مقالة منهجية

تحسين نموذج فأر التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط للأبحاث قبل السريرية

DOI:

10.3791/65908

⸱

أبريل 30, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج فأر التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط هو أداة فعالة ومتزايدة شعبية لدراسة أمراض اللثة. تم تقديم إرشادات مفصلة لتنفيذ نسخة مبسطة من النموذج تركز على تدمير العظام السنخية بين القريبين، بما في ذلك تصميم الدراسات المخبرية، وإنتاج الأدوات المطبوعة ثلاثية الأبعاد، وقياس كمية العظام باستخدام تحليل الميكروميكرو المقطعي المحسن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعب النموذج التجريبي لالتهاب دواعم السن الناتج عن الرباط في الفئران دورا أساسيا في فهم مسببات أمراض اللثة؛ ومع ذلك، لم يتم الاستفادة منه بالكامل للتطبيقات الانتقالية والعلاجية. مماثل للأمراض البشرية، يتطور التهاب دواعم الأسنان الناتج عن الأرباط في الفئران عبر سلسلة من الأحداث الميكروبية والالتهابية والمناعية العظمية المميزة. يتطور تدمير عظم السنخة الناتجة عن الأرباط في فترة قصيرة نسبيا ويمكن قياسه بسهولة، مما يجعله نموذجا مرضيا فعالا من حيث التكلفة للدراسات ما قبل السريرية.

لتجاوز التحدي التقني لنموذج الرباط الكلاسيكي، تم تنظيم نموذج الفأر المبسط الناتج عن التهاب دواعم السن المحفز بالرباط. بدلا من تحفيز المرض في محيط السنين المتجاورين بالكامل، يركز نموذج المرض المبسط على تدمير العظام الالتهابي فقط في المنطقة بين السنين الخلفيين، وهي أيضا المنطقة التي يبدأ فيها مرض اللثة الشائع لدى البشر. نظرا لاستخدامه أدوات طباعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لوضع الربط، فإن النهج سريع وفعال يؤدي إلى زمن إجرائي يتراوح بين 5-10 دقائق لكل فأرة. بينما يتم اكتشاف إشارات عظمية بعد 3 أيام من وضع الربط، يتطور تدمير العظام باستمرار بعد 9 أيام من الربط.

هنا، يتم تطوير بروتوكول نموذج الرباط المبسط من خلال إبراز العناصر المهمة المتعلقة بتصميم الدراسة (مثل حساب القدرة، توحيد الإجراءات، المعايرة)، تطوير الأدوات المطبوعة ثلاثية الأبعاد (مثل "سرير أسنان الفأر" و"حامل الربط"), وقياس كمية عظام السنيخ باستخدام تحليل الميكرو سي إم سي. يستخدم التعبير الجيني اللثوي ل Rank وRankl وOpg، وهو ثلاثية تنظيمية رئيسية لتكوين العظام، كدليل غير مباشر على الفعالية العلاجية. ستوجه الطرق المقدمة في هذه الورقة تطبيق الباحثين لنموذج التهاب دواعم السن المبسط الناتج عن الرباط لاختبار العلاجات المبتكرة لثام الأسنان في البيئة قبل السريرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض اللثة هو عملية التهابية معقدة تؤدي إلى تدمير الهياكل الداعمة للأسنان بما في ذلك اللثة، والرباط اللثوي، والسمنت، والعظم السنخي. لكي يتطور فقدان عظام اللثة، يجب أن يحدث كسر الحاجز اللثوي وغزو البكتيريا، بالإضافة إلى تجنيد الخلايا الالتهابية، والانتقال من استجابة مناعية مهيمن عليها الفطرية إلى استجابة مناعية مكتسبة1. الخلل النهائي بين الخلايا العظمية والخلايا العظمية سيؤدي إلى فقدان عظم السنخات من خلال تدميره2. النتيجة الظاهرية المميزة التي تميز تشخيص أمراض اللثة عن التهاب اللثة القابل للعكس (التهاب اللثة) هي فقدان العظم السنخي. لذلك، فإن كمية عظم السنيخ الداعم للأسنان هي نتيجة علاجية رئيسية في البيئة قبل السريرية.

لا يمكن لأي نموذج حيواني واحد أن يكرر جميع الجوانب البيولوجية المطلوبة لتطوير علاجات مختلفة 3,4,5. نموذج فأر التهاب دواعم السن الناتج عن الأرباط يطور تدميرا قابلا للقياس للعظام في وقت قصير نسبيا (3-9 أيام)، مما يجعله نموذجا فعالا من حيث التكلفة لاختبار تدخلات علاجية جديدة للوقاية من التهاب دواعم السن وتعديلها. على الرغم من نجاحه في دعم تطوير التجارب السريرية البشرية المرحلة الثانية والثالثة 6,7,8,9,10، إلا أن التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط في الفئران لا يستخدم عادة كنموذج ما قبل سريري. لتجاوز التحديات التقنية للنموذج الكلاسيكي الذي يحيط فيه الربط بالسن، تم إنشاء نموذج فأر التهاب دواعم الأسنان المبسط11,12. التعديل البسيط للنموذج الكلاسيكي يركز على موقع تركيز لتدمير العظام، بين الأسنان وليس حولها. فوائد هذا التعديل متعددة الأوجه، بما في ذلك تقليل مدة الوقت المطلوبة ل 1) تدريب الأفراد، 2) سهولة تقنية في إجراء التجربة، و3) قابلية تكرار قياس العظام. بالإضافة إلى ذلك، تم اكتشاف أن العديد من الأحداث الميكروبيولوجية والمناعية التي تتطور وتظهر تحت هذا النموذج المبسط تتماشى مع الفهم الحالي لمرض اللثة البشريالشائع 2,11,12,13. أخيرا، يدعم الوقاية الفعالة من فقدان العظام الناتج عن الأدوية التي أبلغت عنها US 2,14 استخدام نموذج التهاب دواعم السن المبسط الناتج عن الربط كأداة في الجسم لتقييم الجوانب الرئيسية للعلاجات الجديدة للعظام.

جانب مبتكر من نموذج التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط المبسط هو تطوير أدوات مطبوعة ثلاثية الأبعاد لتسهيل عملية تحفيز المرضبسهولة أكبر 11,12. ورغم أن الأمر بديهيا للبعض، أبلغ الباحثون عن عدم القدرة على تجميع أدوات الطباعة ثلاثية الأبعادرقم 15، مما قد يعيق أو يؤخر بدء دراسة الحيوانات. توسع الدراسة الحالية المعلومات المقدمة في دراستنا السابقةللبروتوكول 11وتوفر معلومات مفصلة للسماح بتنفيذ نموذج التهاب دواعم السن المبسط الناتج عن الرباط بنجاح في بيئة مختبرية. التفاصيل المدرجة في هذا البروتوكول الحالي هي جزء من مجموعة معقدة من العوامل التي قد تسهم في نقص قابلية تكرار النتائج العلمية 15,16,17. الاستخدام المستمر للنموذج وامتصاص العظام الموثوق الذي تم تحديده في الدراساتالمتعددة 2,11,12,14,18 ومن قبل مجموعات البحث التعاونية 13,19,20,21 خلال السنوات العشر الماضية يدعم أهمية نشر المعلومات التفصيلية لتعزيز قابلية التكرار في المجتمع العلمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلتزم هذا البروتوكول بإرشادات أبحاث الحيوانات: الإبلاغ عن تجارب الحياة الحية (ARRIVE)رقم 22,23. تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة IACUC التابعة لجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل.

1. التصميم التجريبي

  1. حساب حجم العينة
    ملاحظة: نظرا للطبيعة الانتقالية لبرنامج البحث، فإن حساب القدرة المعروض هنا يعتمد على قياسات عظم السنخات لفئران البرية C57Bl6 التي تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا.
    1. تحليل العظم بناء على القياسات الخطية بين وصلة الأسمنتوم والمينا وتاج العظم السنخي (CEJ-ABC).
      1. الفئران السليمة لديها متوسط مستوى تعلق (أو قياس CEJ-ABC) يبلغ 0.2 مم، بينما الفئران المصابة بالتهاب دواعم السن عند نقطة الربط التي تمر 9 أيام بعد الربط لديها ضعف هذا المقدار (مسافة CEJ-ABC 0.4 مم)11. فقدان عظم السنخة لا يزداد بشكل ملحوظ بعد 9 إلى 18 يوما بعد وضع الرباط11.
      2. قم بإجراء تحليل لحساب القوة بناء على حجم هذا التأثير لتحديد عدد الفئران المطلوبة لكشف هذه الفروقات بين الصحة والمرض (هنا، المجموع 8-10 فئران [الشكل 1A]).
        ملاحظة: تم حساب القدرة لتحقيق قدرة بين 0.8 و0.95، α = 0.05، باستخدام متوسط طاقة من عينتين. يتم عرض متوسطات المجموعة والانحرافات المعيارية في الشكل 1B.
    2. لتحديد تأثير علاجي على فقدان العظام، قم بحساب طاقة مختلف. بدلا من مقارنة الفئران السليمة بالفئران المريضة، حيث تطور كل من الفئران التجريبية والضابطة التهاب دواعم السن في هذا البروتوكول، خصص بين 19 و31 فأرا في المجموعة لضمان قابلية تكرار النتائج عند اختبار تعديل فقدان العظم باستخدام نموذج التهاب دواعم السن المبسط الناتج عن الرباط (انظر النتائج التمثيلية والشكل 1C).
      ملاحظة: تم حساب القدرة باستخدام نفس الاختبار الموضح أعلاه. المتوسطات الجماعية والانحرافات المعيارية معروضة في الشكل 1D.
  2. توحيد الإجراءات ومعايرة الأفراد
    1. تدريب ومعايرة جميع الأفراد المشاركين في تحفيز المرض وقياسه قبل بدء الدراسة (المعايرة والمعايرة داخل المرض؛ r2 ≥ 0.90).
      ملاحظة: يقدر أن التدريب على وضع الأرباط وقياس فقدان العظام يتطلب فترة تتراوح بين 2-3 أشهر (الجدول الزمني المعروض في الجدول 1). يتم عرض خطوات أخرى مطلوبة كجدول زمني في الجدول 1.
    2. بالنسبة لإجراء وضع الربط، اجعل محققين مدربين يعملان معا في غرفة الإجراءات. يبقى الباحث الرئيسي (داخل ومعايرة) هو المشغل الذي يضع الأربطة.
    3. اجعل المحقق الثاني يعمل كمساعد إجرائي ويؤدي الخطوات المذكورة أدناه:
      1. سجل وزن الفأرة.
      2. ضع الفأرة في صندوق المخدر.
      3. ضع مرهم العين على الفأر قبل تسليمه للمشغل لوضعه في "سرير الأسنان للفأر".
      4. تأكد من أن ≥3 "حوامل رباط" محملة بشكل مناسب بالأربطة وجاهزة للاستخدام.
        ملاحظة: لتحسين الكفاءة، من المثالي تحميل ≥3 "حوامل رباط" بشكل مناسب لاستخدام المشغل. يوصى بمراعاة الكفاءة (أي وقت إجراء 5-10 دقائق لكل فأرة)، مما يزيد عدد التجارب التي تجرى في اليوم ويقلل من التأثيرات الدفعية المحتملة.
      5. قم بمراقبة الفأرة (قبل وبعد الإجراء).
        ملاحظة: التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط هو إجراء غير جراحي وغير جراحي يشبه تنظيف الأسنان بالخيط البشري. من المتوقع أن يسبب وضع الربط انزعاجا خفيفا جدا للفئران (ويرجع ذلك أساسا إلى تراكم البكتيريا بين سنين)، لكنه لا يتطلب استخدام مسكنات الألم. لا يتوقع حدوث مضاعفات بعد وضع الربط بواسطة شخص مدرب. يتم مراقبة جميع الحيوانات كل 2-3 أيام بعد وضع الربط. يجب ذكر النقاط الإنسانية (مثل الفشل في العناية أو التغذية، عدم القدرة على النهوض أو التنقل، صعوبة التنفس، الجروح النخرية أو المصابة) في بروتوكول الحيوانات المعتمد، ولكن إذا حدثت أي مضاعفات، يجب استشارة الطاقم البيطري بشأن الإجراءات المناسبة.

2. إنشاء أدوات مطبوعة لتحفيز التهاب دواعم السن في الفئران

ملاحظة: لتحسين وضع الأربطة، تم تطوير أدوات مطبوعة ثلاثية الأبعاد تسمى Mouse Dental Bed وLigature Holder، تتكون من عدة قطع مطبوعة ثلاثية الأبعاد فردية تطبع بشكل منفصل وتجمع يدويا. تم نشر مواصفات المخططات لهذه الأجهزة سابقافي 11 ويمكن للباحثين ذوي الخبرة استخدامها لإنشاء ملفات STL الفردية. تم إنشاء الأجهزة الجديدة في الدراسة الحالية بالتعاون مع مركز تصميم BeAM بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. يمكن الحصول على المواد من خلال المنشأة الأساسية المعنية أو الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام ملفات STL في الملف التكميلي 1.

  1. سرير الأسنان للفئران
    1. اطبع سرير الأسنان للفأر (الشكل 2A) وحامل الربط (الشكل 2B) باستخدام جودة الطباعة القياسية على طابعة ثلاثية الأبعاد باستخدام خيط حمض البولي لاكتيك (PLA) بقطر 3.0 مم. اطبع سرير الأسنان في الاتجاه المصمم والأجزاء الأخرى ذات الأسطح المسطحة الموحدة الموجهة للأسفل مقابل سرير الطباعة. فعل خيار المواد الداعمة عن طريق تفعيل إعداد وضع الدعم. تأكد من أن مادة الدعم تلامس لوحة البناء أولا باختيار خيار لمس لوحة البناء.
      ملاحظة: استخدم ملفات STL الخمسة في الملف التكميلي 1 لطباعة جميع العناصر المطلوبة، بما في ذلك الأنبوب المنفصل، والرباط (مع شق)، وسرير الأسنان للفأر (مع شقوق)، والغطاء، وقفل حامل الربط. راجع جدول المواد لأبعاد كل عنصر (مواصفات المخططات المقدمةسابقا 10).
    2. بعد الانتهاء من الطباعة، قم بقص أي أجزاء مطبوعة من المواد الداعمة من النماذج باستخدام قواطع الأسلاك أو كماشة ذات أنف الإبرة أو أداة أخرى.
      ملاحظة: ارتد نظارات السلامة أثناء هذا الإجراء.
  2. تجميع سرير الأسنان للفأر
    1. لتحضير سرير الأسنان للفأر، قم بترتيب جميع الأجزاء كما هو موضح (الشكل 3A) وتحضير الغراء المستخدم (الشكل 3B).
    2. ضع بضع قطرات من الغراء (الشكل 3C) وثبت البراغي كما هو موضح (الشكل 3D). مرة أخرى، استعد لنقل الغراء (الشكل 3E) إلى المناطق التي سيتم تطبيقه فيها. قم بتحريك فتحة الأنبوب المطبوع (الشكل 3F) في مكانها بحيث يكون الطرف الشائك مواجها بعيدا عن سرير الأسنان في ماوس (وهذا هو المكان الذي سيتصل فيه الخرطوم لتوصيل الإيزوفلوران).
    3. ثبت قطع تثبيت الرأس في مواقعها بالغراء (الشكل 3F).
    4. امسح أي غراء زائد وابق ضغطا بسيطا على جميع القطع المدخلة لتثبيت قوي (الشكل 3F).
  3. تعديلات حامل الأرباط
    1. لتقليل الانزعاج عند قفل أو فتح الآلية، تأكد من أن جميع الحواف المربعة/الحادة في الجزء الخارجي من قفل حامل الربط (الشكل 4A) مائلة قليلا بزاوية 45° باستخدام مقبض شفرة مشرط 15C، رقم 3 مع شفرة 15C.
    2. لضمان ملاءمة آلية القفل بإحكام مع حامل الربط، قم بتسوية أي زوايا داخلية مستديرة على قفل حامل الربط (الشكل 4B-F) باستخدام شفرة مشرط 15C.
      ملاحظة: هذا سيسمح للقفل بالاستقرار الكامل مقابل حامل الربط ويتطلب فقط تعديلات طفيفة.
      1. استخدم أداة تقليم بطباعة ثلاثية الأبعاد أو شفرة مشرط 15C لإزالة "الوميض" المتبقي على الحواف العلوية والسفلية حتى بعد إزالة معظم الدعم، واميل الحواف قليلا عند زاوية 45° (مماثل للميل الذي تم في قفل حامل الرباط في الخطوة الأولى) لضمان قفل محكم.
        ملاحظة: لا تزل الكثير من المواد، ولكن فقط ما يكفي ليثبت القفل دون مقاومة.
    3. إذا كانت رقيقة جدا، قم بقص طول كل طرف حتى يصل إلى مقطع عرضي أكثر سمكا [على الأقل 0.5 مم سمك]، مع التأكد من بقاء فراغ كاف بين الأطراف لمنع الاصطدام بالحنك عند وضع الأربطة. تأكد من أن أطراف القطع لا تقل عن 3 مم بعد القطع (الشكل 5A، موضح ب "CUT").
    4. على أطراف حامل الربط، قم بإزالة أي وميض من "الدعم" الذي طبعت عليه الأداة للتأكد من أن جانب الأطراف مسطح (الشكل 5B، السهم).
    5. قم بإزالة "شريحة" من جانب كل طرف بزاوية 45° لتسهيل تحميل الرباط عليه وكذلك تليين الحواف لمنع الإصابة الرضحية للأنسجة الرخوة (الشكل 5C، موضح بالسهام).
    6. تأكد من أن كل طرف في حامل الربط يحتوي على شق على شكل حرف "V" يمكن أن تستقر فيه أربطة الحرير المصنوعة من الخياطة. إذا تم إزالة هذا في الخطوة 2.3.6 لأن الطرف المطبوع في البداية كان رقيقا جدا، قم بتنقيحه في الطباعة أو إعادة إنتاجه.
      1. إذا كان هذا الشق على شكل "V" مرئيا، ضع حامل الربط على سطح مستو بحيث يكون كلا الطرفين موازيين لسطح الطاولة، وضع شفرة مشرط 15C برفق في قاعدة الشق، وحرك الشفرة بلطف من جانب إلى آخر بحيث تبقى حافة الشفرة عند قاعدة "V" ويلامس جانب الشفرة الجدران العلوية لل"V". مع وضع الشفرة عند قاعدة الشق، قم بتوجيه الشفرة بحذر شديد نحو السطح الخارجي للطرف وكرر هذه الحركة لتحسين قاعدة الشق على شكل "V" على الحافة الخارجية، مما يسمح لخيط الغرز بالتوجيه إلى مكانه بسهولة أكبر.
        ملاحظة: هذا التحرك المتحرك يخلق حركة كافية في الخيط لتحريكها بعيدا وتنقية الشق دون إزالة كمية زائدة من المادة.
      2. إذا لم يكن هذا الشق على شكل حرف "V" مرئيا، ضع حامل الربط على سطح مستو بحيث يكون الطرفان عموديين على سطح الطاولة. أثناء النظر مباشرة إلى الأسفل على كلا طرفي حامل الربط، ضع شفرة مشرط 15C في منتصف الأطراف، وبحركة واحدة متعمدة، قم بقطع ضحل لتكوين بداية ما سيصبح الشق على شكل "V".
        ملاحظة: غالبا ما يكون من الأسهل تنفيذ هذا الفعل على كل طرف بشكل منفصل بدلا من محاولة وضع الشفرة في المكان الصحيح على كلا الطرفين في نفس الوقت.
      3. كرر الخطوة 2.3.7.2 إذا لزم الأمر، مع التأكد من أن حافة شفرة المشرط دائما تتبع إلى نفس المكان في منتصف الطرف.
        ملاحظة: إذا لم تعود الحافة إلى نفس المكان، فسيتم إجراء عدة قطع مما يؤدي إلى بدء انفصال طبقات الخيط في تلك المناطق وقد يقلل من أداء الأداة.
        ملاحظة: يجب اختبار عمق الشق على شكل "V" بشكل دوري باستخدام رباط من حرير الخياطة المربوط لتحديد ما إذا كان الرباط ثابتا أم أنه يستمر في الانزلاق (قد يشير ذلك إلى الحاجة لمزيد من التحسين). يجب طباعة الحامل بحيث يكون الشق مواجها للأسفل على لوحة البناء، وقفل حامل الربط موجها بحيث يكون الفتحة الأعرض للأسفل تلامس لوحة البناء. مرة أخرى، يمكن استخدام مادة الدعم مع ضبط وضع الدعم على لوحة بناء لمس فقط.
  4. حامل الربط المركب
    ملاحظة: بعد إجراء التعديلات، قم بتجميع حامل الربط، وتحقق من ما يلي:
    1. عند تثبيت الرباط في مكانه، تأكد من أن القفل يضغط الخيط على حامل الربط (الذي لا يظهر في الشكل 6A بالسهم، لكنه يظهر في الشكل 6B) إما في أعلى أو أسفل القفل (كلاهما إذا أمكن لكن قد يكون من الصعب تحقيق ذلك).
      ملاحظة: هذا الاحتكاك سيضمن عدم انزلاق الربط من مكانه.
    2. عند تمرير الربط في الأخاديد على حامل الربط، إذا استمر الانزلاق من الأطراف، إما أن تعمق الأخاديد أو تمددها أكثر إلى خارج الطرف لتشكيل "مسار" يجلس فيه الخيط.
    3. تحقق مما إذا كانت العقدتان في المنتصف (الشكل 6C) ومستويتان (خط مستقيم في الشكل 6D) عند النظر من مقدمة حامل الربط؛ وإذا لم يكن كذلك، فأحد الأخدود أعمق من الآخر.
    4. تحقق من أن الربط يقع داخل الشقوق وأنه ليس عميقا جدا؛ وإلا، فهناك خطر متزايد من ملامسة طرف حامل الرباط للأنسجة الرخوة والتسبب في صدمة أثناء وضع الربط.
    5. باستخدام مستكشف الأسنان (الشكل 6E)، تأكد من أن الرباط يرتد إلى مكانه دون أن ينزلق عند تطبيق قوة لطيفة بين العقد (وهذا يحاكي القوة التي سيتعرض لها أثناء وضع الربط).

