريح ، يجب التحقق من تقلص العضلات وسلامتها قبل المتابعة إلى خطوة البروتوكول التالية. تظهر العضلة اليسرى في اللوحة اليسرى عضلة PL متموجة ومفرطة الانقباض وغير مستجيبة (سهم أزرق) ، والتي لا يجوز استخدامها للحصول على ألياف منفصلة. بدلا من ذلك ، يجب تحسين بروتوكول التشريح والبدء من جديد. يعرض نظير PL الذي تم تشريحه جيدا (العضلة اليمنى في اللوحة اليسرى) مظهرا ممدودا وينقبض بشكل واضح (الفيديو التكميلي S1). تظهر اللوحة الموجودة على اليمين عضلتين EDL (السهم الأزرق) وعضلتين FDB داخل محلول كولاجيناز بمظهر صحيح ومستقيم. (د) بمجرد تفكك العضلات، صب الألياف المعزولة في غرفة التجارب وتحقق من انقباضها وسلامتها. على اللوحة اليسرى ، يعيش (السهم الأزرق) وألياف PL الميتة. على اللوحة اليمنى ، حية (السهم الأزرق) وألياف EDL الميتة. (E-G) تم إجراء ثلاث مجموعات من التجارب مع الألياف المعزولة: (E) قياسات تركيز Sarcoplasmic Ca2+ أثناء الارتعاش (النتائج في الشكل 3). (و) التحليلات المورفومترية (النتائج معروضة في الشكل 4). يوضح هذا المثال ألياف PL. (ز) التألق المناعي لدراسات التعبير المتسلسل الثقيل للميوسين (النتائج موضحة في الشكل 5). يوضح هذا المثال ألياف FDB معزولة. قضبان المقياس = 5 مم (B ، C) ، 100 ميكرومتر (D ، F ، G). الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عملية عزل ألياف العضلات ، صور مجهرية توضح تشريح FDB ، Soleus ، EDL ، EHL ، PL ، PDQA.
الشكل 2: المراجع التشريحية والإجراءات العامة لتشريح مجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. تقدم الصفوف ، من أعلى إلى أسفل ، العضلات وفقا لأفضل ترتيب للتشريح: FDB و soleus و EDL و EHL و PL و PDQA. تعرض الأعمدة ، من اليسار إلى اليمين ، المعالم أثناء التشريح. يظهر العمود الأول العضلات أو الأوتار البعيدة مكشوفة حتى يبدأ التشريح. على سبيل المثال ، تشير الأسهم الزرقاء إلى FDB و soleus في الموقع وإلى الأوتار البعيدة ل EDL. يوضح العمودين التاليين التشريح نفسه والعضلات المكشوفة بعد قطع الوتر (الأوتار) البعيدة، كما هو مذكور، على سبيل المثال، بالسهم الأزرق في صف EDL. يوصى بإزالة فرع FDB الموجه إلى الرقم الخامس. يعرض العمود الموجود في أقصى اليمين العضلات بمجرد إزالتها بالكامل ، مع توجيه الأوتار القريبة إلى الجزء العلوي من الصور. توضح الخطوط الزرقاء المتقطعة (أقصى العمود الأيمن) الجروح الطولية أو القطرية التي يجب إجراؤها في عضلات النعل و EDL لضمان دخول الكولاجين إلى حجمها. قضبان المقياس = 5 مم. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة ؛ PDQA = peroneus digiti quarti. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد الفحص المجهري البصري والرسوم البيانية لاضمحلال التألق ؛ معدات لدراسات الإثارة البصرية.
الشكل 3: Ca2+ عابرة مسجلة في ألياف تم الحصول عليها من مجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. (A) الإعداد المستخدم لاقتناء عابرات Ca2+ تحت الإضاءة الخافتة. اللوحة اليسرى: 1. PMT متصل بمجهر مضان مقلوب (2). 3. الكاميرا مقترنة بالمجهر. 4. محفز كهربائي مقترن بغرفة التجارب. 5. يمكن استخدام نظام المعالجة الدقيقة عند التخطيط لفحوصات الفيزيولوجيا الكهربية والحقن لاستكمال اكتساب العابرين Ca2+ . اللوحة الوسطى: يتم تثبيت الغرفة التجريبية (إدراج) مع الخلايا المحملة على مرحلة المجهر وتضيء بالضوء الأزرق (450-490 نانومتر ، السهم الأزرق) لإثارة الصبغة. في هذا الإعداد ، يتم وضع العناصر من 1 إلى 5 فوق طاولة مضادة للاهتزاز وداخل قفص فاراداي. اللوحة اليمنى: بمجرد التحقق من جودة الانكماش وتحميل الصبغة باستخدام الكاميرا (6) ، يتم توجيه الضوء المنبعث إلى PMT ، ويبدأ التحفيز الكهربائي ، ويتم تغذية الإشارة إلى جهاز التحويل الرقمي (7) وإلى برنامج الاستحواذ (8) لتسجيل عابر Ca2+ . يمكن رؤية الوظيفة المتكاملة لهذه العناصر أثناء التجربة الحية في الفيديو التكميلي S6. (ب) عابرات Ca2+ التمثيلية والمعايرة من ألياف الفأر FDB و PDQA و PL و EDL و EHL و Soleus. تؤكد الإشارات المتشابهة والسريعة والضيقة ل FDB و PDQA و PL و EDL و EHL أن لديهم MT-II المعروف بالفعل أنه مشتق من ألياف IIX و IIB ، وهي الأكثر وفرة في هذه العضلات. في المقابل ، يكون النعل العابر أبطأ وأصغر ، وهو نموذجي ل MT-I ، الموصوف أصلا في ألياف I و IIA. يوضح المنحنى الأحمر فوق إشارات EDL و soleus أنه يمكن تزويد مرحلة الاضمحلال ل MT-I و MT-II بوظيفة اضمحلال أسي ثنائي. تنطبق قضبان المعايرة على جميع اللوحات. الشريط الرأسي = 2.5 ميكرومتر من [Ca2+] ، الشريط الأفقي = 10 مللي ثانية. يساعد مفتاح اللون في الأسفل على تحديد العضلات. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة ؛ PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ MT-I = النوع المورفولوجي الأول ؛ MT-II = النوع المورفولوجي الثاني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صور الفحص المجهري للألياف العضلية ؛ الرسوم البيانية لتحليل طول الألياف وقطرها.
الشكل 4: القياسات المورفومترية للألياف القصيرة والمتوسطة والطويلة التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لمجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. يتم تصوير ألياف سليمة وصحية وتمثيلية من كل عضلة في ألواح العمود الموجودة في أقصى اليسار. تم تحرير الصور فقط لتقليل ضوضاء الخلفية وتعزيز التباين ، دون أي تلاعب مباشر بألياف العضلات. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (جميع الألواح). يمكن الاطلاع على بروتوكول القياس ، بالإضافة إلى مظهر وجودة الألياف الطويلة الكاملة ، في الشكل التكميلي S1. يوضح العمود الأوسط توزيعات الأطوال ، مرتبة من العضلة التي قدمت أقصر ألياف (FDB) ، إلى العضلة التي تحتوي على أطول ألياف (النعل). هناك سلسلة متصلة من الأطوال بحيث يكون هناك بعض التداخل بين العضلات ، تمتد على ما مجموعه ~ 5.5 ملم. يتم عرض توزيعات القطر في لوحات الأعمدة الموجودة في أقصى اليمين. تتراوح معظم الألياف بين 30 و 60 ميكرومتر ، مع وجود اختلافات صغيرة بين العضلات. أظهرت تحليلات الاختبار وإعادة الاختبار (n = 78 ألياف، أي ما يعادل 9.85٪ من العينة الكاملة n = 792) للقياسات المورفومترية قابلية عالية جدا للتكاثر (متوسط معامل الاختلاف 1.77٪ - فاصل الثقة 95٪، CI95٪، 1.26-2.27٪ - متوسط معامل الارتباط 0.99 (CI95٪ 0.98-0.99)) ، مما يبرز الموثوقية الجيدة للنتائج. تمت إضافة منحنيات التوزيع الغاوسية مع الرسوم البيانية المرخصة للبرامج. يوضح الشكل التكميلي S2 مخططات شريطية لمتوسط قيم الطول والقطر ودمج توزيعات الطول والقطر لجميع العضلات لتسهيل المقارنة. مفتاح اللون في الأسفل يساعد على تحديد العضلات. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL ، = الهلوسة الباسطة الطويلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفحص المجهري الفلوري لألياف العضلات. تظهر الرسوم البيانية A-D الهياكل الخلوية وعلامات البروتين.
الشكل 5: مقايسات التألق المناعي لأنواع الألياف في معلق الخلية في عضلات FDB المنفصلة. تظهر صور الحقول المختلفة ألياف FDB سليمة ومنفصلة ملتصقة بأسفل الشرائح. (أ) تتناقض الألياف الإيجابية لمضاد الميوسين II (مضان أخضر ، سهم أزرق فاتح قطري) بوضوح مع الألياف السلبية (رأس سهم أزرق فاتح) ، مما يدل على قوة التمييز للفحص. يمكن تأكيد وجود كلا الأليافين في الصورة بسبب وضع العلامات على النوى (مضان أزرق). (ب) يوضح حقل مختلف ليفة أخرى موجبة لمضاد الميوسين II. (ج) تم تأكيد التحديد الصحيح لسلسلة الميوسين الثقيلة في النطاقات A (التألق الأخضر) بواسطة الأجسام المضادة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تتوافق التشققات السوداء المستعرضة الأكثر شهرة مع النطاقات I ، المخصبة في الأكتين ، وبالتالي من المتوقع ألا تتعرف عليها الأجسام المضادة. (د) يسمي الهيماتوكسيلين باللون الأرجواني النوى الطرفية النموذجية الوفيرة، ويسمي اليوزين ساركوبلازم الليف، وهو ما يوضح خلية ناضجة سليمة. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (أ ، ب ، د) ؛ 10 ميكرومتر (ج). اختصار: FDB = flexor digitorum brevis. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الياف FDB و EDL سوليوس PDQA و PL و EHL p
n 12 6 14
ΔF/F 0.68±0.15 0.46±0.06*,† 0.66±0.12 <0.01
[كاليفورنيا2+] (ميكرومتر) 17.46±5.18 11.14±1.86*,† 16.82±3.29 <0.01
RT (مللي ثانية) 0.95±0.10 1.26±0.20*,† 0.95±0.09 <0.01
ارتفاع المنحدر (F / مللي ثانية) 5.97±1.41 3.12±0.79*,† 5.83±0.97 <0.01
HW (مللي ثانية) 3.59±0.85 8.17±3.00*,† 3.19±0.54 <0.01
DT (مللي ثانية) 16.98±7.37 27.26±7.13*,† 11.32±2.06* <0.01
منحدر الاضمحلال (F / مللي ثانية) -0.24±0.07 -0.10±0.03*,† -0.35±0.08* <0.01
τ1 (مللي ثانية) 1.86±0.37 2.07±0.66† 1.57±0.18 <0.05
τ2 (مللي ثانية) 11.50±3.93 46.38±27.14*,† 8.29±2.14 <0.01
أ1 (٪) 48.14±7.27 25.94±8.98*,† 44.59±8.29 <0.01
أ2 (٪) 51.86±7.27 74.06±8.98*,† 55.41±8.29 <0.01
مورفولوجيا MT-II إم تي آي MT-II

