مقالة منهجية

الكشف عن وقياس الدهون الأحادية والدهون الثنائية التي تنتجها الزائفة الزنجارية

DOI:

10.3791/65934

⸱

مارس 29, 2024

 ,  , 
1Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Infectología e Inmunología, Instituto Nacional de Perinatología

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتج الزائفة الزنجارية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي للرامنوليبيد. يكتشف كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ويحدد نسبة الدهون الأحادية والثنائية التي تنتجها كل سلالة. يتضمن القياس الكمي لإجمالي الرامنوليبيدات تقييم مكافئات الرامنوز الموجودة في هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من المواد الطافية المستزرعة باستخدام طريقة الأورسينول.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا البيئية Pseudomonas aeruginosa هي مسببات الأمراض الانتهازية مع مقاومة عالية للمضادات الحيوية التي تمثل خطرا على الصحة. تنتج هذه البكتيريا مستويات عالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المعروفة باسم rhamnolipids (RL) ، وهي جزيئات ذات قيمة تقنية حيوية كبيرة ولكنها مرتبطة أيضا بسمات الفوعة. وفي هذا الصدد، قد يكون الكشف عن الرخصة وتحديدها كميا مفيدا لكل من تطبيقات التكنولوجيا الأحيائية ومشاريع البحوث الطبية الحيوية. في هذه المقالة ، نوضح خطوة بخطوة تقنية الكشف عن إنتاج شكلين من RL التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC): أحادي الرامنوليبيد (mRL) ، والجزيئات المكونة من ديمر من الأحماض الدهنية (بشكل رئيسي C10-C10) مرتبطة بجزء واحد من rhamnose ، و di-rhamnolipids (dRL) ، وهي جزيئات تتكون من ثنائي حمض دهني مماثل مرتبط بشقين من rhamnose. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم طريقة لقياس الكمية الإجمالية ل RL بناء على التحلل المائي الحمضي لهذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من طاف ثقافة P. aeruginosa والكشف اللاحق عن تركيز الرامنوز الذي يتفاعل مع الأورسينول. يمكن استخدام الجمع بين كلتا التقنيتين لتقدير التركيز التقريبي ل mRL و dRL الناتج عن سلالة معينة ، كما هو موضح هنا مع سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلو 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا بيئية وممرض انتهازي يثير قلقا كبيرا بسبب إنتاجها للسمات المرتبطة بالفوعة ومقاومتها العاليةللمضادات الحيوية 1,2. المستقلب الثانوي المميز الذي تنتجه هذه البكتيريا هو RL الفاعل بالسطح الحيوي ، والذي يتم إنتاجه بطريقة منسقة مع العديد من السمات المرتبطة بالفوعة مثل فينازين بيوسيانين ، وهو مضاد حيوي له نشاط الأكسدة والاختزال ، والإيلاستاز البروتياز3. تم استغلال خصائص الشد النشط والاستحلاب ل RL في تطبيقات صناعية مختلفة ويتم تسويقها حاليا4.

تنتج معظم سلالات P. aeruginosa ، التي تنتمي إلى المجموعتين 1 و 2 ، نوعين من RL: mRL ، والذي يتكون من جزء واحد من rhamnose مرتبط بحمض دهني ثنائي بشكل أساسي من 10 ذرات كربون ، و dRL ، الذي يحتوي على جزء رامنوز إضافي مرتبط بالرامنوزالأول 4 (انظر الشكل 1). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن أن مجموعتين صغيرتين من P. aeruginosa (المجموعتان 3 و 5) تنتجان فقطmRL 5,6. يحتوي نوعان من RL على خليط من دايمرات الأحماض الدهنية ، والتي ، كما ذكرنا ، هي C10-C10 بشكل أساسي ، ولكن يتم أيضا إنتاج نسب أصغر من الجزيئات التي تحتوي على ثنائيات C12-C10 و C12-C12 و C10-C12: 1. تم الإبلاغ عن توصيف متجانسات RL التي تنتجها سلالات مختلفة باستخدام HPLC MS / MS 7,8. يمكن للطرق الموصوفة في هذا العمل أن تفرق فقط بين mRL و dRL ولكن لا يمكن استخدامها لتوصيف متجانسات RL.

P. aeruginosa وبعض أنواع Burkholderia هي منتجة طبيعية ل RL9 ، لكن البكتيريا السابقة هي المنتج الأكثر كفاءة. ومع ذلك ، يتم إنتاج RL المستخدم تجاريا حاليا في مشتقات Pseudomonas putida KT2440 التي تعبر عن جينات P. aeruginosa لتجنب استخدام هذا العامل الممرض الانتهازي10,11. إن الكشف عن RL التي تنتجها P. aeruginosa وقياسها الكمي لهما أهمية كبيرة لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التعبير عن السمات المرتبطة بالفوعة12 ، وفي توصيف السلالات التي تنتمي إلى clades 3 أو 513 ، ولبناء مشتقات P. aeruginosa التي تفرط في إنتاج هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي مع تقليل الفوعة14. تم الكشف عن إنتاج المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بواسطة الكائنات الحية الدقيقة المختلفة بناء على بعض الخصائص العامة لهذه المركبات ، مثل طريقة إسقاط الانهيار أو مؤشر الاستحلاب15 ، ولكن هذه الطرق ليست دقيقة ولا محددة16.

هنا ، نصف بروتوكول الكشف عن mRL و dRL باستخدام الاستخلاص السائل لإجمالي RL من طافات الاستزراع لمختلف سلالات P. aeruginosa وفصل كلا النوعين من RL باستخدام TLC. في هذه الطريقة ، يتم فصل RL المستخرج من طافي الاستزراع عن طريق قابليتها للذوبان التفاضلي في المذيبات المستخدمة في TLC ، مما يتسبب في الهجرة التفاضلية على لوحة هلام السيليكا. وبالتالي ، فإن mRL لها هجرة أسرع من dRL ، ويمكن اكتشافها كبقع منفصلة عندما يتم تجفيف الألواح وتلطيخها ب α-naphthol.

تعتمد الطريقة الموضحة هنا للكشف عن mRL و dRL بواسطة TLC على مقالة منشورة مسبقا17 ، وهي سهلة الأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن. كانت هذه الطريقة مفيدة للكشف عن RL في مختلف عزلات P. aeruginosa 13 باستخدام الضوابط المناسبة ، مثل طفرة مشتقة من P. aeruginosa غير قادرة على إنتاج RL. ومع ذلك ، فهي ليست الطريقة المفضلة لتوصيف المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي الجديدة التي تنتجها بكتيريا أخرى غير Pseudomonas aeruginosa بسبب افتقارها إلى الخصوصية.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة لتحديد مكافئات rhamnose لإجمالي RL المستخرج من طاف P. aeruginosa . تحدد هذه الطريقة كمية هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي بناء على تفاعل الأورسينول مع السكريات المختزلة ، مما ينتج عنه منتج يمكن قياسه طيفيا عند 421 نانومتر ، كما هو موضح سابقا18. نظرا لأن التفاعل مع الأورسينول ليس خاصا بالرامنوز ، فمن المهم إجراء هذه الطريقة باستخدام RL المستخرج من طاف الثقافة الذي لا يحتوي على كميات كبيرة من الجزيئات الأخرى المحتوية على السكر ، مثل عديدات السكاريد الدهنية (LPS). يتم استخدام خليط الكلوروفورم / الميثانول المحمض هنا لاستخراج السائل من RL18 ، ولكن يمكن أيضا استخدام أسيتات الإيثيل ، واستخراج الطور الصلب (SPE) يعطي نتائج جيدة جدا19. لا تتطلب طريقة الأورسينول الموصوفة هنا معدات متطورة ويمكن أن توفر نتائج موثوقة إذا تم إجراؤها بعناية خاصة في إعداد العينات التي تم تحليلها ، كما تمت مناقشته. لضمان التحضير السليم للعينة ، من المهم تضمين طفرة Pseudomonas aeruginosa rhlA غير قادرة على إنتاج RL20 وإجراء ثلاث نسخ بيولوجية وثلاث نسخ تقنية لكل تحديد.

كان هناك جدل كبير في الأدبيات16،21فيما يتعلق بتحديد RL بواسطة طريقة orcinol ، مع بعض الدراسات التي تشير إلى أن إنتاج RL مبالغ فيه وأن الفحص يفتقر إلى خصوصية الرامنوز ، مما قد يكشف عن السكريات الأخرى. ومع ذلك ، فإننا نوضح هنا أن الطرق الموصوفة يمكن أن تكون دقيقة ومحددة في ظل الظروف المناسبة. علاوة على ذلك ، للمقارنة مع الإجراءات الموضحة في هذه المقالة ، نستخدم اكتشاف UPLC-MS / MS لمعيار dRL ونثبت أنه يتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام طريقة orcinol. ويرد البروتوكول المفصل لقياس RL كميا باستخدام هذه الطريقة في الملف التكميلي 1.

يتم تمثيل هذه البروتوكولات باستخدام سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلوغروب 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3). تم اختيار هذه السلالات لأنها تتميز بشكل جيد وتنتج ملفات تعريف RL مختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تخطيط هذا الإجراء في الشكل التكميلي 1. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. الكشف عن mRL و dRL في طافات ثقافة P. aeruginosa باستخدام TLC

  1. ابدأ بمرق الطرد المركزي لسلالة P. aeruginosa ذات الأهمية ، المزروعة في وسط سائل لمدة 24 ساعة (للوصول إلى المرحلة الثابتة من النمو حيث يتم إنتاج RL). عادة ، تحتوي هذه الثقافات على 1 × 109 بكتيريا لكل مل.
  2. اضبط الرقم الهيدروجيني للثقافة على 2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.
  3. ضع 5 مل من طاف الثقافة المحمض في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل وأضف 5 مل من الكلوروفورم 2: 1: خليط الميثانول.
  4. حرك الأنبوب عن طريق الانقلاب ثلاث مرات ، في كل مرة لمدة 10 ثوان ، واترك الأنبوب بدون انعكاس لمدة 2 دقيقة بين كل تحريض.
  5. اترك الأنبوب دون تحريكه لمدة 3 ساعات تقريبا حتى يتم فصل المرحلتين ، أو قم بطرد الأنبوب لمدة 10 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية.
  6. انقل المرحلة العضوية (الطبقة السفلية) إلى أنبوب نظيف واترك الأنبوب في شفاط استخراج حتى يحدث الجفاف.
  7. كرر العملية بدءا من الخطوة 1.3 ، ووضع المرحلة العضوية من الكلوروفورم الثاني: استخراج الميثانول ، في الأنبوب الذي تم استخدامه في الاستخراج الأول.
  8. تبخر المرحلة العضوية حتى يتبقى 1 مل أو 1.5 مل. انقل هذا الحجم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وتبخر المذيب حتى يجف طوال الليل.
  9. أضف 50 ميكرولتر من الميثانول إلى الأنبوب المجفف لإعادة تعليق RL.
  10. أداء كروماتوغرافيا طبقة رقيقة على لوحات هلام السيليكا.
    ملاحظة: يجب قطع حجم لوحة TLC وفقا لعدد العينات التي سيتم تحليلها. يجب تطبيق كل عينة على ارتفاع 1.5 سم ، ويجب أن تكون نقطة التطبيق 1 سم من حافة اللوحة (ارسم خطا أفقيا بقلم رصاص).
  11. ضع 5 ميكرولتر من كل عينة باستخدام ماصة دقيقة 10 ميكرولتر.
  12. يتكون الطور السائل TLC من خليط 65: 15: 2 من الكلوروفورم: الميثانول: حمض الخليك. لتحضير 35 mL من هذا الخليط، اخلطي 26 mL من الكلوروفورم، و6 mL من الميثانول، و0.8 mL من محلول مخزون 20٪ من حمض الأسيتيك. امزج هذه المذيبات وضعها في غرفة TLC المغلقة لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء الكروماتوغرافيا ، بحيث يكون الجو مشبعا بالمذيبات المتطايرة.
  13. ضع لوحة TLC في الغرفة ، وتجنب ملامسة النقطة التي تم فيها تطبيق العينات.
  14. أغلق الحجرة واترك TLC حتى يصل المذيب إلى 1 سم قبل حافة اللوحة. في هذه المرحلة ، قم بإزالة اللوحة واتركها تجف (يمكن تطبيق تدفق الهواء لتسريع العملية).
  15. تحضير محلول α-النفثول عن طريق إذابة 5 غرام من هذا المركب في 33 مل من الإيثانول. بمجرد إذابته ، أضف 127.5 مل من الإيثانول ، و 12.6 مل من الماء ، و 20.5 مل من H2SO4 الباردة.
  16. للكشف عن وجود mRL و dRL ، رش محلول α-naphthol على اللوحة في شفاط الاستخراج وضع اللوحة التي تم رشها في فرن على حرارة 85 درجة مئوية لعدة دقائق حتى تظهر العلامة الوردية ل RL.
  17. استخدم صورة TLC لحساب نسبة أحادي وثنائي RL الموجودة في كل عينة باستخدام برنامج يكتشف كثافة كل بقعة.

