العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات بوساطة الكركمينويد على نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي

داء المبيضات الفموي (OC) هو العدوى الفطرية الرئيسية في تجويف الفم. وهو ناتج عن فرط نمو المبيضات النيابة. تشمل العوامل المؤهبة ل OC ضعف الغدد الصماء ، واستخدام المضادات الحيوية واسعة الطيف ، والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، ونقص التغذية ، وجفاف الفم (انخفاض تدفق اللعاب) ، واستخدام أطقم الأسنان ، وسوء النظافة ، وخاصة كبت المناعة¹. من بين أنواع المبيضات ، المبيضات البيض هي الأكثر انتشارا وضراوة. تم العثور عليها كنوع متعايش في جسم الإنسان وكعامل ممرض انتهازي. C. albicans لديه القدرة على تغيير مورفولوجيته من الخمائر المتعايشة (الأريمية) إلى خيوط مسببة للأمراض (خيوط وخيوط كاذبة)². يمكن للأشكال الخيطية ، وخاصة الخيوط ، أن تغزو ظهارة المضيف عن طريق الاختراق الخلوي أو الاختراق النشط ، مما يسبب العدوى³. تشمل عوامل الفوعة الأخرى ل C. albicans الالتصاق ، وتكوين الأغشية الحيوية ، وإفراز الإنزيمات والسموم المحللة للدهون والمائية ، مثل الليباز ، والفوسفوليباز ، والبروتينات ، والمبيضات⁴.

تتضمن علاجات OC استخدام العوامل المضادة للفطريات ، وخاصة البولينات الموضعية والأزول (النيستاتين والميكونازول)⁵. ومع ذلك ، فإنها تظهر فقط فعالية قصيرة الأجل ، والتكرار متكرر. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الإفراط في استخدام مضادات الفطريات إلى ظهور مشكلة تطور المقاومة المضادة للفطريات وانتشارها⁶. لذلك ، هناك حاجة إلى علاجات بديلة ، مثل العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT) ، والذي يجمع بين محسس ضوئي (PS) وضوء بطول موجي مناسب (مثل امتصاص PS) في وجود الأكسجين. ترتبط PSS بالخلايا أو تمتصها ، وعندما يتم تنشيطها بواسطة الضوء ، تنتج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) السامة للخلايا الحساسة⁷.

في aPDT ، أحد المحسسات الضوئية (PSs) المستخدمة هو الكركمين (CUR) ، وهو مركب طبيعي مستخرج من جذور نبات الكركم (Curcuma longa L.) يمتلك الكركمين العديد من السمات العلاجية ، بما في ذلك القدرات المضادة للالتهابات ومضادات الأكسدة والمضادة للسرطان^{ومضادات} الميكروبات ^8,9. وجد تحقيق سابق أن aPDT باستخدام CUR قلل بشكل فعال من C. albicans في نموذج الفئران من داء المبيضات الفموي دون التسبب في أي ضرر لأنسجة المضيف¹⁰. CUR هو الكركمين الرئيسي المستخرج من الكركم ، ولكن توجد أيضا بوليفينول أخرى ، مثل ديميثوكسيكوركومين وثنائي ديميثوكسي كوركومين ، في هذا النبات. أظهر aPDT بوساطة الكركمينو نشاطا مضادا للبكتيريا ضد الأغشية الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية المزروعة في القسطرة¹¹. ومع ذلك ، على حد علمنا ، لا يزال نشاطه المضاد للفطريات ضد C. albicans غير واضح. لذلك ، في هذه الدراسة ، قمنا بتقييم aPDT بوساطة ملح الكركمينويد ضد C. albicans في نموذج الفئران من OC.

تمت الموافقة على بروتوكول البحث لاستخدام الفئران من قبل لجنة أخلاقيات استخدام (رقم الحالة 05/2008 و 09/2020) في كلية طب الأسنان ، أراراكورا ، UNESP. تم استخدام C. albicans (ATCC 90028) كسلالة مرجعية. تم استخدام إناث الفئران السويسرية البالغة من العمر ستة أسابيع (ن = 45) ، مع نطاق كتلة الجسم من 20-30 جم ، في هذه الدراسة. تم توفير من قبل جامعة ولاية ساو باولو ، UNESP ، بوتوكاتو.