3. وضع الربط

ملاحظة: من الممكن وضع الأربطة بين أسنان الفأر مع أو بدون إضافة مسببات أمراض لثة الإنسان11. أظهر تحليل يعتمد على الوقت لتركيب الميكروبات في الرباط (دون مكملات بأنواع البكتيريا البشرية) تحولا في مجتمع الميكروبيوم (خلل الحيوية) خلال تطور التهاب دواعم السن12. لهذا السبب، لا ينصح باستبدال الربط لأنه قد يغير من قابلية تكرار النتيجة. يعتمد إدراج أنواع البكتيريا مع الربط على السؤال الذي يتم تناوله في دراسة محددة. بسبب فقدان الربط المتوقع بنسبة 10-15٪ في11، توضع الأربطة بشكل ثنائي الجانب في فأر واحد. يقلل هذا النهج من فقدان الفئران أثناء التجربة.

  1. بعد تخدير الفأر باستخدام الإيزوفلوران المستنشق، ضع الفأر المخدر في سرير الأسنان للفأر بحيث يكون ظهره ملتصقا بالسرير والأنف قريبا من مخروط الأنف.
    ملاحظة: يجب تخدير الفئران باستخدام إيزوفلوران بنسبة 4٪ (حجم/حجم). يتم ترشيح تبخير الإيزوفلوران والأكسجين بواسطة فلتر هواء بحجم 0.2 ميكرومتر. بمجرد تخدير الفأر بالكامل ووضعه في سرير الأسنان للفأر، يجب الحفاظ على تدفق الفأر بنسبة 1.5-2.5٪ عبر مخروط الأنف. تتم مراقبة الفئران من خلال حركات الجسم اللاإرادية ومعدل التنفس (~55-65 نفسا في الدقيقة). لا يلزم إعطاء مسكن للألم للفئران المسببة لالتهاب دواعم السن الربطي، حيث أن هذا إجراء غير جراحي وغير جراحي يشبه تنظيف الأسنان بالخيط البشري. من المتوقع أن يسبب وضع الربط انزعاجا خفيفا جدا للفئران (ويرجع ذلك أساسا إلى تراكم البكتيريا بين سنين)، لكنه لا يتطلب استخدام مسكنات الألم. لا يتوقع حدوث مضاعفات بعد وضع الربط بواسطة شخص مدرب.
  2. استخدم الأربطة المطاطية لتثبيت رأس الفأر وفتح فمه.
    ملاحظة: الشريط حول القواطع الفكية يسحب اللسان أيضا، والتوتر يكون سلبيا لفتح الفك دون سحبه. يصبح تصور الأضراس أسهل عندما يوجه مصدر الضوء بزاوية لمنع الظلال من حجب مجال الرؤية. تم تصميم سرير الأسنان الخاص بالفئران خصيصا لنموذج الفأر المبسط الناتج عن التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط المحفز. المسافة بين أنف الفأر والمخروط مطلوبة للسماح للفأر بحركات جسدية صغيرة أثناء الإجراء التجريبي. تسمح حركة الفأرة هذه بمراقبة حركة يد المشغل بشكل مناسب أثناء استخدام حامل الربط، وتتحكم في مقدار القوة المستخدمة أثناء وضع الربط. يجب أن يستغرق وضع الربط من 5 إلى 10 دقائق لكل فأرة. يجب إجراء الإجراءات في غطاء مهواة جيدا لإجراء تجارب على الحيوانات
  3. لوضع رباط على الجانب الأيمن، أمسك حامل الربط في اليد اليمنى والمستكشف في اليد اليسرى.
    ملاحظة: إذا لم تكن العقد على الربط في المنتصف بين الأطراف بل أقرب إلى طرف واحد، فقد يكون الرباط أكثر ملاءمة لوضعه على جانب معين. على سبيل المثال، إذا وضعت العقد أقرب إلى الطرف الأيمن لحامل الربط، فقد يكون من الأسهل وضع هذا الرباط على الجانب الأيمن.
  4. ضع طرف المستكشف بلطف تحت التلامس القريب بين الضرس الأول والثاني على الجانب الحنكي.
    1. اجعل رأس المستكشف يلمس الأسنان أولا ثم ينزلق ويستريح على اللثة لتجنب إلحاق الصدمة بالأنسجة الرخوة؛ ضع مقبض المستكشف في زاوية أفقية بمجرد وضعه في وضعه الصحيح.
    2. لاحظ أي طرف من المستكشف يستخدم للوضع على الجانب الأيمن وأيها يستخدم على الجانب الأيسر. تأكد من أن طرف المستكشف يلتصق بمنطقة التلامس القريبة في اتجاه للأعلى مع السماح لانحناء الساق بالانتقال عبر الجانب المقابل لتثبيت الرأس ضد القوى التفاعلية أثناء الوضع.
  5. باستخدام حامل الرباط في زاوية أفقية، اسحب الخد أولا بوضع حامل الرباط فوق التلامس القريب بين الضرس الثاني والثالث، ودفع حافة حامل الرباط نحو الخد لتحريكه، ثم جلب حامل الرباط إلى موقعه عند التلامس القريب بين الأضراس الأولى والثانية.
    ملاحظة: تساعد هذه الخطوة في ضمان عدم احتجاز أي مخاط خدقي بين الرباط والأسنان، مما قد يتداخل مع وضعها.
  6. بمجرد وضع الرباط فوق التلامس القريب بين الضرس الأول والثاني، قم بتدوير مقبض حامل الرباط حتى 45°، وبمزيج من التأرجح اللطيف والانزلاق، ادفع الرباط عبر التلامس.
  7. قطع الخيط الزائد:
    1. استخدم ملقط إبرة رفيع لتثبيت الخيط الزائد المتصل بالعقدة على الجانب الأيمن، واسحب الخيط عبر الأسنان باتجاه اليسار، وباستخدام مقص مفتوح قليلا، انزلق المقص على طول الخيط حتى يوضع على بعد ~1.5 مم من العقدة قبل القطع.
      ملاحظة: يساعد ذلك في تقليل احتمالية حدوث إصابة مخاطية غير مقصودة عند قطع الزائد.
    2. كرر ما سبق مع عكس الاتجاهات للعقدة الأخرى.
  8. اعكس الخطوات السابقة من 3.3. إلى 3.7.2. عند وضع رباط على الجانب المقابل من الفم.
    ملاحظة: ينصح بجمع الأربطة عند التضحية، حيث قد يتغير التحول الخلفي بسبب ظروف تجريبية مختلفة يتم اختبارها12. لتسهيل الجمع، توضع الفئران في سرير الأسنان الماوس ويقطع أحد عقد الرباط تليها إزالة الملاقط بلطف بين الأجزاء المحيطة. يسمح استخدام سرير الأسنان للفأر أثناء جمع الربط باستقرار الفأر المناسب وسهولة الوصول إلى موقع الربط.

4. قياس كمية تدمير العظام

  1. تحليل ميكروميكرو مكرونة ميكرو مقطعية
    1. افتح البرنامج وانقر على ملف | استيراد صورة...
    2. انقر على التصفح في القائمة المنبثقة، ثم انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات Dicom لمسح واحد، واختر الملف الأول.
    3. انقر على فحص للعثور على أي ملفات أخرى داخل المجلد تكون جزءا من نفس العينة الممسوحة ضوئيا وتحديدها. اضغط موافق.
    4. بعد بدء تحميل الصورة، انقر على Visualize و Isosurface.
    5. غير عتبة الصورة إلى 5,000 وعامل جودة السطح (٪) إلى 55.
    6. المربعات المحددة بتفعيل تنعيم الصورة وسطح القص مع عائد الاستثمار الحالي وانقر على التحديث.
    7. قم بضبط خصائص المستوى بالنقر بزر الفأرة الأيمن على نافذة/المستوى في الأسفل (الشكل 7A) والنقر على تعديل خصائص النافذة/المستوى. اختر قيمة كثافة العظام القياسية لجميع العينات. لاتباع هذا البروتوكول، استخدم 2000 لكن قم بتغييره بناء على كثافة عظام العينات وحافظ على ثباته لجميع القياسات.
    8. للتلاعب بالمستويات:
      1. استخدم اختصارات لوحة المفاتيح I/J/K Hide/show للمستويات الثلاث المختلفة.
      2. انقر بزر الفأرة الأيمن وحرك المؤشر للتكبير والتصغير.
      3. اضغط على Shift ثم انقر بزر اليسار للتحريك.
      4. انقر على Slice للتحرك وتدوير المستويات.
      5. انقر على مركز الطائرة لتحريك الطائرة للأمام/الخلف أو ضع المؤشر في مركز المستوى المطلوب واستخدم مفاتيح الأسهم للأعلى والأسفل لتحريك المستوى شريحة تلو الأخرى.
      6. انقر على حافة الطائرة لتدور حول خط مواز لهذه الحافة في مركز المستوى.
      7. انقر على زاوية الطائرة للدوران حول الطائرة.
    9. وجه محور z (اللوح الأزرق في أعلى الشاشة - شريحة z) بحيث تصبح أسطح وأشكال الأسنان الثلاثة مرئية في نفس الوقت (أو أقرب ما يمكن) (الشكل 7B).
    10. مرر عبر نفس المستوى (اللوحة الزرقاء في أعلى شريحة الشاشة) بحيث تكون جذورالضرس الأول والثاني مرئية (الشكل 7C). حاول اختيار نقطة بعيدة بما يكفي في الجذور بحيث يمكن رؤية كل التشريح المحيط به، ولكن أيضا حيث تظهر القنوات محددة جيدا وفي خط مستقيم.
      ملاحظة: قد يحتاج الطائرة إلى تدوير لتوجيه القنوات عموديا.
    11. وجه محور x (الخط الأخضر الرأسي في لوحة شريحة z) ليتماشى مع الجذور الخزفيةللضرس الأول والثاني (حاول محاذاة الجزء المركزي من كل جذر/قناة إذا أمكن؛ وإلا، محاذاة عبر الجذر الخشقيللضرس الأول والجذر الدهميللضرس الثاني) (الشكل 7D).
    12. استخدم اتجاه شريحة x كمرجع لمحاذاة شريحة y (الخط الأزرق الرأسي في لوحة شريحة x).
      1. محاذاة شريحة y بحيث تكون موازية عموديا عبر جذر الضرس الأول في لوحة الشريحة X (الشكل 7E). قم بتدوير المستوى لتوجيه الجذر عموديا. لاحظ أن الخط الأزرق يعبر منتصف الجذر.
        ملاحظة: في مناطق فقدان العظام (كما هو متوقع في هذا النموذج)، قد يكون لدى الحافة السنيخية عيب؛ لذلك، يجب تقدير خط منتصف الجذر لأن العظم المحيط قد لا يكون موجودا لتحديد وسط التجويف بشكل مثالي.
    13. في لوحة شريحة y، قس المسافة من وصلة الأسمنتو المينا (CEJ) إلى قمة العظم السنخية (ABC) بوضع المؤشر في أعمق نقطة من الأخدود عند CEJ والضغط على 1، ثم بوضع المؤشر في أقرب نقطة إلى ABC والضغط على 2 كما هو موضح (الشكل 7F). النقطةالأولى ترمز إليها بسهم أزرق، والنقطة الثانية بسهم أخضر.
      1. إذا لم تظهر الأسهم حتى يتم اختيار النقطتين، اخترها بتمرير السهم فوق المناطق المطلوبة واضغط على مفاتيح الأرقام على لوحة المفاتيح لأن النقر على الفأرة لن يعمل.
      2. إذا كان من الصعب تحديد CEJ، استخدم مفاتيح الأسهم للأعلى والأسفل للتمرير عبر الشرائح المجاورة لتأكيد موقعه.
      3. قس عدة نقاط في ABC إذا كان من الصعب تحديد "أقرب نقطة" للتأكد من وجود تباين ضئيل أو معدوم في القياس.
        ملاحظة: للتأكد من أن القياس الصحيح قد تم أخذه، يجب رؤية شرائح x و z تتقاطع فوق الجذر المطلوب ويمكنك تأكيد القياس بصريا في العرض ثلاثي الأبعاد عن طريق إخفاء المستويات (الشكل 7F).
  2. قياس تعبير اللثة لرانكل/أوبغ ورانكل/الرتبة
    1. اجمع الأنسجة اللثية كما هو موضح سابقا9.
      ملاحظة: أفضل نتائج استخراج الحمض النووي الريبي يتم الحصول عليها باستخدام عينات الأنسجة الطازجة ويجب معالجة تنقية الحمض النووي الريبي في أسرع وقت ممكن.
    2. استخلاص الحمض النووي الريبي لنسيج اللثة عن طريق ضرب الخرز باستخدام المجموعة المشار إليها وخرز السيراميك. اتبع التعليمات الموجودة على الطقم واحتفظ بالعينة عند -80 درجة مئوية حتى يتم التحليل بواسطة qRT-PCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أتحليل البيانات الممثلة لقياسات العظام السنخية الخطية من فئران ذكور وذكور WT عند البداية (الصحة) و9 أيام بعد الربط معروض في الشكل 1A. تشير حسابات القوة إلى أن ما مجموعه 10 فئران (4-5 فئران لكل مجموعة) مطلوبة لاكتشاف الفروق بين هذه المجموعات إذا كان النتيجة الأساسية في الاعتبار هي مستويات العظام الخطية المقاسة بواسطة ميكرو مقطعي (الشكل 1B). ومع ذلك، يتطلب حساب القوة للدراسات ما قبل السريرية أن تطور كلتا المجموعتين من الفئران الته...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الدراسة الحالية معلومات ثاقبة وإرشادات مفصلة خطوة بخطوة حول بروتوكول نموذج الفأر المبسط الناتج عن الربط الذي تم تقديمهسابقا 10. يمكن أن تؤثر التفاصيل الواردة في الورقة الحالية بشكل كبير على قابلية التكرار، وتدعمها تجربة المجموعة مع نموذج فأر التهاب دواعم السن الناتج عن الرباط 11,12,13,18,19,21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملفات STL المستخدمة لإنشاء الأجهزة المطبوعة ثلاثية الأبعاد في المنشورالسابق 9 تخضع لاتفاقية حقوق نشر مع جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم البحث المبلغ عنه في هذا المنشور من المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والوجه التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز K01DE027087 (JTM) و R01DE032830 (JTM). كما حظي العمل بدعم من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01-AI153265 (KVS). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. بالإضافة إلى ذلك، فإن البحث المبلغ عنه هنا مدعوم أيضا برمز تمويل برنامج فولبرايت/CAPES رقم 001 (TA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بليدإنتيجرا4-315Cشفرة 15C
خرز السيراميكVWR10158-6080.5 مل × 1.4 مم خرز سيراميك
مادة الغراء/الراتنجشركة غوريلا للغراء8401519
حامل الربط (مع شق)مركز تصميم بي إيم في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيلغير قابل للتطبيق118.01 مم × 13 مم × 13.74 مم
قفل حامل الربطمركز تصميم بي إيم في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيلغير قابل للتطبيق17.5 مم × 14.57 مم × 17.8 مم
طابعة Lulzbot mini v1.0 ثلاثية الأبعاد  لولزبوت (معدات تصنيع مضافات فارجو 3D, LLC)غير قابل للتطبيقأليف أوجكتس، نموذج Lulzbot Mini v1.0
برنامج مايكرو فيوابتكارات بارالاكس2.5.0-3139البرامج المستخدمة لقياسات العظام
سرير الأسنان للفأر (مع شقوق)مركز تصميم بي إيم في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيلغير قابل للتطبيق103.86 مم × 196.85 مم × 50.99 مم
سطح سرير الأسنان من ماوسمركز تصميم بي إيم في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيلغير قابل للتطبيق99.8 مم × 77 مم × 21.5 مم
خيط حمض البولي لاكتيك (PLA)حرفيا55259عيار 3.0 مم PLA
مجموعة أنسجة RNA من RapidpureMP Biomedicals112721050
مقبض شفرة المشرطبارد-باركر371030مقبض شفرة المشرط 15C
حرير الغرزروبوز للأداة الجراحيةSUT-15-1
بادئات qPCR تقمانثيرمو فيشررانك (Mm00437135_ م1)، رانكل (Mm00441906_ م1)، أوبغ (Mm00435452_ م1)، جاده (Mm99999915_g 1)
VX-765  إنفيفوجين، سان دييغو، الولايات المتحدة الأمريكية#inh-vx765-1مثبط كاسباز-1 المستخدم في تعديل المضيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة