التحليل المكاني عالي الدقة لمستويات التعبير الجيني في الأوتار

Steffany Villaseñor; Mor Grinstein

doi:10.3791/65852

مقالة منهجية

التحليل المكاني عالي الدقة لمستويات التعبير الجيني في الأوتار

737 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65852

⸱

مارس 8, 2024

Steffany Villaseñor¹ , Mor Grinstein¹^,²^,³

¹Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, ²Harvard Stem Cell Institute, ³Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة كيفية تنفيذ بروتوكول محسن في الموقع للأوتار. تناقش هذه الطريقة تحضير الأنسجة ، ونفاذية القسم ، وتصميم المسبار ، وطرق تضخيم الإشارة.

الملخص

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير العديد من البروتوكولات لعلم النسخ عالي الدقة في العديد من المجالات الطبية والبيولوجية المختلفة. ومع ذلك ، فقد تركت الأنسجة الغنية بالمصفوفة ، وعلى وجه التحديد ، الأوتار وراءها بسبب انخفاض عدد الخلايا ، وانخفاض كمية الحمض النووي الريبي لكل خلية ، ومحتوى المصفوفة العالي ، مما جعل تحليلها معقدة. واحدة من أحدث وأهم أدوات الخلية المفردة هي التحليل المكاني لمستويات التعبير الجيني في الأوتار. تتمتع أدوات الحمض النووي الريبي المكانية هذه بأهمية عالية على وجه التحديد في الأوتار لتحديد موقع خلايا معينة من مجموعات جديدة وغير معروفة ، والتحقق من صحة نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وإضافة سياق نسيجي إلى بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية. ستمكن هذه الطرق الجديدة من تحليل الحمض النووي الريبي في الخلايا ذات الحساسية الاستثنائية والكشف عن أهداف الحمض النووي الريبي أحادي الجزيء على مستوى الخلية الواحدة ، مما سيساعد على توصيف الأوتار جزيئيا وتعزيز أبحاث الأوتار.

في ورقة الطريقة هذه ، سنركز على الطرق المتاحة لتحليل مستويات التعبير الجيني المكاني على الأقسام النسيجية باستخدام فحوصات تهجين جديدة في الموقع للكشف عن الحمض النووي الريبي المستهدف داخل الخلايا السليمة على مستويات الخلية الواحدة. أولا ، سنركز على كيفية تحضير أنسجة الوتر للمقايسات المختلفة المتاحة وكيفية تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف دون ضوضاء في الخلفية ولكن بحساسية عالية وخصوصية عالية. بعد ذلك ، ستصف الورقة طرق نفاذية محددة ، وتصميمات المسبار المختلفة ، واستراتيجيات تضخيم الإشارة المتاحة حاليا. ستمكن هذه الطرق الفريدة لتحليل مستويات النسخ للجينات المختلفة في دقة الخلية المفردة من تحديد وتوصيف خلايا أنسجة الأوتار في السكان الصغار والمسنين لمختلف النماذج الحيوانية وأنسجة الأوتار البشرية. ستساعد هذه الطريقة أيضا في تحليل مستويات التعبير الجيني في الأنسجة الأخرى الغنية بالمصفوفة مثل العظام والغضاريف والأربطة.

المقدمة

الأوتار هي الأنسجة الضامة التي تمكن من نقل القوة بين العضلات^{والعظام 1}. من الناحية التنموية ، يتم اشتقاق الخلايا الوسيطة من الخلايا الوسيطة داخل تصلب الجسيدات². أوتار الأطراف مشتقة من الأديم المتوسط الجانبي. وتنشأ الأوتار القحفية من سلالة القمة العصبية القحفية³^،⁴. يمكن تمييز الوتر بالتعبير عن عامل نسخ التصلب⁵ ، على الرغم من أن العديد من العلامات تلعب أيضا دورا رئيسيا في تطور الأوتار ، بما في ذلك tenomodulin و mohawk واستجابة النمو المبكر 1/2⁶^،⁷^،⁸^،⁹.

على الرغم من العلامات القليلة المعروفة للوتر ، بشكل عام ، لا يزال التوصيف الأكثر تعمقا يمثل تحديا لأن الوتر يحتوي على خلايا تمتد عبر تدرج من الخصائص الميكانيكية الحيوية. من الوصلة العضلية ، ووسط الوتر في منتصف الجسم ، والوتر الأكثر تكلس ، توجد خلايا الأوتار في مصفوفات خارج الخلية تتراوح في خصائص الشد. نظرا لأن الوتر يجب أن يتحمل إجهاد الشد الذي يفرضه الاختلاف في القوة الميكانيكية بين الأنسجة الرخوة والصلبة ، فإن التنظيم المكاني للخلايا في الوتر مهم بشكل خاص لوظيفته. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن هذه المجموعات السكانية الفرعية للأوتار.

يمكن استخدام العديد من أدوات النسخ المكاني عالية الدقة للبدء في توضيح المجموعات السكانية الفرعية للخلايا ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أو التهجين في الموقع . ومع ذلك ، في حين أن فحوصات التنميط المكاني هذه تساعد في الكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي عبر الأنسجة بعد التشريح المجهري أو التقسيم ، فإن هذه الطرق يمكن أن تكون صعبة عند إجراؤها على أنسجة الأوتار. الأوتار عبارة عن أنسجة غنية بالمصفوفة تتكون من ما يقرب من 86٪ من الكولاجين بواسطة الكتلة الجافة¹⁰ ، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا للتسلسل. نظرا لكل من المضاعفات في عزل الخلايا عن المصفوفة ، والطبيعة تحت الخلايا للوتر¹¹ ، وعدد الحمض النووي الريبي المنخفض نسبيا ، فإن الوتر هو نسيج يصعب تحليله.

في هذه الورقة ، نقدم طريقة لتحسين فحوصات التهجين الجديدة في الموقع للاستفادة منها للأوتار من خلال توفير طرق تحضير الأنسجة والنفاذية وتصميم المسبار. إلى جانب تقنيات التسلسل الحالية ، قد يساعد هذا الباحثين على توصيف مجموعات الأوتار الفرعية مكانيا عبر الأوتار النامية أو البالغة أو المصابة مع زيادة حساسية الفحص وخصوصيته.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للجنة رعاية المؤسسي واستخدامه (IACUC) وإرشادات AAALAC. تم إجراء التجارب بموجب #2013N000062 بروتوكولي معتمد في مستشفى ماساتشوستس العام. في هذه الدراسة, C57BL / J6 الفئران (5 أسابيع من العمر و P0) تم استخدامها. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد العينة والتثبيت

قتل الفئران في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم كطريقة ثانوية للقتل الرحيم. ثم استخدم المقص لقطع الأطراف الخلفية للفأر على طول مفصل الورك¹². في قارورة التلألؤ ، اغمر الطرف الخلفي للفأر في محلول بارافورمالدهايد (PFA) كاف بنسبة 4٪ لتغطية العينة بالكامل ، وإصلاح الأنسجة لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: بدلا من 4٪ PFA ، يمكن أيضا استخدام 10٪ فورمالين للتثبيت. بعد التثبيت ، يمكن تخزين العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) حتى مزيد من المعالجة. من خلال تثبيت الطرف الخلفي بالكامل ، يمكننا الحفاظ على التوتر على الوتر ولدينا الفرصة لفحص الوتر أو الوتر الأوسط أو الوصلة العضلية.
بعد إزالة PFA من قارورة التلألؤ ، اغسل العينة لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS عن طريق إضافة ما يكفي من PBS لتغطية العينة. بعد ذلك ، اغمر الأطراف الخلفية في 0.5 M EDTA عند 4 درجات مئوية مع التحريك لمدة 1-2 أسابيع ، واستبدلها ب EDTA الطازج كل 2-3 أيام.
بعد إزالة EDTA ، اغسل العينة لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 1x PBS ، وقم بتجفيف العينات في 70٪ EtOH ، وقم بتضمينها في البارافين في الاتجاه المطلوب. استخدم تقنيات تقسيم FFPE التقليدية لتقسيم الأنسجة بسمك 3 ميكرومتر ونقل الأقسام إلى شريحة مجهر معالجة ومشحونة (انظر جدول المواد) ¹³.
ملاحظة: يمكن تخزين الأقسام في درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
إزالة البارافين
1. اخبز الشرائح على طبق ساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم اترك الشرائح تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT). لإزالة شمع البارافين من الشرائح ، ضع الشرائح على رف منزلق وخفضها في طبق تلطيخ مليء بالزيلين. كرر في الزيلين الطازج لمدة 3 × 5 دقائق.
  تنبيه: الزيلين خطير. تعامل معها بعناية.
2. لإعادة ترطيب الأقسام ، اغمر الشرائح في ما يلي لمدة 5 دقائق لكل غسلة ، كل ذلك في RT: اغسل 2x في 100٪ EtOH ، 1x في 75٪ EtOH مخفف في dH₂O ، 1x في 50٪ EtOH مخفف في PBS ، 1x في 25٪ EtOH مخفف في PBS ، و 2x في PBS.
  ملاحظة: تتم جميع خطوات الجفاف باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق ومع حلول EtOH المختلفة في تلطيخ الأطباق.