1. إعداد PS واختيار مصدر الضوء ل aPDT

1. قم بإعداد PS وفقا لمواصفات المادة المراد اختبارها.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام خليط قابل للذوبان في الماء من الكركمينويدات (خليط الملح القابل للذوبان في الماء¹² القائم على CUR) باعتباره PS (انظر جدول المواد والشكل 1). تم تحضير التخفيفات عند 20 ميكرومتر و 40 ميكرومتر و 80 ميكرومتر (15.6 و 29.2 و 58.4 مجم / لتر على التوالي) في ماء فائق النقاء مباشرة قبل الاستخدام وحفظت عند 5 درجات مئوية.
2. حدد جهازا ضوئيا بطول موجي مناسب (مثل طول امتصاص PS) قادر على إضاءة الهدف الحساس للضوء بالكامل بشكل موحد وفي وقت واحد دون تسخين الأنسجة.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام قبضة تحتوي على صمام ثنائي باعث للضوء (LED ، انظر جدول المواد) ، تم تصميمه في معهد Física de São Carlos (جامعة ساو باولو ، ساو كارلوس ، SP ، البرازيل). كانت طاقة الخرج الناتجة عن الضوء 89.2 ميغاواط / سم² بطول موجي أزرق يبلغ حوالي 455 نانومتر.

2. إعداد لقاح C. albicans

1. احتفظ بالسلالة المرجعية C. albicans (ATCC 90028) في الخميرة والببتون والجلوكوز (YEPD ، انظر جدول المواد) مع 50٪ من الجلسرين عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. قم بإذابة السلالة المجمدة في درجة حرارة الغرفة ، وانشر حصة 100 ميكرولتر على طبق بتري مع أجار سكر العنب Sabouraud (SDA) مع الكلورامفينيكول (انظر جدول المواد) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
3. انقل خمس مستعمرات إلى 10 مل من مرق نيتروجين الخميرة مع وسط جلوكوز 2٪ (YNBg) وتنمو هوائيا عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
4. تمييع ثقافة الخميرة في YNBg الطازجة (1:10) واحتضانها هوائيا عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية إلى مرحلة منتصف النمو اللوغاريتمي.
   ملاحظة: توحيد منحنى النمو الميكروبي لكل مختبر سابقا. في البحث الحالي ، سمح للمزارع بالتحضين لمدة 8 ساعات تقريبا ، حتى وصلت إلى مرحلة منتصف اللوغاريتم للنمو كما هو موضح في الكثافة الضوئية عند 540 نانومتر (OD₅₄₀) ، بقيمة متوسطة تبلغ 0.536 ± 0.062 وحدة تعسفية (متوسط ± الانحراف المعياري [SD]).
5. قم بطرد مركزي للمزرعة عند 5000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات مرتين بنفس الحجم من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS ؛ 0.136 M NaCl ، 2 mM KCl ، 1 mM KH₂PO₄ ، 10 mM Na₂HPO₄ ، pH 7.4).
6. استخدم حصص 100 ميكرولتر لأداء أربعة تخفيفات متسلسلة 10 أضعاف في PBS ، ونشر التخفيفات على لوحات SDA ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لعدد المستعمرات. كمعيار ، يتم استخدام المعلقات الفطرية بتركيزات حوالي 4.5 × 10⁷ وحدات تشكيل مستعمرة لكل مليلتر (CFU / mL)].

3. تحريض OC في الفئران

ملاحظة: تم وصف المنهجية التالية سابقا بواسطة Takakura et ^al.13 وتم استنساخها من قبل مجموعتنا^10،14 ، مع بعض التعديلات.

1. توزيع الفئران عشوائيا في تسع مجموعات (ن = 5) ، المقابلة لنفس العدد من العلاجات (الملف التكميلي 1).
   ملاحظة: يجب أن يكون تجويف الفم للفئران سلبيا لنمو المبيضات . يجب التحقق من ذلك عن طريق مسح تجويف الفم وطلاء العينة على SDA.
2. احتفظ بالحيوانات في صناديق البروبيلين¹⁰ (5 فئران لكل صندوق كحد أقصى) ، مع نشارة الخشب لتغطية الأرضيات ، في حظيرة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 23 ± 2 درجة مئوية تحت دورة ضوء / مظلمة 12/12 ساعة. ولا يلزم توفير تخصيب محدد.
3. الحفاظ على الفئران على النظام الغذائي للفأر المبثوق والمياه المفلترة ad libitum.
4. حقن تحت الجلد الدواء المثبط للمناعة ، بريدنيزولون (100 ملغم / كغم من وزن الجسم ، انظر جدول المواد) ، لأول مرة في اليوم الأول لجميع أعضاء المجموعات C + L + 20 ، C + L + 40 ، C + L + 80 ، C + L- 20 μM ، C + L- 40 ، C + L- 80 ، C-L + ، و C-L- (الملف التكميلي 1).
   ملاحظة: احتفظ بالفئران من نفس المجموعة في نفس الصندوق وراقبها يوميا بحثا عن أي علامة على الإجهاد وفقدان الوزن. اطلب المشورة البيطرية للحصول على طعام / ماء مسكن أو معدل إذا لوحظ الإجهاد أو فقدان الوزن.
5. بدءا من اليوم الأول وحتى نهاية التجربة ، قم بتوفير هيدروكلوريد التتراسيكلين في مياه الشرب عند 0.83 مجم / مل¹³.
6. تلقيح ألسنة الفئران في اليوم الثاني ، بما في ذلك المجموعات C + L + 20 و C + L + 40 و C + L + 80 و C + L- 20 و C + L- 40 و C + L- 80 و C-L + و C-L- (الملف التكميلي 1) ، مع لقاح C. albicans . لا تقم بتلقيح تلك الفئران من مجموعة التحكم السلبية (NCtrl).
   1. تخدير عن طريق الحقن العضلي ل 10 مغ/كغ كلوريد كلوربرومازين (انظر جدول المواد) على كل عضلة من عضلات الفخذ قبل إجراء التلقيح.
   2. إجراء التلقيح داخل الفم للفئران عن طريق نقع مسحة معقمة (واحدة لكل) في تعليق موحد طازج (أي معد مباشرة قبل التلقيح) من C. albicans.
   3. ضع الفئران المخدرة في وضع ضعيف. اسحب ألسنتهم برفق من أفواههم باستخدام ملقط معقم. فرك لسان كل فأر بمسحة مبللة لمدة 30 ثانية. راقب الفئران حتى تتعافى من التخدير.
7. في اليوم الخامس، يتم تطبيق حقنة تكميلية تحت الجلد من بريدنيزولون (100 ملغ/كغ من وزن الجسم) للحفاظ على كبت المناعة.
   ملاحظة: هذا البروتوكول كاف للحفاظ على العدوى لمدة 7 أيام بعد التلقيح داخل الفم. يظهر الجدول الزمني للبروتوكول في الشكل 2.

4. العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات واستعادة C. albicans من آفات الفم

1. في اليوم السابع، وقبل العلاج، يتم تخدير باستخدام حقن هيدروكلوريد الكيتامين داخل الصفاق (100 ملغم/كغ من وزن الجسم) مع الزيلازين (10 ملغم/كغ من وزن الجسم) (انظر جدول المواد).
2. ضع كل في وضع ضعيف على جهاز^{وسادة 14,15} مزود بأسلاك من الفولاذ المقاوم للصدأ يمكن لفها حول القواطع لإبقاء الفم مفتوحا.
   ملاحظة: يوصى باستخدام منصات متساوية الحرارة لتدفئة الفئران أثناء تخديرها ، ومنع انخفاض حرارة الجسم في درجة حرارة الغرفة وتجنب الوفيات المرتبطة بالتخدير¹⁵. يجب مراقبة كل مخدر من خلال عدم وجود منعكس انسحاب عند قرص أصابع القدم لتأكيد عمق التخدير. يمكن إعطاء جرعة صيانة واحدة من الكيتامين عند 1/3 الجرعة الأصلية (بدون زيلازين) إذا لزم الأمر.
3. مع تراجع الفك السفلي والخدين ، ضع اللسان برفق خارج الفم.
4. بالنسبة للفئران من مجموعات C + L + ، ماصة 70 ميكرولتر من PS على ظهر اللسان (في أحد التركيزات المختبرة). الحفاظ على الفئران في بيئة مظلمة لمدة 20 دقيقة كفترة ما قبل التشعيع. تأكد من أنه خلال هذا الوقت ، يظل لسان كل في مكانه داخل تجويف الفم لمنع تناول المحسس الضوئي (PS).
5. بعد فترة التحسس الضوئي ، اسحب اللسان من الفم للإضاءة. ضع جهاز LED على ظهر اللسان وأضيء بسرعة 37.5 جول / سم² (7 دقائق مع الجهاز الحالي) (الشكل 3).
6. بالنسبة للحيوانات من مجموعات C + L- ، ماصة 70 ميكرولتر من PS في أحد التركيزات المختبرة على ظهر اللسان ، والحفاظ على هذه الفئران في الظلام لمدة 27 دقيقة.
7. بالنسبة للحيوانات من مجموعة C-L + (المعالجة بالضوء دون أي حساسية ضوئية سابقة) ، ماصة 70 ميكرولتر من محلول ملحي معقم على ظهر اللسان. أبق الفئران في الظلام لمدة 20 دقيقة ثم أضيء ألسنتها بسرعة 37.5 جول / سم² (7 دقائق بالجهاز الحالي).
8. بالنسبة للفئران من مجموعة C-L (غير المعالجة ب PS ولا بالضوء) ، ماصة 70 ميكرولتر من محلول ملحي معقم على ظهر اللسان والاحتفاظ بها في الظلام لمدة 27 دقيقة.
9. استعادة C. albicans من ألسنة جميع الفئران مباشرة بعد العلاج. مسحة الظهر من اللسان لمدة 1 دقيقة مع مسحة القطن معقمة.
10. ضع كل عينة مسحة في أنبوب يحتوي على 1 مل من محلول ملحي معقم ودوامة لمدة دقيقة واحدة لإعادة تعليق الخلايا الميكروبية.
11. قم على الفور بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف في PBS ولوحة 25 ميكرولتر على لوحات SDA في نسختين. احتضان الألواح هوائيا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
12. بعد 48 ساعة ، استخدم عداد مستعمرة رقمي (انظر جدول المواد) لتحديد عدد مستعمرات الخميرة. احسب حمل C. albicans (CFU / mL) لكل.
13. تحويل قيم CFU / mL إلى log₁₀ وتحليلها بشكل صحيح وفقا لتصميم التجربة وافتراضات البيانات.
    ملاحظة: في التحقيق الحالي ، تم استخدام اختبار ويلش أحادي الاتجاه ANOVA و Games-Howell اللاحق (α = 0.05) ¹⁶ .

5. التحليلات النسيجية المرضية

1. في اليوم الثامن ، تخدير الفئران بالكيتامين عند 100 مغ / كغ مع زيلازين عند 10 ملغم / كغم عن طريق الحقن داخل الصفاق والقتل الرحيم بجرعة زائدة من الكيتامين (200 ملغم / كغم تدار عن طريق داخل السماق). تأكيد الوفاة عن طريق التحقق من عدم وجود حركة تنفسية (انقطاع النفس) ، وغياب ضربات القلب (الانقباض).
2. قرصة اللسان بعناية وسحبه من فم. باستخدام مشرط يدوي ، قم بعمل شق قبل الحليمات المحيطة لإزالة اللسان بالكامل جراحيا دون التسبب في أي إصابات للمناطق الأمامية والوسطى.
3. ثبت اللسان في 10٪ من الفورمالين المخزن (درجة الحموضة 7.2-7.4) لمدة 24 ساعة واغسله بالماء الجاري لمدة ساعتين.
4. المضي قدما في إدراج في عملية البارافين: الجفاف ، والتوضيح ، والتشريب^10،14.
5. قم بقص المقاطع التسلسلية (بسمك 5 ميكرومتر) باستخدام ميكروتوم ، ثم ضع المقاطع على شرائح زجاجية. المضي قدما في تلطيخ هذه الأقسام باستخدام حمض شيف الدوري والهيماتوكسيلين (PAS-H) للفحص النسيجي المرضي وتحديد الفطريات من خلال الملاحظة تحت المجهر الضوئي.
6. اطلب من أخصائي علم الأمراض ، ويفضل أن يكون أعمى عن المجموعات التي تمت دراستها ، فحص تفاعل الأنسجة بسبب عدوى C. albicans .
7. وصف الخصائص النسيجية للنسيج (الظهارة والنسيج الضام) ، وخاصة الاستجابات الالتهابية المحلية ذات الشدة المتفاوتة.

أظهر نموذج الفئران من OC بقع بيضاء نموذجية وأغشية كاذبة على لسان جميع الفئران المصابة (الشكل 4A). أكدت C. albicans المستعادة من C-L- استعمار الأنسجة بواسطة هذه الكائنات الحية الدقيقة (تراوحت القيم من 1.62 × 104 إلى 4.80 × 105 CFU / mL). كما هو متوقع ، لم تظهر من مجموعة NCtr أي تغيرات في الأنسجة أو نمو مستعمرة بعد أخذ العينات (الشكل 4B).

قلل aPDT من صلاحية C. albicans عندما تم استخدام curcuminoids عند 80 ميكرومتر للتحسس الضوئي (الشكل 5). كان متوسط التخفيض اللوغاريتمي10 الذي تم تحقيقه باستخدام aPDT بوساطة 80 ميكرومتر PS 2.47 ، مقارنة بالمجموعة C-L (p = 0.008).

لم يكن عدد مستعمرات C. albicans التي تم استردادها من ألسنة الفئران مختلفا بشكل كبير بين الفئران التي عولجت بالكوركومينويدات بدون إضاءة (مجموعات C + L) ، والفئران المعالجة بالضوء ولكن لم يتم تحسسها ضوئيا من قبل (مجموعات C-L +) ، والفئران غير المعالجة (مجموعة C-L) (p ≥ 0.210).

أظهرت السمات النسيجية لألسنة غير المصابة (NCtr) أنسجة طبيعية / صحية ، بما في ذلك الصفيحة المخصوصة السليمة ، والغشاء القاعدي ، والحليمات الخيطية (الشكل 6 أ). في المقابل ، عند فحص الصور النسيجية المرضية لألسنة الفئران من مجموعة C-L- ، كان من الواضح أن الخميرة والخيوط كانت موجودة داخل الطبقة الكيراتينية للظهارة ، على الرغم من عدم وجود تسلل للفطريات. في النسيج الضام الأساسي ، لوحظت استجابة التهابية خفيفة ، بوساطة الخلايا أحادية النواة في المقام الأول ، وكانت الحليمات الخيطية غائبة بشكل ملحوظ (الشكل 6 ب). أظهر التحليل النسيجي لألسنة الفئران في كل من مجموعات C + L و C-L + خصائص مماثلة. في المقابل ، كشفت أقسام اللسان من الفئران المعالجة ب 80 ميكرومتر aPDT بوساطة كوركومينويد عن انخفاض عدد الخلايا الفطرية ، والتي تقتصر بشكل أساسي على الطبقة الكيراتينية للظهارة (الشكل 6C).

الشكل 1: التركيب الكيميائي للمحسس الضوئي. التركيب الكيميائي لخليط الملح القابل للذوبان في الماء المستخدم كمحسس ضوئي ، ويضم 53.4٪ كركمين طبيعي و 46.6٪ كوركومينويدات أخرى (ديميثوكسيكوركومين وثنائي ديميثوكسي كوركومين). متوسط الوزن الجزيئي النهائي هو 730.32 جم / مول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الجدول الزمني للبروتوكول لنموذج الفئران لداء المبيضات الفموي و aPDT. جدول زمني يحدد بروتوكول نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي والعلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (aPDT). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إضاءة ألسنة الفئران بعد التحسس الضوئي. بعد التحسس الضوئي ، (حضانة الأنسجة المصابة بالمحسس الضوئي) ، أضاءت الألسنة عند 37.5 جول / سم2 باستخدام ضوء LED أزرق (~ 455 نانومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الآفات البيضاء في نموذج داء المبيضات الفموي الفئران. (أ) صور تمثيلية تصور الآفات البيضاء التي لوحظت في نموذج الفئران لداء المبيضات الفموي. ب: السيطرة السلبية (غير المصابة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تعافت المبيضات البيضاء من ألسنة الفئران. تمثل البيانات القيم المتوسطة ± الانحراف المعياري للسجل10 (CFU / mL) من مجموعات العلاج. أشار WELCH أحادي الاتجاه إلى أن تأثيرات العلاجات كانت مختلفة إحصائيا بين المجموعات (p < 0.001). تشير الأحرف الصغيرة المختلفة (أ ، ب ، ج) بجوار الوسائل إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية وفقا لاختبار Games-Howell (p≤ 0.030). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: صور تمثيلية للمقاطع النسيجية لألسنة الفئران. تم تلطيخ المقاطع النسيجية لألسنة الفئران باستخدام PAS-H ، وتم التقاط الصور بمعدل 200x. (أ) فئران التحكم السلبي دون داء المبيضات الفموي المستحث ، والحساسية الضوئية ، والإضاءة (مجموعة NCtr). (ب) الفئران المصابة بداء المبيضات الفموي المستحث ، غير حساسة للضوء ولا تتعرض لإضاءة LED (مجموعة C-L). (ج) المصابة بداء المبيضات الفموي المستحث ، المعرضة ل 80 ميكرومتر كوركومينويدس و 37.5 جول / سم2 إضاءة LED (مجموعة C + L + 80). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: المجموعات التجريبية. قائمة بالمجموعات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.