يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الانتقالي لتقييم آثار فرط التأكسج على الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري حديثي الولادة

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا لإنشاء نموذج ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI) باستخدام الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي لحديثي الولادة (nTAEC) وإجراء التعرض لفرط التأكسج ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة تأثير الإجهاد التأكسدي الناجم عن الغلاف الجوي على الخلايا المشتقة من ظهارة سطح مجرى الهواء النامي لحديثي الولادة.

الملخص

تتعرض ظهارة مجرى الهواء المبتسرج لحديثي الولادة باستمرار للضغوطات البيئية. أحد هذه الضغوطات عند حديثي الولادة المصابين بأمراض الرئة يشمل توتر الأكسجين (O2) أعلى من الغلاف الجوي المحيط - يسمى فرط التأكسج (>21٪ O2). يعتمد تأثير فرط التأكسج على مجرى الهواء على عوامل مختلفة ، بما في ذلك المرحلة التنموية للمجرى الهوائي ، ودرجة فرط التأكسج ، ومدة التعرض ، مع التعرض المتغيرة التي يحتمل أن تؤدي إلى أنماط ظاهرية فريدة. في حين كانت هناك أبحاث مكثفة حول تأثير فرط التأكسج على السنخية في الرئة لدى حديثي الولادة وفرط نشاط مجرى الهواء ، لا يعرف سوى القليل عن التأثير الكامن قصير وطويل المدى لفرط التأكسج على الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري حديثي الولادة. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو ندرة نموذج فعال في المختبر لدراسة تطور ووظيفة مجرى الهواء البشري لحديثي الولادة. هنا ، نصف طريقة لعزل وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي البشري لحديثي الولادة (nTAECs) باستخدام شفاطات القصبة الهوائية لحديثي الولادة وزراعة هذه الخلايا في ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI). نثبت أن nTAECs تشكل طبقة أحادية مستقطبة ناضجة في ثقافة ALI وتخضع للتمايز المخاطي الهدبي. نقدم أيضا طريقة للتعرض المعتدل لفرط التأكسج للخلية أحادية الطبقة في ثقافة ALI باستخدام حاضنة متخصصة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف فحصا لقياس الإجهاد التأكسدي الخلوي بعد التعرض لفرط التأكسج في مزرعة ALI باستخدام القياس الكمي الفلوري ، مما يؤكد أن التعرض المعتدل لفرط التأكسج يحفز الإجهاد التأكسدي الخلوي ولكنه لا يسبب تلفا كبيرا في غشاء الخلية أو موت الخلايا المبرمج. يمكن استخدام هذا النموذج لمحاكاة التعرض لفرط التأكسج ذي الصلة سريريا الذي واجهته المسالك الهوائية لحديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة (NICU) واستخدامه لدراسة التأثيرات القصيرة والطويلة الأمد ل O2 على البرمجة الظهارية لمجرى الهواء الوليد. يمكن استخدام الدراسات التي تستخدم هذا النموذج لاستكشاف طرق للتخفيف من الإصابة التأكسدية المبكرة في المسالك الهوائية النامية ، والتي تشارك في تطور أمراض مجرى الهواء طويلة الأمد عند الخدج السابقين.

المقدمة

الأكسجين العلاجي (O2) هو أحد العلاجات الأكثر استخداما في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة (NICU) 1. وبالتالي ، فإن التعرض لفرط التأكسج (>21٪ O2) هو إجهاد جوي شائع يواجهه الأطفال حديثي الولادة المصابين بأمراض الرئة الخطيرة أو بدونها. يمكن أن تختلف استجابات الرئة لفرط التأكسج اعتمادا على شدة و / أو مدة التعرض والموقع التشريحي ونوع الخلية ومرحلة نمو الرئة2،3،4،5،6. ركز الجزء الأكبر من البحث في إصابة فرط التأكسج الرئوي لدى حديثي ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لم يتم جمع عينات شفط القصبة الهوائية لحديثي الولادة إلا بعد موافقة مستنيرة من الوالدين ، وتمت الموافقة على البروتوكول المستخدم للجمع والنقل والتخزين من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما (IRB 14377).

