مقالة منهجية

نموذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الانتقالي لتقييم آثار فرط التأكسج على الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري حديثي الولادة

1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

نصف بروتوكولا لإنشاء نموذج ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI) باستخدام الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي لحديثي الولادة (nTAEC) وإجراء التعرض لفرط التأكسج ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية لدراسة تأثير الإجهاد التأكسدي الناجم عن الغلاف الجوي على الخلايا المشتقة من ظهارة سطح مجرى الهواء النامي لحديثي الولادة.

الملخص

تتعرض ظهارة مجرى الهواء المبتسرج لحديثي الولادة باستمرار للضغوطات البيئية. أحد هذه الضغوطات عند حديثي الولادة المصابين بأمراض الرئة يشمل توتر الأكسجين (O2) أعلى من الغلاف الجوي المحيط - يسمى فرط التأكسج (>21٪ O2). يعتمد تأثير فرط التأكسج على مجرى الهواء على عوامل مختلفة ، بما في ذلك المرحلة التنموية للمجرى الهوائي ، ودرجة فرط التأكسج ، ومدة التعرض ، مع التعرض المتغيرة التي يحتمل أن تؤدي إلى أنماط ظاهرية فريدة. في حين كانت هناك أبحاث مكثفة حول تأثير فرط التأكسج على السنخية في الرئة لدى حديثي الولادة وفرط نشاط مجرى الهواء ، لا يعرف سوى القليل عن التأثير الكامن قصير وطويل المدى لفرط التأكسج على الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري حديثي الولادة. أحد الأسباب الرئيسية لذلك هو ندرة نموذج فعال في المختبر لدراسة تطور ووظيفة مجرى الهواء البشري لحديثي الولادة. هنا ، نصف طريقة لعزل وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي البشري لحديثي الولادة (nTAECs) باستخدام شفاطات القصبة الهوائية لحديثي الولادة وزراعة هذه الخلايا في ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI). نثبت أن nTAECs تشكل طبقة أحادية مستقطبة ناضجة في ثقافة ALI وتخضع للتمايز المخاطي الهدبي. نقدم أيضا طريقة للتعرض المعتدل لفرط التأكسج للخلية أحادية الطبقة في ثقافة ALI باستخدام حاضنة متخصصة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف فحصا لقياس الإجهاد التأكسدي الخلوي بعد التعرض لفرط التأكسج في مزرعة ALI باستخدام القياس الكمي الفلوري ، مما يؤكد أن التعرض المعتدل لفرط التأكسج يحفز الإجهاد التأكسدي الخلوي ولكنه لا يسبب تلفا كبيرا في غشاء الخلية أو موت الخلايا المبرمج. يمكن استخدام هذا النموذج لمحاكاة التعرض لفرط التأكسج ذي الصلة سريريا الذي واجهته المسالك الهوائية لحديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة (NICU) واستخدامه لدراسة التأثيرات القصيرة والطويلة الأمد ل O2 على البرمجة الظهارية لمجرى الهواء الوليد. يمكن استخدام الدراسات التي تستخدم هذا النموذج لاستكشاف طرق للتخفيف من الإصابة التأكسدية المبكرة في المسالك الهوائية النامية ، والتي تشارك في تطور أمراض مجرى الهواء طويلة الأمد عند الخدج السابقين.

المقدمة

الأكسجين العلاجي (O2) هو أحد العلاجات الأكثر استخداما في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة (NICU) 1. وبالتالي ، فإن التعرض لفرط التأكسج (>21٪ O2) هو إجهاد جوي شائع يواجهه الأطفال حديثي الولادة المصابين بأمراض الرئة الخطيرة أو بدونها. يمكن أن تختلف استجابات الرئة لفرط التأكسج اعتمادا على شدة و / أو مدة التعرض والموقع التشريحي ونوع الخلية ومرحلة نمو الرئة2،3،4،5،6. ركز الجزء الأكبر من البحث في إصابة فرط التأكسج الرئوي لدى حديثي الولادة على تأثير التعرض لفرط التأكسج في سياق السنخية بعد الولادة لنمذجة خلل التنسج القصبي الرئوي (BPD) - وهو أكثر أمراض الرئة المزمنة شيوعا التي تصيب الخدج6،7،8،9،10،11. تصنف شدة اضطراب الشخصية الحدية حسب مقدار الدعم التنفسي ، و O2 المطلوب في 36 أسبوعا بعد الحيض9. يتحسن معظم الأطفال المصابين باضطراب الشخصية الحدية سريريا بمرور الوقت مع استمرار نمو الرئتين ، حيث يفطم الغالبية عن دعم الجهاز التنفسي قبل عيد ميلادهم الأول12،13. بغض النظر عن شدة اضطراب الشخصية الحدية بعد الولادة ، فإن الأمراض الكبيرة التي تصيب الأطفال الخدج السابقين تشمل زيادة خطر الصفير في مرحلة ما قبل المدرسة بمقدار 5 أضعاف ، والربو ، والتهابات الجهاز التنفسي المتكررة طوال فترة الطفولة ، ومرض الانسداد الرئوي المزمن المبكر12،14،15،16،17،18،19. تم التحقيق في تأثير فرط التأكسج على مرض مجرى الهواء طويل الأمد والالتهابات الرئوية عند الخدج باستخدام النماذج الحيوانية في المختبر وفي الجسم الحي 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24. ومع ذلك ، ركزت معظم هذه النماذج على دور الأنسجة الوسيطة والظهارة السنخية والعضلات الملساء في مجرىالهواء 25،26،27،28.

تبطن ظهارة سطح مجرى الهواء المسار الكامل للجهاز التنفسي ، وتمتد من القصبة الهوائية وصولا إلى القصبات الهوائية الطرفية ، وتنتهي قبل مستوى الحويصلاتالهوائية 29 مباشرة. الخلايا القاعدية لمجرى الهواء هي الخلايا الجذعية الأولية في ظهارة مجرى الهواء ، مع القدرة على التمايز إلى ذخيرة كاملة من السلالات الظهارية الناضجة لمجرى الهواء ، والتي تشمل الخلايا المهدبة والإفرازية (خلايا النادي: غير المنتجة للمخاط ، وخلايا الكأس: المنتجة للمخاط) 29،30،31،32. استخدمت دراسات زراعة الخلايا في سياق إصابة الرئة فرط التأكسج عند الأطفال حديثي الولادة في الغالب خطوط الخلايا السرطانية البشرية أو الفئرانالبالغة 33،34. بالإضافة إلى ذلك ، استخدمت معظم التجارب في المختبر أنظمة زراعة مغمورة ، والتي لا تسمح بتمايز الخلايا إلى ظهارة مجرى الهواء المخاطية الهدبي تشبه ظهارة مجرى الهواء في الجسم الحي في البشر 35. وبالتالي ، هناك فجوة في المعرفة فيما يتعلق بآثار إصابة الرئة الناجمة عن فرط التأكسج في تطوير الخلايا الظهارية في مجرى الهواء لحديثي الولادة. أحد الأسباب هو ندرة النماذج الانتقالية لدراسة آثار التعرض للغلاف الجوي على ظهارة مجرى الهواء البشري حديثي الولادة. يمكن أن تؤدي إصابة الرئة فرط التأكسج في وقت مبكر من الحياة إلى مرض مجرى الهواء طويل الأمد وزيادة خطر الإصابة بالعدوى ، مما يؤدي إلى عواقب تغير الحياة عند الخدج السابقين14،36،37. في الرضع غير الناجين المصابين باضطراب الشخصية الحدية الشديد ، فإن ظهارة سطح مجرى الهواء لها تشوهات واضحة ، بما في ذلك تضخم خلايا الكأس واضطراب النمو الهدبي ، مما يدل على تصفية الغشاء المخاطي الهدبي غير الطبيعي وزيادة ارتفاع الظهارة مما يضر بعيار مجرىالهواء 38. في العقد الماضي ، كان هناك اهتمام متزايد بزراعة الخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء في واجهة الهواء والسائل (ALI) لدراسة التطور الظهاري لمجرى الهواء بعدالولادة 39،40،41،42. ومع ذلك ، لم يتم استخدام نماذج ALI للخلايا الظهارية لمجرى الهواء الوليدي في سياق نماذج اضطراب الأكسدة والاختزال في الغلاف الجوي مثل التعرض لفرط التأكسج.

باستخدام طريقة منشورةسابقا 39 ، استخدمنا عينات نفطة القصبة الهوائية لحديثي الولادة التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة ونجحنا في عزل وتوسيع الخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء الرغامي لحديثي الولادة (nTAECs). لقد استخدمنا مثبطات Rho و Smad و Glycogen synthase kinase (GSK3) وهدف الثدييات لإشارات الرابامايسين (mTOR) لزيادة قدرة التمدد وتأخير الشيخوخة في هذه الخلايا ، كما هو موضح سابقا39،42 ، مما يسمح بالمرور الفعال واللاحق ل nTAECs. يصف البروتوكول طرقا لإنشاء مزارع 3D ALI باستخدام nTAECs وإجراء التعرض لفرط التأكسج على طبقات nTAEC أحادية. يستخدم تثبيط Rho و Smad لأول 7 أيام من استزراع ALI (أيام ALI من 0 إلى 7) ، وبعد ذلك تتم إزالة هذه المثبطات من وسائط التمايز لبقية مدة ثقافة ALI. يظل السطح القمي للطبقة الأحادية للخلية الظهارية المزروعة في مجرى الهواء المزروع ب ALI معرضا للبيئة43 ، مما يتيح دراسات الاضطراب في الغلاف الجوي ويشبه إلى حد كبير علم الأحياء المرضي لمجرى الهواء النامي لحديثي الولادة المعرض لفرط التأكسج في الجسم الحي. يختلف تركيز O2 المستخدم في دراسات زراعة الخلايا السابقة (بغض النظر عن الخلايا الخليدة أو الأولية) لإصابة الرئة فرط التأكسج الوليدية بشكل كبير (تتراوح من 40٪ إلى 95٪) ، وكذلك مدة التعرض (تتراوح من 15 دقيقة إلى 10 أيام) 36 ، 44 ، 45 ، 46 ، 47. في هذه الدراسة ، تعرضت الطبقة الأحادية لخلية ALI ل 60٪ O2 لمدة 7 أيام من اليوم 7 إلى 14 (بعد إزالة مثبطات Rho / Smad من وسائط التمايز). تم إجراء التعرض لفرط التأكسج خلال المرحلة المبكرة إلى المتوسطة من التمايز المخاطي الهدبي (اليوم 7 إلى 14 ALI) على عكس الظهارة الناضجة المتمايزة تماما ، وبالتالي يحاكي ظهارة مجرى الهواء النامية في الجسم الحي عند الخدج. تقلل استراتيجية التعرض هذه من خطر السمية الحادة O2 (وهو أمر متوقع بتركيزات أعلى من O2) مع الاستمرار في ممارسة الإجهاد التأكسدي ضمن نطاق ذي صلة من الناحية الفسيولوجية وتشبه النافذة الحرجة للانتقال من البيئة داخل الرحم الناقصة نسبيا إلى بيئة خارجية مفرطة التأكسج في الأطفال حديثي الولادة الخدج.

البروتوكول

لم يتم جمع عينات شفط القصبة الهوائية لحديثي الولادة إلا بعد موافقة مستنيرة من الوالدين ، وتمت الموافقة على البروتوكول المستخدم للجمع والنقل والتخزين من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع لمركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما (IRB 14377).

1. التحضير للعزل والمرور وثقافة ALI ل nTAEC

  1. إعداد وسائل الإعلام
    1. وسط مجرى الهواء الظهاري القصبي (BLEAM) مع مثبطات (BLEAM-I): تحضير 500 مل (زجاجة واحدة ، مخزنة عند 4 درجات مئوية) من BLEAM عن طريق إضافة 1.25 مل من مكمل HLL (500 ميكروغرام / مل ألبومين مصل بشري ، 0.6 ميكرومتر حمض اللينوليك ، 0.6 ميكروغرام / مل ليسيثين) ، 15 مل من L-Glutamine (6 مل) ، 2 مل من مستخلص P (0.4٪ ، مستخلص الغدة النخامية البقري) ، 5 مل من TM1 (1 ميكرومتر من الأدرينالين ، 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، 10 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين ، 0.1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون ، 5 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 5 نانوغرام / مل أنسولين) ، 1 مل من محلول المضادات الحيوية (نورموسين ، 0.1 مجم / مل). لمنع شيخوخة الخلايا الأولية وتحسين كفاءة التمدد ، أضف مثبطات عامل النمو التالية كما هو موضحسابقا 39: Y-27632 (بروتين كيناز مرتبط ب Rho أو مثبط ROCK) بتركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومتر ، A83-01 (يثبط إشارات Smad) بتركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر ، CHIR 99021 (مثبط سينسيز الجليكوجين -3 أو GSK3) بتركيز نهائي قدره 0.4 ميكرومتر و Rapamycin (مثبط الهدف الجزيئي للرابامايسين أو mTOR) مع نهائي تركيز 5 نانومتر. قم بتصفية الوسائط من خلال مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر. راجع الجدول 1 للحصول على قائمة بمكونات الوسائط.
    2. الخلية الظهارية للقصبات الهوائية / القصبة الهوائية البشرية (HBTEC) ALI متوسط: اصنع 500 مل من وسائط HBTEC عن طريق إذابة الزجاجة عند 37 درجة مئوية وإضافة 1 مل من محلول المضادات الحيوية (نورموسين ، 0.1 مجم / مل). بمجرد إضافتها ، قم بتصفية الوسائط من خلال مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
    3. وسائط HBTEC مع مثبطات (HBTEC-I): إعداد وسائط HBTEC على النحو الوارد أعلاه. قبل التصفية ، أضف المثبطات التالية: Y-27632 بتركيز نهائي يبلغ 5 ميكرومتر و A83-01 بتركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومتر. قم بتصفية الوسائط من خلال مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: قم بتخزين وسائط BLEAM-I و HBTEC و HBTEC-I عند 4 درجات مئوية ، مؤرخة ومصنفة ، في الظلام (ملفوفة بورق الألمنيوم) ، وقم فقط بتسخين ما هو مطلوب (مدة الصلاحية 30 يوما).
    4. HEPES/FBS: أضف 500 مل من محلول ملحي مخزن ب HEPES و 88 مل من FBS (التركيز النهائي هو 15٪). بمجرد إضافته ، قم بتصفية المحلول من خلال مرشح بحجم المسام 0.22 ميكرومتر وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية ، مؤرخا وموسما.
      ملاحظة: Aliquot ودافئ BLEAM و HEPES-FBS و Trypsin-EDTA إلى 37 درجة مئوية (30 دقيقة على الأقل) قبل الاستخدام.
  2. قوارير ثقافة الطلاء وإدخالات زراعة خلايا ALI بوسط مكيف 804G
    1. قم بإعداد خلية 804G (خط الخلية الظهارية لمثانة الفئران) وسائط مكيفة بالمصفوفة كما هو موضحسابقا 39.
    2. قم بتغطية قارورة زراعة الخلية وإدخالات زراعة الخلايا بوسائط مكيفة ب 804G لمدة 4 ساعات على الأقل في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. راجع الجدول 2 لمعرفة كميات الوسائط اللازمة لتغطية قوارير الاستزراع المختلفة وإدخالات زراعة الخلايا.

2. عزل وتوسيع nTAECs والاستعداد لثقافة ALI اللاحقة

  1. الحصول على شفط القصبة الهوائية الطازج (حوالي 1 مل) أثناء الشفط الروتيني للأنبوب الرغامي لحديثي الولادة المنببين وتجميع الشفط في مصيدة مخاطية. إذا كان حجم الشفط غير كاف للوصول إلى مصيدة المخاط ، اشطف قسطرة الشفط ب 1-3 مل من المحلول الملحي المعقم.
  2. قم بتسمية العينة وتخزينها في كيس بيولوجي على الجليد.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات على الجليد عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة. ومع ذلك ، فإن العائد أعلى مع العينات الجديدة.
  3. نقل العينة من وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة إلى المختبر. قم بتغطية قارورة T25 بوسائط مكيفة بتقنية 804G واستعد لتلقيح العينة في وقت نقل شفط القصبة الهوائية إلى المختبر.
  4. قم بإزالة مصيدة المخاط من كيس الخطر البيولوجي وتنظيف الأسطح الخارجية جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول لتجنب أي تلوث. افتح بعناية الغطاء الموجود على مصيدة المخاط تحت غطاء مزرعة الخلايا المعقم.
  5. قم بتخفيف عينة القصبة الهوائية باستخدام PBS معقم إلى 5 مل (لتخفيف المخاط) ونقل المحتوى بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  6. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 250 × جم ، 20 درجة مئوية -23 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية (بما في ذلك المخاط).
    ملاحظة: تتم جميع عمليات الطرد المركزي هنا عند 250 × جم ، 20 درجة مئوية -23 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ما لم ينص على خلاف ذلك.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من BLEAM-I.
  8. قم بإزالة قارورة T25 من الحاضنة وتخلص من الوسائط المكيفة 804G قبل طلاء العينة.
  9. ضع العينة في قارورة T25 وضعها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (سيطلق على هذا الممر 0 أو P0).
  10. قم بتغيير الوسائط باستخدام BLEAM-I بعد 24 ساعة من الطلاء لغسل الخلايا غير المتصلة وبعد ذلك كل 48 ساعة.
    ملاحظة: بعد معالجة عينة نفطة القصبة الهوائية واحتضانها في وسائط BLEAM-I ، تظهر خلايا متوازية المستطيلات بعد 7-10 أيام من الطلاء. بحلول حوالي 3 أسابيع بعد الطلاء ، تكون الخلايا معبأة بكثافة وتتطلب التربسين للمرور والتوسع والتخزين اللاحق. يتم وضع خلايا المرور المبكر (P1 - P2) في أنابيب التبريد (2.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من وسائط التجميد لكل أنبوب تبريد) وتخزينها في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
  11. قم بإذابة الخلايا المجمدة بسرعة من النيتروجين السائل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ونقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم بحجم مناسب يحتوي على BLEAM-I.
  12. عد الخلايا لتحديد العدد الإجمالي والحي للخلية باستخدام بقعة زرقاء مغرقة وعداد خلوي آلي أو يدوي كما هو موضح سابقا48. قم بتخفيف معلق الخلية بحجم مناسب من BLEAM-I ، بحيث يكون التركيز النهائي 2.1 × 106 خلايا في 15 مل من تعليق الخلية (لقارورة T75).
    ملاحظة: بالنسبة لقارورة T25 ، يتم استخدام 0.7 × 106 خلايا في 5 مل من تعليق الخلية بشكل عام للبذر.
  13. انقل معلق الخلية سعة 15 مل إلى قارورة T75 واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  14. في صباح اليوم التالي ، تبادل وسائل الإعلام مع BLEAM-I الجديد. بعد ذلك ، تبادل الوسائط مع BLEAM-I جديد كل يومين. بمجرد أن تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ -90٪ ، تصبح جاهزة للتربسين لزراعة ALI.
  15. ضع 5 مل من التربسين EDTA (T75) على طبقة أحادية الخلية.
    ملاحظة: تذكر استخدام التربسين الطازج. تجنب استخدام التربسين الذي تم تسخينه عدة مرات.
  16. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في الحاضنة. ثم اضغط على جانب القارورة 8x-10x لإخراج الخلايا. تحقق تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد تم إزاحتها بعد التربسين. إذا بقيت >50٪ من الخلايا على القارورة ، اغسلها باستخدام PBS 2x وكرر خطوة التربسين مع تقليل وقت الحضانة من 2-3 دقائق.
  17. أوقف التفاعل باستخدام 15 مل من HEPES-FBS والماصة لأعلى ولأسفل 4x-5x. انقل الخلايا إلى أنبوب معقم بحجم مناسب وجهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق لتكسير الخلايا.
  18. بعد الطرد المركزي ، استنشق بعناية المادة الطافية. قم بإذابة حبيبات الخلية في 1 مل من BLEAM-I عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل 5x-10x.
  19. عد الخلايا لتحديد إجمالي عدد الخلايا الحية. قم بتخفيف معلق الخلية بحجم مناسب من BLEAM-I ، بحيث يكون التركيز النهائي 1 × 105 خلايا حية لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية.

3. ثقافة ALI ل nTAECs

ملاحظة: يجب طلاء إدخالات زراعة الخلايا بوسائط مكيفة ب 804G واحتضانها لمدة 4 ساعات على الأقل عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 قبل الخطوة التالية (انظر الخطوة 1.2).

  1. قم بإزالة لوحة (صفائح) زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا التي تحتوي على إدخالات زراعة الخلايا من الحاضنة وتخلص من الوسائط المكيفة ب 804G.
  2. أضف 1 مل من BLEAM-I إلى الغرفة القاعدية الجانبية (السفلية) لكل بئر ALI. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (1 × 105 خلايا) إلى الغرفة القمية لإدخالات ثقافة خلايا ALI واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. تعرف هذه المرحلة بأنها يوم ALI -2.
  3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسائط في الغرف القاعدية الجانبية (1 مل) والقمي (100 ميكرولتر) باستخدام BLEAM-I الطازج. عند تغيير الوسائط في الغرفة القمية ، احرص على عدم إزعاج الطبقة الأحادية للخلية. تعرف هذه المرحلة بأنها يوم ALI -1.
  4. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط من كل من الغرف القاعدية والقمي.
    ملاحظة: يستغرق الأمر يومين حتى تصبح الخلايا الموجودة على غشاء زراعة الخلية ملتقية في ظل الظروف المغمورة. في هذه المرحلة ، يمكن إنشاء ALI.
  5. أضف 1 مل من وسائط HBTEC-I إلى الغرفة القاعدية الجانبية ولكن اترك وسائط الغرفة القمية خالية ومعرضة للهواء. تعرف هذه المرحلة بأنها يوم ALI 0.
  6. استمر في تبادل وسائط HBTEC-I (1 مل) في الغرفة القاعدية كل 48 ساعة من اليوم 0 إلى 6 ALI. قم بالتبديل إلى وسائط HBTEC العادية (بدون مثبطات) في اليوم 7 من ALI حتى النقطة الزمنية المطلوبة للحصاد.
    ملاحظة: خلال الأيام السبعة الأولى من ثقافة ALI ، قد تتسرب الوسائط من الغرفة القاعدية إلى الغرفة القمية. يجب استنشاق هذه الوسائط بعناية كل يوم للحفاظ على صحة طبقة الخلية والسماح لها بالتمايز.
  7. حصاد الخلايا وإدخالات زراعة الخلايا والوسائط القاعدية في نقاط زمنية مختلفة للتقنيات الجزيئية والمقايسات والتحليل.
    1. بالنسبة لهذا البروتوكول ، في أيام ALI 0 و 7 و 28 ، حصاد الخلايا لتحليل التعبير الجيني qPCR (بروتوكول الشركة المصنعة القياسي) لعلامات التمايز الظهارية. في أيام ALI 0 و 7 و 14 و 28 ، يتم حصاد إدخالات زراعة الخلايا لاختبار وظيفة الحاجز (الطرق الموضحة أدناه).
    2. في اليومين 0 و 28 من ALI ، استخدم إدخالات مزرعة الخلايا الثابتة بالفورمالين لتلوين الفلورسنت المناعي باستخدام علامات التمايز الظهارية (باستخدام البروتوكول المنشور سابقا)49. في اليوم 14 من ALI ، حصاد الوسائط القاعدية الجانبية لإطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) (بروتوكول الشركة المصنعة القياسي) ، ومحللات الخلايا ل qPCR لعلامات الإجهاد التأكسدي ، واللطخة المناعية مع الأجسام المضادة الكاسباز 3 والأجسام المضادة الكاسباز 3 المشقوقة (بروتوكول الشركة المصنعة القياسي) ، وإدراج ثقافة الخلايا لمقايسة الإجهاد التأكسدي (الطريقة الموضحة أدناه).

4. اختبار وظيفة الحاجز أثناء تمايز ALI

  1. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية (TEER)
    ملاحظة: قم بقياس TEER باستخدام مقياس الفولت الظهاري / أوم (EVOM) أثناء تمايز ALI لتقييم سلامة طبقة الخلية50.
    1. قبل قياس قيم مقاومة مرشح الاختبار ، استخدم ثقافة خلية مطلية بالوسائط مكيفة ب 804G (خالية من أي خلايا) لقياس قيمة مقاومة الخلفية بالأوم (Ω)
    2. اطرح قيمة مقاومة الخلفية من قيم مقاومة مرشح الاختبار واضرب الفرق في مساحة سطح نمو الخلية للحصول على قيمة TEER لكل مرشح اختبار.
      TEER = (ΩT - ΩB) × C
      TEER = المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (Ω.cm2)
      ΩT = اختبار قيمة مقاومة المرشح (Ω)
      ΩB = قيمة مقاومة الخلفية (Ω)
      C = مساحة سطح نمو الخلية (سم2)
      ملاحظة: يتم تثبيت إدخالات زراعة الخلايا المستخدمة في قياسات TEER لاحقا بالفورمالين المخزن بنسبة 10٪ وتستخدم على الفور في تلطيخ الفلورسنت المناعي والفحص المجهري الفلوري (الطريقة الموضحة أدناه) أو تخزينها عند 4 درجات مئوية للتلطيخ لاحقا.
  2. مقايسة النفاذية الظهارية للفلوريسين إيزيثيونات ديكستران (FITC-dextran)
    ملاحظة: تم إجراء مقايسة نفاذية الظهارة باستخدام وزنين جزيئيين مختلفين من FITC-dexterrn (10 كيلو دالتون و 20 كيلو دال) أثناء تمايز ALI.
    1. تحضير محلول عمل FITC-dextran (1 مجم / مل): قم بقياس 5 مجم من FITC واخلطه في 1 مل من DMSO (5 مجم / مل). أعد تعليق مخزون 5 مجم / مل في وسائط HBTEC الدافئة إلى 37 درجة مئوية إلى تركيز 1 مجم / مل. حماية المحلول من الضوء.
    2. نقل مرشحات الاختبار (المحتوية على الخلايا) إلى صفيحة جديدة مكونة من 12 بئرا وإضافة 1 مل من وسائط HBTEC في الحجرة القاعدية الجانبية.
    3. قم بشفط وسائط الحجرة القمية (إن وجدت) واستبدلها ب 250 ميكرولتر من محلول عمل FITC-dextran. احتضن في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء لمدة 60 دقيقة.
    4. قم بإنهاء اختبار FITC-dextern عن طريق إزالة مرشحات الاختبار (التي تحتوي على محلول عمل FITC-dextran) من اللوحة المكونة من 12 بئرا.
    5. اجمع الوسائط القاعدية الجانبية من الصفيحة المكونة من 12 بئرا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل والدوامة.
    6. انقل 100 ميكرولتر من كل أنبوب إلى صفيحة دقيقة من البوليسترين الأسود ذات القاع الشفاف 96 جيدا في ثلاث نسخ. نقل 100 ميكرولتر من وسائط HBTEC إلى آبار إضافية في الصفيحة المكونة من 96 بئرا كعنصر تحكم سلبي لقياس مضان الخلفية.
    7. قم بقياس شدة التألق باستخدام مقياس الطيف الضوئي باستخدام إثارة 490 نانومتر والحد الأقصى للانبعاث 520 نانومتر.
    8. اطرح متوسط قيمة مضان الخلفية من قيم مضان مرشح الاختبار للحصول على مضان مصحح والتعبير عن القيم كنسبة مئوية مقابل قيم التألق المصححة في اليوم 0 ل FITC 10 كيلو دالتون و 20 كيلو دالتون.

5. التعرض لفرط التأكسج باستخدام حاضنة TriGas

  1. في اليوم السابع من ALI ، حدد عدد إدخالات زراعة الخلايا التي سيتم وضعها في فرط التأكسج بناء على الاحتياجات التجريبية واحتياجات الحصاد.
  2. اضبط مستوى O2 في حاضنة TriGas على 60٪ O2. يستغرق الأمر بشكل عام ~ 30-45 دقيقة حتى يصل مستوى O2 إلى 60٪.
  3. بمجرد أن يستقر مستوى O2 عند 60٪ ، ضع لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا مع إدخالات زراعة الخلايا المخصصة لمجموعة فرط التأكسج داخل الحاضنة وأغلق باب الحاضنة.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بأكبر قدر ممكن من الكفاءة لمنع حدوث انخفاض كبير في مستوى O2 داخل الحاضنة.
  4. قم بتغيير الوسائط في إدخالات ثقافة الخلايا المعرضة لفرط التأكسج باتباع نفس الجدول الزمني مثل آبار التحكم (21٪ O2 مكشوفة). افحص إدخالات مزرعة الخلايا كل يوم بحثا عن تسرب الوسائط واستنشق أي تسرب برفق إلى غرفة زراعة الخلايا.
  5. استمر في التعرض لفرط التأكسج لمدة 7 أيام (أيام ALI من 7 إلى 14). بمجرد اكتمال التعرض لفرط التأكسج ، قم بحصاد الخلايا أو إجراء فحوصات باستخدام إدخالات زراعة الخلايا في اليوم 14 من ALI.

6. مقايسة الإجهاد التأكسدي لتقييم آثار فرط التأكسج

ملاحظة: استخدمنا مجموعة فحص CM-H2DCFDA وقمنا بقياس شدة التألق في اليوم 14 من ALI كعلامة على الإجهاد التأكسدي في إدخالات ثقافة الخلايا بعد التعرض ل O2 . H2DCFDA هو شكل مختزل كيميائيا وأسيتيل من 2 ′ ، 7 ′ ثنائي كلورو فلورسين (DCF) وهو مؤشر دائم للخلية الحية لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). CM-H2DCFDA هو مشتق الكلورو ميثيل تفاعل الثيول ل H2DCFDA ، والذي يعزز المزيد من الارتباط التساهمي بالمكونات داخل الخلايا ، مما يسمح بالاحتفاظ بالصبغة داخل الخلية لفترة أطول. هذه الجزيئات غير فلورية حتى تتم إزالة مجموعات الأسيتات بعمل الاستيرازات داخل الخلايا ، وتحدث الأكسدة في الخلية51. بعد الأكسدة داخل الخلايا ، يمكن قياس الزيادة الناتجة في التألق باستخدام مجهر الفلورسنت كمقياس بديل للإجهاد التأكسدي الخلوي52. الكاشف خفيف وحساس للهواء وبالتالي يحتاج إلى الحماية من الضوء وإبقائه محكم الإغلاق قدر الإمكان.

  1. تحضير محلول الفحص CM-H2DCFDA: تحتوي كل قارورة على 50 ميكروغرام من صبغة الكاشف في شكل مسحوق. لعمل محلول مخزون 1 ملي مولار ، أضف 80 ميكرولتر من DMSO المعقم إلى القارورة ، واخلطها جيدا باستخدام ماصة ، ودوامة برفق. للحصول على تركيز نهائي 1 ميكرومتر من الصبغة في إدخالات زراعة الخلايا ، أضف 0.1 ميكرولتر من مخزون 1 ملي مولار لكل 100 ميكرولتر من PBS (على سبيل المثال ، أضف محلول مخزون 0.6 ميكرولتر إلى 600 ميكرولتر PBS ل 6 إدخالات لزراعة الخلايا).
    ملاحظة: يمكن أن يتراوح التركيز النهائي للصبغة بين 1-5 ميكرومتر. يجب تحسين الجرعة لكل حالة مزرعة.
  2. أضف 100 ميكرولتر من محلول الصبغة 1 ميكرومتر في كل مزرعة خلوية لكل من المجموعة المعرضة لفرط التأكسج أو المجموعة المعرضة للنورموكسيا. استخدم ما لا يقل عن 1 مزرعة خلية كعنصر تحكم سلبي من كل مجموعة معالجة (100 ميكرولتر من PBS بدون صبغة). احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، محمية من الضوء. اغسل 1x مع PBS.
  3. تحضير الشريحة: استنزاف أي PBS زائد. أمسك إدخالات ثقافة الخلايا بعناية واستخدم شفرة لقطع غشاء زراعة الخلايا ببطء. صب 1-2 قطرات من السائل الصاعد على الشريحة. باستخدام ملقط مسطح الرأس ، أمسك زاوية الغشاء بعناية ، وضعه على جانب الخلية لأسفل على الحامل ، وقم بتغطيته بقلة غطاء. قم بإزالة السائل الزائد واتركه ليجف في الهواء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. الشرائح جاهزة الآن للتصوير.
    ملاحظة: يجب إجراء تحضير الفحص المجهري للشريحة والفلورسنت في أسرع وقت ممكن حيث تتلاشى شدة الفلورسنت بشكل ملحوظ خلال 2-3 ساعات.
  4. المجهر الفلوري: التقط الصور باستخدام مجهر الفلورسنت باستخدام قناة Cy2 (السيانين-2). التقط صورا من ثلاث مناطق منفصلة وغير متداخلة لكل مزرعة خلية.
  5. الكشف عن الفلورسنت للإجهاد التأكسدي
    ملاحظة: استخدم الصور من الفحص المجهري الفلوري لقياس التألق الكلي للخلية المصححة (CTCF) باستخدام برنامج ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) وسير العمل الموضح أدناه. يعمل CTCF كعلامة للإجهاد التأكسدي في إدخالات ثقافة الخلية بعد التعرض لفرط التأكسج ويتم قياسه عن طريق القضاء على مضان الخلفية بمساعدة برنامج ImageJ.
    1. افتح صورة الفحص المجهري في ImageJ وحدد منطقة الاهتمام باستخدام أداة المستطيل. احفظ منطقة التحديد (α) بالنقر بزر الماوس الأيمن وحدد إضافة إلى مدير ROI (منطقة الاهتمام). استخدم منطقة التحديد هذه عبر الصور.
    2. حدد معلمات القياس ضمن تحليل > تعيين القياسات وحدد المنطقة والكثافة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية ضمن علامة تبويب الإعدادات.
    3. لكل صورة، استخدم نفس منطقة التحديد من مدير عائد الاستثمار وحدد تحليل > القياس. تمثل قيمة الكثافة المتكاملة التألق الكلي (Ft) للمنطقة المحددة. قم بتدوين قيم القياس من النافذة المنبثقة.
    4. لتصحيح مضان الخلفية (Fb) في كل صورة، حدد مساحة صغيرة من المنطقة غير الفلورية باستخدام أداة المستطيل. حدد تحليل > قياس لهذه المنطقة. تمثل قيمة الشدة المتوسطة Fb. قم بتدوين قيم القياس من النافذة المنبثقة.
    5. احسب CTCF بضرب متوسط شدة التألق لقراءات الخلفية في المساحة الإجمالية لعائد الاستثمار وطرح هذا الرقم من قيمة الكثافة المتكاملة لعائد الاستثمار. كرر سير العمل هذا لجميع الصور لكلتا المجموعتين العلاجيتين (Control و Hyperoxia).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = التألق الكلي المصحح للخلية (A.U.)
      Ft = التألق الكلي
      Fb = مضان الخلفية
      α = منطقة الاختيار

النتائج

لعزل nTAECs ، قمنا بجمع نفطات القصبة الهوائية من حديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة ونقلنا الشفاطات على الجليد إلى المختبر لمزيد من المعالجة (الشكل 1 أ). بعد زرع عينات نفطة القصبة الهوائية في وسط نمو ظهارة مجرى الهواء (BLEAM-I التي تحتوي على مثبطات Rho / Smad و GSK3 و mTOR) ، ظهرت الخلايا المستطيلة في غضون 7-10 أيام. بحلول 14 يوما ، كانت الخلايا ملتقية بنسبة 50٪ -60٪ ، وبعد حوالي 21 يوما من الطلاء ، كانت الخلايا معبأة بكثافة وتطلبت التربسين للمرور والتوسع اللاحق. تم حفظ الممرات التسلسلية لهذه الخلايا (حتى P3) بالتبريد في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. ثم تم إذابة الخلايا (≤ المقطع 3) لثقافة ALI.

تم استزراع nTAECs في ALI بمجرد وصولها إلى حوالي 80٪ -90٪ من التقاء في صفيحة T75 في ظروف مغمورة. أجرينا تلطيخ التألق المناعي للطبقة الأحادية nTAEC في اليوم 0 من ALI باستخدام العلامات الخاصة بالخلايا القاعدية - السيتوكيراتين -5 (KRT5) 53 وبروتين الورم p63 (TP63) 54 (الشكل 1 ب). في اليوم 0 من ALI ، تكون جميع الخلايا تقريبا إيجابية KRT5 و TP63 ، مما يشير إلى النمط الظاهري للخلايا القاعدية في مجرى الهواء مع الحد الأدنى من التمايز. بعد إنشاء ALI ، تم قياس TEER باستخدام EVOM (الشكل 1C) وزاد بسرعة في المرحلة المبكرة من ثقافة ALI (ALI اليوم من 0 إلى 7) حيث بدأت nTAECs في تكوين طبقة أحادية خلية مستقطبة ناضجة ، مع استقرار لاحق ل TEER بين اليوم 7 و 28 ALI (الشكل 1 د). علاوة على ذلك ، تم استخدام FITC-dextrans لوزنين جزيئيين (10 كيلو دالتون و 20 كيلو دالتون) لتقييم النفاذية شبه الخلوية أثناء تمايز ALI وأظهر انخفاضا تدريجيا عاما في التألق بمرور الوقت (الشكل 1 ه). يرتبط هذا بتكوين طبقة أحادية الخلية الناضجة أثناء تمايز ALI مع انخفاض نفاذية المواد المذابة. 

أثناء زراعة ALI ، تتمايز الخلايا القاعدية إلى سلالات ظهارية ناضجة ، والتي تشمل الخلايا المهدبة ، وخلايا النادي غير المفرزة للمخاط ، وخلايا الكأس التي تفرز المخاط39. أظهر تحليل التعبير الجيني للعلامات الخاصة بالخلايا الظهارية الناضجة في اليوم 0 من ALI الحد الأدنى من التعبير عن بروتين صندوق الشوكة J155 (FOXJ1 ، علامة الخلية المهدبة) ، والرحم56 (SCGB1A1 ، علامة خلية النادي) و mucin-5AC57 (MUC5AC ، علامة خلية الكأس. الشكل 2 أ) ، مع الزيادة اللاحقة (اليوم 7 و 28 من ALI) مما يشير إلى التمايز في هذه الأنواع الفرعية الظهارية الناضجة لمجرى الهواء أثناء ثقافة ALI. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تلطيخا مناعيا فلوريا في اليوم 28 من ALI باستخدام علامات خاصة بالخلايا الظهارية الناضجة والتمايز الظهاري الكمي الذي يتكون من الخلايا المهدبة الإيجابيةالأسيتيلية 58 (TUBA4A) (~ 22٪) ، SCGB1A1 خلايا النادي الإيجابية (~ 13٪) وخلايا الكأس الإيجابية MUC5AC (~ 3٪) والباقي عبارة عن خلايا قاعدية موجبة KRT5 (~ 51٪) وأنواع الخلايا النادرة الأخرى (الشكل 2 ب).

تم استخدام مثبطات Rho و Smad خلال أول 7 أيام من ثقافة ALI (أيام ALI من 0 إلى 7) ثم تمت إزالتها من وسائط التمايز لبقية مدة ثقافة ALI (الشكل 3 أ). يتعرض السطح القمي للخلية أحادية الطبقة أثناء زراعة ALI للهواء ، مما يتيح دراسات الاضطراب الجوي. تم إجراء التعرض لفرط التأكسج للخلية أحادية الطبقة بنسبة 60٪ O2 بشكل مستمر لمدة 7 أيام من اليوم 7 إلى 14 باستخدام حاضنة TriGas. تم الاحتفاظ بالمجموعة الضابطة في حاضنة منفصلة مع تعرض هواء الغرفة (21٪ O2). بالنظر إلى النية المستقبلية لدراسة العواقب طويلة الأمد (1-2 أسابيع بعد الانتهاء من التعرض O2 ) للتعرض ل O2 على التطور الظهاري لمجرى الهواء وتجديده ، كان من الضروري ألا يؤدي التعرض ل O2 بشكل حاد إلى سمية خلوية شديدة أو تلف الغشاء إلى الحد الذي يعطل بشكل كبير الطبقة الأحادية لخلية ALI. لتقييم تلف غشاء الخلية ، قمنا بقياس إطلاق LDH في الوسط القاعدي الجانبي في اليوم 14 من ALI ، والذي لم يظهر فرقا كبيرا بين فرط التأكسج والثقافات المعالجة بالهواء في الغرفة (الشكل 3 ب). لمزيد من التقييم مما إذا كانت التأثيرات السامة للخلايا من O2 كانت كبيرة بما يكفي للحث على موت الخلايا المبرمج في nTAECs ، أجرينا اللطخة المناعية لإجمالي الكاسباز -3 والكاسباز المشقوق-3 59 على محللات الخلايا التي تم حصادها من فرط التأكسج والمجموعات المعرضة لهواء الغرفة في اليوم 14 من ALI (الشكل 3 ج). كان التعبير الكلي للكاسباز -3 قابلا للمقارنة بين المجموعتين ، ولم يتم اكتشاف تعبير كاسباز -3 المشقوق ، مما يشير إلى أن 7 أيام من التعرض بنسبة 60٪ O2 لم تحفز موت الخلايا المبرمج في nTAECs في اليوم 14 من ALI. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم تحكم إيجابي مع حضانة بين عشية وضحاها ل nTAECs في ظل ظروف مغمورة مع زيادة تركيزات الستايوروسبورين (0.5 ميكرومتر ، 1 ميكرومتر ، و 2 ميكرومتر) ، وهو عامل سام للخلايا ، ومحفز موت الخلايا المبرمج. أكد النشاف المناعي لتعبير الكاسباز -3 الكلي وتعبير الكاسباز -3 المشقوق التحريض الناجح لموت الخلايا المبرمج. لقياس الإجهاد التأكسدي الناجم عن التعرض بنسبة 60٪ O2 ، تم إجراء اختبار الإجهاد التأكسدي الخلوي مع قياس شدة الفلورسنت على الطبقات الأحادية لخلية nTAEC على ALI 14 (الشكل 3 د). تسبب التعرض لفرط التأكسج في زيادة كبيرة في شدة الفلورسنت (محسوبة بواسطة التألق الكلي المصحح للخلية أو CTCF) مقارنة بالخلايا المعرضة لهواء الغرفة ، مما يشير إلى زيادة الإجهاد التأكسدي الخلوي. أظهر تحليل التعبير الجيني للجينات المضادة للأكسدة أن 60٪ O2 تسبب في تنظيم هذه الجينات المضادة للأكسدة في اليوم 14 من ALI ، مع زيادة تنظيم الكاتلاز و SOD1 و SOD2 و GPX3 بشكل كبير (الشكل 3E).

figure-results-1
الشكل 1: تم عزل الخلايا الظهارية للمجرى الرغامي لحديثي الولادة (nTAECs) بنجاح من شفاطات القصبة الهوائية لحديثي الولادة وزرعتها في واجهة الهواء والسائل (ALI). (أ) تم عزل nTAECs باستخدام الشفط الرغامي من حديثي الولادة في حالة مغمورة مع مزرعة ALI اللاحقة. (ب) تم حصاد الخلايا في اليوم 0 من ALI لتلوين الفلورسنت المناعي باستخدام علامات الخلايا القاعدية لمجرى الهواء - KRT5 (أحمر) و TP63 (أحمر). النوى ملطخة باللون الأزرق ب DAPI. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) في إدخالات زراعة الخلايا باستخدام مقياس الظهارة فولت / أوم (EVOM). (د) تم قياس TEER أثناء تمايز ALI. تم تقديم البيانات كمتوسط (ن = 2 متبرعين ، 5-10 آبار لكل متبرع لكل نقطة زمنية). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. (E) تم إجراء مقايسة النفاذية عبر الظهارة من الفلورسين إيزوثيوسيانات-ديكستران (FITC-dextran) أثناء تمايز ALI باستخدام وزنين جزيئيين مختلفين من FITC-dextran (10 كيلو دالتون و 20 كيلو دالتون). تمت إضافة محلول FITC-dextran (10 كيلو دالتون أو 20 كيلو دالتون) إلى الغرفة القمية ، وتم تحضين إدخالات ثقافة الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. تم قياس التألق في وسط الغرفة القاعدية الطيفية الضوئية في ألواح ذات 96 بئرا. تم طرح مضان الخلفية (وسائط HBTEC) من قياسات الاختبار للحصول على قيمة مضان مصححة (معبرا عنها كنسبة مئوية مقارنة بقيم اليوم 0). المعطيات المعروضة كمتوسط (ن = 2 متبرعين ، ثلاثة آبار لكل متبرع لكل نقطة زمنية لكل وزن جزيئي ل FITC-dextran). تشير أشرطة الأخطاء إلى التسويق عبر محرك البحث. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخضع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي لحديثي الولادة (nTAECs) للتمايز المخاطي الهدبي أثناء ثقافة واجهة الهواء والسائل (ALI). (أ) تم حصاد الخلايا في أيام ALI 0 و 7 و 28 لتحليل qPCR للعلامات الخاصة بالخلايا الظهارية: السيتوكيراتين -5 (KRT5) للبروتين القاعدي وصندوق الشوكة J1 (FOXJ1) للمهدب ، والرحم الغلوبين (SCGB1A1) للنادي والميوسين-5AC (MUC5AC) لخلايا الكأس. تم تحديد التعبير النسبي لكل جين باستخدام طريقة δCt مع GAPDH كعنصر تحكم داخلي. البيانات المعروضة كمتوسط (من n = 3 متبرعين ، ثلاثة آبار لكل متبرع لكل نقطة زمنية). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع تحليل Tukey اللاحق ، * p = 0.0114 ، ***p = 0.0005 ، ***p<0.0001. (ب) تم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي للخلايا القاعدية (KRT5 ، أحمر) ، الهدبية (أسيتيلات التوبولين أو TUBA4A ، الأخضر) ، والنادي (SCGB1A1 ، أحمر) ، والكأس (MUC5AC ، الأخضر) في اليوم 28 من ALI لتحديد التمايز الظهاري. النوى ملطخة باللون الأزرق ب DAPI. بيانات النسبة المئوية (٪) للخلايا الإيجابية المعروضة كمتوسط (ن = 2 متبرعين ، إدخالان لزراعة الخلايا لكل متبرع ، 6-8 صور غير متداخلة لكل شريحة ، ما لا يقل عن 3000 خلية يتم عدها لكل شريحة). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. شريط المقياس = 50 ميكرومتر.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: يؤدي فرط التأكسج إلى إجهاد التأكسد الخلوي في الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الرغامي لحديثي الولادة (nTAECs) ولكنه لا يسبب تلفا كبيرا في غشاء الخلية أو موت الخلايا المبرمج. (أ) الجدول الزمني التجريبي للتعرض لفرط التأكسج من nTAECs باستخدام حاضنة Trigas. بدأ التعرض للأكسجين بعد إزالة المثبطات من وسائط التمايز في اليوم السابع من ALI واستمر لمدة 7 أيام (اليوم ALI من 7 إلى 14). (ب) تم حصاد الوسائط القاعدية الجانبية لمقايسة إطلاق LDH لتقييم تلف غشاء الخلية بين هواء الغرفة (التحكم) و 60٪ O2 (فرط التأكسج) المجموعة المعرضة في اليوم 14 من ALI. البيانات المقدمة كنقاط بيانات فردية (الامتصاص المصحح) مع خطوط تشير إلى المتوسط الكلي لكل مجموعة ، n = 3 متبرعين يشار إليهم بالدوائر السوداء والمربعات والمثلثات مع أربعة آبار لكل متبرع ، على التوالي. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير متزاوج ، p = 0.6184. (ج) تم حصاد الخلايا في اليوم 14 من ALI ، وتم إجراء النشاف المناعي لعلامات موت الخلايا المبرمج (caspase-3 و cspase-3) لمقارنة الاستجابات بين هواء الغرفة و nTAECs المعرضة ل O2. تم تصميم التحكم الإيجابي في الفحص عن طريق احتضان nTAECs بين عشية وضحاها باستخدام staurosporine (Stau 0.5 μM و 1 μM و 2 μM) أو التحكم في السيارة (Veh Ctrl) في حالة استزراع مغمورة. تم حصاد الخلايا بحثا عن لطخة مناعية مع إجمالي كاسباز -3 والجسم المضاد الكاسباز 3 المشقوق تم إجراء قياس الكثافة باستخدام α-tubulin كجين للتدبير المنزلي. المعطيات المعروضة كمتوسط (من n = 2-3 متبرعين ، بئر واحد إلى بئرين لكل متبرع). تشير أشرطة الخطأ إلى التسويق عبر محرك البحث (SEM). تم استخدام اختبار t غير متزاوج لمقارنة التعبير الكلي للكاسباز 3 بين هواء الغرفة ومجموعة 60٪ O2 ، p = 0.4. تم استخدام ANOVA أحادي الاتجاه لمقارنة إجمالي تعبير caspase-3 وتعبير caspase-3 المشقوق بين المجموعات المعرضة ل Veh Ctrl و Stau ، * p<0.05 ، *** p<0.0005. (د) تم إجراء اختبار CM-H2DCFDA للإجهاد التأكسدي الخلوي في اليوم 14 من ALI مع إدخالات ثقافة الخلايا التي تم حصادها من هواء الغرفة و O 2-المكشوفة nTAECs. يتم عرض صور المجهر الفلوري التمثيلي لهواء الغرفة (التحكم) و 60٪ O2 (فرط التأكسج) إدخالات ثقافة الخلايا المكشوفة. تم حساب التألق الكلي للخلايا المصحح (CTCF) لمقارنة الإجهاد التأكسدي الخلوي بين هواء الغرفة و 60٪ O 2-المعرضة ل nTAECs. تم تقديم بيانات CTCF كنقاط بيانات فردية مع خط يشير إلى المتوسط الكلي لكل مجموعة ، 6-7 صور / مجموعة من متبرعين فرديين (دوائر ومربعات سوداء) مع بئرين لكل متبرع. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير المزاوج ، * p<0.05. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (E) تم حصاد الخلايا في اليوم 14 من هواء الغرفة ، وتم إجراء الآبار المعرضة لفرط التأكسج لتحليل qPCR لجينات الإجهاد التأكسدي ، بما في ذلك الكاتلاز ، وديسموتاز الأكسيد الفائق 1 و 2 (SOD1 و SOD2) ، والجلوتاثيون بيروكسيداز 1 و 2 و 3 (GPX1 و GPX2 و GPX3). تم تحديد بيانات تغيير الطية لكل جين باستخدام طريقة δCt مع 18s rRNA كتحكم داخلي. قدمت البيانات كمتوسط (من n = 3 متبرعين ، بئران لكل متبرع). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار t غير متزاوج ، * ص <0.05 ، ** ص = 0.006.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون الوسائطمبلغالتركيز النهائي
بليام آي
بليام ميديا500 مل
مكمل HLL1.25 مل500 ميكروغرام / مل من الألبومين البشري في الدم
0.6 ميكرومتر حمض اللينوليك. 0.6 ميكروغرام / مل الليسيثين
ل-جلوتامين15 مل6 مللي متر
استخراج P2 مل0.4٪ مستخلص الغدة النخامية البقرية
TM15 مل1 ميكرومتر أدرينالين. 5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين
10 نانومتر ثلاثي يودوثيرونين. 0.1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون
5ng / مل عامل نمو البشرة (EGF)
5 نانوغرام / مل أنسولين
نورموسين1 مل0.1 مجم / مل
Y-27632قد تختلف بناء على رقم اللوت5 ميكرومتر
أ 83-01قد تختلف بناء على رقم اللوت1 ميكرومتر
CHIR 99021قد تختلف بناء على رقم اللوت0.4 ميكرومتر
رابامايسينقد تختلف بناء على رقم اللوت5 نانومتر
HBTEC
وسائط HBTEC500 مل
نورموسين1 مل0.1 مجم / مل
HBTEC-I
وسائط HBTEC500 مل
نورموسين1 مل0.1 مجم / مل
Y-27632قد تختلف بناء على رقم اللوت5 ميكرومتر
أ 83-01قد تختلف بناء على رقم اللوت0.5 ميكرومتر

الجدول 1: مكونات الوسائط لوسط مجرى الهواء الظهاري القصبي مع مثبطات (BLEAM-I) ، ووسائط ALI للخلايا الظهارية للقصبات الهوائية / القصبة الهوائية البشرية مع مثبطات (HBTEC-I) ، و HBTEC.

قارورة ثقافة الخلية / إدراج ثقافة الخليةوسائط مكيفة بالخلايا 804G (مل)
قارورة T253 مل
قارورة T755 مل
إدراج ثقافة الخلايا 24 بئرا (حجم المسام 0.4 ميكرومتر ، مساحة سطح 0.33 سم2 )400 ميكرولتر

الجدول 2: أحجام الوسائط المكيفة بالمصفوفة المشتقة من الخلايا 804G المطلوبة لقوارير الثقافة وإدراج زراعة الخلايا.

المناقشة

يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة لجمع ومعالجة عينات النهب الرغامي الوليدية من الولدان في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة مع عزل وتوسيع لاحق ل nTAECs الحية من هذه العينات باستخدام الطرق المعمول بهامسبقا 39. علاوة على ذلك ، قمنا بوصف طريقة لزراعة nTAECs على ALI وتوصيف تمايزها إلى ظهارة مجرى هوائي مخاطي هدبية مستقطبة كدالة للوقت عن طريق قياس TEER ، ومقايسة FITC-dextern ، وتلوين الفلورسنت المناعي ، وتحليل qPCR لنوع الخلية (أي القاعدية ، المهدبة ، والنادي والكأس) علامات محددة. الجانب الجديد لهذا البروتوكول هو اضطراب الأكسدة والاختزال في الغلاف الجوي الذي يتم إجراؤه من خلال التعرض المعتدل لفرط التأكسج (60٪ O2) عند تطوير طبقات أحادية nTAEC. لقد أظهرنا أن التعرض بنسبة 60٪ O2 لمدة 7 أيام يحفز الإجهاد التأكسدي الخلوي في nTAECs. نظهر أيضا أن استراتيجية التعرض O2 لا تسبب بشكل حاد موت الخلايا المبرمج الخلوي أو تلف غشاء الخلية ، مما يسمح بالحفاظ على nTAECs في ثقافة ALI بعد وقت الانتهاء من التعرض ل O2 . وبالتالي ، يمكن استخدام النموذج لدراسة كل من التأثيرات قصيرة وطويلة الأمد للتعرض ل O2 على البرمجة الظهارية لمجرى الهواء عند حديثي الولادة.

تمنح زراعة nTAECs في ALI مزايا معينة مقارنة بالثقافة المغمورة التقليدية لأنها تعزز تكوين طبقة أحادية ظهارية مجرى الهواء المستقطبة مع تكوين تقاطع ضيق وتمايز مخاطيهدبي 60،61. أظهرت الدراسات السابقة مع nTAECs أنه في المرحلة المبكرة من ثقافة ALI (اليوم من 0 إلى 7) ، تخضع الخلايا للتقسيم الطبقي الزائف (تظهر على شكل طبقات متعددة الطبقات بدلا من طبقة خلية واحدة) وتشكل أخيرا ظهارة كاذبة ناضجة بنهاية الأسبوع الثاني42،62. يتبع تكوين الوصلة الضيقة مسارا مشابها في المرحلة المبكرة من استزراع ALI مصحوبا بزيادة سريعة في TEER مع الهضبةاللاحقة 63 ، كما هو موضح في النموذج مع nTAECs. علاوة على ذلك ، تعمل الخلايا الظهارية في مجرى الهواء المزروعة في ALI على تعزيز التعبير والتوطين الجانبي للكلودين -1 (أحد مكونات مركب الوصلات الضيقة) ، مما يزيد من خصائص الختم للتقاطعات الضيقة أثناء ثقافة ALI ، مما يعزز تكوين طبقة أحادية للخليةالناضجة 63. يرتبط هذا بانخفاض نفاذية الخلايا ، والتي تم اختبارها في النموذج باستخدام مقايسة FITC-dextaren وأظهر اتجاها متناقصا بشكل عام في نفاذية أحادية الطبقة. لقد حددنا نمط التمايز المخاطي الهدبي في nTAECs مع التلوين المناعي للعلامات الخاصة بالخلايا المهدبة (TUBA4A) والنادي (SCGB1A1) والكأس (MUC5AC) في اليوم 28 من ALI. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا التعبير الجيني للعلامات الخاصة بالخلايا المهدبة (FOXJ1) والنادي (SCGB1A1) والكأس (MUC5AC) خلال الدورة الزمنية ل ALI. أظهرت مجموعات أخرى أن عامل النسخ FOXJ1 ضروري لتكوين الأهداب الحركية ، بينما يوجد TUBA4A في كل من الأهداب الأولية والمتحركة64،65. في هذا النموذج ، يرتبط نمط التعبير الجيني ل FOXJ1 أثناء تمايز ALI ل nTAECs تقريبا بوقت ظهور الأهداب المتحركة في الثقافة الظهارية لمجرى الهواء من الدراسات السابقة64،66.

قامت دراسة حديثة أجراها Teape et al. بتقييم التأثيرات البروتينية والتمثيل الغذائي للتعرض لفرط التأكسج على ثقافة ALI67. ومع ذلك ، تم اشتقاق الخلايا من متبرعين بالغين. سلطت الدراسات السابقة حول الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) 62،68،69،70 وجائحة COVID-19 الأخير71 الضوء على أهمية الاختلافات المرتبطة بالعمر في الاستجابة الظهارية لمجرى الهواء ووظيفتها. استخدم Zhao et al. تدفقات عمل مماثلة لعزل الخلايا الظهارية لمجرى الهواء حديثي الولادة والبالغين وأظهروا أنه بعد 21 يوما من تمايز ALI ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في التركيب الخلوي بين الخلايا الظهارية للمجرى الهوائي حديثي الولادة والبالغين62. ومع ذلك ، كانت هناك اختلافات واضحة في استجابتها لعدوى RSV ، حيث أظهرت خلايا حديثي الولادة المزيد من الخلايا المصابة ب RSV والتلف الظهاري مقارنة بالبالغين. بشكل عام ، أنتجت ظروف الثقافة التي استخدمها Zhao et al. تمايزا أكثر قوة في nTAECs مقارنة بخلالنا ، مع عدد أكبر من الخلايا المهدبة (41٪ مقابل 22٪) والكأس (10٪ مقابل 3٪). يمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى استخدام وسائط نمو مختلفة. لقد ثبت أن وسط PneumaCult-ALI الذي تستخدمه مجموعتهم (على عكس وسط HBTEC-ALI) يحفز تمايزا أكثر قوة مع أعداد أكبر من الخلايا المهدبة والكأس72. في هذا النموذج ، أظهر التعبير الجيني لعلامات محددة من نوع الخلية للخلايا المهدبة والنادي والكأس زيادة سريعة أولية (ALI اليوم من 0 إلى 7) مع انخفاض لاحق حول اليوم 28 من ALI. قد يكون السبب المحتمل هو استقرار التمايز بعد اليوم 14 من ALI ، والذي تم إثباته في الدراسات السابقة مع nTAECs42.

لقد وصفنا استخدام التعرض لفرط التأكسج المعتدل (60٪ O2) لمدة 7 أيام ، والذي نعتقد أنه يحاكي عن كثب تجارب الحياة الواقعية لحديثي الولادة الخدج في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة مقارنة باستخدام مستويات O2 عالية جدا (> 80٪ O2) 67 حيث يزداد خطر السمية الحادة O2 1 ، 5. في الواقع ، تبين أن التعرض بنسبة 95٪ O2 لأنسجة الرئة حديثي الولادة يحفز موت الخلايا المبرمج الخلوي من خلال تنشيط الكاسباز73. ومع ذلك ، فإن استراتيجية التعرض هذه ذات صلة بنسبة مئوية صغيرة فقط من الأطفال في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة الذين ، نتيجة لإصابة الرئة الحادة الناجمة عن O2 ، يصابون باضطراب الشخصية الحدية الشديد مع أمراض الشعب الهوائية المزمنة (نموذج إصابة الرئة الحادة)37. في العصر الحديث من الاستخدام الحكيم للعلاج O2 ، لا يتعرض معظم الأطفال الخدج لمثل هذا الارتفاعO 2 ؛ ومع ذلك ، لا يزالون معرضين لخطر الإصابة بمرض مجرى الهواء في المستقبل (نموذج اضطراب النمو). في هذه المجموعة الأخيرة ، قد تكون الإصابة الناتجة عن اضطراب الأكسدة والاختزال في وقت مبكر صامتة في البداية ولكنها تظهر لاحقا خلال سن الطفل الصغير أو ما بعده في شكل مرض مجرى الهواء المزمن37. أظهرت بياناتنا باستخدام مقايسة الإجهاد التأكسدي الخلوي أن التعرض المعتدل لفرط التأكسج (60٪ O2) زاد بشكل كبير من الإجهاد التأكسدي داخل الطبقة الأحادية لخلية nTAEC. اقترح تحليل إطلاق LDH وتنشيط الكاسباز 3 الخلوي أن استراتيجية التعرض لفرط التأكسج لدينا لم تتسبب في موت كبير للخلايا. يمكن استخدام الأساليب والنظام النموذجي الذي نصفه للكشف عن الآليات الجزيئية الحساسة ل O2 في وقت مبكر من الحياة كرابط للتطور اللاحق للأمراض الرئوية عند الخدج السابقين.

خلال حياة الجنين ، تغمر الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في سائل الرئة وتوجد في بيئة داخل الرحم ناقصة التأكسجنسبيا 26. تخضع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الوليدي لدوران وتمايز سريع وتشكل حاجزا حرجا بين الرئة والعالم الخارجي. مع انتقال الأطفال حديثي الولادة إلى حياة ما بعد الولادة ، تتعرض الخلايا الظهارية في مجرى الهواء لبيئة ما بعد الولادة فرط التأكسج نسبيا. يصبح هذا الانتقال أكثر فجأة عند الأطفال حديثي الولادة الخدج والمرضى سريريا لأنهم يحتاجون أيضا بشكل روتيني إلى O2 العلاجي كجزء من رعايتهم40،74 ، مما يعرضهم لخطر الإصابة التأكسدية بعد الولادة1. في حين أن تأثيرات فرط التأكسج على السنخية الرئوية بعد الولادة قد تم تمييزها جيدا باستخدام النماذج الحيوانية75 ، فإن آثار التعرض لفرط التأكسج على الخلايا الظهارية لمجرى الهواء النامية غير مدروسة نسبيا38. يضيف استخدام الخلايا الظهارية المشتقة من مجرى الهواء البشري حديثي الولادة مع التعرض لفرط التأكسج ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية أثناء ALI أهمية انتقالية لنموذجنا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام التعرض لفرط التأكسج خلال المرحلة المبكرة إلى المتوسطة من التمايز النشط وتكوين الخلية أحادية الطبقة بدلا من ظهارة مجرى الهواء الناضجةالمتمايزة تماما 67 من المحتمل أن يحاكي السيناريو السريري عند الأطفال حديثي الولادة الخدج للغاية (< 28 أسبوعا من الحمل) الذين يولدون خلال المراحل المبكرة (القناة إلى العجزية) من نمو الرئة بدلا من المرحلةالسنخية 7.

نموذجنا له قيود يجب مراعاتها عند تطبيقه على التنمية البشرية والمرض. لقد استخدمنا إعادة البرمجة المشروطة للخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء الوليدي المنشورة سابقا في نموذج ALI ل nTAECs39. يتيح استخدام مثبطات عامل النمو (Rho / Smad / GSK3 / mTOR) مرور أسرع ولاحق لهذه الخلايا. لقد حاولنا زراعة nTAECs في كل من الظروف المغمورة و ALI دون مثبطات في وسط النمو. ومع ذلك ، كان توسع هذه الخلايا ومرورها أبطأ بكثير ، وأصبحت طبقة الخلية أحادية الطبقة في ALI متسربة بحلول نهاية الأسبوع الثاني (البيانات غير معروضة). قامت مجموعة أخرى تستخدم نفس المثبطات لزراعة الخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء لحديثيالولادة 42 بتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإظهار أن وجود هذه المثبطات لم يتسبب في تعبير تفاضلي كبير للجينات المشاركة في الإجهاد التأكسدي أو الانتقال الظهاري الوسيط أو الشيخوخة الخلوية. ومع ذلك ، فقد أخذنا في الاعتبار هذا القيد في نموذجنا وقررنا إجراء التعرض لفرط التأكسج بعد إزالة مثبطات Rho و Smad من وسائط التمايز. في هذه الدراسة ، اختبرنا فقط تأثيرات فرط التأكسج المعتدلة (60٪ O2) على nTAECs. ومع ذلك ، تهدف الدراسات المستقبلية إلى استخدام التعرض المتدرج لفرط التأكسج (40٪ و 60٪ و 95٪ O2) ومقارنة الاستجابات في nTAECs. في حين أن النموذج الموصوف هنا له جاذبية انتقالية نظرا لاستخدام خلايا من حديثي الولادة من البشر الذين تم قبولهم في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة ، فإن هذا نموذج لزراعة الخلايا في المختبر ، وبالتالي ، فإن النتائج المهمة التي تستخدم هذا النموذج تستدعي التأكيد مع نموذج حيواني تكميلي في الجسم الحي .

في الختام ، وصفنا الطريقة خطوة بخطوة لإنشاء نموذج مزرعة ALI ثلاثي الأبعاد في المختبر باستخدام الخلايا الظهارية لمجرى الهواء الوليدي المعزولة من شفط القصبة الهوائية لحديثي الولادة في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة. لقد استخدمنا هذا النموذج لفحص آثار التعرض المعتدل لفرط التأكسج ، وهي إهانة بيئية شائعة عند الأطفال الخدج في وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة. تسبب التعرض لفرط التأكسج في الإجهاد التأكسدي الخلوي في الطبقة الأحادية للخلية دون التسبب في تلف كبير في غشاء الخلية أو موت الخلايا ، مما يسمح باستمرار ثقافة ALI لدراسة التأثيرات طويلة الأمد للتعرض ل O2 على التطور الظهاري لمجرى الهواء حديثي الولادة ووظيفته. يمكن للتطبيقات المستقبلية التي تستخدم هذه الأساليب أن تكشف عن آليات المرض المبكرة المشاركة في التطور طويل الأمد الناجم عن فرط التأكسج للأمراض الرئوية التي غالبا ما تظهر عند الخدج السابقين.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكفصون عنه ولا تضارب في المصالح للإبلاغ عنهم.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة الصحة المشيخية (PHF) والموارد السريرية والانتقالية المشتركة في أوكلاهوما (U54GM104938 مع جائزة التطوير المؤسسي (IDeA) من NIGMS) إلى AG. نود أن نشكر الدكتور بول ليرو والدكتور شينغ بين آي في مستشفى ماساتشوستس العام ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، بوسطن ، ماساتشوستس ، على توفير خلايا متبرعة حديثي الولادة المستخدمة في بعض التجارب. تم إنشاء الأشكال باستخدام Biorender. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ محلول فورمالينفيشر Scientific23-426796
1X PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) ، درجة الحموضة 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts ، 6.5 ممCorning3470
جسم مضاد للتوبولين مضاد للأسيتيلات ، فأر أحادي النسيلةSigmaT7451
الأجسام المضادة لآلفا توبولينAbcamab7291
المضادة للسيتوكيراتين 5 الأجسام المضادةAbcamab53121
BronchiaLife Epithelial Air Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Cparkd caspase-3 الأجسام المضادةالخلية9664T
SCGB1A1 أو بروتين خلية النادي (CC16) الإنسان ، الأرانب متعدد النسيلة الأجسام المضادةBioVendor R & DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (مؤشر الإجهاد التأكسدي العام)Thermo ScientificC6827
ثقافة خلايا كورنينج المعالجة T25 قواريركورنينج430639
كورنينج على شكل حرف U قوارير T75 قواريركورنينج430641U
CyQUANT LDH فحص السميةالخلوية الحرارية العلميةC20300
DAPI محلول (1 مجم / مل)فيشر EN62248
ميثيل سلفوكسيد [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
الماء المقطرGibco15230162
EVOM دليل لقياس TEERأداة الدقة العالميةEVM-MT-03-01
FBS (مصل الأبقار الجنينية)Gibco10082147
فلورسين إيزوثيوسيانات ديكستران (متوسط مول الوزن 10,000)فيشر F0918100MG
الفلورسين إيزوثيوسيانات – ديكستران (متوسط مول الوزن 20،00)سيجماFD20-100MG
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، الإعلانات البشرية-HRPSouthern Biotech1031-05
الماعز المضاد للفأر IgG2b الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) ، الفأر / الإعلانات البشرية-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC واجهة الهواء السائلة (ALI) التمايز تقنيةخلايا شريان الحياةLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i حاضنة ثاني أكسيد الكربون ثلاثي الغازات ، 165 لترطقم
Thermo Scientific4368814
HLLمكمل تقنية LifeLine CellLS-1001
ImageJ NIHN / A
Invivogen Normocin - كاشف مضاد للميكروباتفيشر ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeline Cell TechnologyLS-1013
مصل الماعز العاديGibcoPCN5000
نورموسينإنفيفوجينأنت-nr-05
p63 الجسم المضادسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-25268
ProLong الذهب المضاد للتلاشي حاملInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
فحوصات تبر جين TaqMan Fast Advanced Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gene Exression Asresion: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gene Exression Ascesion: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gene Exression Asression: GAPDHHs02786624_g1Thermo Scientific
Taqman: فحوصات النبذ الجيني
Taqman: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Hs00361185_m1
فحوصات إبراز الجين Taqman: فحوصات MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gene Exression: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Exression Ascesion: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gene Exression Ascesion: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
التصفية المعقمة ذات التدفق السريع Thermo Scientific Nalgene مع غشاء PES (0.22 & mu ؛ M المسام ، 500 مل)Thermo Scientific5660020
TM-1 مكمل مشتركلتقنية Lifeline CellLS-1055
إجمالي إشارات خلية الأجسام المضادة الكاسباز -314220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، فينول أحمرGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
إشارات ثنائي المتوسطة نسخ عكسي cDNA عالي السعة 51030411 حراري علمي imagej.nih.gov/ij/ فحوصات النبذ الجيني GPX1 Thermo Scientific Hs00829989_gH Taqman: فحوصات النبذ الجيني GPX2 Thermo Scientific Hs01591589_m1 Taqman Gene Exression Asression: KRT5 Thermo Scientific Taqman Gene وحدات

المراجع

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.