تنتج الزائفة الزنجارية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي للرامنوليبيد. يكتشف كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ويحدد نسبة الدهون الأحادية والثنائية التي تنتجها كل سلالة. يتضمن القياس الكمي لإجمالي الرامنوليبيدات تقييم مكافئات الرامنوز الموجودة في هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من المواد الطافية المستزرعة باستخدام طريقة الأورسينول.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن وقياس الدهون الأحادية والدهون الثنائية التي تنتجها الزائفة الزنجارية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البكتيريا البيئية Pseudomonas aeruginosa هي مسببات الأمراض الانتهازية مع مقاومة عالية للمضادات الحيوية التي تمثل خطرا على الصحة. تنتج هذه البكتيريا مستويات عالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المعروفة باسم rhamnolipids (RL) ، وهي جزيئات ذات قيمة تقنية حيوية كبيرة ولكنها مرتبطة أيضا بسمات الفوعة. وفي هذا الصدد، قد يكون الكشف عن الرخصة وتحديدها كميا مفيدا لكل من تطبيقات التكنولوجيا الأحيائية ومشاريع البحوث الطبية الحيوية. في هذه المقالة ، نوضح خطوة بخطوة تقنية الكشف عن إنتاج شكلين من RL التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC): أحادي الرامنوليبيد (mRL) ، والجزيئات المكونة من ديمر من الأحماض الدهنية (بشكل رئيسي C10-C10) مرتبطة بجزء واحد من rhamnose ، و di-rhamnolipids (dRL) ، وهي جزيئات تتكون من ثنائي حمض دهني مماثل مرتبط بشقين من rhamnose. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم طريقة لقياس الكمية الإجمالية ل RL بناء على التحلل المائي الحمضي لهذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من طاف ثقافة P. aeruginosa والكشف اللاحق عن تركيز الرامنوز الذي يتفاعل مع الأورسينول. يمكن استخدام الجمع بين كلتا التقنيتين لتقدير التركيز التقريبي ل mRL و dRL الناتج عن سلالة معينة ، كما هو موضح هنا مع سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلو 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3).
المقدمة
Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا بيئية وممرض انتهازي يثير قلقا كبيرا بسبب إنتاجها للسمات المرتبطة بالفوعة ومقاومتها العاليةللمضادات الحيوية 1,2. المستقلب الثانوي المميز الذي تنتجه هذه البكتيريا هو RL الفاعل بالسطح الحيوي ، والذي يتم إنتاجه بطريقة منسقة مع العديد من السمات المرتبطة بالفوعة مثل فينازين بيوسيانين ، وهو مضاد حيوي له نشاط الأكسدة والاختزال ، والإيلاستاز البروتياز3. تم استغلال خصائص الشد النشط والاستحلاب ل RL في تطبيقات صناعية مختلفة ويتم تسويقها حاليا4.
تنتج معظم سلالات P. aeruginosa....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تخطيط هذا الإجراء في الشكل التكميلي 1. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.
1. الكشف عن mRL و dRL في طافات ثقافة P. aeruginosa باستخدام TLC
- ابدأ بمرق الطرد المركزي لسلالة P. aeruginosa ذات الأهمية ، المزروعة في وسط سائل لمدة 24 ساعة (للوصول إلى المرحلة الثابتة من النمو حيث يتم إنتاج RL). عادة ، تحتوي هذه الثقافات على 1 × 109 بكتيريا لكل مل.
- اضبط الرقم الهيدروجيني للثقافة على 2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.
- ضع 5 مل من طاف الثقافة المحمض في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذه المقالة ، تم استخدام ثلاث سلالات مختلفة من نوع P. aeruginosa لتمثيل ثلاث مجموعات فيلو ، لكل منها مستويات إنتاج RL مختلفة ونسب mRL و dRL. تشمل هذه السلالات PAO1 (عزل الجرح من أستراليا ، 195522) ، PA14 (عزل نباتي من الولايات المتحدة الأمريكية ، 197723) ، و PA7 (عزل سريري من الأرجنتين ، 201024). كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام متحولة PAO1 rhlA ، وهي غير قادرة على إنتاج RL. تمت زراعة جميع السلالات لمدة 24 ساعة في وسط PPGAS ، المصممة خصيصا لت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الأكثر دقة للكشف عن RL وقياسه هي HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS)7،8،27 ؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة قد لا تكون في متناول العديد من الباحثين. يمكن إجراء الطرق الموصوفة هنا بشكل روتيني باستخدام المواد والمعدات المختبرية الأساسية للكشف عن تركيزات RL وتقديرها ، ولكن لها بعض القيود ، لا سيما عدم دقتها في تحديد مخاليط mRL و dRL. علاوة على ذلك ، يجب تنفيذ إعداد العينة المستخدمة في القياس الكمي ل RL بعناية. لا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
يتم دعم مختبر GSCh جزئيا من خلال منحة IN201222 من برنامج دعم ومشاريع البحث والابتكار التكنولوجي (PAPIIT) ، المديرية العامة ل Asuntos del Personal Académico - UNAM.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1-NAPHTHOL | SIGMA-ALDRICH | 70442 | |
| حمض الأسيتيك | جي تي بيكر | 9508-02 | |
| الطرد | لأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل و   50 مل | ||
| كلوروفورم | جي تي بيكر | 9180-02 | |
| فرن | |||
| الأثير | جي تي بيكر | 9244-02 | |
| ماصة زجاجية | سيجما ألدريتش | ||
| حمض الهيدروكلوريك | جي تي بيكر | 5622-02 | |
| رطل | |||
| L-RHAMNOSE مونوهيدرات | سيجما-ألدريتش | R-3875 | |
| ميثانول | جي تي بيكر | 9049-02 | |
| أورسينول مونوهيدرات | سيجما-ألدريتش | O1875 | |
| مرق | تريس هيدروكلوريك (0.12 م) ، كلوريد البوتاسيوم (0.02 م) كلوريد الأمونيوم (0.02 م) ، ؛ الببتون (1٪) ، درجة الحموضة 7.4 ؛ تعقيم. إضافة الجلوكوز (5٪) وكبريتات المغنيسيوم (0.0016 م) خلية | ||
| الكوارتز (كوفيت) | سيجما ألدريتش | Z276669 | |
| مستطيل TLC تطوير دبابة | فيشر K4161801020 علمية | ||
| رامنوليبيدات & nbsp ؛ | سيجما ألدريتش | R-90 | |
| مقياس | الضوئي مقابل | ||
| البخاخ | سيجما ألدريتش | Z529710-1EA | |
| حمض الكبريتيك | جي تي بيكر | 9681-02 | |
| TES أنابيب 5 مل | كورنينج | 352002 | |
| TLC هلام السيليكا 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| حمام | مائي | > 80 درجة ؛ ج |
المراجع
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