الجدول 1: حركية Ca2+ العابرة في الألياف المنفصلة إنزيميا التي تم الحصول عليها من مجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. القيم هي متوسط ± الانحراف المعياري. تتوافق قيم p مع تحليل اختبار التباين. *تختلف اختلافا كبيرا عن مجموعات FDB و EDL. †تختلف اختلافا كبيرا عن مجموعات PDQA و PL و EHL. الاختصارات: F = مضان. [Ca2+] = تركيز Ca2+ ذروة الخلايا الخلوية ؛ RT = وقت الارتفاع ؛ HW = المدة بنصف الحد الأقصى ؛ DT = وقت الاضمحلال ؛ τ1 و τ2 = ثوابت زمنية للاضمحلال ؛ A1 و A2 = سعة الاضمحلال ؛ FDB = flexor digitorum brevis ؛ PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة ؛ MT-I = النوع المورفولوجي الأول ؛ MT-II = النوع المورفولوجي الثاني.

الياف إف دي بي PDQA رر مؤسسة كهرباء لبنان EHL سوليوس p
n 370 142 80 70 87 43
الطول (مم) 0.42±0.05* 2.20±0.26** 2.69±0.26† 3.51±0.53†† 3.83±0.44‡ 4.62±0.64 <0.01
القطر (ميكرومتر) 38.40±9.40* 46.39±9.50¶ 45.98±11.18 44.43±7.62 41.96±9.16 46.36±12.85 <0.01

الجدول 2: القياسات المورفومترية للألياف القصيرة والمتوسطة والطويلة التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لمجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. القيم هي متوسط ± الانحراف المعياري. تتوافق قيم p مع تحليل اختبار التباين. *يختلف إحصائيا عن PDQA و PL و EDL و EHL و SOLEUS. **يختلف اختلافا كبيرا عن PL و EDL و EHL و SOLEUS. †تختلف اختلافا كبيرا عن EDL و EHL و soleus. ††تختلف اختلافا كبيرا عن EHL والنعل. ‡تختلف اختلافا كبيرا عن النعل. ¶تختلف اختلافا كبيرا عن EHL. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة.

العضلات / الألياف N n مجموع النوع الأول + الأول/الإدخال الأولي (٪) إجمالي النوع الثاني (٪)
إف دي بي 5 747 21.94±11.47 78.06±11.47
*إف دي بي 8 1483 23.46±2.51 76.54±2.51

الجدول 3: أنواع الألياف في عمليات الاستئصال بالتبريد وفي تعليق الخلية في عضلات FDB المنفصلة للفأر. القيم هي متوسط ± الانحراف المعياري. يشير N إلى عدد ، بينما يشير n إلى العدد الإجمالي للألياف التي تم تحليلها في التجارب. يقدم صف FDB بيانات العضلة بأكملها كما هو محدد في عمليات الاستئصال بالتبريد ، بينما يتوافق صف * FDB مع الألياف المعزولة في تعليق الخلية بعد فصل العضلات. يعكس عمود "النوع الإجمالي الثاني" الألياف النقية من النوع IIA و IIX و IIB. اختصار: FDB = flexor digitorum brevis.

عضل N n النوع الأول (٪) النوع الأول/المدخل الدولي (٪) النوع IIA (٪) النوع IIX (٪) النوع IIB (٪) إجمالي النوع الثاني (٪)
PDQA 4 597 0.00±0.00 10.15±2.62 19.33±6.19 11.68±7.57 58.84±7.63 89.85±2.62
رر 4 576 3.44±3.94 2.04±2.48 23.01±7.03 35.85±5.66 35.66±9.36 94.52±3.90
مؤسسة كهرباء لبنان 4 826 0.00±0.00 10.44±8.33 5.67±5.07 24.75±10.93 59.15±11.36 89.56±8.33
EHL 5 618 0.24±0.76 5.29±3.31 19.04±6.83 21.18±10.91 54.25±11.73 94.47±3.05
سوليوس 4 729 32.18±4.48 1.74±1.30 50.37±7.46 14.58±6.94 1.12±1.93 66.08±5.59

الجدول 4: أنواع الألياف في المقاطع البردية للعضلات التي تعطي أليافا متوسطة وطويلة من الفأر. القيم هي متوسط ± الانحراف المعياري. يشير N إلى عدد ، بينما يشير n إلى العدد الإجمالي للألياف التي تم تحليلها في التجارب. تقدم جميع الصفوف بيانات عن العضلات بأكملها كما هو محدد في عمليات الاستئصال بالتبريد. تعكس أعمدة النوع I و IIA و IIX و IIB أليافا نقية ، بينما يشير العمود I / IIA إلى الألياف الهجينة. عمود "إجمالي النوع II" هو مجموع الأعمدة من النوع IIA و IIX و IIB. الاختصارات: PDQA = peroneus digiti quarti; PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة.