2. القياس الكمي للكمية الإجمالية ل RL التي تقيس مكافئات rhamnose الموجودة في الفاعل بالسطح الحيوي

  1. ضع 1.2 مل من مزرعة الطور الثابت (نمت لمدة 24 ساعة) في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. جمع طاف في أنبوب نظيف.
  2. انقل 333 ميكرولتر إلى أنبوب نظيف (نفذ هذه الخطوة في ثلاث نسخ) وأضف 1 مل من الأثير.
  3. مزيج بقوة في دوامة لمدة 30 ثانية. كرر هذا الإجراء مع أنبوب واحد في كل مرة.
  4. جهاز طرد مركزي لمدة 2 دقيقة عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية. اجمع المرحلة العضوية (المرحلة العليا) ، وانقلها إلى أنبوب نظيف ، واتركها مفتوحة في غطاء الاستخراج حتى يحدث الجفاف.
  5. كرر الاستخراج باستخدام الأثير كما هو موضح في الخطوة 2.2. كرر الخطوتين 2.3 و2.4.
  6. بمجرد أن يجف تماما ، أضف 1 مل من الماء إلى كل أنبوب. اترك الأنابيب لمدة 12 ساعة للسماح ل RL بالترطيب ، ثم قم بتحريكها بقوة في الدوامة.
  7. ضع قارورة نظيفة في الثلج لمدة 5 دقائق (لأنها تفاعل طارد للحرارة). تحضير محلول 60٪ H2SO4 (حماية القارورة من الضوء).
  8. في أنبوب نظيف ، قم بإعداد محلول أورسينول بنسبة 1.6٪ في الماء المقطر. لتحضير كاشف الأورسينول ، امزج 4.4 مل من محلول 60٪ H2SO4 مع 0.6 مل من محلول الأورسينول 1.6٪.
  9. احسب الحجم النهائي لكاشف الأورسينول المطلوب. أضف 900 ميكرولتر من هذا الكاشف إلى كل عينة وإلى كل تركيز من منحنى المعايرة ، باستخدام تركيزات مختلفة من الرامنوز (عادة ، يتم استخدام 9 تركيزات من الرامنوز في نطاق 1 ميكروغرام / مل إلى 9 ميكروغرام / مل) ، وواحد مع 100 ميكرولتر من الماء ، مما يضمن إجراء كل ذلك في ثلاث نسخ.
  10. أضف 100 ميكرولتر من كل عينة RL إلى 900 ميكرولتر من كاشف الأورسينول في أنبوب زجاجي واخلط المحلولين.
  11. احتضان لمدة 30 دقيقة في حمام مائي محمى على حرارة 80 درجة مئوية.
  12. اترك الأنابيب لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  13. اقرأ امتصاص العينات ومنحنى المعايرة عند 421 نانومتر باستخدام خلية كوارتز.
  14. احسب تركيز الرامنوز في كل عينة عن طريق استيفاء الامتصاص على منحنى المعايرة والنظر في الحجم المستخدم للتحديد.
  15. لحساب تركيز ميكرومتر ، اقسم التركيز الذي تم الحصول عليه في ميكروغرام / مل على 182.2 (الوزن الجزيئي للرامنوز) واضربه في 1000.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، تم استخدام ثلاث سلالات مختلفة من نوع P. aeruginosa لتمثيل ثلاث مجموعات فيلو ، لكل منها مستويات إنتاج RL مختلفة ونسب mRL و dRL. تشمل هذه السلالات PAO1 (عزل الجرح من أستراليا ، 195522) ، PA14 (عزل نباتي من الولايات المتحدة الأمريكية ، 197723) ، و PA7 (عزل سريري من الأرجنتين ، 201024). كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام متحولة PAO1 rhlA ، وهي غير قادرة على إنتاج RL. تمت زراعة جميع السلالات لمدة 24 ساعة في وسط PPGAS ، المصممة خصيصا لتعزيز مستويات RL العالية25 ، عند 37 درجة مئوية. تم تلقيح مزارع PPGAS بكثافة بصرية تبلغ 0.05 عند 600 نانومتر باستخدام متوسط LB26 بين عشية وضحاها. عادة ، تحقق سلالات P. aeruginosa كثافة بصرية تبلغ 2 تقاس عند 600 نانومتر في وسط PPGAS بعد 24 ساعة ، وهو ما يتوافق تقريبا مع 1 × 109 بكتيريا لكل مل. لجمع طافات الاستزراع للكشف عن RL وقياسها ، تم طرد المستنبتات بالطرد المركزي عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتم التخلص من حبيبات الخلية. توضح النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هاتين الطريقتين (الشكل 2 والشكل 3) أن كلا من أنواع RL التي تنتجها كل سلالة وكمية إنتاجها تختلف بين السلالات الثلاث التي تم تحليلها. كما هو موضح في الشكل 2 ، ينتج PAO1 حوالي 30٪ mRL و 70٪ dRL ، بينما ينتج PA14 نسبة متساوية من 50٪ mRL و 50٪ dRL ، وينتج PA7 حصريا mRL. يتوافق ملف تعريف إنتاج RL هذا مع التقارير السابقة 12,14.

