يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تثمين الأعشاب البحرية الحمراء Gracilaria gracilis من خلال نهج التكرير الحيوي

3.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65923

⸱

نوفمبر 21, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف العديد من البروتوكولات التي تهدف إلى تثمين متكامل ل Gracilaria gracilis: حصاد الأنواع البرية ، والنمو الداخلي ، واستخراج المكونات النشطة بيولوجيا. يتم تقييم التأثيرات المضادة للأكسدة ومضادات الميكروبات والسامة للخلايا للمستخلصات ، جنبا إلى جنب مع التقييم الغذائي والاستقرار للأغذية المخصبة بالكتلة الحيوية والأصباغ الكاملة للأعشاب البحرية.

الملخص

يتزايد باستمرار الاهتمام بالأعشاب البحرية كمادة وسيطة وفيرة للحصول على مكونات نشطة بيولوجيا قيمة ومتعددة الأهداف. في هذا العمل ، نستكشف إمكانات Gracilaria gracilis ، وهي أعشاب بحرية حمراء صالحة للأكل تزرع في جميع أنحاء العالم لمصلحتها التجارية كمصدر للأجار والمكونات الأخرى لتطبيقات مستحضرات التجميل والأدوية والغذاء والأعلاف.

تم تحسين ظروف نمو G. gracilis من خلال التكاثر الخضري والأبواغ أثناء التلاعب بالظروف الفيزيائية والكيميائية لتحقيق مخزون كبير من الكتلة الحيوية. تم تنفيذ منهجيات الاستخراج الأخضر باستخدام الإيثانول والماء على الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. تم تقييم الإمكانات النشطة بيولوجيا للمستخلصات من خلال مجموعة من المقايسات في المختبر فيما يتعلق بسميتها الخلوية ومضادات الأكسدة وخصائص مضادات الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية المجففة في تركيبات المعكرونة لزيادة القيمة الغذائية للأغذية. كما تم دمج الأصباغ المستخرجة من G. gracilis في الزبادي كملون طبيعي ، وتم تقييم ثباتها. تم تقديم كلا المنتجين لتقدير لوحة حسية شبه مدربة تهدف إلى تحقيق أفضل صياغة نهائية قبل الوصول إلى السوق.

تدعم النتائج تعدد استخدامات G. gracilis سواء تم تطبيقه ككتلة حيوية كاملة و / أو مستخلصات و / أو أصباغ. من خلال تنفيذ العديد من البروتوكولات المحسنة ، يسمح هذا العمل بتطوير منتجات ذات إمكانية ربح أسواق الأغذية ومستحضرات التجميل وتربية الأحياء المائية ، وتعزيز الاستدامة البيئية والاقتصاد الدائري الأزرق.

وعلاوة على ذلك، وتمشيا مع نهج التكرير الحيوي، سيتم استخدام الكتلة الحيوية المتبقية من الأعشاب البحرية كمنشط حيوي لنمو النبات أو تحويلها إلى مواد كربونية لاستخدامها في تنقية المياه لأنظمة الاستزراع المائي الداخلية لماري بوليتكنيك في ليريا، البرتغال.

المقدمة

يمكن اعتبار الأعشاب البحرية مادة خام طبيعية مثيرة للاهتمام تستفيد منها قطاعات الأدوية والأغذية والأعلاف والبيئة. إنها تقوم بالتخليق الحيوي لمجموعة من الجزيئات ، والعديد منها غير موجود في الكائنات الحية الأرضية ، مع الخصائص البيولوجية ذات الصلة 1,2. ومع ذلك ، يجب تنفيذ بروتوكولات الزراعة المحسنة للأعشاب البحرية لضمان وجود مخزون كبير من الكتلة الحيوية.

يجب أن تأخذ طرق الزراعة دائما في الاعتبار طبيعة ثالي الأعشاب البحرية والتشكل العام. Gracilaria gracilis هو تصنيف نسيلي ، مما يعني أن العضو المرتبط ينتج محاور نباتية متعددة. وبالتالي يتم تحقيق التكاثر عن طريق التجزئة (التكاثر الخضري) ، حيث أن كل محور من هذه المحاور قادر تماما على تبني حياة مستقلة عن الثاليوس3 الرئيسي. يمكن دمج الأصناف المستنسخة بنجاح مع منهجيات زراعة بسيطة وسريعة من خطوة واحدة ، حيث يتم الحصول على كميات كبيرة من الكتلة الحيوية عن طريق تقسيم الثاليوس إلى شظايا صغيرة تتجدد بسرعة وتنمو لتصبح أفرادا جدد متطابقين وراثيا. يمكن استخدام كل من الثالي الهابلونتيك والديبلوني في هذه العملية. على الرغم من أن الجنس يظهر دورة حياة ثلاثية الشكل متماثلة الشكل معقدة ، إلا أن التبويض نادرا ما يكون ضروريا إلا عندما يكون التجديد الوراثي للأرصدة مطلوبا لتحقيق محاصيل محسنة. في هذه الحالة ، يؤدي كل من tetraspores (الجراثيم الهابلونية التي تشكلها الانقسام الاختزالي) والأبواغ الكاربوسية (الجراثيم الثنائية التي تشكلها الانقسام) إلى ظهور ثالي عياني يمكن بعد ذلك زراعته ونشره عن طريق التكاثر الخضري4. تملي دورات النمو الظروف البيئية والحالة الفسيولوجية للأفراد ، من بين عوامل بيولوجية أخرى مثل ظهور النباتات الهوائية والتصاق الكائنات الحية الأخرى. لذلك ، يعد تحسين ظروف النمو أمرا بالغ الأهمية لضمان إنتاجية عالية وإنتاج كتلة حيوية عالية الجودة5.

يمكن تحقيق استخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الأعشاب البحرية ، بما في ذلك G. gracilis ، من خلال طرق مختلفة 6,7. يعتمد اختيار طريقة الاستخراج على المركبات المحددة ذات الأهمية والتطبيق المستهدف وخصائص الأعشاب البحرية. في هذه الدراسة ، ركزنا على استخراج المذيبات ، والذي يتضمن استخدام المذيبات الخضراء ، مثل الماء أو الإيثانول ، لإذابة واستخراج المركبات النشطة بيولوجيا من الكتلة الحيوية للأعشاب البحرية. يمكن إجراء الاستخراج من خلال النقع بطريقة متعددة الاستخدامات وفعالة ويمكن استخدامه لمجموعة واسعة من المركبات. إنها طريقة بسيطة ومستخدمة على نطاق واسع تتضمن نقع الكتلة الحيوية في مذيب لفترة طويلة ، عادة في الغرفة أو درجات حرارة مرتفعة قليلا. يتم تقليب المذيب لتعزيز عملية الاستخراج. بعد وقت الاستخراج المطلوب ، يتم فصل المذيب عن المادة الصلبة عن طريق الترشيح أو الطرد المركزي.

الماء مذيب شائع الاستخدام في التطبيقات الغذائية نظرا لسلامته وتوافره وتوافقه مع مجموعة واسعة من المنتجات الغذائية. استخراج المياه مناسب للمركبات القطبية مثل السكريات والببتيدات وبعض الفينول. ومع ذلك ، قد لا يستخرج المركبات غير القطبية بشكل فعال. الإيثانول هو أيضا مذيب يستخدم على نطاق واسع في التطبيقات الغذائية ويمكن أن يكون فعالا في استخراج مجموعة متنوعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك المركبات الفينولية والفلافونويد وبعض الأصباغ. يعرف الإيثانول عموما بأنه آمن للاستخدام في الطعام ويمكن تبخيره بسهولة ، تاركا وراءه المركبات المستخرجة. تجدر الإشارة إلى أن اختيار طريقة الاستخراج يجب أن يأخذ في الاعتبار عوامل مثل الكفاءة والانتقائية والفعالية من حيث التكلفة والتأثير البيئي. يعد تحسين معلمات الاستخراج ، مثل تركيز المذيبات ووقت الاستخراج ودرجة الحرارة والضغط أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الغلة المثلى للمركبات النشطة بيولوجيا من G. gracilis أو الأعشاب البحرية الأخرى.

تم العثور على الأعشاب البحرية لإظهار نشاط مضاد للميكروبات ضد مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات8. يعزى هذا النشاط إلى المكونات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك الفينولات والسكريات والببتيدات والأحماض الدهنية. أثبتت العديد من الدراسات فعاليتها ضد مسببات الأمراض مثل الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية والسالمونيلا sp. والزائفة الزنجارية وغيرها. 9. يعزى النشاط المضاد للميكروبات للأعشاب البحرية إلى وجود مركبات نشطة بيولوجيا يمكن أن تتداخل مع جدران الخلايا الميكروبية والأغشية والإنزيمات ومسارات الإشارات10. قد تعطل هذه المركبات نمو الميكروبات ، وتمنع تكوين الأغشية الحيوية ، وتعدل الاستجابات المناعية.

الأعشاب البحرية الحمراء ، والمعروفة أيضا باسم نباتات رودوفيت ، هي مجموعة من الطحالب التي يمكن أن تظهر نشاطا مضادا للميكروبات ضد مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة. ضمن هذه المجموعة ، يحتوي G. gracilis على العديد من المركبات النشطة بيولوجيا التي قد تساهم في نشاطه المضاد للميكروبات المبلغ عنه. في حين أن الجزيئات المحددة يمكن أن تختلف ، فإن الفئات الشائعة التي تم الإبلاغ عنها في G. gracilis والتي قد تمتلك خصائص مضادة للميكروبات هي السكريات والفينولات والتيربينويدات والأصباغ11. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن وجود وكميات هذه المكونات يمكن أن تختلف اعتمادا على عوامل مثل موقع جمع الأعشاب البحرية ، والموسمية ، والحالة الفسيولوجية للتالي ، والظروف البيئية. لذلك ، قد تختلف الفئة المحددة وتركيز المركبات المضادة للميكروبات في G. gracilis وفقا لذلك.

كما وجد أن G. gracilis يحمل خصائص مضادة للأكسدة ، تحتوي على مركبات فينولية مختلفة ، والتي ثبت أنها تزيل الجذور الحرة وتقلل من الإجهاد التأكسدي12.تساعد مضادات الأكسدة على حماية الخلايا من التلف الناجم عن أنواع الأكسجين التفاعلية ولها فوائد صحية محتملة. يمكن تقييم قدرة مضادات الأكسدة مباشرة من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك نشاط كسح الجذور الحرة 2،2-ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) ، وبشكل غير مباشر ، من خلال القياس الكمي لمحتوى البوليفينول الكلي (TPC) 13.

على الرغم من الإبلاغ عن أن أحد المكونات له نشاط حيوي بارز ، إلا أن تقييم السمية الخلوية لا غنى عنه في تقييم المواد الطبيعية والاصطناعية لاستخدامها في اتصال مع الخلايا أو الأنسجة الحية. هناك عدة طرق لقياس السمية الخلوية ، ولكل منها مزايا وقيود. بشكل عام ، يقدمون مجموعة من الخيارات لتقييم الآثار الضارة للعديد من المواد على الخلايا ، وفي الوقت نفسه ، للتحقيق في آليات تلف الخلايا وموتها14.

في هذا العمل ، نستخدم مقايسة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، وهي طريقة قياس لوني قدمها Mosmann (1983) 15. تقيس هذه الطريقة اختزال أملاح التترازوليوم إلى منتج فورمازان أرجواني بواسطة الخلايا النشطة الأيضية. كلما زادت كمية بلورات الفورمازان ، زاد عدد الخلايا القابلة للحياة ، مما يوفر مقياسا غير مباشر للسمية الخلوية14. نظرا لأنه في هذا العمل ، يقصد من مستخلصات G. gracilis المائية والإيثانول دمجها في تركيبات مستحضرات التجميل الجلدية ، يتم إجراء تقييم السمية الخلوية في المختبر في خط خلايا الخلايا الكيراتينية (HaCaT).

فيما يتعلق بتطبيق الغذاء ، فإن الأعشاب البحرية منخفضة السعرات الحرارية بشكل عام وغنية من الناحية التغذوية بالألياف الغذائية والعناصر الأساسية والأحماض الأمينية والسكريات والأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة والبوليفينول والفيتامينات 2,16. G. gracilis ليست استثناء ، ولها قيمة غذائية مثيرة للاهتمام. وجد Freitas et al. (2021) 4 أن G. gracilis المزروعة تحتوي على مستويات أعلى من البروتين وفيتامين C وحافظت على مستوى الدهون الكلية مقارنة بالأعشاب البحرية البرية. وقد يمثل ذلك ميزة اقتصادية وبيئية، لأن الإنتاج أفضل من استغلال الموارد البرية من الناحية التغذوية. بالإضافة إلى ذلك ، يشعر المستهلكون بقلق متزايد بشأن نوع الطعام الذي يتناولونه ، لذلك من المهم إدخال مكونات جديدة لإثراء الغذاء واستخدام موارد جديدة للحصول على مقتطفات يمكن أن تضيف قيمة إلى المنتج والمطالبة ب "ملصق نظيف". إلى جانب ذلك ، فإن السوق الحالي تنافسي للغاية ، ويتطلب تطوير منتجات جديدة واستراتيجيات مبتكرة لتمييز الشركات المصنعة عن منافسيها17.

إن إثراء المنتجات ذات القيمة الغذائية الرديئة ، مثل المعكرونة ، بالموارد البحرية ، بما في ذلك الأعشاب البحرية ، هو استراتيجية لإدخال هذا المورد كغذاء جديد واستراتيجية تمايز السوق من خلال منتج ذي قيمة غذائية متميزة. من ناحية أخرى ، G. gracilis هو مصدر للأصباغ الحمراء الطبيعية مثل phycobiliproteins18 ، لديها إمكانات عالية للتطبيقات في صناعة المواد الغذائية. أظهرت هذه الأعشاب البحرية اهتماما كبيرا في العديد من المجالات ، ويمكن تطبيقها باستخدام الأعشاب البحرية بأكملها والمستخلصات و / أو الكتلة الحيوية المتبقية. في هذا العمل ، نعرض بعض الأمثلة على هذه التطبيقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. حصاد الكتلة الحيوية وإعدادها

  1. احصد عينات G. gracilis أثناء انخفاض المد وانقلها بسرعة إلى المختبر في صناديق مظلمة ومبردة لتجنب التجفيف والضوء والتعرض للهواء.
  2. في المختبر ، اغسل كل ثالوس بمياه البحر الجارية ونظفها جيدا لإزالة الحطام والأجزاء الميتة والنباتات الهوائية والكائنات الحية الأخرى من السطح.
  3. حافظ على الكتلة الحيوية البرية في مياه البحر المهواة باستمرار (31-35 psu) في غرفة مناخية (20 ± 1 درجة مئوية) مع إشعاع منخفض يوفره ضوء النهار الأبيض البارد ومصابيح الفلورسنت والفترة الضوئية المحددة في الساعة 16:08 (الضوء: الظلام) لمدة 7 أيام. خلال هذه الفترة ، لا توفر أي وسائط مغذية ؛ هذا يسمح للأعشاب البحرية بالتكيف ببطء مع الظروف الداخلية الجديدة.

2. صيانة المخزون

  1. بعد فترة التأقلم ، قم بقطع نصائح صحية من thalli الأعشاب البحرية بشفرة معقمة. بعد Redmond et al. (2014) 19 وتحت ظروف معقمة ، اسحب كل طرف من خلال هلام أجار تم إعداده مسبقا في أطباق بتري (1.0٪ أجار بكتريولوجي ، بنسبة 1: 1 ماء مقطر / مياه البحر) لإزالة أي ملوثات متبقية. قم بإجراء سحب الآجار ثلاث مرات لكل طرف واسحب الطرف دائما عبر الأجزاء غير المستخدمة من هلام أجار.
  2. غسل الأواني الزجاجية الحمضية في محلول حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ، 15 ٪) وشطف جيدا بالماء المقطر. تعقيم جميع الأدوات والأواني الزجاجية والأجار ومياه البحر والماء المقطر المستخدم في عملية التنظيف بواسطة الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 15 دقيقة).
    تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بحمض الهيدروكلوريك التي يقدمها المورد.
  3. تنمو الأطراف في مياه البحر المعقمة عند 35 رطلا من السو ، مكملة بمحلول Von Stosch المخصب (VSE) المعدل للأعشاب البحرية الحمراء ، وفقا ل Redmond et al. (2014) 19. أضف ثاني أكسيد الجرمانيوم (GeO2) إلى الوسط (1 مل / لتر) لمنع نمو الدياتومات النباتية.
    تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب GeO2 التي سلمها المورد.
    ملاحظة: النصائح التي تظهر فقدان التصبغ ، كما لوحظ من خلال تغير اللون الجزئي أو الكلي ، تحت الضغط أو ميتة بالفعل ويجب التخلص منها.

3. زراعة وتوسيع النطاق

  1. بعد فترة التأقلم ، قم بتوزيع حوالي 8-10 أطراف صحية بشكل عشوائي في قوارير مسطحة القاع سعة 250 مل في غرفة مناخية محددة عند 20 ± 1 درجة مئوية مع الضوء الأبيض البارد لفوتونات 20 ± 0.5 μmol m-2 s-1 (1500 لوكس) ، وهي فترة ضوئية محددة في 16 ساعة: 8 ساعات (فاتح: داكن) ، ومياه البحر المعقمة المخصبة بوسائط زراعة VSE التي يتم تجديدها كل أسبوع.
  2. قم بإجراء قياسات الوزن الأسبوعية ، وتجنب إجهاد الثالي بشكل مفرط20. لهذا ، قم بإزالة النصائح بعناية من وسط الثقافة ، واشطفها برفق ، ووزن الملليغرام على نطاق مختبري.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع التجديد الأسبوعي لوسائل الإعلام الثقافية.
  3. قد ينمو ثالي في هذه القوارير حتى كثافة 2 جم / لتر. في هذه المرحلة ، قم بإجراء توسيع نطاق المستلم (250 مل و 1 لتر و 5 لتر). انقل الزراعة إلى حاويات بيضاء مفتوحة في الهواء الطلق سعة 50 لترا وأكبر عندما يصل الحجم إلى 5 لتر.
  4. حساب معدل النمو النسبي (RGR) وفقا ل Patarra et al. (2017) 21 :
    RGR (٪ fw / يوم) = ([Ln (fw) - Ln (iw)] / t) × 100
    حيث IW و FW هما الوزن الطازج الأولي والنهائي ، على التوالي ، معبرا عنه بالجرام ، و T هو الوقت بالأيام.
    ملاحظة: في ظل هذا الإعداد المختبري ، يصل RGR إلى قيم تصل إلى 21٪ في اليوم. يمكن إجراء حصاد الكتلة الحيوية في أي وقت. يجب معالجة الكتلة الحيوية بسرعة لمنع التدهور إما عن طريق التجفيف في الفرن أو التجفيف بالتجميد أو ببساطة تخزينها مجمدة (-20 درجة مئوية) ، اعتمادا على الاستخدام المقصود. يمكن الحفاظ على الكتلة الحيوية المجففة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو تخزينها مجمدة أيضا.

4. إجراء الاستخراج

ملاحظة: لتقييم السمية الخلوية في المختبر ، ومضادات الأكسدة ، والخصائص المضادة للميكروبات لمستخلصات G. gracils ، يأخذ تحضيرها في الاعتبار معلمتين مختلفتين: درجة حرارة الاستخراج ونوع المذيب.

  1. لإجراء عمليات الاستخراج ، جفف الكتلة الحيوية G. gracilis في الفرن وطحن الكتلة الحيوية (على سبيل المثال ، في مطحنة القهوة المنزلية) حتى يمر المسحوق عبر غربال 200 ميكرومتر.
  2. وزن الكتلة الحيوية المجففة (10 جم) وحلها في 100 مل من المذيب (الإيثانول المطلق أو الماء المعقم).
  3. يقلب في وعاء محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بإجراء الإيثانول المتسلسل > الماء والماء > استخراج الإيثانول عند RT و 40 °C و 70 °C.
  5. لكل درجة حرارة ، قم بإجراء عمليات الاستخراج باستخدام الإيثانول والماء بشكل منفصل مرتين.
  6. افصل المستخلصات السائلة عن الكتلة الحيوية المتبقية عن طريق الترشيح من خلال ورق الترشيح (Whatman No.1) ، متبوعا بالطرد المركزي عند 8000 × g لمدة 10 دقائق في RT.
  7. أعد استخدام الكتلة الحيوية الطحلبية المتبقية لمزيد من الاستخراج مع المذيب الآخر. إذا تم استخراج عينة أولا باستخدام الإيثانول ، فاستخرجها بالماء بعد ذلك ، والعكس صحيح.
  8. قم بتجميد وتجفيف المستخلصات المائية وتبخير مستخلصات الإيثانول في مبخر دوار عند 40 درجة مئوية.
  9. تحفظ المستخلصات المجففة على حرارة 4 درجات مئوية.
  10. قم بإذابة المستخلصات بتركيز 50 مجم / مل (مقايسات مضادات الميكروبات) أو 10 مجم / مل (مقايسات مضادات الأكسدة). إذابة المستخلصات المائية في الماء المعقم والمستخلصات الإيثانولية في الإيثانول المطلق.

5. نشاط مضادات الميكروبات

ملاحظة: يجب اختبار المستخلصات الإيثانولية والمائية بشكل فردي ضد Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) و Escherichia coli (DSM 5922) و Listonella anguillarum (DSM 21597). يجب إجراء اختبار مضادات الميكروبات وفقا لتوصيات اللجنة الوطنية لمعايير المختبرات السريرية (NCCLS ، 2012) 22. تم الحصول على جميع الثقافات من المجموعة الألمانية للكائنات الحية الدقيقة ومزارع الخلايا (DSMZ). نمت L. anguillarum على مرق الصويا التربتيك (TSB) أو أجار الصويا التربتيك (TSA) المكمل بكلوريد الصوديوم 1٪ (كلوريد الصوديوم). تمت زراعة السلالتين المتبقيتين على وسط LB (VWR Chemicals ). تم تحضين مستزرعات Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) و Listonella anguillarum (DSM 21597) عند 30 درجة مئوية ، بينما تم تحضين الإشريكية القولونية (DSM 5922) عند 37 درجة مئوية ، وفقا لتعليمات المورد. يمكن استخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق لتحديد النشاط المضاد للميكروبات في الوسائط السائلة ، ويجب أن يتم ذلك على نطاق مجهري ، مما يسمح بتحديد إمكانات مضادات الميكروبات بسرعة وكفاءة. تسمح هذه الطريقة منخفضة التكلفة بالحصول على النتائج في غضون 24 ساعة فقط ، وبالتالي فهي مناسبة لتحديد ، في مرحلة مبكرة ، أفضل ظروف الاستخراج التي تسمح ، لسلالة ميكروبية معينة ، بالحصول على نتائج من حيث العمل المثبط للنمو. ومع ذلك ، تتطلب المنهجية استخدام ألواح دقيقة معقمة بغطاء خاص بنمو الميكروبات ، بالإضافة إلى توفر قارئ صفيحة دقيقة لطول الموجة 600 نانومتر.

  1. قم بإجراء اختبارات التخفيف الدقيق للمرق باستخدام صفائح دقيقة غير معالجة ومستديرة القاع ذات 96 بئرا مع 170 ميكرولتر من مرق مولر-هينتون (MHB) ، ملقحة ب 10 ميكرولتر من اللقاح القياسي (عند 0.5 معيار McFarland) و 20 ميكرولتر من كل مستخلص (50 مجم / مل).
  2. احتضان اللوحات لمدة 24 ساعة في درجة الحرارة المثلى لكل سلالة.
  3. الكشف عن النشاط المضاد للميكروبات عن طريق تقليل العكارة المرئية المقاسة عن طريق تسجيل الكثافة البصرية (OD 600) في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة ، عند 0 ساعة و 24 ساعة.
  4. التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من تثبيط:
    figure-protocol-1
    حيث Abs. ext هو الفرق في الامتصاص المقاس ، بين 0 h و 24 h ، في الآبار التي تحتوي على سلالة بكتيرية تنمو في وجود المستخلص ، ويشير Abs إلى نفس المقياس في الآبار التي تحتوي على السلالة البكتيرية والمذيب.
  5. في هذه الطريقة ، تشمل تفاعلات التحكم ، مع الآبار التي تحتوي فقط على وسط الاستزراع الذي سيكون السيطرة السلبية ، ولكن أيضا الآبار ذات الوسط الملقح بالسلالة القياسية المضافة إلى المذيب (الإيثانول أو الماء) والوسط مع السلالة البكتيرية والمضاد الحيوي الموجب السيطرة (الكلورامفينيكول).

6. نشاط مضادات الأكسدة والقياس الكمي للبوليفينول الكلي

  1. إجمالي محتوى البوليفينول
    ملاحظة: يتم تنفيذ إجمالي محتوى البوليفينول (TPC) باستخدام طريقة Folin-Ciocalteu23 وتكييفها مع النطاق الجزئي.
    1. أضف إلى كل بئر صفيحة دقيقة من 96 بئرا ، محمية من الضوء ، و 158 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 2 ميكرولتر من العينة ، و 10 ميكرولتر من كاشف Folin-Ciocalteu.
      تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بكاشف Folin-Ciocalteu الذي تم تسليمه من قبل المورد.
    2. بعد دقيقتين ، أضف 30 ميكرولتر من Na2CO3 (20٪).
    3. بعد الحضانة في الظلام عند RT لمدة 1 ساعة ، قم بقياس العينات الطيفية عند 755 نانومتر.
    4. استخدم حمض الغال (الذي يسمح برسم منحنى المعايرة) أو الماء عالي النقاء (2 ميكرولتر) كعناصر تحكم.
    5. عبر عن النتائج كمكافئات حمض الغال (مستخلص mg GAE / g).
  2. 2،2 ثنائي فينيل -1-بيكريل هيدرازيل (DPPH) نشاط كسح جذري
    ملاحظة: يتم تقييم النشاط المضاد للأكسدة للمستخلصات كما هو موضح من قبل Duan et al. (2006) 24 ، وتكييفها مع المجهرية
    1. في صفيحة ميكروية ذات 96 بئرا محمية من الضوء ، ضع 2 ميكرولتر من كل عينة (بتركيز 10 مجم / مل) و 198 ميكرولتر من DPPH المذاب في الإيثانول المطلق (0.1 مللي مول).
      تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب DPPH التي قدمها المورد.
    2. قم بتشغيل رد الفعل لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام. قم بقياس الامتصاص عند 517 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة.
    3. قم بإجراء تفاعل تحكم باستخدام 2 ميكرولتر من الإيثانول المطلق / الماء المقطر و 198 ميكرولتر من محلول DPPH. قم بإجراء قياس فارغ باستخدام 2 ميكرولتر من المستخلص و 198 ميكرولتر من الإيثانول المطلق.
    4. عبر عن النتائج كنسبة مئوية من تثبيط DPPH باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-2
      حيث كما هو امتصاص مستخلص الطحالب ، Ab هو امتصاص العينات الفارغة و Ac هو امتصاص السيطرة.

7. تقييم السمية الخلوية في خلايا البشرة

ملاحظة: يتم تقييم التأثير السام للخلايا في المختبر للمستخلصات المائية والإيثانول من G. gracilis في الخلايا الكيراتينية البشرية (خلايا HaCaT - 300493) من خلال مقايسة MTT اللونية كما هو موضح سابقا25. تم الحصول على الخلايا من خدمات خطوط الخلايا ، ألمانيا (CLS) وتم تنفيذ الطريقة وفقا للإرشادات المؤسسية وتعليمات CLS.
تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب MTT التي يقدمها المورد)

  1. صيانة زراعة الخلايا
    1. زراعة خلايا HaCaT في وسط الجلوكوز عالي الجلوكوز (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومحلول مضاد حيوي / مضاد حيوي 1٪ (أمفوتريسين B ، 0.25 مللي مول ؛ بنسلين ، 60 مللي مول ؛ ستربتومايسين ، 100 مللي مول).
    2. استخدم التربسين-EDTA لفصل الخلايا.
      ملاحظة: يتم إنجاز المزرعة الفرعية لخلايا HaCaT بعد وصول الخلايا إلى الالتقاء الكلي.
    3. استزرع الخلايا في غرفة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 95٪ رطوبة.
    4. الاستزراع الفرعي للخلايا وفقا لتعليمات البنك الحيوي كلما وصلت الثقافات إلى التقاء 80٪ -85٪.
  2. تقييم السمية الخلوية
    1. بعد زرع الخلايا في 96 بئرا وحضانتها طوال الليل، عالج خلايا HaCaT (4 × 104 خلايا/بئر) بالمستخلصات المجففة المذابة مسبقا في DMSO (100 ملغم/مل). ثم أضف 2 ميكرولتر من محلول المستخلص إلى 198 ميكرولتر من الوسط واحتضان الألواح لمدة 24 ساعة.
    2. قم بإزالة وسط الاستزراع وأضف 100 ميكرولتر من MTT (0.5 مجم / مل) إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام في ظروف الثقافة العادية المذكورة أعلاه.
    3. قم بإزالة محلول MTT وإذابة بلورات الفورمازان داخل الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر من DMSO.
    4. قم بقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من الخلايا الضابطة غير المعالجة.

8. الابتكار الغذائي

  1. منتج غذائي جديد: المعكرونة مع الأعشاب البحرية
    1. اختيار المكونات وصياغة المعكرونة
      ملاحظة: تم اختيار المكونات بالتعاون مع شركة معكرونة. تم اختيار المكونات الرئيسية (الموصوفة في القسم 8.2) مع مراعاة سهولة الوصول إليها وتوافقها مع خطوط الإنتاج الحالية ، باستخدام الموارد البحرية للحصول على المعكرونة ذات القيمة الغذائية المضافة.
      1. بعد اختيار المكونات ، صمم التركيبة وفقا للقيمة الغذائية المقصودة (مصدر الألياف والفيتامينات والعناصر المعدنية والدهون المشبعة المنخفضة) من خلال تحليل التركيب الكيميائي النظري للتركيبات باستخدام جدول بيانات.
      2. عند استيفاء المتطلبات النظرية ، تابع الإنتاج على نطاق المختبر كما هو موضح في الخطوة 8.1.2.
      3. قم بإجراء اختبار حسي باستخدام لوحة شبه مدربة (>10 متذوقين) للتحقق من الحاجة إلى إعادة الصياغة أو قبول التركيبة للخطوات التالية.
        ملاحظة: تم تدريب اللجنة مسبقا على تذوق المعكرونة وتقييم التركيبات المقدمة فيما يتعلق بسمات مثل النكهة والطعم والرائحة والملمس والمظهر.
    2. إنتاج المعكرونة
      ملاحظة: أنتج عينات معكرونة شيفيري باستخدام آلة بثق المعكرونة.
      1. في الجهاز ، امزج الأجزاء المحددة مسبقا من دقيق الأرز ، G. gracilis ، و Chlorella vulgaris ، وأضف حوالي 30٪ من الماء إلى الخليط.
      2. للحصول على المعكرونة الجافة ، جفف Chifferi عند 68 درجة مئوية لمدة 42 دقيقة ، تليها 5 ساعات ، 30 دقيقة عند 76 درجة مئوية ، لمحاكاة عملية صناعية.
      3. أخيرا ، قم بتعبئة العينات وإغلاقها بالمكنسة الكهربائية وتخزينها في مكان مظلم في RT حتى إجراء مزيد من التحليل.
    3. التحليل الغذائي
      ملاحظة: لتحليل الملف الغذائي ، استخدم العينات المجففة والمبللة في ثلاث نسخ.
      1. محتوى البروتين الخام: قم بإجراء مقايسة البروتين الكلي من خلال طريقة Kjeldahl ، المقتبسة من Duarte et al. (2022) 26 ، باتباع الخطوات 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. تزن بدقة 1.0 جم من العينة (أو الماء المقطر للمقايسة الفارغة) وتخلط مع قرصين كيلدال و 25 مل من H2SO4 في أنابيب الهضم.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب H2SO4 التي سلمها المورد.
      3. قم بهضم العينات في جهاز هضم Kjeldahl عند 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها 90 دقيقة عند 400 درجة مئوية.
      4. بعد التبريد إلى RT ، أضف 80 مل من الماء المقطر والتقطير الأمونيا المتكونة إلى 30 مل من محلول 4٪ H 3 BO3يحتوي على بروموكريزول أخضر وأحمر ميثيل. تتم هذه الخطوة في ظل ظروف قلوية (التقطير بنسبة 40٪ هيدروكسيد الصوديوم باستخدام جهاز تقطير Kjeldahl.
        تنبيه: انظر ورقة بيانات السلامة الخاصة بمحلول H 3 BO3الذي يحتوي على بروموكريزول أخضر وأحمر ميثيل و 40٪ هيدروكسيد الصوديوم الذي يسلمه المورد.
      5. قم بمعايرة العينات المقطرة باستخدام HCl 0.1 M حتى يلاحظ تغير في اللون إلى اللون الوردي الرمادي.
      6. احسب محتوى البروتين الخام، ممثلا بمحتوى النيتروجين في العينة، وعبر عنه بالصورة g لكل 100 g باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-3
        حيث Vs يتوافق مع حجم HCl (mL) المستخدم في معايرة العينة؛ Vb يتوافق مع الحجم المستخدم في الفراغ ؛ N يتوافق مع الحالة الطبيعية حمض الهيدروكلوريك. W يتوافق مع وزن العينة (جم).
      7. إجمالي محتوى الدهون: حدد إجمالي محتوى الدهون باستخدام طريقة Folch ، المقتبسة من Folch et al. (1957) 27 ، باتباع الخطوات 8.1.3.8-8.1.3.14.
      8. تحضير كاشف Folch عن طريق خلط CHCl3 و MeOH بنسبة 2: 1 (v: v).
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بكاشف Folch الذي يسلمه المورد.
      9. لاختبار الأنابيب التي تحتوي على 1 غرام من القسامة، أضف 5 مل من كاشف فولش و0.8 مل من الماء المقطر. تخلط في دوامة لمدة 1 دقيقة.
      10. ثم أضيفي 5 مل أخرى من كاشف Folch وتجانسها لمدة 5 دقائق. أضف 1.2 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.8٪ وتجانس لمدة دقيقتين.
      11. أجهزة الطرد المركزي العينات في 7000 × ز لمدة 10 دقائق. قم بتصفية المرحلة العضوية (المرحلة السفلية) من خلال القطن المحب للماء وكبريتات الصوديوم اللامائية في قارورة زجاجية مستديرة القاع.
      12. لتجنب فقدان العينة ، كرر خطوات إضافة 5 مل من CHCl3 ، والتجانس ، والطرد المركزي ، والترشيح في ظل نفس الظروف.
      13. أخرج المذيب العضوي من المراحل العضوية المجمعة عن طريق التبخر منخفض الضغط واتركه في الفرن عند 105 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تبريد العينات في المجفف.
      14. احسب محتوى الدهون ، معبرا عنه ب g لكل 100 غرام ، باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-4
        حيث W1 هو وزن القارورة الزجاجية الفارغة ذات القاع المستدير ؛ W2 هو الوزن الأولي للعينة ؛ W3 هي القارورة الزجاجية ذات القاع المستدير مع وزن العينة.
      15. محتوى الألياف الخام: تحديد محتوى الألياف الخام باستخدام منهجية مقتبسة من ISO 6865 (2000)28، باتباع الخطوات 8.1.3.16-8.1.3.22.
      16. قم بوزن 1 جم من العينة (W0) في بوتقة زجاجية ذات قاع مرشح (مرجع P2) وضعها في محلل الألياف.
      17. الخطوة الأولى هي التحلل المائي الحمضي: أضف 150 مل من 1.25٪ H 2 SO4 ، مسخن مسبقا ، و2مل من العامل المضاد للرغوة (n-octanol) إلى عمود كل بوتقة ؛ يسخن حتى الغليان ويترك لمدة 30 دقيقة.
      18. بعد إزالة هذا المذيب ، اغسل ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات للانتقال إلى التحلل المائي الأساسي. أضف 150 مل من 1.25٪ هيدروكسيد الصوديوم ، مسخن مسبقا ، و 5 مل من العامل المضاد للرغوة إلى العمود الخالي من السوائل ، وقم بإجراء نفس إجراء التسخين مثل التحلل المائي للحمض.
      19. أخيرا ، قم بغسل ثلاثي ب 150 مل من الأسيتون للاستخراج البارد.
      20. بعد هذه العملية ، قم بإزالة البوتقات بعناية من النظام ووضعها في فرن على حرارة 150 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. سجل الوزن النهائي (W1).
      21. ضع البوتقات في فرن دثر عند 500 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ثم سجل الوزن النهائي (W2).
      22. احسب محتوى الألياف الخام وعبر عن النتائج بالنسب المئوية باستخدام المعادلة التالية:
        ٪ الألياف الخام = 100 × (W1-W2) / W0
      23. ملف تعريف الأحماض الدهنية (FA): حدد ملف تعريف الأحماض الدهنية وفقا ل Fernández et al. (2015) 29 ، باتباع الخطوات 8.1.3.24-8.1.3.29.
        ملاحظة: يتم الحصول على استرات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) عن طريق نقل الميثيل المحفز بالحمض المباشر للعينات المجففة بالتجميد المطحونة. تتم جميع التحليلات في ثلاث نسخ.
      24. أضف 2 مل من محلول 2٪ (v / v) H2SO4 في الميثانول إلى عينة 50 مجم واسكب الخليط عند 80 درجة مئوية لمدة ساعتين مع التحريك المستمر.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة بالميثانول التي يسلمها المورد.
      25. بعد التبريد إلى RT ، أضف 1 مل من الماء عالي النقاء و 2 مل من n-heptane إلى كل عينة ، وقم بدامة الخليط لمدة دقيقة واحدة ، وطرده مركزيا لمدة 5 دقائق.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب n-heptane التي يسلمها المورد.
      26. استعادة المرحلة العليا n-heptane (العضوية) التي تحتوي على FAMEs ونقلها إلى قوارير كروماتوغرافيا الغاز (GC).
      27. التحليل في كروماتوجراف الغاز المجهز بعمود شعري TR-FAME (60 م × 0.25 مم معرف ، سمك فيلم 0.25 ميكرومتر) ، وأخذ عينات تلقائي ، وكاشف تأين اللهب (FID).
      28. اضبط الحاقن (الوضع بدون تقسيم) على 250 درجة مئوية والكاشف على 280 درجة مئوية. اضبط درجة الحرارة الأولية للعمود على 75 درجة مئوية مع الاستمرار لمدة 1 دقيقة. ثم ارفعه عند 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 170 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق. ثم ارفعه عند 5 درجات مئوية / دقيقة إلى 190 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق أخرى. أخيرا ، ارفعه عند 2 درجة مئوية / دقيقة إلى 240 درجة مئوية واستمر لمدة 10 دقائق. استخدم الهليوم باعتباره غازا حاملا بمعدل تدفق مقداره 1.5 mL/min. إمداد الهواء والهيدروجين بمعدلات تدفق تبلغ 350 و 35 مل / دقيقة على التوالي.
      29. حدد ملف تعريف FA من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ الناتجة بمعيار والتعبير عن النتائج كنسبة مئوية من إجمالي الدهون.
      30. ملف تعريف العناصر المعدنية: حدد العناصر المعدنية (Ca ، P ، Mg ، Na ، K ، Fe ، Cu ، Mn ، Zn) التي تم تحليلها بواسطة ICP-OES ، باتباع الطريقة المقتبسة من Pinto et al. (2022) 30 ، باتباع الخطوات 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. قم بوزن حوالي 0.4 جم من كل عينة جافة بدقة وأضف 7.5 مل من HNO3 و 2.5 مل من حمض الهيدروكلوريك.
        تنبيه: راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب HNO3 و HCl التي قدمها المورد.
      32. يتبع الهضم عملية من مرحلتين: زيادة درجة الحرارة من RT إلى 90 درجة مئوية في 30 دقيقة (والحفاظ على 30 دقيقة أخرى عند درجة الحرارة هذه) تليها 60 دقيقة عند 105 درجة مئوية.
      33. قم بتبريد محاليل العينات ، وقم بتخفيفها إلى 25 مل ، وقم بترشيحها والاحتفاظ بها في أنابيب ملصقة. في كل عملية هضم ، قم بإجراء نفس العملية باستخدام مادة مرجعية وفارغة. الحصول على تركيز العناصر المختلفة بواسطة ICP-OES.
      34. عبر عن النتائج بالملغ لكل 100 غرام من fw.
      35. محتوى الكربوهيدرات: احسب محتوى الكربوهيدرات باتباع الخطوات 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. احسب محتوى الكربوهيدرات المتاحة (باستثناء الألياف) بفارق العوامل المحددة مسبقا لكل 100 غرام ، باستخدام المعادلة التالية ، وفقا لمنظمة الأغذية والزراعة (الفاو ؛ 2003) 31
        figure-protocol-5
      37. عبر عن النتائج بالجرام لكل 100 جم.
      38. محتوى الرطوبة والرماد: قدر محتويات الرطوبة والرماد باتباع الخطوات 8-1-3-39-8-1-3-45.
      39. احتضان البوتقات الخزفية لمدة 3 ساعات عند 105 درجة مئوية ، قم بتبريدها في مجفف ووزنها.
      40. قم بوزن 10 جم من العينة في البوتقة وضعها في فرن تجفيف على حرارة 105 درجة مئوية لمدة 3 ساعات حتى لا تختلف القيم من الأوزان المتتالية بأكثر من 10 مجم.
      41. احسب محتوى الرطوبة ، معبرا عنه ب g لكل 100 جم من fw ، باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-6
        حيث W1 هو وزن البوتقة الفارغة ، W2 هو وزن البوتقة مع العينة الطازجة ، و W3 هو وزن البوتقة مع العينة المجففة.
      42. بعد فحص محتوى الرطوبة ، ضع البوتقات مع العينات المجففة في محرقة عند 525 درجة مئويةلمدة 4 ساعات.
      43. كرر هذا الإجراء حتى لا تختلف الأوزان المتتالية بأكثر من 1 ملغ.
      44. قم بتبريد العينات إلى RT في مجفف ثم قم بوزنها.
      45. احسب محتوى الرماد ، معبرا عنه ب g لكل 100 جم من fw ، باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-7
        حيث W1 هو وزن البوتقة الفارغة ، W2 هو وزن البوتقة مع عينة جديدة ، W3 هو وزن البوتقة بالوزن.
      46. قيمة الطاقة: احسب قيمة الطاقة باتباع الخطوات 8.1.3.47-8.1.3.48.
      47. احسب القيمة النشطة للعينات وفقا للائحة الاتحاد الأوروبي:توفير المعلومات الغذائية للمستهلكين (اللائحة 1169/2011)32 ، باستخدام المعادلات:
        الطاقة (كيلو كالوري / 100 جم) = 4 × (جم بروتينات) + 4 × (جم كربوهيدرات) + 9 × (جم دهون) + 2 × (جم ألياف)
        الطاقة (كيلوجول / 100 جم) = 17 × (جم بروتينات) + 17 × (جم كربوهيدرات) + 37 × (جم دهون) + 8 × (جم ألياف)
      48. عبر عن النتائج بالكيلوسعرات حرارية لكل 100 جرام وكيلو جول لكل 100 جرام.
    4. قبول المستهلك
      1. تقييم قبول المستهلك باستخدام عينات المعكرونة المطبوخة في الماء المقطر لمدة 8 دقائق.
      2. إجراء اختبار قبول المستهلك: تقييم المظهر المرئي واللون والملمس والرائحة وطعم البحر والذوق العام والتقييم العام ونية الشراء للعينات.
        ملاحظة: يعتمد اختبار قبول المستهلك على اختبارات المتعة التي تقيم المظهر المرئي واللون والملمس والرائحة وطعم البحر والذوق العام والتقييم العام ونية الشراء على مقياس من 1-9 ، حيث 1 هو تقييم ضعيف ، و 9 هو تقييم جيد جدا.
      3. إجراء الاختبارات الحسية في المقصورات الحسية الفردية في مختبر التحليل الحسي (مع التحكم في درجة الحرارة والإضاءة). توفير أدوات المائدة والمناديل وأكواب زجاجية من المياه المعدنية لتنظيف الحنك بين العينات.
        ملاحظة: تتراوح أعمار المتذوقين بين 16 و 64 عاما من جميع الخلفيات (عدد > 80).
  2. زبادي
    1. استخراج الصباغ
      ملاحظة: قم بإجراء استخراج الصباغ من خلال المنهجية الموضحة في Pereira et al. (2020) 18.
      1. تحضير مذيب الاستخراج ، المخزن المؤقت فوسفات الصوديوم عند 0.1 متر ، مع فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (0.03 م) وفوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (0.07 م). اضبط الأس الهيدروجيني على الرقم الهيدروجيني 6.8 باستخدام NaOH أو HCl.
      2. تزن 1 غرام من G. gracilis وتضاف 50 مل من محلول فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 6.8). تجانس لمدة 10 دقائق ، تليها 10 دقائق من النقع مع هاون ومدقة.
      3. انقل المحلول إلى أنبوب وجهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 12298 × جم (4 درجات مئوية).
      4. تجمع الطافع وإضافة ببطء 65 ٪ كبريتات الأمونيوم. عندما تذوب كل كبريتات الأمونيوم, قم بتغطية المحلول بورقة الألومنيوم واتركه ليترسب عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
        تنبيه: انظر ورقة بيانات السلامة من كبريتات الأمونيوم تسليمها من قبل المورد.
      5. أجهزة الطرد المركزي الراسب لمدة 20 دقيقة عند 12298 × جم (4 درجات مئوية). استعادة بيليه وتذوب في الماء المقطر (حوالي 5 مل).
      6. قم بإجراء غسيل الكلى للمستخلص باستخدام غشاء أنبوب (14 كيلو دالتون) ضد الماء لمدة 24 ساعة ، يليه التجفيف بالتجميد. قم بتخزين المستخلص المجفف بالتجميد المحمي من الضوء على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد الزبادي
      1. تحضير الزبادي الطبيعي عن طريق خلط 1 لتر من الحليب المبستر ، 120 غرام من اللبن الطبيعي ، 20 غرام من السكر ، و 50 غرام من مسحوق الحليب في خلاط حراري لمدة 5 دقائق ، 50 درجة مئوية ، السرعة 3.
      2. ضع الخليط في جرة الخلاط الحراري في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
      3. دمج المستخلص عن طريق مزجه في اللبن بتركيز 0.21٪. قم بتخزين العينات في قوارير زجاجية فردية عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
      4. قم بتخزين الأجزاء الفردية من الزبادي بدون صبغة (تحكم) عند 4 درجات مئوية حتى التحليل.
    3. استقرار اللون
      ملاحظة: تقييم استقرار الصبغة في الزبادي من خلال تحليل اللون لمدة 12 يوما. قم بإجراء تحليل الألوان باستخدام مقياس ألوان الانعكاس ، باستخدام مراقب قياسي 2 درجة ، وإضاءة D65. يتم عرض النتائج كإحداثيات CIELab مع معلمات L (خفة ، أسود - أبيض ، 0 - 100) ، a * (أخضر - أحمر ، -60 - 60) ، و b * (أزرق - أصفر ، -60 - 60). تحتوي المعلمة a* على قيم موجبة للألوان المحمرة وقيم سالبة للألوان الخضراء. تأخذ المعلمة b* قيما موجبة للألوان الصفراء وقيما سالبة للألوان المزرقة. L * هي معلمة اللمعان ، وهي الخاصية التي يمكن بموجبها اعتبار كل لون مكافئا لعضو في التدرج الرمادي بين الأسود والأبيض33.
      1. قم بمعايرة مقياس الألوان باستخدام لوحة خزفية بيضاء (L * 88.5 ، a * 0.32 ، b * 0.33) مقدمة من الشركة المصنعة.
      2. املأ خلية بحوالي 28 جم من العينة (أو عنصر التحكم) وحلل اللون باستخدام برنامج تحليل بيانات الألوان.
        ملاحظة: كان البرنامج المستخدم لتحليل بيانات الألوان هو SpectraMagic NX.
      3. أداء القراءات 5 مرات في ثلاث نسخ عينة / مراقبة.
    4. التحليل الحسي
      ملاحظة: قم بإجراء تقييم حسي للزبادي مع دمج الصباغ باستخدام اختبار المثلث (ISO 4120 ، 2004) 34 وتقييم المتعة للون والطعم والتقدير العام.
      1. بالنسبة لاختبار المثلث ، أعط أعضاء اللجنة ثلاث عينات (عينة واحدة من الزبادي مع الصباغ وعينتين من التحكم ، أو عينتين من الزبادي مع الصباغ وعنصر تحكم واحد) واطلب منهم اختيار عينة مختلفة بناء على الرائحة والملمس والطعم. تقديم عينات في أحجام مماثلة محددة برموز عشوائية مكونة من 3 أرقام.
      2. لتقييم المتعة للزبادي مع الصباغ ، أعط أعضاء اللجنة عينة من الزبادي مع الصباغ واطلب منهم تقييم اللون والطعم والتقدير العام باستخدام مقياس المتعة المكون من 9 نقاط (من الكراهية الشديدة إلى الإعجاب الشديد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نشاط مضادات الميكروبات

عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه كلما ارتفعت نسبة التثبيط ، زادت فعالية المستخلص في تثبيط نمو تلك السلالة المحددة ، وبالتالي ، كلما كان المستخلص أكثر إثارة للاهتمام كمضاد للميكروبات. من خلال هذه المنهجية ، يمكننا تحديد المستخلصات التي لها نشاط أكبر على سلالات بكتيرية معينة بسرعة ، وكذلك تحديد الأكثر إثارة للاهتمام من حيث الاستخدام في المستقبل. وبالتالي ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تستخدم اختبارات النشاط المضاد للميكروبات في وسط سائل لتقييم فعالية المواد المضادة للميكروبات ضد الكائنات الحية الدقيقة المعلقة في وسط سائل وعادة ما يتم إجراؤها لتحديد قدرة المادة على تثبيط النمو أو قتل الكائنات الحية الدقيقة35،36،37،38. يتم استخدامها لتقييم حساسية الكائنات الحية الدقيقة للعوامل المضادة للميكروبات ويتم إجراؤها في أنابيب الاختبار أو ألواح المعايرة الدقيقة ، حيث يتم اختبار تركيزات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (FCT) من خلال المشاريع الاستراتيجية الممنوحة لمركز MARE-Marine Sciences and Environmental (UIDP / 04292/2020 و UIDB / 04292/2020) ، والمختبر المعاون ARNET (LA / P / 0069/2020). مولت FCT أيضا منح الدكتوراه الفردية الممنوحة لمارتا ف. فريتاس (UI / BD / 150957 / 2021) وتاتيانا بيريرا (2021. 07791. دينار بحريني). تم دعم هذا العمل أيضا ماليا من قبل مشروع HP4A - المعكرونة الصحية للجميع (الترويج المشترك رقم 039952) ، بتمويل مشترك من ERDF - الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية ، في إطار برنامج البرتغال 2020 ، من خلال COMPETE 2020 - البرنامج التشغيلي للتنافسية والتدويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الإيثانول المطلقAga ، البرتغال64-17-5
كلوريد الأمونيومPanReac12125-02-9
الأمفوتريسين بسيجما-ألدريتش1397-89-3
ميزان المقياس التحليليSartorius ، TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizenii < / em >المجموعة الألمانية من الكائنات الحية الدقيقة و مزارع الخلايا (DSMZ)DSM 347
BiotinPanreac AppliChem58-85-5
أجهزة الطرد المركزيEppendorf ، 5810R5811JH490481
ChloramphenicolPanReac56-75-7
CO2< / sub> ChamberMemmertN / A
مصابيح الفلورسنت البيضاءالباردة OSRAM Lumilux SkywhiteN / A
مقياس الكثافة McFarlandGrant InstrumentsN / A
DMEM متوسطSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma ، شتاينهايم ، ألمانيا1898-66-4
الإشريكية القولونية (DSM 5922) < / em>المجموعة الألمانية للكائنات الحية الدقيقة ومزارع الخلايا (DSMZ)DSM5922
الإيثانول 96٪AGA-Portugal64-17-5
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم (Na2EDTA) جيتي بيكر6381-92-6
مصل الأبقار الجنيني (FBS) ورقسيجما ألدريتشF7524
(واتمان رقم 1) قواريرواتمانWHA1001320
VWR الدولية ، الكابيديتشي ، البرتغال N / A
Folin-CiocalteuVWR Chemicals31360.264
حمض الغاليك  Merck149-91-7
أكسيد الجرمانيوم (IV) ، 99.999٪AlfaAesar1310-53-8
خلايا HaCaT – 300493CLS-Cell Lines Services ، ألمانيا & nbsp ؛300493
المحرك المغناطيسي للوحة الساخنةIKA ، C-MAG HS706.090564
كبريتات الحديدVWR كيماويات10124-49-9
غطاء محرك السيارة التدفق الصفحيTelStar ، البرتغال526013
LB Medium   ؛VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarum< / em>المجموعة الألمانية للكائنات الحية الدقيقة ومزارع الخلايا (DSMZ)  DSM 21597
كلوريد المنغنيزVWR للكيماويات7773.01.5
الماصات الدقيقة  Eppendorf ، البرتغالN / A
MicroplatesVWR International ، Alcabideche ، البرتغال   ؛10861-666
MicroplatesGreiner738-0168
Microplates (معقمة)قارئ Microplate10022403
Scientific   مقياس الطيف الضوئي الدقيق Epoch ، BioTek ، فيرمونت ، الولايات المتحدة الأمريكية1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)VWR Chemicals90004-658
فرنالموثق ، FD11512-04490
فرنالموثق ، BD11504-62615
البنسلينسيجما ألدريتش1406-05-9
مقياس الأس الهيدروجيني Inolab  VWR International, Alcabideche, Portugal 15212099
نصائح PippeteEppendorf ، البرتغال5412307
Pyrex Bottles Media Storage  VWR International, Alcabideche, Portugal 16157-169
المبخر الدوارهايدولف ، لابوروتا 400080409287
بخارالروتابوور IKA HB10 ، VWR International ، Alcabideche ، البرتغال07.524254
كربونات الصوديوم (Na2< / sub>CO3< / sub>)Chem-Lab497-19-8
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)  نورماكس كيم7647-14-5
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةRiedel-de Ha & euml; ن7558-79-4
SpectraMagic NXكونيكا مينولتا ، اليابانبرنامج تحليل البيانات الملونة
مقياس الطيفEvolution 201 ، Thermo Scientific ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية5A4T092004
StreptomycinSigma-Aldrich57-92-1
ThiaminePanreac AppliChem59-43-8
Trypsin-EDTAسيجما ألدريتشT4049
تريبتيك فول الصويا أجار (TSA) VWRللكيماوياتICNA091010617
مرق الصويا Tryptic (TSB)  VWR Chemicals22091
مياه فائقة النقاء  مختبر Advantage A10 Milli-Q ، ميرك ، دارمشتات ، ألمانياF5HA17360B
مضخة فراغبوتشي ، سويسراFIS05-402-103
فيتامين ب 12ميرك68-19-9
ترشيح Fisher الضوئي

المراجع

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562(2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516(2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81(2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492(2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822(2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769(2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688(2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611(2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482(2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427(2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068(2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364(2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642(2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380(2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431(2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخلاص الطحالب البحريةالمركبات النشطة بيولوجياًالنشاط المضاد للأكسدةمقايسة السمية الخلويةالتحليل الحسيملف الأحماض الدهنيةتدعيم الأغذية
تثمين الأعشاب البحرية الحمراء Gracilaria gracilis من خلال نهج التكرير الحيوي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.