الملف التكميلي 1: دراسات التعبير عن سلسلة الميوسين الثقيلة في العضلات بأكملها. تقدم البروتوكولات تفاصيل لتحديد أشكال سلسلة الميوسين الثقيلة عن طريق التألق المناعي في عمليات التجميد وعن طريق الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل بولي أكريلاميد الصوديوم في متجانسات العضلات بأكملها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: تفاصيل مورفولوجيا الألياف التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لمجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. (أ) تظهر مسطرة معايرة المجهر المجهري المفتوحة لضبط المقياس في برنامج تحليل الصور على اليسار. توضح اللوحة اليمنى كيف تم قياس القطر بشكل متكرر كما هو موضح بالخطوط الزرقاء المتعامدة مع المحور الطويل للألياف (الأسهم الزرقاء) ، بينما تم قياس الطول مرة واحدة من طرف إلى طرف كما هو موضح بالخط الأزرق على طول المحور الرئيسي للألياف. (ب) تم تجميع العديد من الصور مع تحرير طفيف لإثبات المظهر الطويل والصحي لألياف PDQA و PL و EDL و EHL والألياف النعلية (إدخالات صغيرة باللون الأزرق والأخضر والأصفر والبرتقالي والوردي). تم تحرير الصور المجمعة بشكل أكبر لإعطاء الألياف مظهرا أفضل (صور كبيرة وسوداء وبيضاء). (ج) صور مدينة دبي للإنترنت للألياف FDB و PDQA و PL والألياف الوحيدة التي تسلط الضوء على عدم انتظام طرفها الطبيعي وتشققاتها المستعرضة المعروفة. يمكن رؤية مظهر DIC لألياف EDL و EHL المتبقية في الفيديو التكميلي S3 والفيديو التكميلي S4. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يساعد مفتاح اللون في الأسفل على تحديد العضلات. الاختصارات: FDB ، flexor digitorum brevis ؛ PDQA, peroneus digiti quarti; PL ، بيرونيوس لونجوس ؛ EDL ، الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL ، الهلوسة الباسطة الطويلة ؛ DIC = تباين التداخل التفاضلي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: مخططات الشريط وتوزيعات الطول والقطر المدمجة للألياف التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لمجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. (أ) تؤكد المخططات الشريطية (متوسط ± الانحرافات المعيارية) و (ب) الرسوم البيانية المدمجة تباين الأطوال ولكن تشابه الأقطار عبر جميع المجموعات. *يختلف اختلافا كبيرا عن PDQA و PL و EDL و EHL و SOLEUS. **يختلف اختلافا كبيرا عن PL و EDL و EHL و SOLEUS. †تختلف اختلافا كبيرا عن EDL و EHL و soleus. ††تختلف اختلافا كبيرا عن EHL والنعل. ‡تختلف اختلافا كبيرا عن النعل. ¶تختلف اختلافا كبيرا عن EHL. يساعد مفتاح اللون في الأسفل على تحديد العضلات. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: دراسات التألق المناعي لتكوين نوع الألياف لمجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. تظهر عمليات التجميد التمثيلية الموسومة بالأجسام المضادة المستخدمة في التحليلات الجودة الجيدة للعينات وسلامتها. هناك غلبة واضحة للألياف من النوع الثاني في جميع العضلات ، باستثناء النعل الذي تكون فيه كمية الألياف من النوع الأول كبيرة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يساعد مفتاح اللون في الأسفل على تحديد العضلات. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: الفصل الكهربائي لأشكال MHC في مجموعة من ست عضلات خلفية للفأر. (أ) يعمل نوعان من المواد الهلامية الكاملة التمثيلية في أيام مختلفة مع عينات مختلفة توضح جودة ونظافة وقابلية استنساخ مسافة الفصل والهجرة لأشكال MHC عند تلوينها باللون الأزرق Coomassie. على الرغم من أن هاتين الصورتين تم تحريرهما قليلا لتعزيز التباين والوضوح للقارئ ، فقد تم إجراء التحليلات في مواد هلامية غير محررة. ب: أمثلة على تحليل الأربطة لكل عضلة من العضلات الست. بعد تحديد عائد الاستثمار في ممرات الجل ، يتم إنشاء ملف تعريف مؤامرة ويتم استخدام نوبة Gaussian لتقدير نسبة أشكال MHC في مجموعة من ست عضلات. تكوين MHC الذي تم العثور عليه كان: FDB: I 9.0 ± 5.0٪ ، IIa + IIx 91.0 ± 5.0٪ (n = 3) ؛ PDQA: IIa + IIx 25.9 ± 2.4٪ ، IIb 74.1 ± 2.4٪ (ن = 3) ؛ PL: IIa + IIx 24.9 ± 2.2٪ ، IIb 75.1 ± 2.2٪ (ن = 3) ؛ EDL: IIa + IIx 22.0 ± 2.3٪ ، IIb 78.0 ± 2.3٪ (ن = 4) ؛ EHL: IIa + IIx 27.5 ± 1.0٪ ، IIb 72.5 ± 1.0٪ (ن = 3) ؛ النعل: I 35.8 ± 2.5٪ ، IIa (+IIx + IIb عند وجوده) 64.2 ± 2.5٪ (ن = 4). يساعد مفتاح اللون في الأسفل على تحديد العضلات. يشير المستطيل الرمادي أسفل الهلام الموجود في أقصى اليمين في A إلى علامة الوزن الجزيئي التي تشير إلى هجرة IIa إلى ~ 200 KDa. الاختصارات: FDB = flexor digitorum brevis; PDQA = بيرونيوس ديجيتي كوارتي ؛ PL = بيرونيوس لونجوس ؛ EDL = الباسطة الرقمية الطويلة ؛ EHL = الهلوسة الباسطة الطويلة ؛ MHC = سلسلة الميوسين الثقيلة. عائد الاستثمار = منطقة الاهتمام. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي S1: لا ينقبض البيرونوس الطويل التالف والمموج (PL ، يسار) عند التحفيز ، بينما ينقبض PL السليم (الأيمن) جيدا ، حتى عندما يكون بعيدا عن الأقطاب الكهربائية. تكبير 0.8x. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.7 هرتز و 50 فولت من خلال قطبين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي S2: التعاقد مع ألياف بيرونيوس لونجوس. تكبير 20x. وضع تباين التداخل التفاضلي. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.5 هرتز و 50 فولت من خلال قطبين كهربائيين من البلاتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي S3: التعاقد الباسطة ديجيتوروم لونجوس الألياف. تكبير 20x. وضع تباين التداخل التفاضلي. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.5 هرتز و 50 فولت من خلال قطبين كهربائيين من البلاتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي S4: التعاقد الباسطة الهلوسة الطويلة الألياف. تكبير 20x. وضع تباين التداخل التفاضلي. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.5 هرتز و 50 فولت من خلال قطبين كهربائيين من البلاتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي S5. التعاقد مع الألياف الوحيدة. تكبير 20x. وضع تباين التداخل التفاضلي. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.5 هرتز و 50 فولت ، من خلال قطبين من البلاتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو التكميلي S6: تسجيل مباشر لعابر Ca2+ من ألياف رقمية طويلة باسطة محملة ب Mag-Fluo-4 ، AM كما هو موضح في الخطوة 4.1.4. يطلق بروتوكول التحفيز نبضات تيار مستطيلة تبلغ 1.2 مللي ثانية و 0.5 هرتز و 50 فولت من خلال قطبين كهربائيين من البلاتين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

Discussion

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Disclosures

وصفنا بروتوكولا للحصول على ألياف منفصلة إنزيميا بأطوال وأنواع مختلفة من ست عضلات للفئران البالغة: ثلاثة منها موصوفة بالفعل (flexor digitorum brevis ، extensor digitorum longus ، soleus) وثلاثة منها انفصلت بنجاح لأول مرة (الباسطة الهلوسة الطويلة ، peroneus longus ، peroneus digiti quarti).

Acknowledgements

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للبروفيسور روبنسون راميريز من UdeA للمساعدة في وبعض الصور ولكارولينا بالاسيوس للدعم الفني. ساعدنا يوهان بينيدا من Kaika في إعداد الكاميرات الملونة والفلورية. شيوان نغو ، من جامعة كوينزلاند ، يرجى تدقيق المخطوطة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل CODI-UdeA (2020-34909 من 22 فبراير 2021 ، و 2021-40170 من 31 مارس 2022 ، SIU) ، ومكتب التخطيط-UdeA (E01708-K و ES03180101) ، ميديلين ، كولومبيا ، إلى JCC. لم يشارك الممولون في جمع البيانات وتحليلها أو كتابة المخطوطات أو تقديمها.

Materials

الجسم العلمي شرائح مشحونة أدوات تم استخدام مضان
<قوي > الكواشف < / قوي>
الإيثانول المطلقسيجما ألدريتش32221
الأسيتونميرك179124
أكريلاميدجيبكو BRL15512-015
بيرسلفات الأمونيومبانريك141138.1610
الأجسام المضادة للميوسين Iسيجما ألدريتشM4276الجسم المضاد الأساسي
المضاد للميوسين II الجسم المضادSigma AldrichM8421الجسم المضاد الأساسي
المضاد للميوسين IIA الجسم المضادAmerican Type Culture CollectionSC-71المضاد الأساسي. مشتق من الورم الهجين HB-277
الأجسام المضادة للميوسين IIBدراسات النمو بنك الورم الهجينBF-F3-c & nbsp ؛الجسم المضاد الأولي
Bis-acrylamideAMRESCO0172
ألبومين مصل البقرThermo ScientificB14
كاشف برادفوردMerck1.10306.0500
بروموفينول أزرقكارلو إربا428658
كربونات الكالسيومميرك102066
ثاني كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>) ميرك2389
الكلوروفورمسيجما ألدريتش319988
الكولاجيناز نوع 2ورثينجتونCLS-2 / LS004176
القنصل ماونت9990440الحراري
Coomassie Brilliant blue R 250 & nbsp ؛ميرك112553
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD2650
ديثيوثريتول (DTT)أمريسكو0281
حمض الإيدتيك (EDTAAMRESCO0322
Eosin YSigma AldrichE4009
GlycerolPanreac 1423291211
جلايسينبانريك151340.1067
مصل الماعزسيجما ألدريتشG9023
هيماتوكسيلينحراري6765015
هيبسأمريسكو0511
هوشست 33258سيجما ألدريتش861405
إيميدازولأمريسكوM136
IsopentaneSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4 ، AMInvitrogenM14206محضر فقط في DMSO. حمض البلورونيك غير مطلوب ولا ينبغي استخدامه لتجنب تدهور الألياف.
MercaptoethanolApplichemA11080100
MethanolProtokimicaMP10043
الفئرانعدةعدةلهذه المخطوطة ، استخدمنا فقط C57BL / 6 الفئران. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض النتائج الأولية أن البروتوكول يعمل بشكل جيد مع الفئران السويسرية ويبستر من نفس العمر والوزن.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N ، N ، N '، N '- tetramethylethane-1،2-diamine (TEMED) PromegaV3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Tocris1870
مركب القطع الأمثل (OCT) الجسم المضاد الثانوي للحرارة العلمية6769006
Thermo ScientificA-11001الماعز المضادة للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز, Alexa Fluor 488
كبريتات الدودسيل الصوديومPanreac 1323631209
TRIS 0.5 M ، درجة الحموضة 6.8   ؛AMRESCOJ832
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materials< / قوي >
غرفة تشريححسب الطلب
Erie Scientific5951PLUS
غرفة الحمام التجريبيةWarner InstrumentsRC-27NE2غرفة حمام ضيقة مع تحفيز ميداني ، مجمعة على منصة ساخنة PH-6
ملقط دقيقWorld Precision Instruments500338 ، 500230
مقص ناعمأدوات الدقة العالميةمقص Vannas 501778
ماصات زجاجية باستورعدةأطراف
مصقولة بالنارقوارير زجاجية مع غطاءعدة2-3 مل حجم
مقص التشغيلالدقة العالمية501223-G
Equipment< / قوي >
الطرد المركزيThermo ScientificSL 8R
مجهر متحد البؤرOlympusFV1000
CryostatLeicaCM1850
الكاميرا الرقميةZeissErc 5s و Axio 305Axio 305 ، إلى جانب Stemi 508 المجسم ، لالتقاط الصور أثناء التشريح ؛ بينما تم استخدام Erc 5s أو Axio 208 ، إلى جانب مجهر Axio Observer A1 ، لالتقاط صور للألياف المعزولة ومقايسات التألق المناعي
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Electrophoresis chamberBio Radمجهر مقلوب Mini-Protean IV
مقترنا بالتألقZeissAxio Observer A1مقترنا بمصدر ضوء مناسب ومرشحات وأهداف لمضاعف ضوئي
أنبوب HoribaR928 ، Hamamatsu ، في مقياس ضوئي D104 ، Horibaمقترن بالمنفذ الجانبي للمجهر الفلوري
StereoscopeZeissStemi 508
محفز آلات العشب S6
حمام مائي  MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Free Software لتحليلات الكهربائيات جامعةكنتاكيGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
برنامج مجاني لتحليل الصور والقياسالميكانيكي المعاهد الوطنية للصحةImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
برنامج مرخص للحصول على إشارات Ca2 + < / sup> وتحليلاتالأجهزة الجزيئيةpCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
برنامج مرخص للتحليلات الإحصائية والرسوم البيانيةOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260 (2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14 (2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939 (2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898 (2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976 (2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118 (2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -. P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199 (2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807 (2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074 (2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961 (2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669 (2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796 (2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654 (2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126 (2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -. Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075 (2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

ألياف عضلية هيكلية قصيرة ومتوسطة وطويلة سليمة تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لست عضلات خلفية للفئران: Beyond Flexor digitorum brevis
Contact Us Recommend to Library
Research
Business
Education
Solutions
About JoVE
Others
Contact Us Recommend to Library
JoVE logo

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved

Privacy Terms of Use Policies