يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحليل النوعي والكمي لإنتاج Siderophore من Pseudomonas aeruginosa

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

مارس 15, 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول تحليلات نوعية وكمية لإجمالي siderophores و pyoverdine و pyochelin من Pseudomonas aeruginosa.

الملخص

تشتهر الزائفة الزنجارية (P. aeruginosa) بإنتاجها لمجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف. إحدى هذه الآليات هي كسح الحديد من خلال إنتاج siderophore. تنتج P. aeruginosa نوعين مختلفين: pyochelin ، الذي لديه تقارب مخلب أقل للحديد ، و pyoverdine ، الذي لديه تقارب مخلب أعلى للحديد. يوضح هذا التقرير أنه يمكن قياس البيوفيردين مباشرة من المواد الطافية البكتيرية ، بينما يحتاج البيوشلين إلى استخلاصه من المواد الطافية قبل القياس الكمي.

الطريقة الأساسية للتحليل النوعي لإنتاج siderophore هي مقايسة لوحة أجار كروم أزورول سلفونات (CAS). في هذا الفحص ، يؤدي إطلاق صبغة CAS من مركب Fe3+-Dye إلى تغيير اللون من الأزرق إلى البرتقالي ، مما يشير إلى إنتاج siderophore. من أجل القياس الكمي للسيدروفورات الكلية ، تم خلط المواد الطافية البكتيرية بنسب متساوية مع صبغة CAS في لوحة عيار ميكروي ، متبوعة بالتحليل الطيفي عند 630 نانومتر. تم قياس Pyoverdine مباشرة من المادة الطافية البكتيرية عن طريق مزجها بنسب متساوية مع 50 mM Tris-HCl ، متبوعا بالتحليل الطيفي. أكدت ذروة عند 380 نانومتر وجود البيوفيردين. أما بالنسبة ل Pyochelin ، فلم يكن القياس الكمي المباشر من الطافية البكتيرية ممكنا ، لذلك كان لا بد من استخراجه أولا. كشف التحليل الطيفي اللاحق عن وجود pyochelin ، مع ذروة عند 313 نانومتر.

المقدمة

تحتاج الكائنات الحية إلى الحديد لأداء وظائف حيوية مختلفة ، مثل نقل الإلكترونات وتضاعف الحمض النووي1. من المعروف أن Pseudomonas aeruginosa ، وهو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام ، يمتلك مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف ، من بينها آلية واحدة هي تكوين siderophore2. خلال ظروف استنفاد الحديد ، تطلق P. aeruginosa جزيئات متخصصة تسمى siderophores ، والتي تروي الحديد من البيئة المحيطة. Siderophores يخلب الحديد خارج الخلية ، ويتم نقل مجمع ferric-siderophore الناتج بنشاط إلى الخلية3.

من المعروف أن P. aeruginosa تنتج اثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin. من المعروف أن البيوفيردين لديه تقارب مخلب أعلى للحديد (1: 1) ، بينما من المعروف أن البيوشلين له تقارب مخلب أقل للحديد (2: 1) 4. يطلق على Pyochelin أيضا اسم siderophore الثانوي لأنه يحتوي على تقارب مخلب أقل منالحديد 5. يتم التحكم في إنتاج وتنظيم siderophores بنشاط بواسطة أنظمة استشعار النصاب (QS) في P. aeruginosa6.

إلى جانب تبريد الحديد ، تشارك siderophores أيضا في تنظيم عوامل الفوعة وتلعب دورا نشطا في تكوين الأغشية الحيوية7. تخدم Siderophores أدوارا حاسمة إضافية ، بما في ذلك المشاركة في إشارات الخلية ، والدفاع ضد الإجهاد التأكسدي ، وتسهيل التفاعلات بين المجتمعات الميكروبية8. عادة ما يتم تصنيف Siderophores بناء على المجموعات الوظيفية المحددة التي يخلبون من خلالها الحديد. الروابط الثلاثة الأولية في هذا التصنيف هي التصنيف ، والهيدروكسيمات ، و α-هيدروكسي كربوكسيلات3. Pyoverdines هي السمات المميزة لأنواع Pseudomonas الفلورية مثل P. aeruginosa و P. fluorescens5. وهي تتكون من كروموفور فلوري أخضر مختلط مقترن بقليل الببتيد يحتوي على 6-12 من الأحماض الأمينية. تشارك العديد من توليفات الببتيد غير الريبوسومية (NRPs) في تخليقها9. أربعة جينات تشارك في إنتاج وتنظيم البيوفيردين هي pvdL و pvdI و pvdJ و pvdD10. Pyoverdine مسؤول أيضا عن العدوى والفوعة في الثدييات11. يلاحظ أن P. aeruginosa تنتج البيوشلين في ظروف معتدلة تحد من الحديد ، بينما يتم إنتاج البيوفيردين خلال البيئات الشديدة التي تحد من الحديد12. اثنان من الأوبيرونات المشاركة في إنتاج pyochelin هما pchDCBA و pchEFGHI13. تجدر الإشارة إلى أنه في وجود البيوسيانين ، يؤدي البيوشلين (التصنيف) إلى تلف الأكسدة والالتهابات ويولد جذور الهيدروكسيل الضارة بالأنسجة المضيفة11.

تم اعتماد مقايسة كروم أزورول سلفونات (CAS) على نطاق واسع نظرا لشموليتها وحساسيتها العالية وملاءمتها الأكبر مقارنة بالمقايسات الميكروبيولوجية ، والتي ، على الرغم من حساسيتها ، يمكن أن تكون محددة بشكل مفرط14. يمكن إجراء اختبار CAS على أسطح أجار أو في محلول. يعتمد على تغير اللون الذي يحدث عندما ينتقل أيون الحديديك من مركبه الأزرق المكثف إلى اللون البرتقالي. يحدد الفحص اللوني CAS استنفاد الحديد من مركب ثلاثي الفاعل بالسطح Fe-CAS. هذا المركب الخاص ، الذي يتكون من المعدن والصبغة العضوية والسطحي ، له لون أزرق ويظهر ذروة امتصاص عند 630 نانومتر.

يقدم هذا التقرير طريقة للكشف النوعي عن إنتاج siderophore ، حيث يمكن للمرء اكتشاف إنتاج siderophores على لوحة أجار. كما يتم توفير طريقة للتقدير الكمي لإجمالي إنتاج siderophore في لوحة microtiter والكشف والتحليل الكمي لاثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin ، من P. aeruginosa.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على جميع العزلات البكتيرية ل P. aeruginosa من مختبرات علم الأحياء الدقيقة الطبية من فادودارا وجايبور ، الهند. تم التعامل مع جميع العزلات السريرية المختارة في خزانة السلامة الحيوية (BSL2) وتم توخي أقصى درجات الحذر أثناء التعامل مع العزلات البكتيرية أثناء التجارب. يتم توفير التفاصيل التجارية لجميع الكواشف / الحلول في جدول المواد.

1. تحضير صبغة كروم أزورول سلفونات (CAS) ووسائط أجار

  1. تحضير صبغة CAS (100 مل) بالتركيب التالي:
    1. قم بإذابة 60 مجم من CAS في 50 مل من الماء المقطر (الحل 1).
    2. قم بإذابة 2.7 مجم من FeCl3 · 6H2O في 10 مل من 10 mM HCl (محلول 2).
    3. قم بإذابة 73 مجم من بروميد السيتريمونيوم (HDTMA) في 40 مل من الماء المقطر (محلول 3).
    4. امزج بعناية الحل 1 والحل 2 والحل 3. تخزينها في زجاجة.
  2. قم بإعداد CAS agar باتباع الخطوات التالية:
    1. أضف 100 مل من محلول الملح MM9 إلى 750 مل من الماء المقطر.
    2. قم بإذابة 32.24 جم من حمض بيبيرازين-N، N'-bis (2-إيثان سلفونيك حمض) (PIPES).
    3. أضف 15 جم من أجار أجار. الأوتوكلاف واتركه ليبرد.
    4. أضف 30 مل من محلول حمض الكازامينو المعقم و 10 مل من محلول الجلوكوز المعقم بنسبة 20٪ إلى الخليط.
    5. أضف 100 مل من صبغة CAS واخلطها واسكبها في ظروف معقمة.
      ملاحظة: يتم توفير تحضير وسائط MM9 ومحلول حمض الكازامينو و8-هيدروكسيكينولين في الملف التكميلي 1. المخزن المؤقت PIPES حساس لدرجة الحموضة. لن يذوب حتى يتم تحقيق الرقم الهيدروجيني 5.6. تأكد من مراقبة الرقم الهيدروجيني باستمرار لأنه عندما تبدأ الأنابيب في الذوبان في الماء ، فإنها ستزيد من خفض درجة الحموضة. استخراج حمض Casamino مع نفس الحجم من 3 ٪ 8-هيدروكسي كينولين المذاب في الكلوروفورم. اترك المحلول غير القابل للامتزاج عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا واجمع المرحلة العليا من المحلول بعناية دون الإخلال بالمرحلة السفلية.

2. التحليل النوعي لإنتاج siderophores

  1. اضبط OD600 نانومتر على 0.2 لمزارع P . aeruginosa المزروعة لمدة 24 ساعة.
  2. باستخدام حلقة سلكية معقمة ، قم بخط الثقافة البكتيرية على لوحة أجار CAS.
  3. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام وسائط مياه الببتون أو محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.8٪ لتخفيف الثقافة البكتيرية. إذا لم يلاحظ نمو البكتيريا في 24 ساعة ، احتضان لوحات CAS لمدة 48 إلى 72 ساعة.

3. التقدير الكمي لإجمالي siderophores

  1. إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. بعد 48 ساعة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بزراعة البكتيريا عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من صبغة CAS إليها.
  4. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  5. بعد الحضانة ، خذ قراءات طيفية عند 630 نانومتر.
  6. احسب النتائج التي تم الحصول عليها لتحديد كمية إجمالي siderophores كنسبة مئوية لوحدة siderophore (PSU).
    ملاحظة: يمكن حساب PSU على النحو التالي: [(Ar - As) / Ar] × 100
    حيث ، Ar = امتصاص المرجع عند 630 نانومتر ، As = امتصاص الطافي الخالي من الخلايا للعينة. كمرجع ، يجب إضافة صبغة CAS إلى وسائط مياه الببتون غير الملقحة. املأ جميع الأواني الزجاجية ، مثل أنابيب الاختبار والقوارير وما إلى ذلك ، ب 6 M HCl لمدة 2 ساعة واشطفها مرتين بالماء المقطر لإزالة أي أثر للحديد عليها.

4. التقدير الكمي للبيوفردين

  1. إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة على مدار 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. بعد 48 ساعة ، قم بقياس OD600 نانومتر من نمو البكتيريا قبل المضي قدما.
  3. أجهزة الطرد المركزي الثقافة البكتيرية في 4650 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو ذات 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من 50 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) إليها.
  5. خذ قراءات طيفية عند OD405 نانومتر.

5. استخراج Pyochelin وقياس الطيف الضوئي

  1. إعادة تلقيح المستزرعات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط King's B (الملف التكميلي 1) بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. بعد 24 ساعة ، خذ 100 مل من الثقافة وأجهزة الطرد المركزي عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الطرد المركزي ، أضف 5 مل من 1 M حامض الستريك إلى المادة الطافية. استخراج مرتين مع 50 مل من خلات الإيثيل.
  4. تصفية المرحلة العضوية مع كبريتات المغنيسيوم من خلال مرشح حقنة. قم بتخزين المرحلة العضوية المفلترة عند -20 درجة مئوية.
  5. خذ قراءات طيفية عند 320 نانومتر.
    ملاحظة: نظرا لأن البيوشلين مركب غير مستقر للغاية في درجة حرارة الغرفة ، فقم بإجراء عملية الاستخراج على الجليد. استخدم حقنة معقمة سعة 50 مل لفصل الفلتر. ضع القطن على طرف المحقنة وأضف 1 جم من كبريتات المغنيسيوم عليه. ثبت مرشح حقنة معقم عند طرف المحقنة واجمع المرشح في أنبوب معقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل القياس الكمي للسيدروفورات من العزلات السريرية ، تم إجراء فحص نوعي لإنتاج siderophore لضمان إنتاج siderophores. لوحظ الكشف النوعي عن siderophores من العزلات السريرية عن طريق خطوط البكتيريا على ألواح أجار CAS. تم اختيار ثلاث عزلات سريرية ، وهي MR1 و TL7 و J3 ، جنبا إلى جنب مع PAO1 (السلالة المرجعية) ، للدراسة. أظهرت جميع العزلات السريرية الثلاثة و PAO1 نتائج إيجابية لإنتاج siderophore ، حيث أشارت هالة برتقالية صافية حول النمو البكتيري على سطح أجار الأزرق إلى إنتاج siderophore إيجابي (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد إجمالي siderophores واثنين من siderophores مختلفة من P. aeruginosa ، وهما pyoverdine و pyochelin ، من طاف الخلايا البكتيرية الحرة. في مقايسة ألواح أجار CAS ، تشكل صبغة CAS وأيونات Fe3+ معقدا. عندما تنتج البكتيريا siderophores ، فإنها تطفئ أيونات Fe3+ من مركب CAS-Fe3+ ، مما يؤدي إلى تغيير اللون حول نمو البكتيريا. ينتج عن هذا التغيير هالة برتقالية صافية حول نمو البكتيريا14,15. في حين أن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالتمويل من DBT - برنامج تدريس التكنولوجيا الحيوية ، DBT - برنامج BUILDER و FIST. السيد شكرا الزمالة الواردة من SHODH. HP تشكر الزمالة التي تلقتها من CSIR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجار أجار ، النوع الأولهيميدياGRM666
8-هيدروكسي كينولينلوبا كيمي4151
حمض الكازامينيومSRL للكيماويات68806
سيتيل تريميثيل بروميد الأمونيوم (CTAB)هيميدياRM4867-100G
كلوروفورممرك1070242521
الكروم أزورول سلفوناتهيميدياRM336-10G
حامض الستريكميرك100241
سكر العنب أحادي الهيدراتميرك108342
ثنائي كلورو ميثانميرك107020
سداسي هيدرات كلوريد الحديديكهيميدياGRM6353
قوارير زجاجيةبوروسيل5100021
أنابيب اختبار زجاجيةبوروسيل9820U05
حمض الهيدروكلوريكSDFCL20125
قاعدة الملك المتوسطة BHIMEDIAM1544-500G
M9 الحد الأدنى من الأملاح المتوسطةHIMEDIAG013-500G
كبريتات المغنيسيوم  Qualigens10034
MultiskanGO مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية51119200
البيبتون من النوع الأول ، البكتريولوجيةHIMEDIARM667-500G
الأنابيب خالية من الحمضMP Biomedicals190257
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومميرك1048731000
ببتون البروتيوزHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis مقياس الطيف الضوئيShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
كلوريد الصوديومQualigens15915
.

المراجع

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تحديد كمية البيوفيرديناستخلاص البيوشيلينمقايسة أغار CASالتحليل الطيفي الضوئيالطافي الخالي من الخلاياعوامل الضراوةكنس الحديدلوحة المعايرة الدقيقة
التحليل النوعي والكمي لإنتاج Siderophore من Pseudomonas aeruginosa
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.