Method Article

التفكك الميكانيكي للأنسجة لتحليل الخلية المفردة باستخدام جهاز آلي

DOI:

10.3791/65866

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2UMD Terrapin Works, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير بروتوكول عام للتفكك الميكانيكي الأنزيمي وشبه الآلي المشترك للأنسجة لتوليد معلقات أحادية الخلية للتحليلات النهائية ، مثل قياس التدفق الخلوي. يتم تضمين تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل الجهاز الميكانيكي منخفض التكلفة الذي تم تطويره لهذا البروتوكول.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت القدرة على عزل الخلايا المفردة وإعدادها لتحليل عينات الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات والأبحاث الطبية الحيوية الجديدة. تستغرق البروتوكولات اليدوية لعمليات عزل الخلية الواحدة وقتا طويلا للغاية وعرضة لتنوع المستخدم. البروتوكولات الميكانيكية الآلية قادرة على تقليل وقت المعالجة وتنوع العينات ولكن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو فعالة من حيث التكلفة في إعدادات البحث منخفضة الموارد. تم تصميم الجهاز الموصوف هنا لتفكك الأنسجة شبه الآلي باستخدام المواد المتاحة تجاريا كبديل منخفض التكلفة للمختبرات الأكاديمية. تم توفير تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل تصميم الجهاز. ينتج بروتوكول التفكك بشكل موثوق معلقات أحادية الخلية مع إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة للمستحضرات اليدوية عبر أنسجة الفئران المتعددة. يوفر البروتوكول القدرة على معالجة ما يصل إلى 12 عينة من الأنسجة في وقت واحد لكل جهاز ، مما يجعل الدراسات التي تتطلب أحجام عينات كبيرة أكثر قابلية للإدارة. يسمح البرنامج المصاحب أيضا بتخصيص بروتوكول الجهاز لاستيعاب الأنسجة المختلفة والقيود التجريبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تحليل الخلية الواحدة سريعا أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات الطبية الحيوية الجديدة ، سواء لتطبيقات مثل قياس التدفق الخلوي ، وتحديد أنواع الخلايا المختلفة ، أو تسلسل الخلية الواحدة ، أو لتحديد الاختلافات الجينومية أو النسخية بين الخلايا1. يتطلب إجراء عمليات عزل الخلايا هذه من الأنسجة ذات الأهمية فرم الأنسجة المقطعة ودفعها عبر مصفاة خلايا دقيقة لتصفية النسيج الضام من الخلايا المرغوبة (الشكل 1 أ). يتطلب عزل أنواع الخلايا الملتصقة ، مثل الخلايا المتغصنة أو الضامة ، أو الخلايا من الأنسجة الليفية بشكل خاص ، خطوات فصل ميكانيكية أو إنزيمية إضافية2،3،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية UMD (IACUC). تم استخدام الأنسجة من إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 7 إلى 9 أسابيع لهذه الدراسات. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. التفكك اليدوي

ملاحظة: هذه الخطوة مقتبسة من Maisel K. et al.7.

  1. قم بإزالة الأنسجة المقطعة وضعها في وسط زراعة الخلايا الباردة باستخدام مصل بقري الجنين بنسبة 5٪ (FBS).
  2. اقطع الأنسجة باستخدام مقص تشريح حاد حتى تصبح الشظايا أصغر من 1 مم في أي بعد.
  3. انقل المنديل المفروم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5 مل من الوسا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن لهذا البروتوكول الميكانيكي شبه الآلي تكرار نتائج التجارب التي تمت فيها معالجة الخلايا يدويا. تظهر معلقات الخلايا المحضرة باستخدام هذا الجهاز وعن طريق التفكك اليدوي إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة عبر رئة الفأر والكلى وأنسجة القلب (الشكل 2 أ ، ب). لم تتأثر مجموعات الخلايا المناعية ، مثل الخلايا التائية والخلايا المتغصنة ، بشكل كبير باختلاف في بروتوكول العزل (الشكل 2C). وبالمثل ، يظهر تحليل تعبير العلامات السطحية على مجموعات الخلايا المناعي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم هذا الجهاز لسهولة التجميع في إعداد البحث لتوفير معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الكاملة لتحليل الخلية الواحدة لاحقا. الميزات ، على الرغم من أنها أساسية ، كافية لتلبية احتياجات الباحثين في البيئات الأكاديمية وخارجها. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لاستخدام هذا الجهاز في قدرته على تحسين إعداد المعلقات أحادية الخلية عن طريق تقليل التباين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي القدرة على معالجة عينات 12+ في وقت واحد إلى تعزيز الاتساق من عينة إلى عينة ، والتي قد تتأثر بزيادة الوقت اللازم لبروتوكولات التفكك اليدوي. في المؤسسات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تلقي التمويل من قسم فيشيل للهندسة الحيوية (KM) ، و T32 GM080201 (MA) ، وزمالة Vogel الصيفية الممنوحة (MA) ، ومؤسسة LAM (KM) ، وجمعية الرئة الأمريكية (KM). يود المؤلفون أن يشكروا ميشيل كالوزينسكي على المساعدة في التحرير.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
¼ بوصة ورقة أكريليك  12 × 24 بوصةأكريليك ميجا ستورN / A
½ بوصة ورقة أكريليك 12 بوصة × 12 بوصةSimbaLuxSL-AS13-12x12
12 G أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ (لأذرع التوتر)Everbilt1000847413
16 G سلك كهربائي (تقطعت بهم السبل)أفضل التوصيلاتغير
متوفرة2 × 3 مم مغناطيس   لوحة ترحيل SU-CRO0587N / A
2 قناة (لعكس قطبية التيار إلى المحركات)AEDIKOAE06233
محركات تيار مستمر بقطر 37 مم (12 فولت ، 200 دورة في الدقيقة) × 12GreartisanN / Aعزم الدوران المقدر: 2.2 Kg.cm
نسبة التخفيض: 1: 22
التصنيف الحالي: 0.1 A
D حجم عمود الإخراج: 6 × 14 مم (0.24 بوصة × 0.55 بوصة) (D x L)
حجم علبة التروس: 37 × 25 مم (1.46 بوصة × 0.98 بوصة) (عمق × طول)
حجم المحرك: 36.2 × 33.3 مم (1.43 بوصة × 1.31 بوصة) (عمق × طول)
حجم ثقب التركيب: M3 (غير مدرج)
محول طاقة AC / C مع وحدة تحكم في الجهد المتغير   ؛   (5 أمبير ، 3-12 فولت)Mo-guJ19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A محول باك الدقة تنحي محولWalfront1A(محول الطاقة لتشغيل Arduino Nano)
Arduino Nano & nbsp ؛   (لافين)أزرار LAFVIN8541582500
 AwpeyePush-button
C57BL6 / J الفئران  جاكسون مختبر
كولاجيناز 4ورثينجتونCLS4 LS004188
كولاجيناز ديروش11088866001
DMEM (وسط النسر المعدل من دولبيكو)كورنينج10-013-CV
DNAseRoche11284932001
شريط رغوي مزدوج الجوانبSANKAN / A
لوحة دوائر النماذج الأولية على الوجهينdeyueN / A
EDTASIGMA- AldrichE7889
كهربائي ولحامالحديد LDK1002P
شريط كهربائي3M03429NA
FBS (مصل الأبقار الجنينية)Gibco16140089
gentleMACS C TubesMiltenyi130-093-237
برنامج Graphpad PrismGraphPad و La Jolla و CAمستشعر تأثير القاعة
الأبعاد : 0.79 × 0.79 × 0.39 بوصةSunFounder43237-2
مقرنة سداسية 6 مم نحاسية بمحرك تتحمل × 2 × 12مسامير رأس سداسية UxcellN / A
(برغي غطاء رأس سداسي M4-.70 × 12) × 12FASN / A
(ل Arduino Nano)ELEGOOEL-CP-004
شاشة LCDJANSANEN / A
M3 مسامير غطاء رأس مقبس سداسية × 12Shenzhen
Baishichuangyou
Technology Co. Ltd		310luosditaozhuang
M3 الفولاذ المقاوم للصدأمسامير الماكينة مسامير غطاء مقبس سداسي الرأس المسطح (30 مم) × 36لا يزال مستيقظاa52400001
موصلات طرفية سريعة الفصلIEUYO22010064
عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء (10x)إشارات الخلية46232
درع محول طرفي لوحة التوسع ل Arduino Nano & nbsp ؛ 12 "× 24"Shenzhen
Weiyapuhua
التكنولوجيا		60-026-3
لحام أسلاك توصيل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).
  2. Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue DissociationSingle Cell AnalysisMechanical DissociationMotorized DeviceCell SuspensionFlow CytometryCell ViabilityImmune Cell IsolationSurface Marker ExpressionRed Blood Cell Lysis

Related Articles