يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65867

⸱

يناير 26, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لتقييم ما إذا كانت EVs الصغيرة (sEVs) المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل الحاجز الدموي الدماغي في إناث الفئران البالغة غير الحوامل.

الملخص

وتشكل المضاعفات الدماغية الوعائية، بما في ذلك الوذمة الدماغية والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية، السبب الرئيسي لوفيات الأمهات المرتبطة بمقدمات الارتعاج. الآليات الكامنة وراء هذه المضاعفات الدماغية الوعائية لا تزال غير واضحة. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بخلل المشيمة واضطراب حاجز الدم في الدماغ (BBB). ومع ذلك ، لا يزال يتم تحديد العلاقة بين هذين الجهازين البعيدين. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المشيمة تطلق جزيئات الإشارة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية ، في الدورة الدموية للأم. يتم تصنيف الحويصلات خارج الخلية وفقا لحجمها ، مع الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs أصغر من 200 نانومتر في القطر) تعتبر جزيئات إشارات حرجة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في تسمم الحمل ، هناك عدد متزايد من sEVs المتداولة في الدورة الدموية للأمهات ، والتي لا يتم فهم وظيفة الإشارة إليها جيدا. تحفز التشوهات المشيمية التي يتم إطلاقها في مقدمات الارتعاج أو من مشيمة الحمل الطبيعية المعرضة لنقص الأكسجة الخلل البطاني في الدماغ وتعطيل BBB. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم ما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل BBB في الجسم الحي.

المقدمة

ما يقرب من 70 ٪ من وفيات الأمهات بسبب تسمم الحمل ، ومتلازمة الحمل ارتفاع ضغط الدم التي تتميز بضعف عمليات المشيمة ، والخلل البطاني الجهازي للأم ، وفي الحالات الشديدة ، الفشل متعدد الأعضاء1،2 ، ترتبط بمضاعفات الأوعية الدموية الدماغية الحادة 3,4. تحدث معظم وفيات الأمهات في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل5. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة على الرغم من الأهمية السريرية والوبائية للمضاعفات الدماغية الوعائية المرتبطة بتسمم الحمل.

من ناحية أخرى ، تعد الحويصلات خارج الخلية (EVs) (القطر ~ 30-400 نانومتر) وسطاء أساسيين للتواصل بين الخلايا بين الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك التفاعل بين الأم والمشيمة6. بالإضافة إلى البروتينات والدهون على السطح الخارجي ، تحمل المركبات الكهربائية البضائع داخل (البروتينات والحمض النووي الريبي والدهون). يمكن تصنيف EVs إلى (1) exosomes (قطر ~ 50-150 نانومتر ، وتسمى أيضا EVs الصغيرة (sEVs)) ، (2) EVs متوسطة / كبيرة ، و (3) أجسام موت الخلايا المبرمج ، والتي تختلف حسب الحجم ، والتكوين الحيوي ، والمحتوى ، ووظيفة الإشارات المحتملة. يتم تحديد تكوين EVs من خلال الخلايا التي تنشأ منها ونوع المرض7. تعبر المركبات الكهربائية المشتقة من الأرومة المخلبية عن الفوسفاتيز القلوي المشيمي (PLAP)8,9 ، والذي يكتشف المركبات الكهربائية الصغيرة المنتشرة المشتقة من المشيمة (PDsEVs) أثناء الحمل. أيضا ، يساعد PLAP على تمييز التغيرات في حمولة PDsEVs وآثارها في تسمم الحمل مقابل الحمل المعياري10،11،12،13،14،15.

تم التعرف على المشيمة كعنصر ضروري في الفيزيولوجيا المرضية لتسمم الحمل16 أو المضاعفات الدماغية المرتبطة بهذا المرض17،18،19. ومع ذلك ، كيف يمكن لهذا العضو البعيد أن يحدث تغييرات في الدورة الدموية في الدماغ غير معروف. نظرا لأن sEVs تلعب أدوارا محورية في الاتصال من خلية إلى خلية نظرا لقدرتها على نقل المكونات النشطة بيولوجيا من الخلايا المانحة إلى الخلايا المتلقية6،20،21 ، فقد ربط عدد متزايد من الدراسات sEVs المشيمة بتوليد خلل وظيفي في بطانة الأم21،22،23،24 ، بما في ذلك الخلايا البطانية للدماغ25,26في النساء المصابات بتسمم الحمل. وبالتالي ، فإن حل وسط وظيفة بطانة الدماغ قد يؤدي إلى تعطيل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، وهو عنصر حاسم في المضاعفات الوعائية الدماغية المرتبطة بتسمم الحمل3،27.

ومع ذلك ، فإن النتائج قبل السريرية باستخدام الأوعية الدماغية للفئران المعرضة لمصل النساء المصابات بتسمم الحمل28 أو الخلايا البطانية للدماغ البشري المعرضة لبلازما النساء المصابات بتسمم الحمل29 ذكرت أن العامل (العوامل) المنتشرة تحفز تعطيل BBB. على الرغم من وجود العديد من المرشحين الذين لديهم القدرة على إلحاق الضرر ب BBB الموجود في الدورة الدموية للأم أثناء تسمم الحمل ، مثل المستويات المرتفعة من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي عامل نخر الورم)18,28 أو منظمات الأوعية الدموية (أي عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF))29,30,31 ، أو الجزيئات المؤكسدة مثل البروتينات الدهنية المؤكسدة (oxo-LDL)32,33 ، من بين أمور أخرى34، لا يقيم أي منهم اتصالا مباشرا بين المشيمة و BBB. في الآونة الأخيرة ، أظهرت sEVs المعزولة من المشيمة التي تعاني من نقص الأكسجين القدرة على تعطيل BBB في الفئران الإناث غيرالحوامل 25. نظرا لأن sEVs المشيمة قد تحمل معظم العوامل المتداولة المدرجة مع القدرة على تعطيل BBB ، تعتبر sEVs مرشحة مناسبة لتوصيل المشيمة المصابة ، وتكون حاملة لعوامل الدورة الدموية الضارة ، وتعطل BBB في تسمم الحمل.

يسمح لنا هذا البروتوكول بالتحقيق فيما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين يمكن أن تعطل BBB في إناث الفئران غير الحوامل كوكيل لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمضاعفات الدماغية أثناء تسمم الحمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ المعبر عنها في إعلان هلسنكي وبإذن من مجالس المراجعة الأخلاقية المعنية. أعطى جميع المشاركين من البشر موافقتهم المستنيرة قبل جمع العينات ، كما ورد سابقا25. وبالإضافة إلى ذلك، وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا والسلامة البيولوجية التابعة لجامعة بيو - بيو على هذا المشروع (منحة Fondecyt 1200250). تم إجراء العمل الحيواني وفقا للمبادئ الأساسية للثلاثة R في استخدام في التجربة35 ، ووفقا لتوصيات المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر التي نشرها المعهد الوطني الأمريكي للصحة. تم الاحتفاظ بالحيوانات في بيئات مناسبة في بيت بجامعة بيو بيو. تم الحصول على المشيمة الطازجة (ن = 4) في غضون 1 ساعة بعد العملية القيصرية الاختيارية من الأمهات (الذين تتراوح أعمارهم بين 28-31 سنة) مع الحمل الطبيعي في المدى (38 إلى 41 أسبوعا من الحمل). تم إجراء العمليات القيصرية في مستشفى هيرميندا مارتن السريري ، تشيلان ، تشيلي ، كما ورد سابقا25. لتطبيق نموذج الجسم الحي ، تم استخدام إناث الفئران غير الحوامل البالغة من العمر 4-6 أشهر (سلالة C57BLACK / 6). تم تقسيمهم إلى ثلاث مجموعات تجريبية: (1) السيطرة (بدون علاج) ، (2) عولجوا ب sEVs من normoxia (sEVs-Nor) ، و (3) عولجوا ب sEVs من المشيمة المستزرعة ناقصة الأكسجين (sEVs-Hyp) ، والتي تم استخدامها لتقييم اضطراب BBB في الجسم الحي25. كانت جميع المحاليل المحقونة معقمة. أيضا ، تم إعداد sEVs في ظروف معقمة وتحت غطاء السلامة البيولوجية من الفئة الثانية لتجنب التلوث.

1. زراعة المشيمة

  1. لاستخراج نباتات مشيمة الحمل الطبيعية ، تحقق من الطريقة التي نشرها Miller et al. 200536.
  2. قم بإزالة الجلطات بعناية من الصفيحة القاعدية للمشيمة البشرية باستخدام ملقط معقم. استخراج explants الصغيرة للحصول على استخراج الأنسجة النهائية من 10 غرام.
  3. تأكد من إزالة نباتات المشيمة من الأرباع الأربعة لجزء الأم من المشيمة. تأكد من استبعاد الأنسجة غير الحيوية والمناطق المتكلسة.
  4. للتلاعب بأنسجة المشيمة ، افعل ذلك على الجليد ، في ظل ظروف معقمة ، وداخل خزانة السلامة الحيوية.
  5. اغسل النباتات (ثلاث مرات على الأقل) بكميات وفيرة (خمسة مجلدات من النباتات) من محلول الفوسفات العازل البارد (4 درجات مئوية) (PBS 1x ، درجة الحموضة 7.4) لإزالة أكبر قدر ممكن من الدم. جهاز طرد مركزي (252 × جم لمدة 10 دقائق) في درجة حرارة الغرفة بين الغسيلات.
  6. يعاد تعليق 10 جم من النباتات المغسولة في 20 مل من وسط الاستزراع المكمل بمصل بقري جنيني 2٪ ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  7. ضع التعليق في طبق ثقافة 100 مم. اترك النباتات لمدة ساعتين في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 21٪ أكسجين و 5٪ CO2.
  8. بعد ذلك ، أعد غسل النباتات باستخدام 1x PBS عند 37 درجة مئوية (ثلاث مرات). جهاز طرد مركزي (252 × جم لمدة 10 دقائق) في درجة حرارة الغرفة بين الغسيلات.
  9. علاوة على ذلك ، أعد تعليق الأنسجة في 20 مل من وسط الثقافة المستنفد سابقا من الجسيمات النانوية.
    ملاحظة: لاستنفاد الجسيمات النانوية ، قم بإجراء الطرد المركزي الفائق (120000 × جم لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة) والترشيح الدقيق (مرشح 0.22 ميكرومتر).
  10. قسم النباتات المعاد تعليقها إلى طبقين ثقافتين (100 مم). يجب أن يحتوي كل طبق استزراع على 10 مل من النباتات المعلقة.
  11. بعد ذلك ، ضع أحد الأطباق التي تحتوي على نباتات مشيمية في ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية مع 8٪ أكسجين و 5٪ CO2) ، بينما ضع الآخر في غرفة نقص الأكسجين بنسبة 1٪ O2.
    ملاحظة: (اختياري) يمكن إجراء تحليل صلاحية الأنسجة باستخدام نفس عمليات استخراج الأنسجة و 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (مقايسة MTT) كما هو موضح في مكان آخر37،38. استخدم تركيز البروتين الكلي المقاس في تجانسات النباتات لتطبيع قيم MTT.
  12. بعد 18 ساعة في الاستزراع ، احصد الوسائط المكيفة للنباتات في أنبوب جديد سعة 15 مل.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، يمكن تجميد الوسائط المكيفة (-80 درجة مئوية) لفترة طويلة (أسابيع).

2. عزل sEVs المشتقة من المشيمة

  1. عزل sEVs من الوسط المكيف باستخدام بروتوكول الطرد المركزي التفاضلي والترشيح الدقيق بعد التقارير المنشورة سابقا25,39.
  2. إجراء الطرد المركزي المتسلسل للوسط المشروط المحصود. الخطوات المتسلسلة لأجهزة الطرد المركزي هي (1) 300 × جم لمدة 10 دقائق ، (2) 2000 × جم لمدة 10 دقائق ، (3) 10000 × جم لمدة 30 دقيقة ، و (4) 120000 × جم لمدة 2 ساعة. أداء درجة حرارة غرفة الطرد المركزي.
  3. في كل عمليات الطرد المركزي هذه ، باستخدام ماصة 20-100 ميكرولتر ، قم بجمع المادة الطافية بعناية وتجاهل الحبيبات.
  4. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتمرير آخر طاف تم جمعه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بإجراء طرد مركزي إضافي واحد عند 120000 × جم لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية أثناء تعليق الحبيبات (التي تحتوي على sEVs المشيمة) في 500 ميكرولتر من PBS (درجة الحموضة 7.4) وتمر مرة أخرى عبر مرشح 0.22 ميكرومتر. أخيرا ، قم بإجراء طرد مركزي أخير عند 120,000 × g لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  6. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات (التي تحتوي على sEVs المشيمة) في 500 ميكرولتر من PBS (درجة الحموضة 7.4 ، المستنفدة سابقا من sEVs) وتمر عبر مرشح 0.22 ميكرومتر.
  7. قم بتسمية العينات على أنها مخزون من sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) أو sEVs-نقص الأكسجة (sEVs-Hyp).
    ملاحظة: قم بإعداد 50-100 ميكرولتر من sEVs المعزولة لمزيد من التجارب. يمكن تخزين المركبات الكهربائية الصغيرة عند -80 درجة مئوية لفترة طويلة (أشهر).
  8. قم بتوصيف sEVs المشيمة حسب الحجم والعدد وعلامة البروتين sEVs ، كما ورد سابقا25. متوسط قطر الجسيمات المثالي ل sEVs هو 50-150 نانومتر.
    ملاحظة: يتضمن توصيف sEVs الكشف الإيجابي عن CD63 و Tsg101 و Alix و HSP70 (أي لتوصيف مجموعات sEVs المخصبة في exosomes). أيضا ، استخدم PLAP كعلامة على أصل المشيمة25.
  9. قم بقياس الكمية الإجمالية للبروتين في محلول sEVs باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يوضح الشكل 1 نظرة عامة على مزرعة زرع المشيمة وعزل الحويصلة خارج الخلية.

3. حقن الفئران

  1. تخدير في غرفة تحريض مخدر مع توزيع 5٪ إيزوفلوران (انظر جدول المواد). تحقق من مستوى التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم.
  2. بعد ~ 40 ثانية ، ضع الماوس في نظام التخدير باستخدام قناع الوجه وحافظ على مستوى تخدير 2٪ إيزوفلوران.
  3. بعد ذلك ، ضع على منصة تسخين (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة 28 درجة مئوية. الحفاظ على العينين مشحمة بالدموع الاصطناعية.
  4. قبل الحقن ، قم بتخفيف sEVs المشيمة (200 ميكروغرام من البروتين الكلي) مع محلول الفوسفات (درجة الحموضة ، 7.4) حتى تصل إلى الحجم النهائي البالغ 70 ميكرولتر.
  5. تطهير منطقة الحقن باستخدام 70 ٪ من الإيثانول ومسحات القطن. تأكد من استخدام حقنة الأنسولين بإبرة 30 جم لحقن محلول sEVs.
    ملاحظة: يمكن وضع المحقنة على منصة التسخين لمدة 5 دقائق للحصول على درجة حرارة فسيولوجية.
  6. ثم ، حقن الحل في الوريد الوداجي الخارجي. هذه الخطوة تحتاج إلى تدريب خاص.
    ملاحظة: يجب إجراء العملية بحذر ، وسحب الإبرة ببطء والشفط بلطف إلى دليل على ارتجاع الدم.
  7. بعد الحقن ، ضع ضغطا خفيفا على المنطقة المحقونة لمدة ~ 15 ثانية باستخدام قطعة قطن جافة. بعد ذلك ، أعد إلى أقفاصها.
  8. تأكد من تقييم الوعي والسلوك لمدة 15 دقيقة. مؤشر على تحقيق الوعي هو استعادة للنشاط الحركي الكلي.
    ملاحظة: تأكد من الحفاظ على درجة حرارة دافئة في أقفاص الحيوانات.

4. غيبوبة الفئران السريعة ومقياس السلوك (RMCBS)

  1. استخدم RMCBS لتقييم المعلمات العصبية والرفاهية للحيوانات40.
    ملاحظة: يسمح RMCBS بإجراء تقييم سريع (~ 3 دقائق) مع الحد الأدنى من الإجهاد الحيواني بسبب تدخل المشغل. يحتوي RMCBS على عشرة معلمات (كل درجة هي 0-2).
  2. قم بتقييم رفاهية الماوس باستخدام مقياس RMCBS عند 0 ساعة (قبل حقن sEVs) و 3 ساعات و 6 ساعات و 12 ساعة و 24 ساعة بعد الحقن.
    ملاحظة: قم بإجراء تحليل claudin-5 (في 6 ساعات بعد حقن sEVs) وتسرب إيفان الأزرق (في 24 ساعة بعد حقن sEVs) لتقييم اضطراب BBB (الشكل 2).

5. تحليل تسرب إيفان الأزرق

  1. بعد حقن sEVs المشيمة (24 ساعة) ، قم بتخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. تحضير محلول إيفان الأزرق (2٪ ، مخفف في محلول عازلة للفوسفات ، 1x) (انظر جدول المواد).
  3. باستخدام الوصول المداريالخلفي 25 ، قم بحقن محلول Evan's Blue عند 2 مل / كجم.
  4. اسمح لمحلول إيفان الأزرق بالدوران لمدة 20 دقيقة تحت صيانة التخدير.
  5. بعد ذلك ، قم بإجراء التروية داخل القلب باتباع البروتوكول41 الموصوف سابقا بمحلول ملحي (~ 3 مل ، 0.9٪ ، وزن / حجم) لإزالة صبغة إيفان الزرقاء من الدورة الدموية. هذه الخطوة إلزامية.
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الإجراء ، قم بزيادة التخدير إلى 5٪ وتحقق من مستوى عميق من التخدير (أي انخفاض كبير في معدل التنفس).
  6. كشف القلب عن طريق بضع الصدر الإنسي41 (الشكل 3).
  7. بعد ذلك ، إصلاح كله مع ضخ داخل القلب من محلول بارافورمالدهيد (4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، v / v).
    ملاحظة: تحقق من صلابة الذيل لمراقبة التثبيت المناسب.
  8. علاوة على ذلك ، بمجرد اكتمال التثبيت ، قم باستخراج الدماغ بعناية ، ووزنه ، وتصويره41. التقاط الصور مع الدماغ كله بالقرب من مسطرة42.
  9. بعد ذلك ، ضع الدماغ في قطاعة فأر الدماغ (انظر جدول المواد).
  10. تشريح الدماغ إلى تسعة أقسام ، ذيلية الرافعة ، بما في ذلك المخيخ (100 ميكرومتر لكل قسم).
  11. بعد التشريح ، تصور والتقاط صور لشرائح الدماغ في مجهر تكبير ستيريو (انظر جدول المواد).
  12. استخدم الصور الملتقطة لتحديد تسرب إيفان الأزرق باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لتحليل وجود صبغة إيفان الزرقاء ، قم بتعيين قيم إيفان الزرقاء باستخدام تحكم إيجابي في قسم الدماغ (من مراقبة المحقون بالصبغة ولكن بدون نضح داخل القلب). تتراوح قيم إيفان الزرقاء التي تم الوصول إليها من التحكم الإيجابي بشكل عام بين 75 و 110 في الرسم البياني للقناة الزرقاء (الشكل 4).
  13. تأكد من تحليل صور الدماغ بشكل أعمى من قبل المجموعة التجريبية المعنية لتجنب تحيز المراقب. بدلا من ذلك ، قم بقياس تسرب إيفان الأزرق عن طريق تجانس الدماغ متبوعا بالتحليل الطيفي43.
    ملاحظة: في تجارب منفصلة ، باستخدام أدمغة معزولة حديثا من الفئران المحقونة ب sEVs (6 ساعات) ، قم بتحليل مستويات البروتين في claudin 5 (CLND-5) (انظر جدول المواد) ، وهو تقاطع ضيق حرج متورط في ضيق BBB44 (الشكل 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يقيم هذا البروتوكول قدرة sEVs المشتقة من المشيمة المزروعة في نقص الأكسجة على تعطيل BBB في الفئران غير الحوامل. تسمح هذه الطريقة للمرء بفهم أفضل للعلاقة المحتملة بين المشيمة والدماغ في الظروف الطبيعية والمرضية. على وجه الخصوص ، قد تشكل هذه الطريقة وكيلا لتحليل مشاركة sEVs المشيمة في بداية المضاعفات الدماغية في تسمم الحمل.

على عكس الفئران المحقونة ب sEVs-Nor ، تظهر الفئران المحقونة ب sEVs-Hyp انخفاضا تدريجيا في النتيجة العصبية حتى 24 ساعة (الجدول 1) ، مما يشير إلى قدرة sEVs-Hyp ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تكشف هذه الدراسة النقاب عن رؤى جديدة حول الضرر المحتمل الناتج عن sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظروف نقص الأكسجين على اضطراب حاجز الدم في دماغ القوارض. تتضمن الآلية المرضية انخفاضا في CLND-5 في منطقة الدماغ الخلفية25.

كشفت التحقيقات السابقة أن البلازما sEVs من الأفراد المصابين بتسمم الحمل تحفز الخلل البطاني في مختلف الأعضاء باستخدام النماذج في المختبر 46,47. قام هذا التحقيق بشكل خاص بفحص ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا الباحثين الذين ينتمون إلى GRIVAS Health على مدخلاتهم القيمة. كما تنتمي القابلات والموظفون السريريون من خدمة أمراض النساء والتوليد إلى مستشفى دي شيلان ، تشيلي. أسسها فونديسيت العادية 1200250.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفئران البالغة الدماغ slecer ماتريكوس 3D مطبوعةملف الوصول المفتوحالفئران البالغة الفئرانالبالغة تقطيع الدماغ. مطبوع في خيوط جيش التحرير الشعبى الصينى.
الأجسام المضادة الأولية المضادة للأكتينسيجما-ألدريتشكلون AC-74للتحكم في التحميل (اللطخة الغربية)
الجسم المضاد الأساسي المضادللكلاودين 5 سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-374221الجسم المضاد الأساسي لبروتين الوصلة الضيقة CLDN5 للفئران BBB (اللطخة الغربية)
مجموعة بروتين BCAمجموعة Thermo Scientific23225لقياس تركيز البروتين
وسائط الثقافة # 200 500 ملThermo Fisher Scientificm200500وسائط الثقافة لعمليات المشيمة
D180 CO2< / sub> حاضنةRWD Life scienceD180حاضنة قياسية لتثبيت النباتات المستخرجة والثقافة sEVs-Nor
Evans Blue صبغة   > 75٪ 10 جمSigma-AldrichE2129.10Gصبغة لتحليل اضطراب الحاجز الدموي الدماغي في الجسم الحي
مصل بقري الجنين 500 ملحراري فيشر 16000044 العلميعامل النمو المضاف لوسائط الاستزراع 200
طرد مركزي فائق Himac CP100NXHimac eppendorf5720410101أجهزة الطرد المركزي الفائقة للوسائط المعدة > 1،20،000 ×
جم برنامج ImageJالمعاهد الوطنية للصحةhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane × 100 ملUSP Baxter212-094عامل تخدير مستنشق متطاير للفئران
كيت سيلتيتر 96 غير مشع  Promega0000105232 في المختبر < / em> فحص لاستخلاص المشيمة الجدوى
الماوس IgG الجسم المضاد الثانويThermo Fisher ScientificMO 63103الجسم المضاد الثانوي ل CLDN5 (اللطخة الغربية)
NanoSight NS300MalvernPanalytical 90278090تحليل التتبع النانوي للجسيمات من المكثفات المشيمية الوسائط المرفقة
Paraformaldehide E 97٪ محلول 500 ملThermo Fisher ScientificA11313.22محلول مثبت لشرائح أنسجة المخ والتروية داخل القلب (مرة واحدة مخففة)
PBS 1 × درجة الحموضة 7.4 500 ملمحلول غسيل 10010023 Thermo Fisher Scientificلمستخرجات المشيمة
Peniciline-Streptomicine 100x 20 ملThermo Fisher Scientific10378016مضادات الأحياء لوسائط
زراعة مستخلصات المشيمةProOX C21 مركزية الخلايا O2< / sub> و CO2< / sub> وحدة تحكم الغرفة الفرعيةBioSpherixSCR_021131CO2< / sub> للحث على نقص الأكسجة في غرفة محكمة الغلق ل sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 gChemie7061عامل القتل الرحيم
الإنساني Somnosuite نظام التخدير منخفض التدفقKent ScientificsSS-01Isoflurane المرذاذ للقوارض الصغيرة
منصة الاحترار الجراحيةKent ScientificsA41166منصة الاحترار لتخدير الصيانة في الفئران
مرشحات الحقن ، Polytetrafluoroethylene (PTFE) ، كارهة للماء ، 0.22 وميكرو ؛ م ، معقمة ، 25 مممختبرات جنوبية10026ترشيح الوسائط المضطربة التي يتم حصادها من النباتات المشيمية   ؛
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عالية السرعة المنضدية  هيتاشي هيماك CT15E / CT15REهيتاشي أنظمة طبية6020أجهزة الطرد المركزي التسلسلية للوسائط المجهزة < 1،20 ، 000 × جم
مجهر مجهر ثلاثي العينيات معبر وضوء عاكس 10x-160x & nbsp ؛سنتر ميديكال2597مجهر مجسم لتسجيل شرائح الدماغ
جهاز مجموعة

المراجع

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64(2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000(2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670(2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68(2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451(2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2(2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22(2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124(2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقص أكسجة المشيمةنموذج فأر لانعكاس تسمم الحملخلل الوظيفة البطانية الدماغيةتسرب صبغة إيفانز الزرقاءزراعة مستأصل المشيمةالطرد المركزي المتسلسلحقن الوريد الوداجيتقييم الدرجة العصبية
اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.