1. التحضير للعزل والمرور وثقافة ALI ل nTAEC

  1. إعداد وسائل الإعلام
    1. وسط مجرى الهواء الظهاري القصبي (BLEAM) مع مثبطات (BLEAM-I): تحضير 500 مل (زجاجة واحدة ، مخزنة عند 4 درجات مئوية) من BLEAM عن طريق إضافة 1.25 مل من مكمل HLL (500 ميكروغرام / مل ألبومين مصل بشري ، 0.6 ميكرومتر حمض اللينوليك ، 0.6 ميكروغرام / مل ليسيثين) ، 15 مل من L-Glut....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لعزل nTAECs ، قمنا بجمع نفطات القصبة الهوائية من حديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة ونقلنا الشفاطات على الجليد إلى المختبر لمزيد من المعالجة (الشكل 1 أ). بعد زرع عينات نفطة القصبة الهوائية في وسط نمو ظهارة مجرى الهواء (BLEAM-I التي تحتوي على مثبطات Rho / Smad و GSK3 و mTOR) ، ظهرت الخلايا المستطيلة في غضون 7-10 أيام. بحلول 14 يوما ، كانت الخلايا ملتقية بنسبة 50٪ -60٪ ، وبعد حوالي 21 يوما من الطلاء ، كانت الخلايا معبأة بكثافة وتطلبت التربسين.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة لجمع ومعالجة عينات النهب الرغامي الوليدية من الولدان في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة مع عزل وتوسيع لاحق ل nTAECs الحية من هذه العينات باستخدام الطرق المعمول بهامسبقا 39. علاوة على ذلك ، قمنا بوصف طريقة لزراعة nTAECs على ALI وتوصيف تمايزها إلى ظهارة مجرى هوائي مخاطي هدبية مستقطبة كدالة للوقت عن طريق قياس TEER ، ومقايسة FITC-dextern ، وتلوين الفلورسنت المناعي ، وتحليل qPCR لنوع الخلية (أي القاعدية ، المهدبة ، والنادي والكأس) .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكفصون عنه ولا تضارب في المصالح للإبلاغ عنهم.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة الصحة المشيخية (PHF) والموارد السريرية والانتقالية المشتركة في أوكلاهوما (U54GM104938 مع جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من NIGMS) إلى AG. نود أن نشكر الدكتور بول ليرو والدكتور شينغ بين آي في مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس ، على توفير خلايا متبرعة حديثي الولادة المستخدمة في بعض التجارب. تم إنشاء الأشكال باستخدام Biorender. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ محلول فورمالينفيشر Scientific23-426796
1X PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts ، 6.5 ممCorning3470
جسم مضاد للتوبولين مضاد للأسيتيلات ، فأر أحادي النسيلةSigmaT7451
الأجسام المضادة لآلفا توبولينAbcamab7291
المضادة للسيتوكيراتين 5 الأجسام المضادةAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Air Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cparkd caspase-3 الأجسام المضادةالخلية9664T
SCGB1A1 أو بروتين خلية النادي (CC16) الإنسان ، الأرانب متعدد النسيلة الأجسام المضادةBioVendor R & DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (مؤشر الإجهاد التأكسدي العام)Thermo ScientificC6827
ثقافة خلايا كورنينج المعالجة T25 قواريركورنينج430639
كورنينج على شكل حرف U قوارير T75 قواريركورنينج430641U
CyQUANT LDH فحص السميةالخلوية الحرارية العلميةC20300
DAPI محلول (1 مجم / مل)فيشر EN62248
ميثيل سلفوكسيد [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
الماء المقطرGibco15230162
EVOM دليل لقياس TEERأداة الدقة العالميةEVM-MT-03-01
FBS (مصل الأبقار الجنينية)Gibco10082147
فلورسين إيزوثيوسيانات ديكستران (متوسط مول الوزن 10,000)فيشر F0918100MG
الفلورسين إيزوثيوسيانات – ديكستران (متوسط مول الوزن 20،00)سيجماFD20-100MG
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، الإعلانات البشرية-HRPSouthern Biotech1031-05
الماعز المضاد للفأر IgG2b الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، الفأر / الإعلانات البشرية-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC واجهة الهواء السائلة (ALI) التمايز تقنيةخلايا شريان الحياةLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثي الغازات ، 165 لترطقم
Thermo Scientific4368814
HLLمكمل تقنية LifeLine CellLS-1001
ImageJ NIHN / A
Invivogen Normocin - كاشف مضاد للميكروباتفيشر ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeline Cell TechnologyLS-1013
مصل الماعز العاديGibcoPCN5000
نورموسينإنفيفوجينأنت-nr-05
p63 الجسم المضادسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-25268
ProLong الذهب المضاد للتلاشي حاملInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
فحوصات تبر جين TaqMan Fast Advanced Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Asresion: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Ascesion: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Asression: GAPDHHs02786624_g1Thermo Scientific
Taqman: فحوصات النبذ الجيني
Taqman: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Hs00361185_m1
فحوصات إبراز الجين Taqman: فحوصات MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Exression Ascesion: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Ascesion: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
التصفية المعقمة ذات التدفق السريع Thermo Scientific Nalgene مع غشاء PES (0.22 & mu ؛ M المسام ، 500 مل)Thermo Scientific5660020
TM-1 مكمل مشتركلتقنية Lifeline CellLS-1055
إجمالي إشارات خلية الأجسام المضادة الكاسباز -314220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، فينول أحمرGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
إشارات ثنائي المتوسطة نسخ عكسي cDNA عالي السعة 51030411 حراري علمي imagej.nih.gov/ij/ فحوصات النبذ الجيني GPX1 Thermo Scientific Hs00829989_gH Taqman: فحوصات النبذ الجيني GPX2 Thermo Scientific Hs01591589_m1 Taqman Gene Exression Asression: KRT5 Thermo Scientific Taqman Gene وحدات

المراجع

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Ph....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الخلايا ثلاثية الأبعادالتعرض لفرط الأكسجةخلايا المسالك الهوائية لحديثي الولادةالواجهة بين الهواء والسائلمقايسة الإجهاد التأكسديعزل الشفط الرغاميالتمايز المخاطي الهدبياستقطاب الطبقة الخلوية الأحاديةأمراض الرئة لدى حديثي الولادة

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.