Method Article

معالجة الأنسجة وعزل الخلايا الليفية الأولية من المهبل البشري

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول تقنية موثوقة وفعالة لعزل الخلايا الليفية الأولية من الأنسجة المهبلية البشرية قبل انقطاع الطمث أو بعد انقطاع الطمث. لا تأخذ البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الليفية المهبلية في الاعتبار تحديات عزل الخلايا عن الأنسجة الهرمة. تم الحصول على الأنسجة المهبلية من النساء بعد جراحة هبوط أعضاء الحوض.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هبوط أعضاء الحوض هو اضطراب يؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرأة. يحدث عندما تضعف العضلات والأربطة وتتسبب في انخفاض أعضاء الحوض في الحوض ، مما يخلق انتفاخا في المهبل. كانت الجراحة لتصحيح هبوط أعضاء الحوض علاجا أساسيا. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بدراسة تكوين الأنسجة للمرضى الذين يعانون من هبوط على المستوى الخلوي.

يوجد حاليا إجماع ضئيل فيما يتعلق بتأثير عمر المتبرع أو المريض على العلاجات القائمة على الخلايا. تركز البروتوكولات المنشورة الحالية لعزل الخلايا الليفية المهبلية إما على أنسجة ما قبل انقطاع الطمث أو تهمل التعليق على عمر الأنسجة المانحة. تستخدم معظم البروتوكولات الحالية نماذج حيوانية. اتساق الأنسجة المهبلية البشرية أكثر كثافة من الأنسجة المستخدمة في معظم البروتوكولات. في هذه الدراسة ، تم الحصول على الأنسجة المهبلية البشرية في المقام الأول من المتبرعين الأكبر سنا ، مما ساهم على الأرجح في فشل البروتوكولات الحالية.

الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول قياسي للحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية بشكل موثوق ، بغض النظر عن عمر المتبرع وحالة انقطاع الطمث. تم استنساخ النتائج باستخدام أنسجة من تسعة متبرعين منفصلين خضعوا لجراحة هبوط أعضاء الحوض. كان ستة مرضى في مرحلة ما بعد انقطاع الطمث ، وكان أكبر متبرع يبلغ من العمر 78 عاما. كان متوسط عمر المتبرعين بالأنسجة 59.

هنا ، نصف طريقة موثوقة لتوليد تعليق خلية واحدة غني بالخلايا الليفية باستخدام مزيج من التفكك الأنزيمي والميكانيكي وتجميع تعليق الخلايا لخزعات مهبلية متعددة من متبرع واحد. قد يكون العزل الموثوق للخلايا الليفية الأولية المهبلية البشرية مفيدا في دراسة هبوط أعضاء الحوض وكذلك تفاعلات الميكروبيوم والمضيف.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاوت بين الجنسين في العلوم والبحوث هو قضية مستمرة. البحث في الاضطرابات التي تؤثر في المقام الأول على الأشخاص من جنس الإناث يعاني من نقص التمويل1. هبوط أعضاء الحوض هو اضطراب يرتبط بقوة بالجنس الأنثوي. يحدث عندما تضعف العضلات والأربطة وتتسبب في انخفاض أعضاء الحوض في الحوض ، مما يخلق انتفاخا في المهبل2. لا يعرف سوى القليل عن التفاعلات الخلوية في سياق هذه الفيزيولوجيا المرضية ، ولا كيف تؤثر عوامل مستوى الأنسجة على نجاح التدخلات الجراحية3.

من المسلم به على نطاق واسع أن الخلايا الأولية بدلا من خطوط الخلايا ضرورية للبحث السريري الانتقالي في توفير المزيد من الأهمية الفسيولوجية4. تؤخذ الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة الجسم ذات الأهمية وقد تحاكي بدقة أكبر علم وظائف الأعضاء في الجسم الحي . قد يكون عزل الخلايا الليفية الأولية من المهبل البشري مفيدا لدراسة الآليات البيولوجية لهبوط أعضاء الحوض ونمذجة المرض ، مع مراعاة خصائص المتبرع الرئيسية ، مثل العمر وحالة انقطاع الطمث.

يؤثر هبوط أعضاء الحوض عادة على الأفراد الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث. يمثل عزل وتكاثر الخلايا الليفية الأولية في دراسة هذه الحالة تحديا بسبب انخفاض عدد الخلايا والقدرة الاستنساخية من المتبرعين الأكبر سنا5. في تجربتنا ، فشل استخدام البروتوكولات الموصوفة سابقا لتفكك الأنسجة المهبلية في استخراج أي خلايا ليفية من خزعة الأنسجة القياسية 1 سم2 .

من خلال مراجعة الأدبيات ، وجدنا أن دراسات مماثلة تم تقسيمها إلى مجموعتين: النماذج الحيوانية ، مثل الفئران6 ، والنماذج البشرية 7,8. عند اتباع بروتوكول الماوس ، أدى استخدام المقص لمعالجة أنسجة الأنسجة المهبلية البشرية إلى عدم كفاية الهضم الميكانيكي. لم ينجح استقراء البروتوكولات باستخدام أنسجة الفئران ومواقع الأنسجة الأخرى9.

استخدمت معظم الأوراق التي تستخدم عينات مهبلية بشرية أنسجة من أفراد ما قبل انقطاع الطمث مع هبوط أعضاء الحوض 7,10. على الرغم من أن بعض الأوراق أبلغت عن استخدام عينات من كل من الأفراد قبل انقطاع الطمث وبعدانقطاع الطمث 11 ، إلا أنها لم تصف بتفصيل كاف البروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الليفية بنجاح من المتبرعين الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث. قد يكون العزل ونمذجة المرض باستخدام الخلايا الليفية من أنسجة ما بعد انقطاع الطمث ضروريا لفهم الفيزيولوجيا المرضية الخلوية لهبوط أعضاء الحوض ، حيث أن هذه الحالة لها أعلى معدل انتشار لدى الأفراد في العقد التالي لانقطاع الطمث12.

وصفنا طريقة لعزل وزراعة تعليق خلية واحدة غنية بالخلايا الليفية من الأنسجة المهبلية البشرية باستخدام مزيج من التفكك الميكانيكي والإنزيمي. توضح هذه المقالة بروتوكولا موثوقا به حول كيفية الحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية بعد انقطاع الطمث أو الشيخوخة. تم التأكد من أن الخلايا المعزولة هي خلايا ليفية من خلال الفحص المورفولوجي باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن الفيمنتين و F-actin وأكتين العضلات الملساء α (α-SMA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الأنسجة المهبلية من النساء اللائي يخضعن لجراحة هبوط أعضاء الحوض. تم اعتبار الأنسجة المهبلية التي تم جمعها بعد الجراحة نفايات وسيتم التخلص منها بخلاف ذلك. تم إجراء الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في ماساتشوستس جنرال بريغام.

1. حصاد الأنسجة المهبلية من المريض

  1. تشخيص هبوط أعضاء الحوض عن طريق أخذ التاريخ واستخدام نتائج فحص الحوض: تم الحصول على قياسات القياس الكمي لهبوط أعضاء الحوض (POP-Q) في العيادة ، مما يدل على هبوط أعضاء الحوض.
  2. استخدم معايير الإدراج التالية: أكثر من 18 سنة من العمر ؛ تاريخ هبوط أعضاء الحوض أعراض. اختيار التصحيح الجراحي لهبوط أعضاء الحوض.
  3. استبعاد ما يلي: النساء الحوامل والمرضى الذين يرفضون التبرع بالأنسجة.
  4. تقليم الأنسجة المهبلية الزائدة كخطوة ضرورية لجراحة هبوط أعضاء الحوض. يتم استئصال هذه الظهارة المهبلية بسماكة كلية بعد العمليات الجراحية التالية: القولون الأمامي ، القولون الخلفي ، والتهاب المهبل.
  5. انقل الأنسجة إلى المختبر في كوب معقم لجمع العينات باستخدام وسائط DMEM / F12 (Gibco) العادية المالحة أو الخالية من المصل. ابق على الجليد.

2. معالجة الأنسجة والهضم

  1. تحضير الأنسجة
    1. قم بقياس وقطع الأنسجة لتشمل السماكة الكاملة للظهارة المهبلية ، مما يخلق شرائح تبلغ حوالي 1 سم2.
    2. تأكد من القياس الدقيق لحجم الخزعة 1 سم2.
      ملاحظة: المبالغة في تقدير حجم خزعة الأنسجة قد تضعف هضم الأنسجة.
    3. تحضير 2-3 خزعات مهبلية إضافية بقياس 1 سم2 لكل منها من متبرع واحد ووضع الخزعات جانبا.
  2. الهضم الميكانيكي
    1. ضع الخزعة المهبلية في طبق بتري لزراعة الخلايا 10 سم. ماصة 500-1000 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل مكملة ب 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين بونتو الأنسجة المهبلية لمنع الأنسجة من الجفاف.
    2. فرم الأنسجة المهبلية إلى شظايا صغيرة باستخدام مشرطين معقمين (رقم 11 أو رقم 15) في كلتا اليدين.
    3. تأكد من أن أطراف الشفرات متعامدة مع سطح الأنسجة. ضع ضغطا متساويا وثابتا على سطح الأنسجة باستخدام مشرطين. قم بإجراء سحب بالتناوب لقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا.
    4. كرر تقنية الفرم هذه باستخدام تقنية المشرطين حتى تصبح العينة ذات تناسق موحد مع قطع 1-2 مم.
      ملاحظة: يجب أن يستغرق الهضم الميكانيكي باستخدام هذه التقنية ثنائية المشرط لخزعة 1 سم2 حوالي 15-20 دقيقة حتى يكتمل.
    5. أضف 2-3 مل من وسائط DMEM / F12 الخالية من المصل مع 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B إلى اللوحة ، مع تعليق الأنسجة المفرومة. ماصة المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل لتفتيت أي كتل.
  3. الهضم الأنزيمي
    1. انقل المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف وسائط DMEM / F12 الخالية من المصل إلى طبق زراعة الأنسجة حيث تم فرم الأنسجة المهبلية لجمع أي شظايا أنسجة متبقية. نقل الحل الذي يحتوي على شظايا الأنسجة إلى الأنبوب المخروطي. أضف وسائط DMEM / F12 إضافية خالية من المصل حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 10 مل.
    2. قم بإذابة 5 ملغ من ليبراز في 1 مل من الماء المعقم (5 ملغ / مل). يخزن في قسمة 230 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر أو -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
    3. أضف 230 ميكرولتر من ليبراز (مخزون 13 وحدة / مل) إلى الأنبوب ، مع التركيز النهائي 0.3 وحدة / مل.
      ملاحظة: قد يختلف نشاط Liberase بين الدفعات. قم بإذابة كل حصصة مباشرة قبل الاستخدام باستخدام حمام مائي. تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
    4. كرر الخطوات 2.1-2.3 ل 2-3 خزعات مهبلية إضافية لنفس المتبرع.
      ملاحظة: احتفظ بكل محلول يحتوي على شظايا الأنسجة من خزعة واحدة في أنابيب مخروطية منفصلة. على سبيل المثال ، 4 خزعات مهبلية في 4 أنابيب. هذا مهم لتكوير الخلايا الأمثل بعد الطرد المركزي.
    5. احتضان الأنابيب لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع تحريض مستمر وقوي باستخدام خلاط عينة.
    6. ضع خلاط عينة في حاضنة CO2 . الحفاظ على التحريض المستمر. (إعدادات خلاط العينة: 25 دورة في الدقيقة من الحركة الدورانية لمدة 5 ثوان ، و 30 درجة من الحركة المتبادلة (دوران الإمالة) لمدة 5 ثوان ، و 2 درجة من حركة الاهتزاز (الدوامة) لمدة 3 ثوان).
    7. أثناء الحضانة ، دوامة الأنابيب على فترات 30 دقيقة.
    8. أجهزة الطرد المركزي العينات في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
    9. أعد تعليق الحبيبات في وسائط 1-2 mLof DMEM / F12 مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B لتخفيف إنزيم Liberase . ماصة بقوة حتى يتم إعادة الحبيبات بالكامل.

3. ثقافة الخلية

  1. إزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة
    1. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر فوق حاوية مخروطية معقمة سعة 50 مل.
    2. اجمع معلق الخلية من خزعات الأنسجة المتعددة لنفس المتبرع معا.
    3. قم بتصفية الأنسجة / معلق الإنزيم ، واضغط من خلاله باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل. كرر هذه الخطوة حتى تظهر شظايا الأنسجة المتبقية مضغوطة بالكامل.
      ملاحظة: قد يكون هناك بعض المخاط من شظايا أنسجة المهبل التي لا تعمل بشكل كامل من خلال مصفاة. تجاهل المخاط مع مصفاة الخلية.
  2. تجميع زراعة الخلايا
    1. لوحة معلقة الخلايا المجمعة من خزعات مهبلية متعددة (من نفس المتبرع) على طبق بتري (60 مم × 15 مم).
    2. احتضان طبق بتري في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    3. مراقبة وتأكيد وجود خلايا غير ملتصقة باستخدام مجهر تباين الطور.
    4. تأكد من أن تركيز المجهر على الجزء السفلي من اللوحة.
      ملاحظة: قد يكون هناك العديد من الخلايا المناعية في المقدمة. سيتم إرفاق عدد أقل من الخلايا الليفية بأسفل اللوحة.
    5. انتظر لمدة 18-24 ساعة قبل تغيير وسائط زراعة الخلايا لضمان التصاق كاف بالخلايا.
    6. قم بتغيير وسط الاستزراع كل ثلاثة أيام حتى يحدث التقاء 80٪. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ ، قم بالتوسع إلى قارورة أكبر أو تجميد حصص الخلايا لاستخدامها في المستقبل.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع الأنسجة المهبلية من 10 متبرعين مستقلين يخضعون لجراحة هبوط أعضاء الحوض. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم عزل الخلايا من الأنسجة المهبلية البشرية. كان لمجموعات الخلايا مظهر ممدود ومسطح وشكل مغزل. مثل الدراسات الأخرى ، لاحظنا أبطأ بكثير في مضاعفة قدرات الخلايا وانخفاض القدرة الاستنساخية للخلايا الليفية مع زيادة عمر المتبرع. وقد لوحظت هذه الاختلافات عند مقارنة الخلايا الليفية المعزولة من الأفراد الأكبر سنا (75-78 سنة) مع تلك المعزولة من الأفراد الشباب (35-47 سنة). أظهرت خلايا المتبرعين في منتصف العمر مظهرا وسيطا (56-61 عاما). تم تقدير معدلات تكاثر الخلايا في البداية عن طريق التصور المباشر باستخدام مجهر تباين الطور بنفس كثافة البذر المعروفة.

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 1 تمثيلا بيانيا لبروتوكول التفكك والعزل. باتباع هذه الخطوات ، أسفر هذا البروتوكول عن معدل نجاح بنسبة 90٪ لعزل الخلايا الليفية الأولية في تسعة من كل عشرة متبرعين بأعداد كافية من الخلايا للسماح بزراعة الخلايا الفرعية. وبلغ متوسط عمر المتبرعين 59 عاما.

البروتوكول (المؤلف ، السنة)الأنسجة المانحة للبروتوكول الأصليعدد المتبرعينعمر المتبرع بالسنواتالخلايا الليفية التي تم الحصول عليهامورفولوجيا
رويز زاباتا وآخرون ، 2013المهبل البشري356-78لاغير متوفر
خان وآخرون ، 2016أذن الفأر والذيل248-65لاغير متوفر
وايز وآخرون ، 2019الأنسجة البشرية356-75لاغير متوفر
نادالوتي وآخرون ، 2020القلفة البشرية165لاغير متوفر
حاليالمهبل البشري1035-79نعمعلى شكل مغزل

الجدول 1: مقارنة بروتوكولات العزل الناجح للخلايا الليفية المهبلية البشرية. مقارنة بين بروتوكولات مختلفة موجودة مع بروتوكولاتنا ويتضح من النتائج المورفولوجية.

يوضح الجدول 1 نتائج استخدام بروتوكولات أخرى لمحاولة عزل الخلايا الليفية المهبلية في هذه الدراسة. قمنا بتطوير بروتوكول قياسي لعزل الخلايا الليفية الأولية من الغشاء المخاطي المهبلي والمتبرعين الأكبر سنا5.

اختبرنا العديد من البروتوكولات المعمول بها ، بما في ذلك تلك المدرجة في الجدول 1 ، ولم نلاحظ أي نجاح في عزل الخلايا باستخدام هذه البروتوكولات في دراستنا. نقترح الأسباب التالية لقيودها.

يتضمن البروتوكول الذي نشره Ruiz et al.3 كشط اللفافة وقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة. في تجربتنا ، من الصعب التمييز بين اللفافة ، وقد تؤدي محاولات الكشط إلى انخفاض كبير في إنتاجية الخلايا. في حين أن هذه الطريقة واضحة ومباشرة ، إلا أنها تفتقر إلى التفاصيل الهامة ، مما يحد من قابليتها للتعميم. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن الهضم الميكانيكي في هذا البروتوكول غير كاف لأنسجة ما بعد انقطاع الطمث ، والتي تميل إلى أن تكون أكثر كثافة.

تستخدم البروتوكولات التي نشرها Khan et al.9 و Waise et al.13 مقصا لتقطيع الأنسجة ، والتي لا تقدم قوى قص كبيرة متعددة الاتجاهات مقارنة بتقنية المشرط. في تجربتنا ، لم تعمل طريقة المقص بشكل فعال أيضا.

أخيرا ، لم ينجح بروتوكول Nadalutti et al.14 ، الذي استخدم طريقة الزرع ، في إنتاج الخلايا الليفية في أيدينا. قد تكون هذه الطريقة أقل فعالية بسبب طبيعة أنسجة ما بعد انقطاع الطمث ، والتي قد تتطلب معالجة ميكانيكية وإنزيمية أكثر عدوانية لفصل الخلايا الليفية بنجاح.

figure-results-2
الشكل 2: صورة تباين الطور للخلايا العالقة في اليوم 0. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 2 الخلايا العالقة في اليوم 0 باستخدام بروتوكولنا.

figure-results-3
الشكل 3: صورة تباين الطور للخلايا الليفية الأولية المهبلية في اليوم 14 من المزرعة عند تكبير 100x من معلق خلية مجمعة لثلاث خزعات من الأنسجة 1 سم2 . الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 3 الخلايا الليفية الأولية عند تكبير 100x من تعليق خلية مجمعة من 3 خزعات من الأنسجة بأبعاد 1 سم مربع.

تم التحقيق في هوية الخلايا الليفية من خلال تقنيات الفلورسنت المناعي كما هو موضح سابقا مع تعديلات طفيفة. للتحقق من الأصل الخلوي للخلايا المهبلية الأولية ، استخدمنا مؤشرات حيوية محددة من أصل الخلايا الليفية عن طريق تلطيخ المناعي. تم تحديد الخلايا على أنها خلايا ليفية بناء على التلوين الإيجابي للفيمنتين (الشكل 4) و F-actin و α-SMA من عينات الأنسجة قبل انقطاع الطمث وبعد انقطاع الطمث (الشكل 5). تم استزراع الخلايا الليفية للتوسع مع قابلية عالية (>90٪) لاستخدامها في التجارب.

figure-results-4
الشكل 4: تلطيخ إيجابي للفيمنتين في الخلايا الليفية المهبلية. خضعت الخلايا الليفية الأولية المعزولة قبل انقطاع الطمث وبعد انقطاع الطمث لتحليل IF وتم التقاط الصور بتكبير 200x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تلطيخ إيجابي ل F-actin و α-SMA للخلايا الليفية المهبلية. نتائج التعبير عن البروتين مقارنة مع السيطرة IgG. تم جمع الصور بتكبير 200x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذكرت العديد من الدراسات السابقة كيفية عزل الخلايا الليفية الأولية عن المهبل البشري 3,7. استخدمت العديد من الدراسات الأنسجة المهبلية البشرية من الأفراد قبل انقطاع الطمث مع هبوط أعضاء الحوض. على الرغم من أن بعض الأوراق أبلغت عن استخدام الأنسجة من الأفراد قبل انقطاع الطمث وبعدانقطاع الطمث 7،11 ، إلا أنها لم تصف بتفصيل كاف البروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الليفية بنجاح من المتبرعين الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث. يكون جدار المهبل أكثر سمكا في النساء بعد انقطاع الطمث المصابات بهبوط الأعضاء التناسلية منه عند النساء قبل انقطاع الطمث ، مما قد يفسر زيادة صعوبة العزلة في هذه الفئةمن السكان 13. يعد العزل الناجح عن المتبرعين بعد انقطاع الطمث أمرا ضروريا لنمذجة المرض والتحقيق فيه ، حيث أن اضطرابات قاع الحوض هي الأكثر انتشارا في الفئات العمرية بعد انقطاع الطمث أو الفئات العمرية الأكبر سنا.

أنشأنا بروتوكولا لحصاد وزراعة الخلايا الليفية المهبلية البشرية بنجاح وثبات من المتبرعين الذين تتراوح أعمارهم بين 35 و 78 عاما. تم تأكيد الأصل الخلوي للخلايا المهبلية الأولية من خلال المؤشرات الحيوية ذات الأصل الليفي عن طريق تلطيخ المناعي.

يتيح إجراء عزل الخلايا الليفية المهبلية البشرية المعروضة هنا عزل وزراعة الخلايا الليفية الأولية. في تجربتنا ، فشل استخدام البروتوكولات المنشورة سابقا للأنسجة الحيوانية9والبشرية3،14،16 لتفكك الخلايا الأولية في استخراج أي خلايا ليفية من عينات المهبل البشري في هذه الدراسة14.

افترضنا سببين محتملين لتحديات تفكك الخلايا عن الأنسجة المهبلية البشرية: (1) سمك الجلد من الغشاء المخاطي أكبر في المتبرعين الأكبر سنا وبالمقارنة مع الأنسجة غير المخاطية من المتبرعين الأكبر سنا13،17 مما يجعل تفكك الخلايا أكثر صعوبة و (2) قد تنخفض كثافة الخلايا الليفية بشكل ملحوظ في الأفراد الأكبر سنا17.

بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك بعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي لا ينبغي تعديلها. الخطوة الأولى الحاسمة هي تنفيذ عملية هضم ميكانيكية صارمة للغاية. هنا ، نستخدم تقنية المشرطين. في تجربتنا ، فإن الاستبدال بالمقص لفرم الأنسجة لا ينتج عنه شظايا صغيرة بما يكفي لفصل الخلايا الليفية عن الأنسجة المهبلية البشرية.

الخطوة الحاسمة الأخرى هي تجميع تعليق الخلية وتجميع 3-4 خزعات كاملة السماكة (1 سم2) من متبرع واحد. هذا ضروري للحصول على خلايا كافية للزراعة المستمرة. في جميع الحالات ، حصدنا أنسجة أكثر بكثير من 1 سم2 حيث يتم قطع ظهارة المهبل الزائدة كجزء ضروري من جراحة هبوط أعضاء الحوض. في هذه الدراسة ، قمنا فقط بتجميع معلقات الخلايا التي نشأت من نفس المتبرع حيث سعينا للتحقيق والتمييز بين الخصائص الخلوية والانتشار بين مختلف المتبرعين.

يتميز بروتوكولنا بميزة واضحة: يؤدي الهضم الميكانيكي والأنزيمي إلى غلات أفضل للأنسجة بعد انقطاع الطمث ، ولكن ليس له تأثير سلبي على عينات ما قبل انقطاع الطمث.

نحن نقر بالعديد من القيود على بروتوكولنا. قد يكون الوصول إلى الأنسجة المهبلية البشرية أمرا صعبا في الحالات التي لا يتم فيها إجراء جراحة هبوط المهبل. قد تكون الحاجة إلى تجميع معلقات الخلايا لعينات خزعة الأنسجة المتعددة أيضا قيودا.

في الختام ، سيكون هذا البروتوكول للحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية أداة مفيدة للتحقيقات المستقبلية في اضطرابات قاع الحوض ، خاصة في الأفراد بعد انقطاع الطمث بالإضافة إلى إضافة مهمة لأبحاث صحة المرأة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن امتناننا لجميع أعضاء مركز فنسنت للبيولوجيا الإنجابية في مستشفى ماساتشوستس العام ، وكذلك مؤسسة مستشفى فينسنت التذكاري ، على دعمهم السخي. شكر خاص للدكتور بو رويدا ومختبره على اقتراحاتهم القيمة وعلى إعارتنا معدات المختبر.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أمفوتريسين بيبيو تيكنيB23192
مصفاة خلوية (100 مو ؛ م)ThermoFisher
Scientific (15 مل) فيشرالعلمي   ؛14-959-53A
DMEM / F12ThermoFisher Scientific11320033
ريشة مشرط يمكن التخلص منه رقم 15SocorexFB.15
مصل الأبقار الجنينيSigma AldrichNC1983075
أنابيب الطرد المركزي المخروطية عالية الوضوح (50 مل) فيشرالعلمية & nbsp ؛14-432-22
HulaMixer خلاط عينةThermoFisher Scientific15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISAR & D SystemsDY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISAR & D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
Penicillin / Streptomycin (5000U / ml)ThermoFisher Scientific15070063
أطباق بتري ، بوليسترين (100 مم × 20 مم)Millipore SigmaP5606
ماصات مصلية (10 مل)ThermoFischer Scientific170356N
محاقن معقمة (5 مل)فيشر ساينتوانتيك14-955-458
أنابيب الطرد المركزي المخروطية 22363549

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).">Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
  2. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).">MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
  3. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).">Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
  4. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).">Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).">Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
  6. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).">Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
  7. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
  8. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).">Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
  9. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).">Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
  10. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
  11. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).">Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
  12. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).">Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
  13. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).">Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
  14. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).">Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
  15. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).">Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
  16. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).">Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
  17. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).">Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vaginal Fibroblast IsolationPrimary FibroblastsPelvic Organ ProlapseHuman Vaginal TissueMechanical DissociationEnzymatic DigestionCell Suspension PoolingPostmenopausal TissuePhase Contrast MicroscopyImmunofluorescence Analysis

Related Articles