مقالة منهجية

جراحة زرع العصب المبهم البطني ودراسات التسجيل في الفئران المستيقظة

3.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65896

⸱

يناير 19, 2024

 ,  , 
1Bionics Institute, 2Medical Bionics Department, University of Melbourne, 3Department of Otolaryngology, University of Melbourne

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول التقنية الجراحية لزرع مجموعة أقطاب كهربائية على العصب المبهم البطني في الفئران ، إلى جانب طرق اختبار الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة والتحفيز باستخدام الجهاز المزروع.

الملخص

يمكن تطبيق تحفيز العصب المبهم البطني (VNS) على فرع الحجاب الحاجز من العصب المبهم للفئران. نظرا لموقعه التشريحي ، ليس له أي آثار تنفسية وقلبية خارج الهدف ترتبط عادة ب VNS عنق الرحم. عدم وجود آثار تنفسية وقلبية خارج الهدف يعني أن شدة التحفيز لا تحتاج إلى خفض لتقليل الآثار الجانبية الشائعة أثناء VNS عنق الرحم. تظهر بعض الدراسات الحديثة التأثيرات المضادة للالتهابات ل VNS في البطن في نماذج الفئران لمرض التهاب الأمعاء والتهاب المفاصل الروماتويدي وتقليل نسبة السكر في الدم في نموذج الفئران لمرض السكري من النوع 2. يعد الجرذ نموذجا رائعا لاستكشاف إمكانات هذه التقنية بسبب التشريح الراسخ للعصب المبهم ، والحجم الكبير للعصب الذي يسمح بسهولة التعامل معه ، وتوافر العديد من نماذج الأمراض. هنا ، نصف طرق تنظيف وتعقيم مجموعة قطب VNS البطني والبروتوكول الجراحي في الفئران. كما نصف التكنولوجيا المطلوبة لتأكيد التحفيز فوق العتبة عن طريق تسجيل جهود الفعل المركب المستحث. لدى VNS البطني القدرة على تقديم علاج انتقائي وفعال لمجموعة متنوعة من الحالات ، بما في ذلك الأمراض الالتهابية ، ومن المتوقع أن يتوسع التطبيق بشكل مشابه ل VNS عنق الرحم.

المقدمة

تحفيز العصب المبهم (VNS) الذي يتم تقديمه في موقع عنق الرحم في الرقبة هو علاج معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للصرع المقاوم للحرارة والاكتئاب المقاوم وإعادة التأهيل بعد السكتة الدماغية1 ، ومعتمد من المفوضية الأوروبية لفشل القلب في أوروبا2. تمت الموافقة على VNS عنق الرحم غير الغازية من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لعلاج الصداع النصفيوالصداع 1. من المتوقع أن يتوسع تطبيقه ، حيث أظهرت التجارب السريرية الأخيرة فعالية VNS في مؤشرات أخرى مثل مرض كرون3 والتهاب المفاصل الروماتويدي 4,5 وضعف تحمل الجلوكوز ومرض السكري من النوع 2 6,7. على الرغم من أنها واعدة ، إلا أن VNS عنق الرحم يمكن أن يسبب بطء القلب وانقطاع النفس بسبب التنشيط غير المستهدف للألياف العصبية التي تعصب الرئتين والقلب8،9،10. يتم الإبلاغ عن آثار جانبية مثل السعال والألم وتغيير الصوت والصداع وزيادة مؤشر انقطاع النفس ونقص التنفس بشكل شائع في المرضى الذين يتلقون VNSعنق الرحم 11,12. يعد تقليل قوة التحفيز استراتيجية شائعة لتقليل هذه الآثار الجانبية ، ولكن انخفاض الشحن قد يحد من فعالية علاج VNS عن طريق الفشل في تنشيط الألياف العلاجية11. لدعم هذه الفرضية ، كان معدل المستجيبين للمرضى الذين يتلقون تحفيزا عالي الكثافة لعلاج الصرع أعلى من معدل المرضى الذين يتلقون تحفيزا منخفض الكثافة13.

يتم تطبيق VNS البطني على العصب المبهم تحت الحجاب الحاجز ، فوق الفروع الكبدية والاضطرابات الهضمية14 (الشكل 1). أظهرت دراستنا السابقة أن VNS البطني في الفئران لا يسبب آثارا جانبية قلبية أو تنفسية مرتبطة ب VNS10 عنق الرحم. تظهر الدراسات السابقة أيضا التأثيرات المضادة للالتهابات ل VNS البطني في نموذج الفئران لمرض التهاب الأمعاء والتهاب المفاصلالروماتويدي 10,15 بالإضافة إلى انخفاض نسبة السكر في الدم في نموذج الفئران لمرض السكري من النوع 216. في الآونة الأخيرة ، تمت ترجمة تقنية VNS البطنية لأول تجربة سريرية بشرية لعلاج مرض التهاب الأمعاء (NCT05469607).

تم تطوير مجموعة أقطاب العصب المحيطي المستخدمة لتوصيل التحفيز إلى العصب المبهم البطني (WO2019095020 17) خصيصا للاستخدام في الفئران ، وتتألف من اثنين إلى ثلاثة أزواج من أقطاب البلاتين الموضوعة على بعد 4.7 مم ، مدعومة بكفة مطاطية من السيليكون من الدرجة الطبية ، ولسان خياطة لتثبيت المصفوفة في المريء ، وسلك رصاص وموصل عن طريق الجلد يتم تركيبه على منطقة أسفل الظهر (الشكل 2). يتم نفق سلك الرصاص تحت الجلد على الجانب الأيسر من. يسمح تصميم زوج الأقطاب الكهربائية المتعددة بالتحفيز الكهربائي للعصب بالإضافة إلى تسجيل جهود الفعل المركبة المستحثة كهربائيا (ECAPs) ، والتي تؤكد الوضع الصحيح للزرع على العصب وشدة التحفيز فوق العتبة. البطن VNS جيد التحمل في الفئران تتحرك بحرية لعدة أشهر10،15،16. هذا يسمح لتقييم فعاليته على نماذج المرض.

تصف هذه المخطوطة طرق تعقيم مصفوفة الأقطاب الكهربائية ، وجراحة زرع العصب المبهم البطني ، والتحفيز المزمن وتسجيل ECAPs في الفئران المستيقظة لدراسة فعالية VNS البطني في مجموعة متنوعة من نماذج المرض. تم تطوير هذه الطرق في الأصل لدراسة فعالية VNS في البطن في نموذج الفئران لمرض التهاب الأمعاء10 ، كما تم استخدامها بنجاح لنموذج الفئران من التهاب المفاصل الروماتويدي15 والسكري16.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى سانت فنسنت (ملبورن) وامتثلت للمدونة الأسترالية لرعاية واستخدام للأغراض العلمية (المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا) وقانون منع القسوة على (1986). في المجموع ، تم استخدام 24 أنثى فأر أغوتي داكنة (8-9 أسابيع) لهذه الدراسة. تألفت المجموعات التجريبية من: مجموعة عادية (ن = 8) لم تتلق أي حقن كولاجين أو زرع VNS. مجموعة مرض غير محفزة (ن = 8) تلقت غرسة وحقن كولاجين (لم يتم إجراء اختبارات فيزيولوجية كهربية) ؛ ومجموعة الأمراض المحفزة (ن = 8) التي تلقت غرسة وحقن كولاجين واختبار فيزيولوجي كهربي وعلاج VNS. حدثت جراحة الزرع قبل 5 أيام من حقن الكولاجين ، وبدأ التعود على علاج VNS بعد 4 أيام من حقن الكولاجين وحدث على مدار 7 أيام. تم تطبيق علاج VNS من اليوم 11 إلى 17 (ضمنا) بعد حقن الكولاجين15. بالنسبة لمجموعة المرض المحفز ، تم إجراء اختبار الفيزيولوجيا الكهربية مباشرة بعد جراحة الزرع تحت التخدير ، في يوم حقن الكولاجين ، وبعد 10 أيام من حقن الكولاجين ، ويوم الإنهاء (17 يوما بعد حقن الكولاجين).

1. Sonication وتعقيم مجموعة القطب

  1. اضبط المنظف بالموجات فوق الصوتية على تردد 80 كيلو هرتز واملأ الخزان بالموجات فوق الصوتية بماء الصنبور. اغمر مجموعة الأقطاب الكهربائية في محلول التنظيف في حاوية بلاستيكية نظيفة وضعها في خزان الموجات فوق الصوتية.
    ملاحظة: يتم تلخيص حل التنظيف ووقت الصوتنة لاستخدامها في كل خطوة في الجدول 1. استخدم حاوية نظيفة لكل خطوة.
  2. ضع مجموعة الأقطاب الكهربائية الصوتية في كيس تعقيم باستخدام ملقط نظيف صوتي بمحلول تنظيف سائل 0.5٪ في الماء المقطر وشطفه بالماء المقطر. الأوتوكلاف مجموعة الأقطاب الكهربائية لمدة 45 دقيقة مع درجة حرارة قصوى تبلغ 130 درجة مئوية ، واتركها تجف على مقعد نظيف.

2. زرع مجموعة قطب كهربائي على العصب المبهم البطني

ملاحظة: في هذه الدراسة استخدمنا إناث فئران أغوتي داكنة (8-9 أسابيع من العمر)15. لقد استخدمنا هذا البروتوكول بنجاح لزرع ذكور الفئران Sprague-Dawley البالغة بشكل مزمن (10-14 أسبوعا من العمر)10,16. يتم إجراء الجراحة في ظل ظروف معقمة ، ويتم تعقيم جميع الأدوات ومجموعة الأقطاب الكهربائية والمواد الاستهلاكية مثل أطراف الشاش والقطن عن طريق التعقيم.

  1. تخدير الفئران في غرفة الحث باستخدام 3٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة أكسجين. بمجرد عدم وجود منعكس دواسة لقرص إصبع القدم ، انقل الجرذ إلى حصيرة الحرارة باستخدام ترموستات على الطاولة الجراحية وضع قناع إيزوفلوران على الأنف.
  2. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة المستقيم طوال الجراحة وضبط مستوى الأيزوفلوران بين 1.5٪ و 2.5٪ للحفاظ على معدل التنفس بين 40 إلى 62 نفسا في الدقيقة. اضبط إعداد حصيرة الحرارة إذا لزم الأمر ، للحفاظ على نطاق درجة حرارة المستقيم بين 35.9 - 37.5 درجة مئوية.
  3. يجب تطبيق تسكين الألم قبل التخدير تحت الجلد باستخدام محاقن سعة 1 مل مع إبر 25 غرام (كاربروفين 5 ملغ/كغ والبوبرينورفين 0.03 ملغ/كغ تحت الجلد) قبل بدء الجراحة.
  4. احلق بسخاء حول موقع الشق ، بما في ذلك المنطقة على طول خط الوسط البطني من عملية xyphoid إلى نهاية القفص الصدري ، والجانب القطني من الظهر على طول خط الوسط الظهري ، والجانب الأيسر من الجسم بين الطرف الأمامي والطرف الخلفي للسماح بنفق تحت الجلد للصفيف.
  5. نظف المواقع الجراحية بحركة دائرية ثلاث مرات بجولات متناوبة من البيتادين والكحول وضع ستارة جراحية على. يجب تطبيق البوبيفاكايين (1-2 ملغ/كغ) تحت الجلد باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة 25 غرام في مواقع الشق الظهري والبطني.
  6. ضع في راقد بطني وقم بعمل شق بطول 2 سم على الظهر حيث سيتم تثبيت قاعدة التمثال عن طريق الجلد باستخدام شفرة مشرط.
  7. اقلب الجرذ إلى الاستلقاء الظهري وقم بعمل شق 3 سم على الجلد على طول خط الوسط أسفل عملية xyphoid مباشرة باستخدام شفرة مشرط. ارفع الجلد بالقرب من موقع الشق ، وباستخدام مقص التشريح ، قم بتشريح طبقة الجلد من طبقة العضلات حول الشق.
  8. للسماح بنفق تحت الجلد للمصفوفة من قاعدة التمثال إلى موقع الزرع ، ضع على جانبه الأيمن ، وأدخل مرقئا من الشق البطني وتشريح حاد نحو موقع الشق الظهري. اقطع حافة غطاء الإبرة وأدخل مجموعة الأقطاب الكهربائية لحمايتها أثناء النقل (الشكل 1 ب). باستخدام اليدين (ارتداء قفازات معقمة) ، قم بتوجيه مجموعة الأقطاب الكهربائية تحت الجلد نحو الشق البطني.
  9. للوصول إلى المريء والعصب المبهم ، ضع في راقد ظهري مرة أخرى. قم بعمل شق 3 سم على طبقة العضلات على طول خط الوسط أسفل عملية xyphoid ، وهو كبير بما يكفي لكشف طول الكبد بالكامل. تجنب إتلاف الكبد خلال هذه الخطوة.
  10. قم بعمل شق أصغر (أقل من 1 سم) على طبقة العضلات بشكل جانبي (الجانب الأيسر من) إلى الشق البطني الرئيسي. قم بنفق مجموعة الأقطاب الكهربائية من خلال هذا الشق الصغير باستخدام غطاء الإبرة المستخدم في الخطوة 2.8 لإدخال المصفوفة في تجويف البطن.
    ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من التوتر المطبق على موقع الشق الرئيسي وتقلل من خطر انفجار الغرز.
  11. اسحب طبقات الجلد والعضلات لإبقاء تجويف البطن مفتوحا. تأكد من الحفاظ على رطوبة الأنسجة باستخدام أطراف القطن والشاش المنقوع في محلول ملحي معقم للتعامل مع الأنسجة.
  12. اسحب الكبد برفق عن طريق قطع النسيج الضام حوله باستخدام مقص Vannas ووضع مبعثر فوق قطعة صغيرة من الشاش المنقوع في محلول ملحي للحماية. سحب المعدة برفق, للسماح استقامة المريء والعصب المبهم العلوي, عن طريق وضع مبعدة بين المريء والمعدة.
    ملاحظة: يتم إجراء المبعدات عن طريق تقريب الطرف المدبب لخطافات السمك.
  13. بعد التعرض للسطح البطني للمريء ، حدد العصب المبهم البطني وفروعه الفرعية ، بما في ذلك العصب الكبدي والعصب البطني وفرعين معديين (الشكل 1 د).
  14. قطع النسيج الضام الذي يثبت العصب المبهم البطني إلى المريء باستخدام ملقط دقيق ومقص فانا وتشريح طول العصب من فوق الفروع الكبدية والاضطرابات الهضمية مباشرة باتجاه الحجاب الحاجز. تأكد من عدم تمزق العصب أو تمديده أو قرصه. ضع مصفوفة أقطاب كهربائية بجوار العصب للتأكد من فصل طول كاف للعصب عن النسيج الضام لتناسب المصفوفة.
  15. بمجرد إزالة النسيج الضام حول العصب ، مرر خيوط الحرير (7-0) على جانب القطب من صفيف الكفة تحت العصب. افتح سوار المصفوفة وضع العصب بعناية في قناة المصفوفة.
  16. تأكد من أن طول العصب بالكامل يجلس داخل قناة المصفوفة. اربط الغرز حول الكفة معا لإغلاق الكفة بإحكام لضمان عدم انزلاق العصب من القناة. تقليم الغرز.
  17. باستخدام خياطة حريرية 7-0 ، قم بخياطة علامة تبويب المصفوفة على المريء لتأمين المصفوفة في مكانها ومنعها من الالتواء. تجنب إتلاف الفروع الأخرى للعصب المبهم أو إدخال إبرة عميقة جدا في عضلة المريء الملساء.
  18. قم بإزالة المبعدات برفق وتأكد من إزالة كل الشاش من تجويف البطن. تطبيق 1-2 مل من محلول ملحي معقم دافئ باستخدام حقنة سعة 1 مل في تجويف البطن وإعادة وضع الكبد إلى الموضع الصحيح.
  19. أغلق طبقة العضلات بخياطة حريرية 3-0 باستخدام تقنية خياطة الجري البسيطة ، مما يجعل عقدة مربعة آمنة مع 3 رميات على الأقل في كلا الطرفين. غرز الفضاء معا بشكل وثيق (حوالي 3 مم) لمنع المضاعفات مثل فتق / بروز عملية xyphoid .
  20. استخدم خياطة لإغلاق شق الصفاق مع شق طبقة العضلات ، لتقليل فرصة التصاق الأنسجة.
  21. باستخدام مادة خياطة قابلة للامتصاص (Vicryl 4-0) ، أغلق شق الجلد. استخدم تقنية خياطة مدفونة مثل خياطة المرتبة العمودية المدفونة ، أو خياطة الجلد المدفونة لمنع من إزالة الخيط.
  22. حول إلى راقد بطني ، وباستخدام المقص ، قم بتمديد الشق الظهري إلى 4-5 سم ، وقم بالتشريح الحاد بين العضلات وطبقة الجلد بشكل أكبر حتى تتمكن قاعدة موصل الموصل عن طريق الجلد من الجلوس بشكل مسطح على طبقة العضلات.
  23. باستخدام خياطة الحرير 3-0 ، اصنع من 6 إلى 8 خيوط متقطعة بسيطة حول قاعدة الموصل لتثبيتها بطبقة العضلات تحتها. أغلق شق الجلد بخياطة حريرية 3-0 ، باستخدام تقنية خياطة المرتبة الأفقية ، مما يضمن عقدة مربعة آمنة مع 3 رميات على الأقل.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، تفضل الغرز الحريرية المضفرة لسهولة التعامل معها وقدرتها على إنشاء عقدة أكثر أمانا مقارنة بالغرز أحادية الشعيرات.
  24. عند الانتهاء من الجراحة، يتم تطبيق محلول هارتمان تحت الجلد (1 مل / 100 جم / ساعة). قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران واترك يتعافى على حصيرة حرارية أثناء تشغيل الأكسجين (1.5 لتر / دقيقة). بمجرد أن يكون الجرذ واعيا ومتحركا بالكامل ، أعد الجرذ إلى قفصه المنزلي ، ووضعه على وسادة حرارية ، حتى يتعافى تماما من التخدير.
  25. راقب عن كثب تعافي من الأيزوفلوران وتأكد من أن قادر على الوصول إلى الطعام والشراب. في اليومين التاليين، يجب توفير تسكين الألم بعد الجراحة تحت الجلد (كاربروفين 5 ملغ/كغ، يوميا) لتخفيف الألم. راقب على الأقل 2x يوميا وتحقق من وجود دليل على التغوط وجودة المعطف ومستوى النشاط ووجود أي تورم أو إفرازات من الجروح الجراحية.
  26. سجل وزن ، وفي حالة نادرة يفقد 10 ٪ أو أكثر ، ابدأ العلاج المكثف. يشمل العلاج المكثف إعطاء السوائل تحت الجلد (محلول هارتمان ، 2 × 10 مل) كل يوم ، وتوفير طعام إضافي مثل الخضروات الطازجة ومكملات الجل الغذائية ، ووضع نصف القفص على وسادة حرارية مع ترموستات لمزيد من الدفء. زيادة وتيرة الرصد حتى يتعافى. يجب الاستمرار في تطبيق التسكين (كاربروفين 5 ملغ/كغ، SQ، يوميا) إذا لزم الأمر بناء على مقياس التجهم.

3. اختبار الفيزيولوجيا الكهربية

ملاحظة: يؤكد تسجيل جهود الفعل المركب المستثار (ECAPs) الموضع المناسب لمصفوفة الأقطاب الكهربائية على العصب المبهم. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تسجيل ECAPs باستخدام مصفوفة الأقطاب الموصوفة أعلاه تأكيدا محتملا للتنشيط الكهربائي للألياف C المبهمة و VNS10,15 فوق العتبة.

  1. قم بقياس مقاومة الأرضية المشتركة للأقطاب الكهربائية لتقييم سلامتها واكتشاف أي دوائر مفتوحة أو قصيرة من الأسلاك قبل تسجيل ECAPs. يجب أن يكون لأقطاب العصب المبهم البطني العاملة في الجسم الحي قيم مقاومة تتراوح بين 4 - 20 كيلو أوم.
  2. اختبار أثناء التخدير ، أي بعد الجراحة مباشرة ، أو الاستيقاظ والتحرك بحرية. قم بإجراء اختبار مستيقظ بعد 2-3 أيام على الأقل من الجراحة للسماح للجروح الجلدية الجراحية بالشفاء والاستقرار. اجمع المعدات اللازمة لاختبار المعاوقة والفيزيولوجيا الكهربية والتي تشمل محفزا مخصصا وجهازا للحصول على البيانات ومضخما تفاضليا معزولا وبرنامج الحصول على البيانات وتحليلها كما هو موضح في جدول المواد.
  3. لف بمنشفة إذا لزم الأمر ، وقم بتوصيل كابل بالموصل الخلفي عن طريق الجلد ، وقم بتوصيل الطرف الآخر من الكبل بجهاز تحفيز. لاختبار مقاومة الأرض المشتركة للأقطاب الكهربائية ، قم بتطبيق نبضات التيار ثنائي الطور (100 μs لكل مرحلة وتيار 107 μA) بين القطب محل الاهتمام وجميع الأقطاب الكهربائية الأخرى على المصفوفة.
  4. قم بقياس ذروة الجهد في نهاية المرحلة الأولى من شكل موجة الجهد (إجمالي V) واحسب المقاومة الكلية (إجمالي Z) باستخدام قانون أوم (Z = الجهد / التيار).
  5. قم بتوصيل زوج من الأقطاب الكهربائية بالمحفز وزوج من الأقطاب الكهربائية بمعدات التسجيل وقم بتطبيق التحفيز ثنائي القطب لتوليد ECAPs باستخدام القطب المرجعي لزرع VNS الموضوعة تحت الجلد كمرجع للتسجيل التفاضلي ل ECAPs. قم بعمل مجموعتين من التسجيلات في المتوسط من إجمالي 50 تكرارا باستخدام برنامج الحصول على البيانات وتحليلها.
  6. استخدم الإعدادات التالية للقياسات.
    التيارات: من 0 إلى 2 مللي أمبير بزيادات 0.1 مللي أمبير ؛
    عرض النبض: 25 - 200 ميكروثانية ؛
    فجوة الطور البيني: 8 - 50 ميكروثانية ؛
    معدل التحفيز: 10 - 30 نبضة / ثانية ؛
    معدل أخذ العينات: 100 كيلو هرتز ؛
    الفلتر: تمرير عالي 200 هرتز ، تمرير منخفض 2000 هرتز ، كسب الجهد 1 × 102.
  7. باستخدام برنامج تحليل البيانات ، قم بتحليل استجابة ECAP عن طريق قياس الجهد من الذروة إلى الذروة لأشكال الموجات داخل نافذة التحليل (4-10 مللي ثانية بعد التحفيز ، المشار إليها بالتظليل في الشكل 3A ، B). تعرف عتبة ECAP بأنها الحد الأدنى لشدة تيار التحفيز التي تنتج سعة استجابة لا تقل عن 0.1 μVذروة الذروة في كلتا المجموعتين من متوسط تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية. سيتم تكرار استجابة صالحة لمستويين حاليين على الأقل فوق العتبة ، ولن تكون موجودة لمستويين حاليين على الأقل أقل من العتبة 10,15.

4. VNS البطن المزمن في الفئران المستيقظة

ملاحظة: يمكن تطبيق VNS البطني على المستيقظة بمجرد التئام الجرح الجراحي حول الموصل عن طريق الجلد واستقراره. لتقليل أي استجابة للإجهاد والسماح بجمع البيانات بشكل أفضل ، اعتادت على بيئة التعامل مع المختبرين وتحفيزهم ، ساعة واحدة في اليوم على مدار سبعة أيام قبل جراحة الزرع وبدء علاج VNS.

  1. قم بقياس مقاومة كل قطب كهربائي كما هو موضح في الخطوة 3.4 ، قبل تطبيق أي VNS. تأكد من أن مقاومة الأقطاب الكهربائية المحفزة أقل من 20 كيلو أوم.
  2. قم بتوصيل كبل بالموصل الخلفي عن طريق الجلد وقم بتوصيل الطرف الآخر من الكبل بمحفز مبرمج لتطبيق التحفيز المناسب (على سبيل المثال ، 27 هرتز ، 1.6 مللي أمبير ، عرض نبضة 200 ميكرو ثانية مع فجوة بين الطور 50 ميكروثانية ، 30 ثانية تشغيل ، 2.5 دقيقة إيقاف15) ، وقم بتشغيل المحفز.
    ملاحظة: على الرغم من أن غالبا ما تلاحظ وهي تغفو أثناء التحفيز إذا اعتادت بشكل مناسب ، استخدم كابلا به مادة خارجية واقية مثل الملفات الفولاذية حيثما أمكن لمنع مضغها.
  3. راقب في بداية كل جلسة علاج VNS للتأكد من عدم وجود رد فعل سلبي مثل الاستمالة المفرطة أو الزيادة / النقصان المفاجئ في مستوى النشاط بالتزامن مع توقيت التحفيز.
  4. راقب كل 30 دقيقة للتحقق من التواء الكابل أو فصله. لتطبيق VNS بشكل مزمن (على سبيل المثال ، 3 ساعات في اليوم على مدار 7 أيام15) ، كرر الخطوات 4.1-4.3 في بداية كل جلسة.
    ملاحظة: قد يقلل استخدام المبدل من فرصة التواء الكابلات وقد يتطلب مراقبة أقل تكرارا.

النتائج

يعد تسجيل جهود الفعل المركب المثار (ECAPs ، الشكل 3 أ ، ب) مباشرة بعد الجراحة تقنية يمكن استخدامها للمساعدة في تأكيد الموضع الصحيح للعصب داخل قناة المصفوفة ، وأن التحفيز فعال في تنشيط العصب المبهم.

في الشكل 3 ، تم زرع إناث فئران agouti الداكنة (8-9 أسابيع من العمر) مع مجموعة قطب VNS. في الفئران التي تم اختيارها عشوائيا لتلقي التحفيز العلاجي ، تم تسجيل ECAPs مباشرة بعد الجراحة (اليوم 0 ، الشكل 3 أ) وفي نهاية جلسة العلاج VNS (اليوم 23 ، الشكل 3 ب). يشير وجود ECAPs (الشكل 3B) إلى أن شدة التحفيز كانت أعلى من العتبة العصبية وأن العصب قد تم تنشيطه بنجاح. تم استبعاد في مجموعة علاج VNS إذا لم يتم تسجيل ECAPs حيث لم يكن هناك ضمان بأن التحفيز قد تم تسليمه بنجاح15. يمكن استخدام زمن انتقال الاستجابة العصبية (الشكل 3A ، B ، المشار إليه بالسهم الأخضر) لتقييم فئة الألياف التي تم تنشيطها.

في الدراسات السابقة ، لاحظنا أن معظم الاستجابات العصبية تحدث عادة بين 4 مللي ثانية و 10 مللي ثانية10,15. بالنظر إلى أن المسافة بين أزواج التحفيز والتسجيل هي 4.7 مم ، فإن سرعة التوصيل التقريبية لنافذة الاستجابة هذه هي 0.47 - 1.2 م / ث ، وهو ما يتوافق مع سرعة التوصيل للألياف C18.

هناك زيادة في العتبة العصبية بين اليوم 0 (377 μA ، الشكل 3A) واليوم 23 (1335 μA ، الشكل 3B) ، والذي يحدث بمرور الوقت على الأرجح بسبب التليف الحميد الطفيف الذي يتشكل حول واجهة الأنسجة والقطب10,15.

يشير الشكل 3C إلى إعداد الاختبار التجريبي وتحديد موضع الموصل الخلفي ، والذي ظل مستقرا طوال فترة الاختبار لمدة 3 أسابيع15.

مخطط تحفيز العصب المبهم وصور وضع القطب الكهربائي التي توضح الإعداد الجراحي وتسميات التشريح.
الشكل 1: مواقع VNS عنق الرحم و VNS البطن. (أ) يتم تطبيق VNS عنق الرحم فوق الفروع إلى القلب والممرات الهوائية ، ويتم تطبيق VNS في البطن أسفل هذه الفروع. (ب) يتم إدخال مجموعة الأقطاب الكهربائية في غطاء إبرة (مع إزالة الحافة) لحمايتها أثناء حفر الأنفاق تحت الجلد. (C) يتم زرع مصفوفة VNS ببطن الفئران وتثبيتها بالغرز (D) فوق الفروع البطنية والكبدية أسفل الحجاب الحاجز. الاختصارات: VN = العصب المبهم ، ب. = فرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد الموصل عن طريق الجلد في معدة الفئران يظهر مصفوفة الأقطاب الكهربائية لمخطط تحفيز المعدة.
الشكل 2: مجموعة VNS للفئران. (أ) تتكون مجموعة VNS للفئران من موصل عن طريق الجلد ومجموعة أقطاب كهربائية متصلة بسلك الرصاص. (ب) يمكن خياطة شريط جبس بالقرب من مجموعة الأقطاب الكهربائية إلى المريء للمساعدة في تثبيت موضع المصفوفة. تأتي مجموعة العصب المبهم البطني القياسي للفئران مع زوجين من الأقطاب الكهربائية (E1 و E2 و E3 و E4). يمكن استخدام كلا أزواج الأقطاب الكهربائية إما للتحفيز أو التسجيل. يتم تثبيت الموصل عن طريق الجلد على منطقة الخشب للحيوان ، ويتم نفق سلك الرصاص تحت الجلد على الجانب الأيسر من. يتم وضع القطب المرجعي على طول سلك الرصاص تحت الجلد على الجانب الأيسر من بمجرد زرع مجموعة الأقطاب الكهربائية. يتم زرع مجموعة الأقطاب الكهربائية على العصب المبهم على طول المريء فوق المعدة وأسفل الحجاب الحاجز مباشرة. (ج) يوفر الطول الإضافي لسلك الرصاص على الجانب الأيسر من تحت الجلد تخفيفا للإجهاد. الاختصارات: E = قطب كهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجربة الفيزيولوجيا الكهربية: الرسوم البيانية للجهد مقابل الوقت لاستجابة التحفيز في اليومين 0 و 23 ؛ إعداد الفئران.
الشكل 3: آثار الفيزيولوجيا الكهربية النموذجية المسجلة من العصب المبهم البطني أثناء الزرع المزمن والجرذ الذي يتلقى علاج VNS. (أ) كل أثر للفيزيولوجيا الكهربية هو في المتوسط 25 تكرارا. تشير المربعات المظللة باللون الأخضر إلى الكمون النموذجي لاستجابة الألياف C في العصب المبهم البطني للفئران ، بين 4 مللي ثانية و 10 مللي ثانية (باستخدام مجموعة أقطاب كهربائية بمسافة 4.7 مم بين أزواج الأقطاب الكهربائية المحفزة وتسجيلها ، من المركز إلى المركز). يتم تمييز ECAPs برؤوس أسهم خضراء. (ب) فأر يتلقى علاج VNS عبر الموصل عن طريق الجلد على ظهره في قفص المنزل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل التنظيفوقت السونات
1. 0.5٪ بيروينج في ماء عالي النقاء15 دقيقة
2. المياه فائقة النقاء5 دقائق
3. المياه فائقة النقاء5 دقائق
4. 96٪ إيثانول10 دقائق
5. المياه فائقة النقاء5 دقائق
6. المياه فائقة النقاء5 دقائق

الجدول 1: خطوات الصوت. يوفر الجدول تفاصيل الصوتنة التي يتم إجراؤها هنا.

المناقشة

تم استخدام هذه الطريقة لجراحة زرع VNS في البطن والتحفيز المزمن للعصب المبهم وتسجيل ECAPs بنجاح وتحملها جيدا لمدة 5 أسابيع في الفئران بعد الزرع10،15،16. يعد تراجع المعدة والكبد والأمعاء للحصول على رؤية جيدة للمريء والعصب المبهم إحدى الخطوات الرئيسية في الجراحة. بمجرد سحب هذه الأعضاء ، يصبح العصب المبهم متاحا. يخاطر تراجع المعدة بتعريض التنفس للخطر ، وفي هذه الحالة يتم تخفيف المبعد. بالإضافة إلى ذلك ، عند قطع النسيج الضام المحيط بالمريء للوصول إلى العصب المبهم ، يجب توخي الحذر لتجنب تلف الحجاب الحاجز ، مما قد يؤدي إلى اضطراب في الضغط داخل الصدر ، وقمع الجهاز التنفسي الحاد ، وموت أثناء الجراحة. يوصى بإزالة النسيج الضام المحيط بالمريء بما يكفي لتناسب مجموعة الأقطاب الكهربائية فوق الفروع الكبدية والاضطرابات الهضمية.

تشمل المضاعفات المحتملة بعد الجراحة التصاق الأنسجة حول المريء والفتق والعلوص بعد الجراحة. يمكن تقليل التصاق الأنسجة عن طريق التطبيق الليبرالي للمحلول الملحي المعقم في تجويف البطن أثناء الجراحة وقبل إغلاق تجويف البطن. يجب أن يساعد إغلاق طبقة الصفاق مع طبقة العضلات أيضا في حماية الأعضاء الداخلية وتقليل التصاق الأنسجة. نظرا لأن الكبد يصاب بكدمات بسهولة ويمكن أن يسبب التلاعب بالأمعاء علوصا بعد الجراحة ، فمن المهم التعامل البسيط واللطيف مع هذه الأعضاء. أخيرا ، خاصة في الثقيلة ، من الأهمية بمكان وضع غرز خياطة جارية بالقرب من بعضها البعض أو استخدام الغرز المتقطعة بدلا من ذلك عند إغلاق تجويف البطن لمنع الفتق وبروز عملية xyphoid .

كرعاية قياسية بعد الجراحة ، يجب فحص بانتظام بعد الجراحة بحثا عن دليل على التغوط وتغيير الوزن والمعطف ومستوى النشاط ووجود أي تورم أو إفرازات من الجروح الجراحية. في حالات نادرة ، قد يحدث إفراز مفرط واحمرار وتورم حول الجروح الجراحية ، مما يشير إلى الإصابة. في مثل هذه الحالات ، يتم إعطاء المضادات الحيوية مثل Baytril (0.2 مجم / مل ، في مياه الشرب لمدة 3-5 أيام) حتى يتم حل العدوى. في حين أن الفئران الطبيعية تتعافى بشكل جيد من الجراحة ، فإن الفئران التي تعاني من ظروف صحية معرضة للخطر (أي نماذج المرض) قد تتطلب مزيدا من الوقت قبل أن يبدأ الاختبار والتحفيز بعد الجراحة. الرعاية المناسبة بعد الجراحة (كما هو ملخص في الخطوة 2.26) لهذه ضرورية لرفاهية.

أحد قيود هذا البروتوكول هو أنه في حين أن تصميم مجموعة أقطاب VNS للفئران ممتاز لتسجيل استجابة أبطأ للألياف C ، فإن التباعد بين أزواج الأقطاب الكهربائية (4.7 مم) قد لا يكون مناسبا لالتقاط نشاط بعض أنواع الألياف الأسرع. على الرغم من أن الطول الإجمالي للمصفوفة محدود بالطول المتاح للعصب المبهم تحت الحجاب الحاجز فوق الفروع الكبدية والاضطرابات الهضمية ، يمكن شراء صفائف VNS هذه بأزواج أقطاب كهربائية إضافية. يمكن استخدام هذه المصفوفات لاستكشاف تطبيق تحفيز الحجب الذي يمكنه التلاعب باتجاه VNS16,19 ، مما يوسع الاستخدام المحتمل لهذا النموذج.

يمكن استخدام تسجيل ECAPs لتقييم موضع المصفوفة حول العصب ، وجودة واجهة القطب وقدرة الجهاز على تنشيط الألياف المبهمة. المبهم هو عصب لاإرادي ، يتكون من 97٪ -99٪ من ألياف C18,20 ، مع 1٪ -3٪ المتبقية من الألياف عبارة عن ألياف ميالينية (وظيفة غير معروفة) ، كما أكدت دراسات المجهر الإلكترونيالنافذ 20. من المحتمل أن تكون الاستجابات في الشكل 3 ناتجة عن نشاط العصب المبهم المستحث كهربيا، بدلا من النشاط العضلي؛ لأنها تناسب شكل وشكل جهد الفعالية المركبة للعصبالمحيطي 21,22. علاوة على ذلك ، فإن سرعة التوصيل النموذجية للعصب المبهم البطني للفئران ECAPs هي 0.47 - 1.2 م / ث ، وهو ما يتوافق مع سرعة التوصيل للألياف C18. في الدراسات التجريبية الأولية لتطوير الأجهزة ، تم التحقق من صحة التسجيلات في دراسات الفئران المخدرة عن طريق قطع العصب المبهم بين القطب المحفز والتسجيل ، مما أدى إلى القضاء على أي استجابات مستثارة (البيانات غير معروضة). تم تصميم مجموعة الأقطاب الكهربائية بحيث يجلس العصب المبهم داخل قناة من البلاتين والسيليكون ، مما يعزله كهربائيا بشكل فعال عن هياكل الهيكل المحيطة (على سبيل المثال ، المريء). كما يتم إجراء كل من التحفيز والتسجيل باستخدام تكوينات ثنائية القطب باستخدام أقطاب كهربائية مجاورة ، مما يقلل من فرص انتشار التحفيز وتلوث التسجيل. لقد أبلغنا باستمرار عن أشكال موجية مماثلة بعد التحفيز الكهربائي للعصب المبهم البطني في الاستعدادات المخدرة واليقظة10،15،16،19،23 ، بما في ذلك الدراسات التي أكدت فيها التأثيرات الفسيولوجية للتحفيز تنشيط العصب المبهم10،15،16. على الرغم من أنه من المستحيل استبعاد تلوث التسجيل بالنشاط العضلي ، إلا أن الاستجابات العضلية عادة ما يمكن تمييزها عن الاستجابة العصبية نظرا لملف تعريف سعة النمو السريع والكبير24 على عكس ملفات تعريف النمو المتدرجة والأصغر التي لوحظت في دراساتنا10,15 وفي الشكل 3 أ ، ب: اليوم 0: المستوى الحالي 377 μA الكمون: 7.24 مللي ثانية > المستوى الحالي 1750 μA: 6.74 مللي ثانية.

في حين أن تنشيط العصب المبهم تحت الحجاب الحاجز الذي يتكون بالكامل تقريبا من الألياف C20,25 قد ثبت أنه فعال لعلاج النماذج قبل السريرية لمرض التهاب الأمعاء10 والتهاب المفاصل الروماتويدي15 والسكري16 ، لم يتم استكشاف معلمات VNS البطنية المثلى لتعظيم تأثيرها العلاجيبشكل كامل 14. سيكون إجراء مزيد من الأبحاث حول هذا الموضوع ذا فائدة كبيرة ، حيث يتم حاليا التحقيق في تطبيق VNS البطني لعلاج مرض التهاب الأمعاء في أول تجربة سريرية بشرية. نظرا لأن التأثير المضاد للالتهابات ل VNS البطني يعتبر جهازيا26 ، فهناك احتمال كبير أن يكون هذا العلاج فعالا أيضا في الحالات الالتهابية الأخرى مثل الذئبة الحماميةالجهازية 27 وأمراض الكلى المزمنة28.

تظهر دراساتنا على الفئران أن VNS في البطن له ميزة فريدة على VNS عنق الرحم من حيث أنه لا يسبب تأثيرات قلبية أو تنفسية خارج الهدف10. يمكن تطبيق التحفيز عالي الكثافة لفترات أطول من الوقت دون المساس بالتنفس أو معدل ضربات قلب. مقترنة بالقدرة على مراقبة الاستجابة العصبية المثارة التي تؤكد شدة التحفيز فوق العتبة ، توفر هذه الطريقة نموذجا رائعا لدراسة فعالية VNS البطنية لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض. مع استمرار تطبيق VNS في التوسع ، من المتوقع أن يتوسع تطبيق طريقة VNS هذه أيضا.

الإفصاحات

تم إجراء هذا البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل تطوير غرسة VNS في بطن الفئران من قبل وكالة مشاريع البحوث الدفاعية المتقدمة (DARPA) BTO ، تحت رعاية الدكتور دوغ ويبر والدكتور إريك فان جيسون من خلال مركز أنظمة الحرب الفضائية والبحرية (العقد رقم N66001-15-2-4060). تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل صندوق حضانة معهد بيونيكس. يقر معهد بيونيكس بالدعم الذي يتلقونه من حكومة فيكتوريا من خلال برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية. نود أن نشكر السيد أوين بيرنز على التصميم الميكانيكي ، والبروفيسور جون بي فورنيس على الخبرة التشريحية ، والبروفيسور روبرت كيه شيبرد على خبرة الواجهة الطرفية والتعديل العصبي والتسجيل ، والسيدة فيليبا كاميرير والسيدة إيمي مورلي لتربية واختبارها ، والسيدة فينيلا مونتز والدكتورة بيتا جريجسبي على نصائحهم بشأن رعاية بعد الجراحة ، والسيدة جيني تشو وفريق تصنيع الأقطاب الكهربائية من NeoBionica لإنتاج صفائف VNS.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ محلول ملحيBriemarpakSC3050
BaytrilBayer
BetadineSanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (بوبرينورفين)جهاز Jurox
للحصول على البياناتNational InstrumentsUSB-6210
DietGel Boost (مكمل غذائي جلي)ClearH2O
ملقطة دومون ، النمط 5ProSciTechT05-822
دومون تويزر ، النمط N7 ، الإغلاقالذاتي ProSciTechEMS72864-D
Elmasonic P سونيكاتورالحل Elma
HartmannBaxterAHB2323
HemostatProSciTechTS1322-140
HPMC / PAA جل العين المرطبAlcon
Igor Pro-8 البرمجياتWavemetrics، Inc
Isoflo (Isoflurane)Zoetis
Isolated Differential AmplifierWorld Precision InstrumentsISO-80
Liquid pyronegDiverseyHH12291محلول التنظيف
Marcaine (Bupivacaine)Aspen
ستارة بلاستيكيةMultigate22-203
غرسة العصب المبهم للجرذNeo-Bionica
Rimadyl (كاربروفين) خياطةحرير Zoetis
3-0إيثيكون
7-0Ethicon
SteriClave الأوتوكلافCominox24S
ثوب جراحي معقم يمكن التخلصZebravetDSG-S
انتحاري خطافات النيكل JarvisWalker
مياه فائقةالنقاء Merck MillipreMilli-Q Direct
UnderpadsZebravetUP10SM
مقص VannasProSciTechEMS72933-01
خياطة Vicryl 4-0Ethicon
خياطة حرير منه

المراجع

  1. Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987(2023).
  2. Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
  3. Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911(2020).
  4. Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
  5. Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
  6. Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662(2023).
  7. Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203(2014).
  8. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  9. McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
  10. Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418(2019).
  11. Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
  12. Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
  13. Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
  14. Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
  15. Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133(2022).
  16. Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257(2022).
  17. Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
  18. Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
  19. Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479(2020).
  20. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
  21. Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
  22. Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
  23. Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16(2023).
  24. Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5(2023).
  25. Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
  26. Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
  27. Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149(2021).
  28. Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جراحة زرع العصب المبهم البطني ودراسات التسجيل في الفئران المستيقظة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.