2. RNAscope (ISH التجاري)^{بروتوكول 14} التكيف

إعداد الحلول والمجسات
1. قم بإعداد محلول TEG للمعالجة المسبقة للعينات المقسمة عن طريق الجمع بين 25 ملي مولار من Tris-HCl عند درجة الحموضة 8 و 10 ملي مولار من EDTA و 50 ملي مولار من الجلوكوز. قم بعمل حجم كاف لجميع العينات المراد معالجتها أو تحضير الفائض ؛ تعقيم الترشيح والتخزين في RT ؛ امزج المحلول بشكل صحيح قبل استخدامه.
2. قم بإعداد ما يكفي من 1x Wash Buffer (انظر جدول المواد) لجميع عمليات الغسيل وتخزينها في RT.
3. في حمام مائي أو حاضنة 40 درجة مئوية ، قم بتسخين المجسات ذات الأهمية لمدة 10 دقائق. ثم قم بإعداد المجسات وفقا لبروتوكول ISH¹⁴.
المعالجة المسبقة للعينات
1. بدلا من استخدام محلول المعالجة المسبقة الموصى به ، اغمر الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على عازلة TEG لمدة 4 ساعات عند 60 درجة مئوية.
  ملاحظة: يمكن تمديد حضانة المخزن المؤقت TEG لمدة تصل إلى 6 ساعات إذا كانت الأنسجة كثيفة بشكل خاص أو إذا كان استرجاع المستضد لفكرة ربط الحمض النووي الريبي ذات الأهمية أمرا صعبا. في هذه الحالة ، يمكن إضافة نقطة توقف هنا ، حيث يتم تجفيف الشرائح وحفظها في ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل.
2. قم بإزالة العينات من المخزن المؤقت واتركها تجف. بعد ذلك ، ارسم حول العينات بقلم حاجز كاره للماء ، واغمرها في طبق تلطيخ آخر يحتوي على البروتياز الرابع ، واحتضنها في فرن لمدة 45 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  ملاحظة: نوصي باستخدام البروتياز الوريدي للفئران البالغة. في حالة استخدام الفئران الأصغر سنا ، مثل P0 ، نوصي باستخدام إنزيم أكثر اعتدالا ، مثل البروتياز III ، لمدة 30 دقيقة. عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها للأعمار المختلفة ، راقب سلامة الوتر وتحقق من تدهوره. إذا كانت الأنسجة تنفصل أو متدهورة ، فقم بتقليل وقت الحضانة أو تغيير البروتياز المستخدم.
3. اغسل العينات مرة أخرى في المخزن المؤقت TEG لمدة 30 دقيقة ثم قم بتهجين المجسات وفقا لبروتوكول ISH¹⁴.
4. أضف 50-100 ميكرولتر من كاشف التركيب أعلى العينة. ضع غطاء فوق العينات للفحص المجهري. عند التصوير ، استخدم تكبيرا عاليا (هدف 40x أو أعلى) لعرض الإشارة.

3. بروتوكول HCR^{ISH 15} التكيف

التثبيت اللاحق
1. تحضير 4٪ PFA (في PBS) ، محلول PBT (0.1٪ Tween-20 في PBS) ، والبروتيناز K في PBS (تركيز المخزون 10 مجم / مل ، التركيز النهائي 5 ميكروغرام / مل).
2. لبدء خطوة الإصلاح الأولى ، اغمر الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على 4٪ PFA لمدة 5 دقائق ؛ بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ وتخزينه للاستخدام في الخطوات اللاحقة. اشطف الشرائح لمدة 2 × 5 دقائق في محلول PBT وقم بإزالة محلول PBT. ضع الشرائح في طبق تلطيخ يحتوي على محلول البروتيناز K (5 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق واشطفها في محلول PBT 2 × 5 دقائق.
3. ابدأ خطوة postfix الثانية واغمر الشرائح في 4٪ PFA لمدة 5 دقائق.
  ملاحظة: هذا هو نفس 4٪ من PFA المحفوظة من الخطوة 3.1.2.
4. اشطف الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق في محلول PBT.
  ملاحظة: تتم جميع خطوات التثبيت مع الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية.
الأسيتيل
1. تحضير محلول الأستلة الذي يحتوي على 625 ميكرولتر من أنهيدريد الخليك ، و 3.3 مل من 1 M ثلاثي إيثانول أمين (TEA) ، و 246 مل من ddH₂O. تأكد من الخلط جيدا واستخدامه مباشرة بعد التحضير.
2. ضع الشرائح في محلول الأستلة لمدة 10 دقائق ثم اشطفها 3 × 5 دقائق في محلول PBT. اشطف الشرائح في ddH₂O واتركها تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة. ثم ارسم حول العينات بقلم حاجز كاره للماء.
  ملاحظة: تتم جميع خطوات الأستلة باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية
التهجين
1. قم بتسخين المخزن المؤقت للتهجين إلى 37 درجة مئوية وقم بتسخين غرفة مرطبة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
  تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت على الفورماميد، وهو مادة خطرة. إذا لم تكن الشرائح جافة بدرجة كافية ، فقم بمسح الحواف بمنديل مختبري لإزالة الدرجة العالية_{الزائدة 2}O.
2. قم بإعداد محاليل المسبار عن طريق إضافة 0.4 مللي مول من كل خليط مسبار إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين.
  ملاحظة: في حالة استخدام تصوير dHCR ، استخدم تركيزا أعلى من المسبار لتحسين كفاءة تهجين المسبار.
3. قم بإعداد 4 لتر من كلوريد الصوديوم سترات الصوديوم (20x SSC) عن طريق الجمع بين 3 M كلوريد الصوديوم (701.1 جم من كلوريد الصوديوم في حجم نهائي قدره 4 لتر) و 0.3 متر من Na₃CH₆H₅O₇ • 2H₂O (352.8 جم) ثم ضبط الرقم الهيدروجيني النهائي إلى 7 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك أو 10 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم. أضف ما يكفي من H₂O للوصول إلى 4 لتر ، قم بإعداد 5x SSCT عن طريق تخفيف 20x SSC إلى 5x وإضافة ما يكفي من 10٪ Tween 20 بحيث يكون 0.1٪ من الحجم الإجمالي.
4. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى العينة ، ضع الشرائح في غرفة مرطبة ، واترك الشرائح تحتضن لمدة 10 دقائق. قم بإزالة محلول التهجين واستنزاف المخزن المؤقت الزائد على الشريحة عن طريق نشاف الحواف بمسح معملي.
5. أضف 100 ميكرولتر من محلول المسبار المحضر أعلى العينة وضع غطاء على العينة. احتضن في فرن طوال الليل أو لمدة 12-16 ساعة في غرفة مرطبة بمحلول يحتوي على 5x SSC و 50٪ فورماميد. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
  ملاحظة: نظرا لأن الحضانة بين عشية وضحاها ، فإن إضافة الغطاء هو تقليل التبخر.
6. اترك حصة من محلول SSCT 5x في حمام مائي 37 درجة مئوية وكمية ثانية في RT. توقع أحجام هذه الحصص المطلوبة بناء على رقم العينة وعدد عمليات الغسيل في الخطوة التالية.
غسل
1. باستخدام محلول SSCT 5x المسخن مسبقا ، قم بإعداد 75٪ مخزن غسيل / 25٪ 5x SSCT ، و 50٪ مخزن غسيل / 50٪ 5x SSCT ، و 25٪ مخزن غسيل / 75٪ 5x محاليل SSCT.
2. لإزالة المجسات الزائدة ، اغمر الشرائح على التوالي لمدة 15 دقيقة لكل غسلة عند 37 درجة مئوية في 75٪ مخزن غسيل / 25٪ 5x SSCT ، 50٪ مخزن غسيل / 50٪ 5x SSCT ، و 25٪ مخزن غسيل / 75٪ 5x SSCT. اسمح للغطاء أن تطفو من العينات.
3. احتضن الشرائح 2 × 15 دقيقة مع 100٪ 5x SSCT ثم اغمرها في 5x SSCT لمدة 5 دقائق في RT.
  ملاحظة: يمكن إجراء خطوات الغسيل باستخدام الشرائح الموجودة على رف منزلق وفي أطباق تلطيخ تحتوي على المحاليل المعنية أو مع إضافة المحاليل على شكل قطرات.
التضخيم
1. قم بإعداد 6 مللي مول من دبوس الشعر h1 و 6 مللي مول من دبوس الشعر h2 عن طريق التبريد المفاجئ 2 ميكرولتر من مخزون 3 ميكرومتر (يسخن عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ويبرد إلى RT). حماية دبابيس الشعر من الضوء أثناء هذه العملية.
  ملاحظة: يتم توفير دبابيس الشعر HCR h1 و h2 في مخزن تخزين دبوس الشعر وهي جاهزة للتبريد المفاجئ. التقط دبابيس الشعر الباردة h1 و h2 في أنابيب منفصلة.
2. جفف الشرائح عن طريق نشاف حوافها بمنديل معملي. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم أعلى العينة وضعه في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة في RT. قم بإعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة دبابيس شعر h1 المبردة ودبابيس الشعر h2 المبردة إلى 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم في RT.
3. قم بإزالة المخزن المؤقت للتضخيم واستنزاف السائل الزائد على الشريحة عن طريق نشاف الحواف بمنديل مختبري. أضف 100 ميكرولتر من خليط دبوس الشعر المحضر مسبقا وضع البارافيلم فوق العينة. احتضن الشرائح لمدة لا تقل عن 4 ساعات أو طوال الليل في غرفة مظلمة ومرطبة في RT.
4. لإزالة دبابيس الشعر الزائدة ، اغمر الشرائح في 5x SSCT في طبق تلطيخ واحتضنها في RT لمدة 30 دقيقة. كرر الغسيل في 5x SSCT طازج لمدة 30 دقيقة ، ومرة ثالثة لمدة 5 دقائق.
5. جفف الشرائح عن طريق نشاف الحواف بمنديل مختبري وأضف 50-100 ميكرولتر من كاشف التثبيت أعلى العينة. ضع غطاء فوق العينات للفحص المجهري. عند التصوير ، استخدم تكبيرا عاليا (هدف 40x أو أعلى) لعرض الإشارة.

النتائج

figure-results-1
الشكل 1: تعبير Poly A RNA في وتر العرقوب في الفأر البالغ باستخدام RNAScope. صورة تمثيلية لوضع العلامات الناجحة على بولي أ في وتر العرقوب للفأر (اللوحة اليسرى) باستخدام مقايسة ISH التجارية. يؤكد التموضع المشترك مع DAPI خصوصية المسبار (الألواح الوسطى واليمنى) ، مما يسمح بالتحكم في ضوضاء الخلفية. تم التقاط الصور بمعدل 63 ضعفا باستخدام مجهر Leica SPE متحد البؤر. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: ISH = تهجين في الموقع. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تعبير بولي A RNA في وتر العرقوب للفأر P0 باستخدام RNAScope. صورة تمثيلية لوضع العلامات الناجحة Poly A في P0 calcaneus الفأر (اللوحة اليسرى) باستخدام مقايسة ISH التجارية. يؤكد التحديد المشترك مع DAPI والحد الأدنى من ضوضاء الخلفية خصوصية المسبار (الألواح الوسطى واليمنى). يتميز الوتر بخط متقطع. تم التقاط الصور باستخدام مجهر ZEISS Axio Imager. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: ISH = تهجين في الموقع. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سيساعد هذا البروتوكول الباحثين على استخدام أدوات التهجين المتوفرة تجاريا في الموقع وتكييفها لاستخدامها في أنسجة الأوتار البالغة. هذا يسمح لنا في النهاية بتحليل مستويات النسخ للجينات المختلفة في دقة خلية واحدة مستنيرة مكانيا. سيكون للتشغيل الناجح لمقايسة ISH خصوصية عالية للأهداف ذات الاهتمام والحد الأدنى من ضوضاء الخلفية. يمكن استخدام البروتوكول في كل من أوتار العرقوب لدى البالغين وحديثي الولادة (الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 والشكل 4). يمكن استخدام Poly A كعنصر تحكم للمساعدة في التحقق من صحة التشغيل الناجح من خلال التأكيد النوعي على وجود مستويات متوقعة من الحمض النووي الريبي في العينة.

ومع ذلك ، هناك عدة طرق قد تحتاج بها بروتوكولات ISH إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. على سبيل المثال ، يوضح الشكل 5 تهجين غير كاف للمسبار ل Poly A في الوتر ، بحيث لا تحتوي عدة مناطق من الوتر على إشارة Poly A ، على الرغم من أن صبغة DAPI المضادة تظهر أن الخلايا كانت موجودة بالفعل. علاوة على ذلك ، إذا تم الإفراط في هضم الأنسجة في خطوات الإصلاح اللاحقة في HCR من خلال وقت حضانة البروتيناز K الممتد (الشكل 6) أو في خطوات المعالجة المسبقة في RNAScope من خلال حضانة البروتياز الرابع الممتدة ، فيمكن أن تتعطل مورفولوجيا الأنسجة. أخيرا ، الشكل 7 هو مثال على الشكل الذي سيبدو عليه التحكم السلبي إذا لم تتم إضافة مسبار تهجين الحمض النووي الريبي ، ولكن لا يزال يتم استخدام بقعة نووية.

figure-results-3
الشكل 3: تعبير الحمض النووي الريبي التصلب في وتر العرقوب في الفأر البالغ باستخدام HCR. صورة تمثيلية لتصنيف الحمض النووي الريبي الناجح لتصلب الصلبة في وتر العرقوب للفأر البالغ (اللوحة اليسرى) باستخدام HCR. يستخدم DAPI كبقعة نووية مضادة (اللوحة الوسطى). يؤكد تحديد الموقع مع DAPI خصوصية المسبار (اللوحة اليمنى). تم التقاط الصور بمعدل 63 ضعفا باستخدام مجهر Leica SPE متحد البؤر. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: HCR = تفاعل التهجين المتسلسل. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تعبير Poly A RNA في وتر العرقوب للفأر P0 باستخدام HCR. صورة تمثيلية لوضع العلامات على Poly A RNA في وتر العرقوب P0 الفأر باستخدام HCR. يقوم DAPI و Poly A بتسمية كل من العظام ووتر العرقوب في العقبي (اللوحين الأيمن والأيسر ، على التوالي). يؤكد تحديد موقع كل من مجسات DAPI و Poly A عبر كلا الأنسجة والحد الأدنى من ضوضاء الخلفية تشغيل HCR ناجحا (اللوحة اليمنى). تم التقاط الصور باستخدام مجهر ZEISS Axio Imager. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: HCR = تفاعل التهجين المتسلسل. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تشغيل HCR غير الناجح مع مجسات Poly A RNA في وتر العرقوب P0. صورة تمثيلية لوضع العلامات غير الناجحة على Poly A RNA في وتر العرقوب P0 الفأر باستخدام HCR. قام DAPI بتسمية النوى في عظم ووتر العقبي (اللوحة اليسرى) ، لكن مسبار Poly A HCR لم يتخلل جميع أنحاء الوتر (اللوحة الوسطى واليمنى ، انظر رؤوس الأسهم البيضاء). ومع ذلك ، نجح بولي أ في تسمية معظم العظام. تم التقاط الصور باستخدام مجهر ZEISS Axio Imager. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: HCR = تفاعل التهجين المتسلسل. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مثال على وضع العلامات على HCR Poly-A في وتر العرقوب للفأر البالغ مفرط الهضم. صورة تمثيلية لوضع العلامات على Poly A RNA في وتر العرقوب الفأر البالغ مفرط الهضم باستخدام HCR. يتواصل Poly A و DAPI بشكل صحيح في هذه العينة (اللوحة اليمنى) ، ولكن التشكل أحادي المحور النموذجي للوتر يتعطل (رؤوس الأسهم البيضاء). تم التقاط الصور باستخدام مجهر ZEISS Axio Imager. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: HCR = تفاعل التهجين المتسلسل. DAPI = 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: التحكم السلبي في منظار بولي أ RNAscope في وتر العرقوب في الفأر البالغ. صورة تمثيلية للتحكم السلبي لعلامة Poly A RNA التي لم تتم فيها إضافة مسبار Poly A ، ولكن كانت مجسات التضخيم كذلك. كما هو متوقع ، نجح DAPI في تسمية النواة (اللوحة اليسرى) ، ولكن لم تكن هناك إشارة موجودة ل Poly A (اللوحة الوسطى). تم التقاط الصور باستخدام مجهر ZEISS Axio Imager. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. اختصار: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في هذه الورقة ، نصف التعديلات التي تم إجراؤها للاستفادة من أدوات ISH الحالية بحيث يمكن استخدامها في أنسجة الأوتار بدرجة عالية من الخصوصية والحساسية. نظرا لأن الوتر عبارة عن نسيج عالي الكثافة ، فيجب إجراء تعديلات على البروتوكول في كثير من الأحيان لتحقيق درجات مماثلة من اختراق المسبار ونوعيته. تعد طرق النفاذية المحددة هذه واستراتيجيات تضخيم الإشارة لأنسجة الأوتار جزءا لا يتجزأ من تحسين فعالية بروتوكولات ISH التي تمت مناقشتها. بدون هذه الخطوات ، من الصعب على المجسات أن يكون لها تفاعل قوي ومحدد: الحمض النووي الريبي في الوتر.

في RNAscope¹⁴ ، يجب إجراء تعديلات على المخزن المؤقت للمعالجة المسبقة المستخدم بحيث يعمل البروتوكول بشكل أكثر فعالية في أنسجة الأوتار. وبشكل أكثر تحديدا ، فإن استخدام TEG Buffer كمعالجة مسبقة يحسن وصول المجسات إلى الحمض النووي الريبي المستهدف. بالإضافة إلى TEG Buffer ، يتم تمديد معالجة البروتياز الوريدي إلى ما بعد الوقت القياسي ، بحيث يتراوح طوله من 45 دقيقة إلى 1 ساعة. في HCR¹⁵ ، تمت زيادة طول الغسالات ، وأضيفت خطوات لاحقة قبل بدء مقايسة RNA-FISH. تضمنت خطوات postfix إضافة خطوات الحضانة في 4٪ PFA و PBT و Proteinase K ومحلول الأستلة. بشكل جماعي ، تساعد هذه التعديلات في تحسين وصول المسبار إلى الحمض النووي الريبي الوتر وتقليل ضوضاء الخلفية¹⁶^،¹⁷. ومع ذلك ، على الرغم من أن تعديلات البروتوكول هذه تساعد في زيادة خصوصية وحساسية المجسات المستخدمة في ISH عن طريق تعديل حلول المعالجة المسبقة المستخدمة وإضافة خطوات التثبيت لزيادة إمكانية الوصول إلى ارتباط المسبار بالحمض النووي الريبي ، إلا أن هناك قيودا تم إنشاؤها بواسطة تصميم المسبار.

لتحسين التحديات التي تفرضها إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبي للمجسات ، يمكن إجراء تعديلات إضافية لتحسين فحوصات ISH. إذا تم استخدام تصوير dHCR - وهي طريقة للقياس الكمي المطلق الرقمي ل mRNA¹⁵ - ، فمن المستحسن زيادة تركيز المسبار لتحسين كفاءة تهجين المسبار. علاوة على ذلك ، فإن استخدام فترة أقصر في خطوات التضخيم يضمن أن تكون النقاط أحادية الجزيء محدودة الحيود. قد تؤدي فترات الحضانة الأطول إلى زيادة التألق الذاتي من العضلات عند التصوير. إذا كان الوتر المختار أكثر كثافة و / أو أكبر من وتر العرقوب الفئراني البالغ ، فإننا نوصي بزيادة مدة خطوة تثبيت PFA بنسبة 4٪.

هذه التعديلات على بروتوكولات ISH التجارية المذكورة أعلاه هي الأكثر فائدة لأنسجة الفئران البالغة أو الأنسجة الأكثر كثافة التي تتطلب خطوات معالجة مسبقة أو تثبيت أطول. على الرغم من أن هذه التعديلات على البروتوكولات الحالية تساعد في تحسين إمكانية وصول المجسات إلى الحمض النووي الريبي ، إلا أن بعض المجسات قد تتطلب تركيزا أعلى أو وقتا أطول للحضانة في الفئران الأكبر سنا مما هو عليه في الفئران الأصغر سنا أو في حديثي الولادة ، اعتمادا على إمكانية الوصول إلى أشكال الحمض النووي الريبي المستهدفة التي سترتبط بها المجسات في المجموعات العمرية المختلفة. فيما يتعلق باستخدام البروتياز في خطوات المعالجة المسبقة لمنظار الحمض النووي الريبي ، نوصي باستخدام البروتياز الوريدي لمدة 45 دقيقة لأوتار الفئران البالغة ولكن البروتياز الثالث لمدة 30 دقيقة لأوتار حديثي الولادة. لتقييم فعالية الفحص ، أو تقييم أي تعديلات على البروتوكول ، أو لمقارنة التعبير بشكل عام عبر العينات ، يمكن استخدام العديد من عناصر التحكم. على سبيل المثال ، يمكن مقارنة مسبار Poly A مع بقعة نووية مضادة تستخدم لتقييم خصوصية التشغيل ، لتقييم توزيع / تحلل الحمض النووي الريبي في العينة ، والتأكد من أن الحمض النووي الريبي كان في متناول المجسات. وبالمثل ، يمكن أن تعمل مجسات جينات التدبير المنزلي أيضا كعناصر تحكم للوصول إلى إمكانية الوصول إلى الحمض النووي الريبي. تساعد عناصر التحكم الإيجابية ذات الأهداف التي لها أنماط تعبير معروفة في تأكيد الخصوصية، وستساعد عناصر التحكم السلبية في تقييم أي ربط محتمل غير محدد.

بشكل عام ، نظرا لأنه يتم تطوير العديد من التقنيات لفهم ملف تعريف التعبير الجيني المكاني للأنسجة بشكل أفضل ، هناك حاجة إلى المزيد من الطرق للتحقق من صحة النتائج. على وجه الخصوص ، تظهر المقايسات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية كأدوات شائعة لتقييم التعبير الجيني ، ولكن يجب فحص نتائجها مكانيا بدقة أعلى. للمساعدة في ذلك ، يمكن استخدام فحوصات ISH لفهم السياق المكاني للبيانات النسخية التي تنتجها المزيد من المقايسات الكمية والتحقق من صحتها بشكل أفضل. في الأوتار ، سيساعد الاقتران مثل هذه المقايسات في توصيف الخلايا الموجودة عبر الوتر ووسط الجسم والوصلة العضلية عن طريق التحقق من صحة العلامات المكانية الخاصة بمجموعات الخلايا الفريدة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون جينا غالواي وأعضاء مختبر غالواي على دعمهم وتشجيعهم في تطوير هذه البروتوكولات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1 م عازلة
10٪ محلول
10٪ توين -20
20x محلول ملحي سترات الصوديوم عازلة
4٪ PFA
ACD RNAscope مجموعة كاشف الفلورسنت متعدد الإرسال V2	ACD	323100
الخليك أنهيدريد
أكسيو تصوير مجهر	ZEISS
C57BL / J6 الفئران		معرف JAX: 000664
Coverslips	Fisher	12-541-042
ddH _{2 < / sub>O}
ETDA	Thermofisher	AM9262
EtOH
Glucose	VWR Chemicals BDH	BDH9230-500G
HCR RNA-FISH BUNDLE	Molecular Instruments Inc.
نظام التهجين HybEZ II	ACD
Immedge Barrier	Pen Vector Laboratories	H4000
Leica SPE مجهر متحد البؤر	Leica
Parafilm	Fisher
Boued Phosphate Salted (PBS ، 1x)	Invitrogen	AM9625	تمييع 10x PBS في ماء مللي Q للحصول على محلول 1x
البروتياز الرابع
بروتيناز K	Roche	3115836001
RNAscope H_{2< / sub>O_{2< / sub> وكواشف البروتياز}}	ACD	P 322381 N	المدرجة في ACD RNAscope مجموعة كاشف الفلورسنت المتعدد الإرسال V3
RNAscope مجموعة الكشف عن الفلورسنت متعددة	ACD	PN 323110	متضمن في ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2
RNAscope Target Retrieval	Recode ACD	322000	المضمنة في ACD RNAscope الفلورسنت متعدد الإرسال كاشف كاشف الفلورسنت V4
RNAscope Wash Buffer	ACD	PN 310091	المضمنة في ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V5
RNAscope مسبار مخفف	ACD	300041
حامل الشرائح	StatLab	4465A
طبق تلطيخ مع غطاء	StatLab	LWS20WH
Superfrost Plus شرائح مجهر	فيشر	1255015	معالجة, شرائح مشحونة
Tris-HCl
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L

ثلاثي إيثانول أمينفورمالين الإرسال

المراجع

Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

التحليل المكاني عالي الدقة لمستويات التعبير الجيني في الأوتار

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة