يوضح هذا البروتوكول تقنية موثوقة وفعالة لعزل الخلايا الليفية الأولية من الأنسجة المهبلية البشرية قبل انقطاع الطمث أو بعد انقطاع الطمث. لا تأخذ البروتوكولات الحالية لعزل الخلايا الليفية المهبلية في الاعتبار تحديات عزل الخلايا عن الأنسجة الهرمة. تم الحصول على الأنسجة المهبلية من النساء بعد جراحة هبوط أعضاء الحوض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
معالجة الأنسجة وعزل الخلايا الليفية الأولية من المهبل البشري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هبوط أعضاء الحوض هو اضطراب يؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرأة. يحدث عندما تضعف العضلات والأربطة وتتسبب في انخفاض أعضاء الحوض في الحوض ، مما يخلق انتفاخا في المهبل. كانت الجراحة لتصحيح هبوط أعضاء الحوض علاجا أساسيا. في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بدراسة تكوين الأنسجة للمرضى الذين يعانون من هبوط على المستوى الخلوي.
يوجد حاليا إجماع ضئيل فيما يتعلق بتأثير عمر المتبرع أو المريض على العلاجات القائمة على الخلايا. تركز البروتوكولات المنشورة الحالية لعزل الخلايا الليفية المهبلية إما على أنسجة ما قبل انقطاع الطمث أو تهمل التعليق على عمر الأنسجة المانحة. تستخدم معظم البروتوكولات الحالية نماذج حيوانية. اتساق الأنسجة المهبلية البشرية أكثر كثافة من الأنسجة المستخدمة في معظم البروتوكولات. في هذه الدراسة ، تم الحصول على الأنسجة المهبلية البشرية في المقام الأول من المتبرعين الأكبر سنا ، مما ساهم على الأرجح في فشل البروتوكولات الحالية.
الهدف من هذه الدراسة هو وصف بروتوكول قياسي للحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية بشكل موثوق ، بغض النظر عن عمر المتبرع وحالة انقطاع الطمث. تم استنساخ النتائج باستخدام أنسجة من تسعة متبرعين منفصلين خضعوا لجراحة هبوط أعضاء الحوض. كان ستة مرضى في مرحلة ما بعد انقطاع الطمث ، وكان أكبر متبرع يبلغ من العمر 78 عاما. كان متوسط عمر المتبرعين بالأنسجة 59.
هنا ، نصف طريقة موثوقة لتوليد تعليق خلية واحدة غني بالخلايا الليفية باستخدام مزيج من التفكك الأنزيمي والميكانيكي وتجميع تعليق الخلايا لخزعات مهبلية متعددة من متبرع واحد. قد يكون العزل الموثوق للخلايا الليفية الأولية المهبلية البشرية مفيدا في دراسة هبوط أعضاء الحوض وكذلك تفاعلات الميكروبيوم والمضيف.
المقدمة
التفاوت بين الجنسين في العلوم والبحوث هو قضية مستمرة. البحث في الاضطرابات التي تؤثر في المقام الأول على الأشخاص من جنس الإناث يعاني من نقص التمويل1. هبوط أعضاء الحوض هو اضطراب يرتبط بقوة بالجنس الأنثوي. يحدث عندما تضعف العضلات والأربطة وتتسبب في انخفاض أعضاء الحوض في الحوض ، مما يخلق انتفاخا في المهبل2. لا يعرف سوى القليل عن التفاعلات الخلوية في سياق هذه الفيزيولوجيا المرضية ، ولا كيف تؤثر عوامل مستوى الأنسجة على نجاح التدخلات الجراحية3.
من المسلم به على نطاق واسع أن الخلايا الأولية بدلا من خطوط الخلايا ضرورية للبحث السريري الانتقالي في توفير المزيد من الأهمية الفسيولوجية4. تؤخذ الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة الجسم ذات الأهمية وقد تحاكي بدقة أكبر علم وظائف الأعضاء في الجسم الحي . قد يكون عزل الخلايا الليفية الأولية من المهبل البشري مفيدا لدراسة الآليات البيولوجية لهبوط أعضاء الحوض ونمذجة المرض ، مع مراعاة خصائص المتبرع الرئيسية ، مثل العمر وحالة انقطاع الطمث.
يؤثر هبوط أعضاء الحوض عادة على الأفراد الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث. يمثل عزل وتكاثر الخلايا الليفية الأولية في دراسة هذه الحالة تحديا بسبب انخفاض عدد الخلايا والقدرة الاستنساخية من المتبرعين الأكبر سنا5. في تجربتنا ، فشل استخدام البروتوكولات الموصوفة سابقا لتفكك الأنسجة المهبلية في استخراج أي خلايا ليفية من خزعة الأنسجة القياسية 1 سم2 .
من خلال مراجعة الأدبيات ، وجدنا أن دراسات مماثلة تم تقسيمها إلى مجموعتين: النماذج الحيوانية ، مثل الفئران6 ، والنماذج البشرية 7,8. عند اتباع بروتوكول الماوس ، أدى استخدام المقص لمعالجة أنسجة الأنسجة المهبلية البشرية إلى عدم كفاية الهضم الميكانيكي. لم ينجح استقراء البروتوكولات باستخدام أنسجة الفئران ومواقع الأنسجة الأخرى9.
استخدمت معظم الأوراق التي تستخدم عينات مهبلية بشرية أنسجة من أفراد ما قبل انقطاع الطمث مع هبوط أعضاء الحوض 7,10. على الرغم من أن بعض الأوراق أبلغت عن استخدام عينات من كل من الأفراد قبل انقطاع الطمث وبعدانقطاع الطمث 11 ، إلا أنها لم تصف بتفصيل كاف البروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الليفية بنجاح من المتبرعين الأكبر سنا أو بعد انقطاع الطمث. قد يكون العزل ونمذجة المرض باستخدام الخلايا الليفية من أنسجة ما بعد انقطاع الطمث ضروريا لفهم الفيزيولوجيا المرضية الخلوية لهبوط أعضاء الحوض ، حيث أن هذه الحالة لها أعلى معدل انتشار لدى الأفراد في العقد التالي لانقطاع الطمث12.
وصفنا طريقة لعزل وزراعة تعليق خلية واحدة غنية بالخلايا الليفية من الأنسجة المهبلية البشرية باستخدام مزيج من التفكك الميكانيكي والإنزيمي. توضح هذه المقالة بروتوكولا موثوقا به حول كيفية الحصول على الخلايا الليفية المهبلية البشرية بعد انقطاع الطمث أو الشيخوخة. تم التأكد من أن الخلايا المعزولة هي خلايا ليفية من خلال الفحص المورفولوجي باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور والتألق المناعي (IF) لتقييم التعبير عن الفيمنتين و F-actin وأكتين العضلات الملساء α (α-SMA).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على الأنسجة المهبلية من النساء اللائي يخضعن لجراحة هبوط أعضاء الحوض. تم اعتبار الأنسجة المهبلية التي تم جمعها بعد الجراحة نفايات وسيتم التخلص منها بخلاف ذلك. تم إجراء الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية في ماساتشوستس جنرال بريغام.
1. حصاد الأنسجة المهبلية من المريض
- تشخيص هبوط أعضاء الحوض عن طريق أخذ التاريخ واستخدام نتائج فحص الحوض: تم الحصول على قياسات القياس الكمي لهبوط أعضاء الحوض (POP-Q) في العيادة ، مما يدل على هبوط أعضاء الحوض.
- استخدم معايير الإدراج التالية: أكثر من 18 سنة من العمر ؛ تاريخ هبوط أعضاء الحوض أعراض. اختيار التصحيح الجراحي لهبوط أعضاء الحوض.
- استبعاد ما يلي: النساء الحوامل والمرضى الذين يرفضون التبرع بالأنسجة.
- تقليم الأنسجة المهبلية الزائدة كخطوة ضرورية لجراحة هبوط أعضاء الحوض. يتم استئصال هذه الظهارة المهبلية بسماكة كلية بعد العمليات الجراحية التالية: القولون الأمامي ، القولون الخلفي ، والتهاب المهبل.
- انقل الأنسجة إلى المختبر في كوب معقم لجمع العينات باستخدام وسائط DMEM / F12 (Gibco) العادية المالحة أو الخالية من المصل. ابق على الجليد.
2. معالجة الأنسجة والهضم
- تحضير الأنسجة
- قم بقياس وقطع الأنسجة لتشمل السماكة الكاملة للظهارة المهبلية ، مما يخلق شرائح تبلغ حوالي 1 سم2.
- تأكد من القياس الدقيق لحجم الخزعة 1 سم2.
ملاحظة: المبالغة في تقدير حجم خزعة الأنسجة قد تضعف هضم الأنسجة. - تحضير 2-3 خزعات مهبلية إضافية بقياس 1 سم2 لكل منها من متبرع واحد ووضع الخزعات جانبا.
- الهضم الميكانيكي
- ضع الخزعة المهبلية في طبق بتري لزراعة الخلايا 10 سم. ماصة 500-1000 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل مكملة ب 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين بونتو الأنسجة المهبلية لمنع الأنسجة من الجفاف.
- فرم الأنسجة المهبلية إلى شظايا صغيرة باستخدام مشرطين معقمين (رقم 11 أو رقم 15) في كلتا اليدين.
- تأكد من أن أطراف الشفرات متعامدة مع سطح الأنسجة. ضع ضغطا متساويا وثابتا على سطح الأنسجة باستخدام مشرطين. قم بإجراء سحب بالتناوب لقطع الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا.
- كرر تقنية الفرم هذه باستخدام تقنية المشرطين حتى تصبح العينة ذات تناسق موحد مع قطع 1-2 مم.
ملاحظة: يجب أن يستغرق الهضم الميكانيكي باستخدام هذه التقنية ثنائية المشرط لخزعة 1 سم2 حوالي 15-20 دقيقة حتى يكتمل. - أضف 2-3 مل من وسائط DMEM / F12 الخالية من المصل مع 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B إلى اللوحة ، مع تعليق الأنسجة المفرومة. ماصة المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة لأعلى ولأسفل لتفتيت أي كتل.
- الهضم الأنزيمي
- انقل المحلول الذي يحتوي على شظايا الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف وسائط DMEM / F12 الخالية من المصل إلى طبق زراعة الأنسجة حيث تم فرم الأنسجة المهبلية لجمع أي شظايا أنسجة متبقية. نقل الحل الذي يحتوي على شظايا الأنسجة إلى الأنبوب المخروطي. أضف وسائط DMEM / F12 إضافية خالية من المصل حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 10 مل.
- قم بإذابة 5 ملغ من ليبراز في 1 مل من الماء المعقم (5 ملغ / مل). يخزن في قسمة 230 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر أو -80 درجة مئوية لمدة 6 أشهر.
- أضف 230 ميكرولتر من ليبراز (مخزون 13 وحدة / مل) إلى الأنبوب ، مع التركيز النهائي 0.3 وحدة / مل.
ملاحظة: قد يختلف نشاط Liberase بين الدفعات. قم بإذابة كل حصصة مباشرة قبل الاستخدام باستخدام حمام مائي. تجنب التجميد والذوبان المتكرر. - كرر الخطوات 2.1-2.3 ل 2-3 خزعات مهبلية إضافية لنفس المتبرع.
ملاحظة: احتفظ بكل محلول يحتوي على شظايا الأنسجة من خزعة واحدة في أنابيب مخروطية منفصلة. على سبيل المثال ، 4 خزعات مهبلية في 4 أنابيب. هذا مهم لتكوير الخلايا الأمثل بعد الطرد المركزي. - احتضان الأنابيب لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع تحريض مستمر وقوي باستخدام خلاط عينة.
- ضع خلاط عينة في حاضنة CO2 . الحفاظ على التحريض المستمر. (إعدادات خلاط العينة: 25 دورة في الدقيقة من الحركة الدورانية لمدة 5 ثوان ، و 30 درجة من الحركة المتبادلة (دوران الإمالة) لمدة 5 ثوان ، و 2 درجة من حركة الاهتزاز (الدوامة) لمدة 3 ثوان).
- أثناء الحضانة ، دوامة الأنابيب على فترات 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي العينات في 3000 × غرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة وتجاهل المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في وسائط 1-2 mLof DMEM / F12 مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) و 100 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B لتخفيف إنزيم Liberase . ماصة بقوة حتى يتم إعادة الحبيبات بالكامل.
3. ثقافة الخلية
- إزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة
- ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر فوق حاوية مخروطية معقمة سعة 50 مل.
- اجمع معلق الخلية من خزعات الأنسجة المتعددة لنفس المتبرع معا.
- قم بتصفية الأنسجة / معلق الإنزيم ، واضغط من خلاله باستخدام مكبس حقنة سعة 5 مل. كرر هذه الخطوة حتى تظهر شظايا الأنسجة المتبقية مضغوطة بالكامل.
ملاحظة: قد يكون هناك بعض المخاط من شظايا أنسجة المهبل التي لا تعمل بشكل كامل من خلال مصفاة. تجاهل المخاط مع مصفاة الخلية.
- تجميع زراعة الخلايا
- لوحة معلقة الخلايا المجمعة من خزعات مهبلية متعددة (من نفس المتبرع) على طبق بتري (60 مم × 15 مم).
- احتضان طبق بتري في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
- مراقبة وتأكيد وجود خلايا غير ملتصقة باستخدام مجهر تباين الطور.
- تأكد من أن تركيز المجهر على الجزء السفلي من اللوحة.
ملاحظة: قد يكون هناك العديد من الخلايا المناعية في المقدمة. سيتم إرفاق عدد أقل من الخلايا الليفية بأسفل اللوحة. - انتظر لمدة 18-24 ساعة قبل تغيير وسائط زراعة الخلايا لضمان التصاق كاف بالخلايا.
- قم بتغيير وسط الاستزراع كل ثلاثة أيام حتى يحدث التقاء 80٪. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ ، قم بالتوسع إلى قارورة أكبر أو تجميد حصص الخلايا لاستخدامها في المستقبل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم جمع الأنسجة المهبلية من 10 متبرعين مستقلين يخضعون لجراحة هبوط أعضاء الحوض. باستخدام البروتوكول الموصوف ، تم عزل الخلايا من الأنسجة المهبلية البشرية. كان لمجموعات الخلايا مظهر ممدود ومسطح وشكل مغزل. مثل الدراسات الأخرى ، لاحظنا أبطأ بكثير في مضاعفة قدرات الخلايا وانخفاض القدرة الاستنساخية للخلايا الليفية مع زيادة عمر المتبرع. وقد لوحظت هذه الاختلافات عند مقارنة الخلايا الليفية المعزولة من الأفراد الأكبر سنا (75-78 سنة) مع تلك المعزولة من الأفراد الشباب (35-47 سنة). أظهرت خلايا المتبرعين في منتصف العمر مظهرا وسيطا (56-6...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ذكرت العديد من الدراسات السابقة كيفية عزل الخلايا الليفية الأولية عن المهبل البشري 3,7. استخدمت العديد من الدراسات الأنسجة المهبلية البشرية من الأفراد قبل انقطاع الطمث مع هبوط أعضاء الحوض. على الرغم من أن بعض الأوراق أبلغت عن استخدام الأنسجة من الأفراد قبل انقطاع الطمث وبعدانقطاع الطمث 7،11 ، إلا أنها لم تصف بتفصيل كاف البروتوكول المستخدم لعزل الخلايا الليفية بنجاح من الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
نود أن نعرب عن امتناننا لجميع أعضاء مركز فنسنت للبيولوجيا الإنجابية في مستشفى ماساتشوستس العام ، وكذلك مؤسسة مستشفى فينسنت التذكاري ، على دعمهم السخي. شكر خاص للدكتور بو رويدا ومختبره على اقتراحاتهم القيمة وعلى إعارتنا معدات المختبر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أمفوتريسين بي | بيو تيكني | B23192 | |
| مصفاة خلوية (100 مو ؛ م) | ThermoFisher | ||
| Scientific (15 مل) فيشر | العلمي ؛ | 14-959-53A | |
| DMEM / F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| ريشة مشرط يمكن التخلص منه رقم 15 | Socorex | FB.15 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطية عالية الوضوح (50 مل) فيشر | العلمية & nbsp ؛ | 14-432-22 | |
| HulaMixer خلاط عينة | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Human Fibronectin DuoSet ELISA | R & D Systems | DY1918-05 | |
| Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA | R & D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicillin / Streptomycin (5000U / ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| أطباق بتري ، بوليسترين (100 مم × 20 مم) | Millipore Sigma | P5606 | |
| ماصات مصلية (10 مل) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| محاقن معقمة (5 مل) | فيشر ساينتوانتيك | 14-955-458 |
المراجع
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