يوضح الشكل 3A كمية مكافئات الرامنوز الموجودة في RL التي ينتجها كل نوع من هذه الأنواع الثلاثة من السلالات. من كميات الرامنوز المكتشفة ، من الواضح أن السلالة PA14 تنتج أعلى كمية من RL ، بينما تنتج سلالة PA7 أقل كمية. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام هذه النتائج وحدها لتقدير تركيز ميكرومتر من RL الناتج عن كل سلالة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لطريقة الأورسينول وحدها توفير تركيز RL تقريبي ، لأنها تعتمد على توصيف نسب mRL و dRL التي تنتجها كل سلالة من الاهتمام. لذلك ، للحصول على تقدير لتركيز ميكرومتر من RL ، يجب مراعاة نسبة كل نوع من أنواع RL المحددة في TLC ، ويجب تضمين منحنى قياسي بتركيزات مختلفة من الرامنوز (الشكل 3B).

يمكن بالفعل استخدام طريقة الأورسينول لتحديد تركيز RL عند إنتاج نوع واحد فقط من هذا الفاعل بالسطح الحيوي. في مثل هذه الحالات ، يتوافق تركيز ميكرومتر من rhamnose المكتشف مباشرة مع تركيز μM من mRL. بالنسبة إلى dRL ، نظرا لأن اثنين من الرامنوز يتم إنتاجهما عن طريق التحلل المائي لكل جزيء dRL ، يجب تقسيم تركيز ميكرومتر من الرامنوز المكتشف في RL على 2 للحصول على تركيز ميكرومتر (راجع الشكل 4).

ومع ذلك ، فإن غالبية سلالات P. aeruginosa تنتج كلا النوعين من RL بنسب متفاوتة (كما هو موضح في الشكل 2) ، مما يجعل من الممكن تحديد تركيز تقريبي فقط من إجمالي RL. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، قمنا بتقدير إنتاج RL لكل سلالة على النحو التالي: بالنسبة لسلالة PA7 ، نظرا لأنها تنتج mRL فقط ، فإن جزء الرامنوز الذي يشكل RL (44.6 ميكروغرام / مل + 4.5 ميكروغرام / مل) يتوافق مباشرة مع تركيز ميكرومتر (244.78) ، وهو ما يمثل تركيز هذا الفاعل بالسطح الحيوي في طافية الاستزراع ، حيث يحتوي كل جزيء RL على جزء واحد من rhamnose. ومع ذلك ، بالنسبة لسلالة PAO1 ، على الرغم من أن تركيز الرامنوز المكتشف كان 111.55 ميكروغرام / مل + 11.41 ميكروغرام / مل ، فإن 30٪ فقط يتوافق مع mRL. لذلك ، تحتوي 70٪ من جزيئات RL على اثنين من الرامينوز لكل جزيء. لتقدير تركيز RL ، تم تقسيم تركيز μM rhamnose (612.24) على 5 ، مع الأخذ في الاعتبار أن 1/5 يتوافق مع تركيز μM من mRL (122.49) و 2/5 (244.89) إلى dRL. وبالتالي ، فإن التركيز التقريبي μM ل RL الناتج عن هذه السلالة هو 367.39.

بالنسبة لسلالة PA14 ، كان تركيز الرامنوز المكتشف 194.39 ميكروغرام / مل + 11.5 ميكروغرام / مل ، والذي تم تحويله إلى تركيز ميكرومتر (1066.9) وقسمه على 3. تمثل النتيجة تركيز كل نوع RL ، مع الأخذ في الاعتبار أن كل نوع تم إنتاجه بنسبة 50٪ وأن dRL يحتوي على 2 رامنوز لكل جزيء. وبالتالي ، تنتج هذه السلالة 355.63 ميكرومتر من mRL ونفس تركيز dRL ، مما ينتج عنه تركيز تقريبي μM من RL يبلغ 711.27 ، أي ما يقرب من ضعف سلالة PAO1 وحوالي ثلاثة أضعاف التركيز الناتج عن سلالة PA7.

figure-results-1
الشكل 1: التركيب الكيميائي للمتجانسات الرئيسية للرهامنوليدات الأحادية والدهون الثنائية الرامنوليبيدات. أ: الينبيدات الأحادية الرامنوليدات. ب: ثنائي الرامنوليبيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الكشف عن الشحوم الأحادية والدهون الثنائية بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. (أ) صورة للوحة TLC توضح معايير RL ، و RL الناتج عن سلالات PAO1 و PA14 و PA7 ومشتق PAO1 ΔrhlA الطافر. (ب) تقدير نسبة كل نوع من أنواع RL (mRL و dRL) في كل عينة من العينات التي تم اختبارها في (A) ، باستخدام برنامج ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: القياس الكمي لتركيز RL باستخدام طريقة الأورسينول. (أ) تركيز رامنوز (ميكروغرام/مل) الموجود في RL المستخرج من طافات الاستزراع لسلالات PAO1 (الشريط الأسود) و PA14 (شريط رمادي فاتح) و PA7 (شريط رمادي غامق). تشير الأشرطة إلى الانحراف المعياري. (ب) منحنى معايرة رامنوز للتجربة الموضحة في (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحقق من صحة طريقة الأورسينول مقارنة مع UPLC-MS / MS للقياس الكمي dRL. (أ) تم تحديد معيار dRL باستخدام UPLC-MS / MS. (B) طريقة الأورسينول مقارنة بتركيز الرامنوز معبرا عنه بوحدة mM. (ج) يعطي تركيز mM نفسه من dRL مثل rhamnose ضعف الامتصاص تقريبا عند 421 nm ، كما هو متوقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: بروتوكول تفصيلي لتحديد dRL بواسطة UPLC-MS / MS. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة الأكثر دقة للكشف عن RL وقياسه هي HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS)7،8،27 ؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة قد لا تكون في متناول العديد من الباحثين. يمكن إجراء الطرق الموصوفة هنا بشكل روتيني باستخدام المواد والمعدات المختبرية الأساسية للكشف عن تركيزات RL وتقديرها ، ولكن لها بعض القيود ، لا سيما عدم دقتها في تحديد مخاليط mRL و dRL. علاوة على ذلك ، يجب تنفيذ إعداد العينة المستخدمة في القياس الكمي ل RL بعناية. لا ينبغي أن تكون الثقافات المستخدمة للكشف عن RL والقياس الكمي في المرحلة الثابتة المتأخرة ، حيث قد يتم تجميع الخلايا أو تحللها ، مما يؤدي إلى معلقات خلايا غير متجانسة يمكن أن تسبب تباينا في النتائج التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتداخل الحطام الخلوي مع طريقة الأورسينول.

يمكن الحصول على نتائج دقيقة عند تنفيذ البروتوكول الموصوف باستخدام الضوابط المناسبة ، مثل سلالة Pseudomonas aeruginosa غير القادرة على إنتاج RL (مثل الطافر PAO1 ΔrhlA 20 المستخدم في هذا العمل ، الشكل 2). هذه النتائج مفيدة لتوصيف عزلات P. aeruginosa المختلفة12,13 ، أو تعديل السلالات وراثيا لزيادة إنتاج RL14 ، أو دراسة علم الوراثة الجزيئي لإنتاج RL بواسطة عزلات P. aeruginosa المختلفة 12.

وبالتالي ، يمكن استخدام الطرق الموصوفة هنا لتوصيف سلالات Pseudomonas aeruginosa لإنتاجها لعوامل الفوعة وتقييم إمكاناتها التكنولوجية الحيوية ، خاصة في المراحل الأولى من التحقيق. من المهم ملاحظة أن هذه الطرق لا يقصد بها أن تكون بدائل لتقنيات مثل HPLC / MS ، بل كتقنيات يمكن الوصول إليها لتوصيف السلالة الأولية والتلاعب الجيني لسلالات P. aeruginosa .

علاوة على ذلك ، إذا كان تركيز البحث على إنتاج RL للأغراض الطبية الحيوية ، فمن الأهمية بمكان الاعتراف بأن إنتاج RL هو مجرد واحد من عدة عوامل تنتجها Pseudomonas aeruginosa. بالإضافة إلى ذلك ، لا يرتبط نوع RL المنتج أو كمية إنتاجه ارتباطا وثيقا بضراوة سلالة معينة ، حيث تتأثر الفوعة بعوامل متعددة28.

فيما يتعلق باستنساخ الطرق الموصوفة هنا ، يجب إيلاء اهتمام خاص عند الحصول على المراحل العضوية في كل من اكتشاف RL بواسطة TLC (الخطوة 1.6) وقياس RL باستخدام طريقة orcinol (الخطوة 2.4). حتى كمية صغيرة من المرحلة الأخرى التي تم أخذها أثناء الاستخراج يمكن أن تؤدي إلى تباين كبير في النتائج التي تم الحصول عليها. يعد استخراج RL من طاف الثقافة خطوة حاسمة في تحقيق نتائج موثوقة وقابلة للتكرار باستخدام طريقة orcinol. من الأهمية بمكان أنه عند جمع الطور العضوي ، يتم استبعاد الطور البيني والمرحلة السائلة. إذا لم يتم تجفيف مرحلة الأثير تماما في غضون 3 ساعات ، فمن المحتمل أن تحتوي على ماء ، مما يستلزم استخراجا جديدا.

تمت مناقشة استخدام طريقة الأورسينول للقياس الكمي RL ، مع الحجج ضد دقتها وخصوصيتها. لقد زعم أن RL غالبا ما يتم المبالغة في تقديرها ، والطريقة ليست محددة لأن الأورسينول يمكن أن يتفاعل مع السكريات المختلفة ، وليس فقط الرامنوز. توضح البيانات الحالية أنه إذا تم استخراج RL بكفاءة من طاف الثقافة ، فإن هذه التقنية محددة ، كما يتضح من عدم وجود تفاعل عند استخدام متحولة rhlA كعنصر تحكم سلبي. ومع ذلك ، لتقديم دليل إضافي على دقة الطريقة في الكشف ، بغض النظر عن إجراء الاستخراج ، اكتشفنا معيار dRL بواسطة UPLC-MS / MS كما هو موضح سابقا27 ، وقارنا النتائج التي تم الحصول عليها بطريقة orcinol18 (الملف التكميلي 1 ، الشكل 4A). وجدنا ، كما وردفي 18 ، ارتباطا جيدا جدا بين تركيز RL المقاس باستخدام هذه الطريقة ، حيث يتوافق كل تركيز ميكرومتر من dRL المكتشف مع ضعف الامتصاص عند 421 نانومتر تقريبا مثل نفس تركيز رامنوز ميكرومتر (الشكل 4B ، C). توضح تجربة التحكم هذه بوضوح دقة هذه الطريقة في القياس الكمي ل RL.

ومع ذلك ، نظرا للتحدي المتمثل في قياس تركيز مخاليط mRL و dRL باستخدام طريقة الأورسينول ، فإن معظم المنشورات تشير إلى النتائج كمكافئات رامنوز في RL. قد لا يكون لهذه القيمة علاقة مباشرة بتركيز RL الفعلي ، كما هو موضح في الأمثلة المقدمة هنا ، ولكنها مع ذلك تعمل كوسيلة مفيدة لمقارنة كميات RL في ظل ظروف مختلفة ، خاصة عند استخدام نفس سلالة P. aeruginosa .

تم الإبلاغ عن طريقة بديلة للقياس الكمي mRL و dRL ، والتي تعتمد على إذابة صبغة Victoria Pure Blue BO الكارهة للماء ، والتي يشيع استخدامها في أقلام الحبر الجاف29. هذه الطريقة سريعة وغير مكلفة. ومع ذلك ، تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد الإنتاج غير المتجانس ل RL بواسطة P. putida وهو غير ممكن للاستخدام مع RL التي تنتجها P. aeruginosa ، حيث يتداخل تعبير البيوسيانين السام الأزرق مع هذه الطريقة.

وباختصار، فإن الطرق الموصوفة هنا توفر بديلا قابلا للتطبيق للكشف عن RL الذي تنتجه المتصورة الزنجارية وقياسه كميا ولا يتطلب معدات متطورة ومكلفة. أنها توفر نهجا عمليا للباحثين لتقييم إنتاج RL في مجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم مختبر GSCh جزئيا من خلال منحة IN201222 من برنامج دعم ومشاريع البحث والابتكار التكنولوجي (PAPIIT) ، المديرية العامة ل Asuntos del Personal Académico - UNAM.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-NAPHTHOLSIGMA-ALDRICH70442
حمض الأسيتيكجي تي بيكر9508-02
الطردلأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل و   50 مل
كلوروفورمجي تي بيكر9180-02
فرن
الأثيرجي تي بيكر9244-02
ماصة زجاجيةسيجما ألدريتش
حمض الهيدروكلوريكجي تي بيكر5622-02
رطل
L-RHAMNOSE مونوهيدراتسيجما-ألدريتشR-3875
ميثانولجي تي بيكر9049-02
أورسينول مونوهيدراتسيجما-ألدريتشO1875
مرقتريس هيدروكلوريك (0.12 م) ، كلوريد البوتاسيوم (0.02 م) كلوريد الأمونيوم (0.02 م) ،   ؛ الببتون (1٪) ، درجة الحموضة 7.4   ؛   تعقيم. إضافة  الجلوكوز (5٪) وكبريتات المغنيسيوم (0.0016 م) خلية
الكوارتز (كوفيت)سيجما ألدريتشZ276669
مستطيل TLC تطوير دبابةفيشر K4161801020 علمية
رامنوليبيدات & nbsp ؛سيجما ألدريتشR-90
مقياسالضوئي مقابل
البخاخسيجما ألدريتشZ529710-1EA
حمض الكبريتيكجي تي بيكر9681-02
TES أنابيب 5 ملكورنينج352002
TLC هلام السيليكا 60 F254MERCK1.05554.0001
حماممائي> 80 درجة ؛ ج
أجهزة المركزي تجفيف CLS706510 PPGAS الطيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
  2. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  3. Williams, P., Cámara, M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).
  4. Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market. Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).
  5. Freschi, L., et al. The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity. Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).
  6. Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes. Diversity. 14 (5), 345(2022).
  7. Déziel, E., et al. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).
  8. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).
  9. Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).
  10. Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).
  11. Noll, P., et al. Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process. Bioresource Technology. 25, 101767(2024).
  12. García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity. Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).
  13. Grosso-Becerra, M. V., et al. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).
  14. Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon. Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).
  15. Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).
  16. Twigg, M. S., et al. Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development. Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).
  17. Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents. Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).
  18. Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. Constituent analyses of glycosaminoglycans. Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).
  19. Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction. Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).
  20. Rahim, R., et al. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).
  21. Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).
  22. Holloway, B. W. Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa. Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).
  23. Mathee, K. Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost. Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).
  24. Roy, P. H., et al. Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7. PLoS ONE. 5, e8842(2010).
  25. Zhang, Y., Miller, R. M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).
  26. Miller, J. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).
  27. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids. Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).
  28. Lee, D. G., et al. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial. Genome Biology. 7 (10), 90(2006).
  29. Kubicki, S., et al. A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة