تمكين دراسات التعبير الجينات المعدلة وراثيا عالية الإنتاجية باستخدام معالجة السوائل الآلية للبروتوبلاستات المصنوعة من أوراق الذرة

Summary

يصف هذا البروتوكول إنشاء تخطيط تعداء عشوائي باستخدام معالج سائل آلي ، وبروتوكول عزل البروتوبلاست لأوراق الذرة المبتذلة ، وإجراء تعداء 96 بئرا باستخدام معالج سائل.

Abstract

شهد مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية تطورات ملحوظة في السنوات الأخيرة ، مما أحدث ثورة في القدرة على معالجة النباتات وهندستها لأغراض مختلفة. ومع ذلك ، مع زيادة التنوع في البحث في هذا المجال وتعقيدا بشكل متزايد ، فإن الحاجة إلى حلول فحص عابرة مبكرة وفعالة ويمكن الاعتماد عليها وعالية الإنتاجية لتضييق نطاق الاستراتيجيات التي تمضي قدما في التحول المستقر أصبحت أكثر وضوحا. إحدى الطرق التي عادت إلى الظهور في السنوات الأخيرة هي استخدام البروتوبلاست النباتي ، حيث تتوفر طرق العزل والتعداء في العديد من الأنواع والأنسجة ومراحل النمو. يصف هذا العمل بروتوكولا آليا بسيطا للتحضير العشوائي للبلازميد داخل صفيحة مكونة من 96 بئرا ، وطريقة لعزل بروتوبلاست أوراق الذرة المبطلة ، وإجراء التعداء الآلي. يمثل اعتماد الحلول الآلية في التكنولوجيا الحيوية النباتية ، والتي تتمثل في بروتوكولات مناولة السوائل الجديدة هذه لتعداء البروتوبلاست النباتي ، تقدما كبيرا على الطرق اليدوية. من خلال الاستفادة من الأتمتة ، يمكن للباحثين التغلب بسهولة على قيود الأساليب التقليدية ، وتعزيز الكفاءة ، وتسريع التقدم العلمي.

Introduction

يعد تعداء البروتوبلاست النباتي ، وهو إدخال مادة وراثية غريبة في الخلايا النباتية الخالية من جدران الخلايا ، تقنية محورية ، وفي نصف القرن الماضي ، تشمل العديد من الأنواع لدعم أبحاث التكنولوجيا الحيوية النباتية. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه الطرق يمكن أن يكون مؤلما ومحدودا في النطاق ، حتى مع إنتاج ملايين البروتوبلاست في كل عزلة. غالبا ما تكون الطرق التقليدية لتعداء البروتوبلاست النباتي شاقة وتستغرق وقتا طويلا وعرضة للتباين ومتطلبة تقنيا ، مما يؤدي إلى أنظمة متخصصة ذات قابلية منخفضة للتكاثر¹. ومع ذلك ، فإن الإمكانات التي أدخلتها الحلول الآلية في السنوات الأخيرة تسلط الضوء على إمكانية بث حياة جديدة في هذه التقنية الشابة البالغة من العمر 60 ^{عاما 2,3}. مع إمكانية أتمتة الخطوات الحاسمة والمتكررة مثل تحضير المواد ، وحضانة بولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، وتوزيع كاشف التعدي اللاحق ، يمكن للباحثين تقليل متطلبات المناولة المادية والمصادر المحتملة الأخرى للخطأ البشري^{بشكل كبير 4}. علاوة على ذلك ، يضمن التحكم الدقيق والتوحيد الذي توفره أنظمة معالجة السوائل الآلية نتائج تعداء متسقة وقابلة للتكرار.

في حين أن عزل البروتوبلاست هو عملية دقيقة تتضمن التقطيع والهضم والحضانة والترشيح والطرد المركزي ، فإن جزء التعدي من هذه البروتوكولات مصمم خصيصا لمعالجات السوائل الآلية. يتم إجراء معظم بروتوكولات تعداء البروتوبلاست بوساطة PEG ، وخلط البروتوبلاست المعزول في وجود PEG والحمض النووي البلازميد المنقى لمدة محددة بتركيز دقيق (يعتمد على الأنواع والأنسجة) يسمح لهذه الخلايا بأخذ الحمض النووي البلازميد⁵. يتبع هذا التعدي سلسلة من خطوات الغسيل ، وتبلغ ذروتها في حضانة^{ليلية 6}. بعد فترة الحضانة ، إذا تم تصميم كل شيء وتسليمه بشكل صحيح ، فإن التجربة تؤدي إلى التعبير عن المكون محل الاهتمام و / أو إمكانية تقييم المكونات التنظيمية المختلفة⁷. عادة ما يتم التعامل مع جميع خطوات الشفط والاستغناء والتحريض / الخلط المرتبطة بهذا الإجراء بواسطة ماصة يدوية. يعد تنفيذ مثل هذا البروتوكول يدويا ، تفاعلا فرديا واحدا في كل مرة ، أمرا شاقا ويقدم تباينا غير ضروري بين العينات مع الحد أيضا من السعة التي يمكن تقييمها في أي وقت. كانت البروتوكولات الآلية للتلاعب بخلايا الثدييات أو الحشرات والتخليق الكيميائي في صناعة الأدوية قيد التنفيذ لعدة سنوات^4،8،9. يتزايد استخدام البروتوبلاست والبروتوكولات التي تنطوي على مناولة السوائل الآلية للمواد النباتية^{10،11،12،13}.

إن اعتماد بروتوكولات معالجة السوائل الآلية لتعداء البروتوبلاست النباتي يحمل وعدا كبيرا للتطبيقات البحثية. يمكن للباحثين استكشاف مكتبات وراثية أكبر ، وفحص وظائف جينية محددة بوتيرة متسارعة ، والتحقيق في التفاعلات الجينية المعقدة المتعلقة بإجهاد النبات بشكل أكثر شمولا¹⁴. تتيح قابلية التوسع للأساليب الآلية التي تستخدم كبسولات ذات 96 بئرا جنبا إلى جنب مع فحص التألق إجراء تجارب عالية الإنتاجية وتسمح للعلماء بتوليد البيانات والرؤى بسرعة التي يمكن أن تغذي التقدم في التكنولوجيا الحيوية^{النباتية 11}. ومع ذلك ، مع هذه الزيادة في الإنتاجية ، مما يؤدي إلى توليد مئات ، إن لم يكن الآلاف من نقاط البيانات ، يجب أن يكون هناك مراقبة جودة إضافية تفسر أي مصادر خطأ قد تربك النتائج¹⁵. أحد العناصر التي تم تحديدها كعامل مساهم في العديد من التخصصات العلمية هو تأثير الحافة. ستقترح بعض استراتيجيات التخفيف أفضل صفيحة لاستخدامها أو ملء المساحة بين الآبار أو الآبار الخارجية بالمياه لمكافحة هذه الظاهرة^16،17. ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجيات تضيف الوقت ، وإذا لم يكن هناك شيء معين يمكن التخلص منه متاحا ، فإن الخيار الوحيد هو القبول بأقل أو تأجيله. بدلا من ذلك ، فإن النظر إلى الاستراتيجيات التي تأخذ في الحسبان هذا التأثير عبر مخطط الحظر لا يضحي بالإنتاجية أو يؤخر التنفيذ.

يسعى بروتوكول البروتوبلاست لأوراق الذرة المسبب وطريقتيه الآليتين الموضحين في الشكل 1 إلى معالجة التباين المتأصل في تجارب البروتوبلاست عن طريق أتمتة أجزاء متعددة من طريقة البروتوبلاست المتعارف عليها ، وتخصيص مادة البلازميد للوعاء المستخدم في التعدي ، والتعداء نفسها. يتم توضيح هذه الطرق لمنصة بروتوبلاست أوراق الذرة المبطلة لأنها منصة بروتوبلاست جيدة التميز وبسيطة وفعالة. يمكن الوصول إلى جميع الخطوات المفصلة على الفور من خلال بروتوكولات نقل البروتوبلاست ، والتي تستخدم حلول مؤقتة مماثلة أو نفسها. ومع ذلك ، يجب مراعاة اهتمام خاص للخصائص الفريدة لأنسجة وأنواع مصدر البروتوبلاست قبل اعتماد هذه التقنيات. تعمل هذه التحسينات من خلال الأتمتة على تبسيط إعداد المواد للتجارب الفردية وتحسين الإنتاجية بشكل كبير ، من التعداء المتسلسل واحدا تلو الآخر إلى 96 تعداء يتم التعامل معها في وقت واحد. سيظهر هذا العمل أيضا مبررا لاستخدام الكتل العشوائية غير المكتملة لحساب التحيز الموضعي للوحة.

Protocol

1. إنشاء لوحة الإرسال

1. إنشاء تخطيط سطح السفينة: لإنشاء طريقة عشوائية للوحة DNA ، افتح برنامج معالج السوائل. انقر على طريقة جديدة زر من شريط القائمة لإنشاء طريقة جديدة. أضف خط إعداد الأداة بين خطي البداية والانتهاء بالضغط على زر إعداد الأداة على اللوحة اليسرى.
   ملاحظة: يمكن العثور على لقطات الشاشة ذات الصلة التي تتبع هذا البروتوكول الآلي في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3.
2. انقر فوق سطر إعداد الأداة ، وابحث عن أدوات المختبر الصحيحة من قائمة فئة Labware ، واسحبها إلى تخطيط سطح السفينة كما هو موضح في الشكل التكميلي 1.
   ملاحظة: إذا لم يتم تعريف أدوات المختبر مسبقا ، فستحتاج إلى برمجتها في معالج السوائل وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، ولكن هذه التعليمات خارج نطاق هذا البروتوكول.
3. نقل من إعداد الملف: اضغط على زر Transfer From File في لوحات الخطوات وضع سطر Transfer From File أسفل سطر إعداد الأداة. تأكد من أن اختيار الطرف واستبداله كما هو موضح في الشكل التكميلي 3.
4. حدد أن الملف يحتوي على صف رأس وتأكد من صحة معلومات العمود.
5. اضغط على منطقة المصدر لتنشيطها وانقر فوق لوحة المصدر من تخطيط سطح السفينة ، وحدد اللوحة المستهدفة ، وأدخل كمية الحمض النووي المراد سحب العينات.
6. اضغط على زر التخصيص لتحديد تقنية سحب العينات بالتفصيل، مثل لمسات الأطراف على الحائط.
7. حدد كمية الحمض النووي البلازميد المراد نقلها. يستخدم هذا البروتوكول 20 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد لكل تعداء (جيد).
   ملاحظة: ستعتمد كمية الحمض النووي البلازميد التي يتم نقلها إلى لوحة التعداء قبل تعداء البروتوبلاست على منصة البروتوبلاست المستخدمة.
8. إنشاء مستند نقل من ملف .csv.
   1. يتكون هذا المستند من عمودين. قم بإعداد العمود الأول ، أي العمود من ، والذي يشير إلى موقع الحمض النووي البلازميد للمخزون داخل رف الأنبوب ، أي للعينة 1 ؛ سيكون هذا جيدا A01. نظرا لأن هذا النقل يحدث ثلاث مرات (ثلاثة ممثلين) ، يجب أن تشير ثلاثة صفوف إلى A01 في العمود من.
   2. قم بإعداد العمود الثاني ، أي إلى العمود ، المستخدم لتحديد بئر وجهة بناء البلازميد للوحة 96 بئرا. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون العينة 1 (A01) B02 و D04 و H07. احفظ هذا كملف .csv ليكون متوافقا مع برنامج معالج السوائل.
9. قبل تشغيل البروتوكول ، تحقق من تحميل مواضع سطح السفينة ، وتحديد برامج المختبر بشكل صحيح ، ويتضمن مستند التوزيع العشوائي مواقع جيدة لجميع عينة الحمض النووي في رف الأنبوب ، وأن هناك عينة بلازميد كافية في الأنابيب لتنفيذ البروتوكول.
10. قم بتوسيع قائمة خصائص الملف لخطوة النقل من الملف، وحدد الملف .csv الذي تم إنشاؤه وقم بتشغيل البروتوكول.
11. قم بتغطية ألواح التعداء بختم من رقائق الألومنيوم عند اكتمال البروتوكول بنجاح. قم بتخزين ألواح الإرسال عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. ستتم إضافة بروتوبلاست أوراق الذرة المعزولة إلى لوحة التعداء هذه في الخطوة 3.3.

2. عزل البروتوبلاست من أوراق الذرة المسخنة

1. لبدء عزل بروتوبلاست أوراق الذرة المعطلة ، احصل على خلفية وراثية متوافقة مع البروتوبلاست مثل NP222 التي تم استخدامها هنا¹⁸. قم بإعداد 3 مخازن مؤقتة فقط ، وهي المخازن المؤقتة MMg و W5 و WI ، المدرجة في الجدول 1 قبل بدء التجربة واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد محلول الهضم و PEG في يوم التجربة للحصول على أفضل النتائج.
2. يقوم السطح بتعقيم 25 بذرة عن طريق غمرها أولا في محلول مبيض تجاري بنسبة 25٪ ورجها على شاكر منصة دوارة لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد التقليب ، اشطف البذور جيدا باستخدام الماء المعقم (DI). كرر خطوة الشطف 5x. تشرب البذور في ماء معقم طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
4. زرع البذور على تربة رطبة معقمة في اليوم التالي. أضف كريات الطين الجافة لإزالة الرطوبة الزائدة من التربة لمنع التلوث الفطري.
5. قم بزراعة شتلات الذرة في غرفة نمو خفيفة لمدة 16 ساعة عند 28 درجة مئوية (الرطوبة النسبية (RH) 30٪) لمدة 3 أيام تقريبا حتى يصل القمر إلى 1-2 سم فوق التربة ثم انقله إلى غرفة مظلمة بنفس درجة الحرارة والرطوبة النسبية لمدة 5-7 أيام إضافية.
6. احصد أول نسيج ورقي حقيقي عن طريق قصه فوق الطوق الأول مباشرة.
7. يعقم السطح أنسجة الأوراق لفترة وجيزة في 25٪ مبيض تجاري و 250 ميكرولتر من محلول 20٪ Tween 20 لمدة 1 دقيقة. اشطف مادة الأوراق جيدا 5 مرات بماء DI.
8. جفف أنسجة أوراق الذرة (برفق) بأنسجة خالية من النسالة ، وباستخدام شفرة حادة ، قم بإزالة ~ 1.5 سم من طرف وقاعدة كل شفرة ورقة.
9. قطع أنسجة الأوراق المتبقية إلى شرائح عرضية ضيقة (0.5 مم - 1 مم) وضعها في طبق بتري مقاس 100 × 25 مم.
10. قم بتعقيم 25 مل من محلول الهضم من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة في طبق بتري الذي يحتوي على الأنسجة المقطعة.
11. يتسلل الفراغ إلى أنسجة الأوراق بمحلول الهضم عن طريق تطبيق الفراغ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مجفف فراغ عند ضغط -75 ملي بار تقريبا.
    ملاحظة: يجب أن يكون ضغط الفراغ المنزلي للعديد من المختبرات الأكاديمية والخاصة كافيا لهذه الخطوة.
12. ضعه على شاكر منصة دوار ورجه عند 25 درجة مئوية في الظلام عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 إلى 3 ساعات. عندما يتبقى 10 دقائق حتى نهاية فترة الهضم ، قم بزيادة السرعة إلى 90 دورة في الدقيقة.
13. صب محلول الهضم وأي مادة نباتية غير مهضومة من خلال قمع فوق مرشح غربال 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.
14. الطرد المركزي المحلول داخل أنبوب 50 مل عند 150 × جم لمدة 4 دقائق لحبيبات البروتوبلاست. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 10-15 مل من محلول MMg Buffer.
15. كرر الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية. أعد التعليق في 5 - 10 مل من المخزن المؤقت MMg الطازج.
16. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بقياس كثافة البروتوبلاست المعزول بعناية. أعد التعليق إلى كثافة تقريبية تبلغ 5 × 10⁵ بروتوبلاست لكل مل.
17. اسمح للعزل بالراحة على الجليد لمدة ~ 30 دقيقة قبل التعداد. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد محلول PEG. قم بإذابة PEG تماما في محلول باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية واتركه هناك حتى التعداد.

3. تعداء البروتوبلاست الآلي

ملاحظة: تتم إدارة الخطوات من 3.6 إلى 3.15 بالكامل بواسطة معالج السوائل الآلي، باستثناء توقفي المستخدم مؤقتا عند الخطوتين 3.10 و3.13، اللتين تتطلبان الطرد المركزي اليدوي. يمكن العثور على لقطات الشاشة ذات الصلة التي تتبع هذا البروتوكول الآلي في الملحق ، الشكل التكميلي 1 ، الشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4 ، والشكل التكميلي 5.

1. قم بإعداد تخطيط سطح السفينة لمعالج السائل للتعداء وفقا لطريقة تعداء البروتوبلاست الموضحة في الخطوات التالية. قم بتجميع المواد التالية: لوحة الوجهة (في هذه الحالة ، ستكون سوداء سعة 96 بئرا مع صفيحة دقيقة سفلية شفافة لقياس التألق) ، صندوق واحد من 25 - 250 ميكرولتر نصائح أتمتة عريضة التجويف لخطوة شفط PEG ، خمسة صناديق من 25 - 250 ميكرولتر أطراف أتمتة الماصة لخطوات معالجة السوائل المتبقية ، ثلاثة أحواض بلاستيكية كخزانات كاشف ، لوحة واحدة فارغة من 96 بئرا لجمع النفايات ، ومحاليل الغسيل العازلة المتبقية ، W5 و WI.
2. مباشرة قبل بدء إجراء التعدي ، قم بتصفية تعقيم محلول PEG من خلال وحدة تصفية فراغ معقمة يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.
3. من البروتوبلاست المعلق في المخزن المؤقت MMg ، أضف 100 ميكرولتر (حوالي 50.000 بروتوبلاست) إلى كل بئر من لوحة التعداء المعدة مسبقا والمذابة. للقيام بذلك ، اسكب محلول المخزن المؤقت المحتوي على البروتوبلاست في حوض معقم سعة 10 مل واستخدم ماصة متعددة القنوات. استمر في التقليب اللطيف للحوض الصغير لمنع البروتوبلاست من الاستقرار خارج المحلول أثناء خطوة النقل اليدوي هذه.
4. صب محلول PEG في الحوض المناسب ووضع لوحة التعداء ، التي تحتوي الآن على البروتوبلاست والحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على لوحة تعداء ، محضرة باستخدام الخطوة 1 ، في الموقع المحدد وفقا لتخطيط السطح.
5. لإنشاء طريقة تعداء البروتوبلاست ، افتح برنامج معالج السوائل وقم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه.
   1. نقل أدوات المختبر بين الطوابق: استبدل صندوق الطرف الفارغ على سطح تحميل الأطراف بآخر جديد باستخدام الأمر Move Labware. حدد المجموعتين من وإلى من طريقة عرض التكوين .
   2. بالنسبة للأحجام التي تزيد عن 200 ميكرولتر: لا تستبدل الأطراف بين عمليات النقل. تلميحات التحميل لخطوة النقل الأولى وإلغاء التحميل بعد خطوة النقل الأخيرة، والتي تتطلب تحديد خيارات التحميل/التفريغ بشكل صحيح لكل خطوة نقل كما في الشكل التكميلي 3.
6. إنشاء تخطيط سطح السفينة: مثل طريقة إنشاء لوحة الإرسال ، لإنشاء طريقة تعداء آلية للحمض النووي ، افتح برنامج معالج السوائل. انقر فوق طريقة جديدة زر من شريط القائمة لإنشاء طريقة جديدة. أضف خط إعداد الأداة بين خطي البدء والانتهاء بالضغط على زر إعداد الأداة على اللوحة اليسرى. قم بإنشاء تخطيط سطح السفينة وفقا لتخطيط سطح السفينة الموضح في الشكل التكميلي 1.
7. خلط الخلية / الحمض النووي: أضف خطوة لخلط البروتوبلاست والحمض النووي قبل إضافة PEG باستخدام زر إجراء الجهاز وإعداد الجهاز (اهتزاز محدد موضع أدوات المختبر الآلي أو ALP) ، وسرعة الاهتزاز (1500 دورة في الدقيقة) ، ووقت الاهتزاز (10 ثوان).
8. إضافة وخلط PEG: لبدء التعدي ، أضف خطوة نقل لإضافة 110 ميكرولتر من PEG من خزان PEG باستخدام ماصة 96 جرابا. تأكد من برمجة مواضع المصدر والوجهة الصحيحة وفقا لتخطيط سطح السفينة المحدد. قم ببرمجة خطوة النقل لشفط PEG 1 مم من قاع الخزان وإيداع PEG 3 مم من قاعدة الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على خليط البروتوبلاست / الحمض النووي. أضف خطوة اهتزاز أخرى بعد إضافة PEG عن طريق نسخ ولصق الخطوات المبرمجة مسبقا.
9. حضانة PEG: أضف خطوة إيقاف مؤقت عن طريق تحديد زر الإيقاف المؤقت ، وحدد شاكر ، وأدخل وقت الحضانة المحدد مسبقا ، والذي يبدأ من إضافة PEG.
   ملاحظة: سيستمر مؤقت الإيقاف المؤقت ما لم يكن هناك أي انقطاعات أو انقطاعات في الستائر الخفيفة قد تؤدي إلى ظهور رسالة خطأ. تأكد من أنه إذا كان التلاعب بسطح السفينة ضروريا ، مسح هذه الرسائل قبل الابتعاد.
10. إضافة / خلط المخزن المؤقت W5: أضف ثلاثة خطوط نقل سعة 200 ميكرولتر لنقل ما مجموعه 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت W5 إلى لوحة التعداء لإخماد تفاعل حضانة PEG. اتبع إضافة المخزن المؤقت W5 عن طريق الاهتزاز وإيقاف المستخدم مؤقتا للسماح بالطرد المركزي للوحة النقل.
11. إيقاف المستخدم مؤقتا 1: جهاز الطرد المركزي للوحة تعداء البروتوبلاست عند 100 × جم لمدة 4 دقائق. أعد لوحة التعدي ، الآن مع البروتوبلاست المحبب ، إلى موضع السطح المناسب. أضف إيقاف مؤقت للمستخدم بالنقر فوق الزر إيقاف مؤقت ، باستثناء الآن مع تحديد خيار إيقاف النظام مؤقتا للنظام بأكمله .
    ملاحظة: يجب مسح النافذة المنبثقة لرسالة الإيقاف المؤقت قبل أن يستمر معالج السائل مع بقية البروتوكول.
12. إزالة المادة الطافية: أضف سطرين من النقل لإزالة 400 ميكرولتر من المادة الطافية ونقلها إلى صفيحة النفايات. لتجنب شفط الخلية أثناء إزالة المادة الطافية ، اضبط المسافة من القاع على 6 مم.
13. إضافة / خلط WI أضف 3 خطوط نقل لنقل 580 ميكرولتر من المخزن المؤقت WI إلى لوحة التعداد. أضف خطوة اهتزاز أخرى بعد إضافة WI عن طريق نسخ ولصق الخطوات المبرمجة مسبقا. انتقل إلى إيقاف المستخدم المؤقت التالي.
14. إيقاف المستخدم مؤقتا 2: جهاز الطرد المركزي للوحة تعداء البروتوبلاست عند 100 × جم لمدة 4 دقائق. أعد لوحة التعدي ، الآن مع البروتوبلاست المحبب ، إلى موضع السطح المناسب.
15. إزالة المادة الطافية: أضف أربعة أسطر من النقل لإزالة 680 ميكرولتر من المادة الطافية ونقلها إلى صفيحة النفايات. لتجنب شفط الخلية أثناء إزالة المادة الطافية ، اضبط المسافة من القاع على 6 مم.
16. نقل البروتوبلاستات إلى صفيحة دقيقة: يتكون النقل النهائي لهذا البروتوكول من خطوتي نقل سعة 150 ميكرولتر. قبل كل خطوة فردية ، قم بشفط البروتوبلاستات بشكل متكرر عند 50 ميكرولتر / ثانية عند 2 مم من أسفل لوحة التعدي واستغرضها عند 3 مم. بعد ذلك، باستخدام نفس أطراف الماصة، انقلها إلى الصفيحة الدقيقة للوجهة.
    ملاحظة: سيؤدي الشفط والاستغناء عن حجم المخزن المؤقت فوق الحبيبات قبل نقلها إلى الصفيحة الدقيقة إلى إزعاج أي بروتوبلاست متبقي محبوب في الجزء السفلي من لوحة التعدي لضمان عدم فقدان العينة. نظرا لأن التوزيع العشوائي قد تم أثناء إنشاء لوحة التعدي ، فإن هذا يختتم البروتوكول الآلي.
17. احتضان الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل قياس التألق الأول.

Results

الحصول على بيانات الرصد التي تدعم أن تأثيرات الحواف قد تؤثر على قياسات الاستجابة؛ تم إجراء دراسة تجريبية لتأكيد هذه الشكوك. في هذه الدراسة ، تم تطبيق الطرق المذكورة أعلاه على ثلاث ألواح مكررة مكونة من 96 بئرا بمستوى معالجة واحد فقط. تم نقل جميع البروتوبلاستات باستخدام pSYN11250¹⁹ ، وهو بلازميد يعبر بشكل أساسي عن ZsGreen ، بهدف إظهار وجود اختلافات منهجية في مستوى الاستجابة للوحدات الموجودة على حافة اللوحة مقارنة بالصف الثاني ، والمناطق المركزية من اللوحة. يتم تعريف الآبار ال 36 الموجودة على الحافة الخارجية للوحة على أنها الكتلة 1 ، والبئر ال 28 في الصف الثاني من الحافة على أنها الكتلة 2 ، والبئر ال 32 المركزية على أنها بلوك 3 - انظر الشكل 2 أ اللوحة اليمنى السفلية. يمكن أن يستوعب هذا الترتيب 28 مستوى علاجا كتصميم كتلة كاملة عشوائية (RCBD) أو 32 مستوى معالجة كتصميم كتلة عشوائية غير مكتملة (RIBD). في الشكل 2 أ ، لكل تكرار (مندوب) ، تم تطبيع نقاط البيانات الأولية لكل بئر بالمتوسط من تلك اللوحة المعنية. في جميع التكرارات الثلاثة للتجربة ، تكون الاستجابات على حافة اللوحة ، في المتوسط ، أكبر بمقدار 1-1.5 مرة من الحد الأدنى. يصور الشكل 2 ب وسائل الكتلة كنسبة مئوية من متوسط اللوحة الكلي لكل تكرار. يوضح الجدول 2 جداول ANOVA أحادية الاتجاه من تركيب نموذج خطي مع كتلة كتأثير ثابت. لأسباب تتعلق بالتوزيع العشوائي المقيد الذي ينطوي عليه تصميمات الكتل ، يعتبر الاستدلال القائم على اختبار الفرضية لعامل الحجب تقريبيا في أحسن الأحوال وغير صالح في أسوأ الأحوال. ومع ذلك ، فإن ملاءمة نموذج بعامل حظر ثابت مفيد لتقييم ما إذا كان مخطط الحجب مفيدا. يمثل Mn_Sq (الكتلة) متوسط الانحراف التربيعي لوسائل الكتلة حول المتوسط الكلي. يمثل Mn_Sq (الخطأ) متوسط الانحراف التربيعي للملاحظات الفردية حول مجموعتهم ، في هذه الحالة ، المتوسط الكلي نظرا لعدم وجود عامل معالجة في النموذج. عندما يكون Mn Sq (كتلة) أكبر من Mn Sq (خطأ) ، أي أن نسبة F أكبر من واحد ، فقد تم تقليل حجم متوسط الخطأ التربيعي بشكل فعال بالنسبة إلى التصميم العشوائي بالكامل (CRD) ، وبالتالي زيادة القوة الإحصائية لمقارنة المعالجات ذات الاهتمام وتقليل عرض فترات الثقة التي تقدر تباينات العلاج. يوضح الشكل 2 ب نسب F تتجاوز بكثير واحدة ، وتميل الاستجابة المقاسة إلى الانخفاض أثناء تحركها نحو المركز على جميع الألواح الثلاثة المتماثلة. في جميع التكرارات الثلاثة ، لوحظت فواصل ثقة بنسبة 95٪ عند المستوى 0.05 لكتلة واحدة على الأقل لا تغطي متوسط اللوحة المرصودة. لذلك ، يمكن استنتاج أن مخطط الحظر يزيد بشكل كبير من دقة هذه التقديرات. بالإضافة إلى الدقة الأقل ، قد يؤدي الفشل في حساب تباين الإزعاج المكاني إلى نتائج زائفة بسبب إمكانية الخلط بين تأثيرات العلاج وتأثير الحافة.

على الرغم من أن هناك تاريخا طويلا من بروتوكولات عزل وتعداء البروتوبلاست من الذرة المائية التي يعود تاريخها إلى أوائل التسعينيات ، إلا أن هذا البروتوكول يقدم بعض التعديلات الإضافية على الإجراء التقليدي لتسهيل عزل البروتوبلاست القابل للتكرار بشكل أفضل لأغراض تعداء البروتوبلاست^{عالي الإنتاجية 20}. تقلل خطوات تعقيم سطح أنسجة البذور والأوراق قبل الهضم من التلوث الفطري دون الحاجة إلى وسائط معقمة. سيساعد استخدام التربة أيضا في الحفاظ على انخفاض التكاليف بالنسبة لاستخدام وسائط النمو المتخصصة أو شراء حاويات معقمة تستخدم لمرة واحدة. يمكن توسيع نطاق البروتوكول في مراحل عديدة لاستيعاب مستويات مختلفة من الإنتاجية. ينتج عن ما يقرب من 2 جم من أنسجة الأوراق الأولى ما بين 5 × 10⁶ - 10 × 10⁶ بروتوبلاست. نظرا لأن 5 × 10⁶ بروتوبلاست مطلوبة لكل تعداء للوحة 96 بئرا ، فإن بروتوكول العزل ، كما هو مكتوب ، يمكن أن يستوعب 2 تشغيل من بروتوكول التعداد. يستخدم هذا البروتوكول أيضا MMg كمحلول غسيل بدلا من محلول W5 الأساسي. تم اشتقاق هذا في الأصل من منشورات نبات الأرابيدوبسيس الجذر البروتوبلاست كوسيلة لتقليل عدد المحاليل العازلة المستخدمة في أي خطوة معينة من إجراء تعداء البروتوبلاست²¹. ومع ذلك ، فقد تم استخدامه أيضا في بروتوبلاست أوراق الذرة المصابة خلال عام 2022²². سيكون المزيد من التحسين في عزل وتعدي أي بروتوكول بروتوبلاست هو تبسيط وتقليل المحاليل العازلة. كما هو الحال حاليا ، ينتقل هذا البروتوكول بين المخزن المؤقت للهضم الأساسي ، والمخزن المؤقت W5 ، والمخزن المؤقت MMg ، والمخزن المؤقت ل WI. سيكون تبسيط الحلول مفيدا جدا لتحسين قابلية استنساخ تجارب البروتوبلاست وتقليل التباين من شخص لآخر أو من دفعة إلى دفعة بين التجارب. من الملاحظ أن آخر حداثة في البروتوكول هي عدم وجود إزالة كاملة لحلول المخزن المؤقت بعد تعداء PEG. السبب في أن الأتمتة ممكنة هو أن الذرة البروتوبلاستية الموضحة هنا وغيرها من الذرة التي اختبرناها ، هو أنها تبدو متسامحة مع التخفيف كوسيلة لإخماد التفاعل بدلا من الإزالة الكاملة للمحاليل العازلة المختلفة¹¹. يشير إنتاج المراسل ، كما هو موضح في التحكم في تعداء GFP المستخدم هنا ، إلى أن البروتوبلاست يمكن أن يتحمل ما يصل إلى 5٪ PEG دون أي تأثير سلبي على شدة التألق (الشكل التكميلي 6). هذه القيمة أكثر من ضعف تركيز PEG المتوقع عند الانتهاء من البروتوكول الموصوف هنا.

الشكل 1: تخطيطي توضيحي لإجراء عزل البروتوبلاست وتعداده. يشار إلى الخطوات التي تم فيها إدخال الأتمتة بالخطوط الحمراء المتقطعة والمربعات الزرقاء المصاحبة. تتوافق الأرقام المحاطة بدائرة حمراء مع الطرق الثلاث الموصوفة. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير الحافة وتأثير التخفيف من تخطيطات التكرار. (أ) الخرائط الطبوغرافية التي توضح تغيير الطية في شدة التألق لألواح 96 بئرا المنقولة باستخدام pSYN11250 بالنسبة لمتوسط اللوحة ل 3 تجارب مكررة مستقلة (Rep). يظهر متوسط هذه التجارب أيضا مع مخطط الحجب ، المشار إليه بالخطوط المنقطة الملونة المختلفة الموضوعة في الأعلى. (ب) مخططات شريطية توضح وسائل الكتلة كنسبة مئوية من متوسط اللوحة الإجمالي للألواح المكررة 1 و 2 و 3 من اليسار إلى اليمين. تمثل الدوائر شبه الشفافة نقاط البيانات الأولية بعد قسمتها على متوسط اللوحة. أشرطة الخطأ هي فواصل ثقة بنسبة 95٪ عند المستوى 0.05 ، مع إشارة الشرطة المركزية إلى المتوسط. تشير الألوان البني والذهبي والرمادي إلى الحافة والصف الثاني والجزء الداخلي من اللوحة ، على التوالي. يمثل الخط الأحمر المتقطع عند 100٪ متوسط اللوحة الإجمالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخزن مؤقت	الكاشف
هضم	1.5٪ السليلوز روبية
	0.3٪ كبير الإنزيم
	0.6 م مانيتول
	10 ملي متر MES (درجة الحموضة 5.7)
	1 ملي كلوريدالتيجيد 2
	0.1٪ (وزن / حجم) BSA
	0.5 نانومتر β-Mercaptoethanol أو 0.5 mM DTT
م.إم جي	0.6 م مانيتول
	15 ملي ملغم كلوريد2
	4 ملي ميغابايت MES ، درجة الحموضة 5.7
W5	154 ملي كلوريد الصوديوم
	125 ملي CaCl2
	5 ملي KCl
	2 ملي ميغابايت MES ، درجة الحموضة 5.7
اي	0.6 م مانيتول
	4 ملي ميغابايت MES ، درجة الحموضة 5.7
	4 ملي كيلوسيل
الوتد	30٪ PEG (وزن / حجم)
	0.6 م مانيتول
	100 ملي كلوريدالمكالس 2

الجدول 1: حلول عازلة لعزل ونقل بروتوبلاست الذرة المبطلة.

مندوب	مصدر	مدافع	مجموع متر مربع	مينيسوتا مربع	قيمة F	العلاقات العامة (>ف)
النسخ المتماثل 1	حجز	2	0.26	0.13	10.64	<0.001
	المتبقيه	93	1.135	0.012
النسخ المتماثل 2	حجز	2	0.507	0.25	21.41	<0.001
	المتبقيه	93	1.102	0.012
النسخ المتماثل 3	حجز	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	المتبقيه	93	1.861	0.02

الجدول 2: جدول ANOVA أحادي الاتجاه للتكرارات الثلاثة لتجربة تعداء pSYN11250 ذات 96 بئرا. لكل لوحة مكررة: يشير عمود المصدر إلى مصدر التباين ، ويشير Df إلى درجات الحرية ، ويشير Sum Sq إلى مجموع المربعات ، ويشير Mn Sq إلى متوسط المربعات (Sum Sq / Df) ، وتشير قيمة F إلى نسبة Mn_Sq (كتلة) إلى Mn_Sq (خطأ) ، وتشير Pr (>F) إلى القيمة p لاختبار F العالمي.

الشكل التكميلي 1: لقطات شاشة للوحة معلومات البرنامج. فئات الاختيار التي تتعلق بعمل طريقة جديدة بالإضافة إلى تخطيطات سطح السفينة لبروتوكولات التوزيع العشوائي والنقل. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: الخطوات الرئيسية في إعداد بروتوكول إنشاء لوحة التعديد. لقطات الشاشة التي تم التقاطها أثناء إنشاء بروتوكول إنشاء لوحة التعداد. يتوافق رقم وعنوان كل لوحة مع الخطوات الواردة في البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: لقطات شاشة لمعالجة أدوات المختبر وتحميل الأطراف لإنشاء بروتوكول التعداد. تمثل هذه الخطوات التي تحدث عدة مرات في جميع أنحاء البروتوكول ، لذا لتجنب تكرار الإشارة ، يتم عرض الخطوات التمثيلية هنا. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: خلط الحمض النووي للخلية من خلال إيقاف المستخدم مؤقتا 1. لقطات شاشة تم التقاطها أثناء إنشاء بروتوكول التعداد. يتوافق رقم وعنوان كل لوحة مع الخطوات داخل نص البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: إزالة المواد الطفية بعد إيقاف المستخدم المؤقت 1 من خلال نقل العينات إلى صفيحة دقيقة. لقطات شاشة تم التقاطها أثناء إنشاء بروتوكول التعداد. يتوافق رقم وعنوان كل لوحة مع الخطوات داخل نص البروتوكول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: ZsGreen منقول من أوراق الذرة المتبادلة البروتوبلاست المعالجة بتركيزات مختلفة من PEG في المسار الزمني للمخزن المؤقت WI. يوضح الرسم البياني الشريطي شدة التألق النسبية للبروتوبلاست بعد معالجة PEG في 24 و 48 و 72 ساعة مع القياس بواسطة قارئ صفيحة دقيقة. شريط الخطأ = SD ، n = 4. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لأتمتة إنشاء لوحة تعداء وعزل بروتوبلاست أوراق الذرة الممتدة مع تعداء آلي. من أجل الإكمال الناجح لجزء إنشاء لوحة الإرسال من البروتوكول ، فإنه يتطلب روبوتا آليا لمعالجة السوائل مزود بجراب من 8 قنوات. بالنسبة لبروتوكول التعداء ، يوصى باستخدام جراب 96 بئرا لتعداء الألواح الكاملة والموحدة المكونة من 96 بئرا. يمكن إكمال طريقة التعدي باستخدام جراب من 8 قنوات ، ولكن يجب إيلاء اعتبار خاص لمقدار الوقت الذي تستغرقه خطوات الشفط والاستغناء ، بالإضافة إلى الوقت الذي يمكن أن يعزى إلى تغيير الأطراف بين الأعمدة. تم توثيق الاختلافات في مدة حضانة PEG جيدا ليكون لها تأثير كبير على كفاءة التعدي والتعبير عنه ، وبالتالي ، يجب مراعاة اهتمام خاص لهذه العوامل المساهمة لمنع التباين في معالجة^{العينة 13}. قبل بدء بروتوكول معالج السوائل ، من المهم مراعاة خطوات البروتوكول وما إذا كان يمكن إكمال أنشطة معينة في وقت واحد. يستخدم هذا البروتوكول جهازا يقوم بتحميل النصائح على جراب 96 بئرا من موضع واحد على سطح السفينة. يشتمل معالج السائل لهذا البروتوكول على وظيفة حيث يقوم الروبوت بتبديل مربعات الإكرامية أثناء فترات الحضانة أو أثناء خطوات إيقاف المستخدم مؤقتا لتجنب إضافة وقت إضافي إلى البروتوكول. عند اتخاذ قرار شراء معالج سائل ، فكر في الوظائف ووسائل الراحة المحتملة الموفرة للوقت.

بينما تم تطوير هذا البروتوكول لاستخدام أجهزة Beckman Coulter NXp و Biomek FX ، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أي جهاز مناولة سوائل مماثل. تمتلك جميع معالجات السوائل بعض الوسائل للإشارة إلى كيفية نقل الأحجام من موقع إلى آخر ومقدارها. بالنسبة لهذا البروتوكول، استخدمت هذه الأجهزة أمر سطر النقل من الملف. إذا تم تعريف أدوات المختبر بشكل صحيح ، فيمكن للمستخدم الانتقال من أو إلى أي سفينة. في ظروف استثنائية ، مثل إذا كانت رفوف الأنبوب أو المحولات غير متوفرة تجاريا ، يمكن استخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد هذه الموصلات. بالنسبة لبروتوكولات تعداء البروتوبلاست النموذجية ، فإن 20 ميكروغرام من الحمض النووي بتركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر هو حجم قياسي للمواد للعديد من منصات البروتوبلاست¹³_. أثناء إنشاء لوحة الإرسال ، كإجراء احترازي إضافي ، استخدم أطراف مرشح 0.2 - 20 ميكرولتر لتقليل أي مخاطر تلوث بسبب البلازميد الهباء الجوي أثناء النقل. تؤدي إزالة المكون البشري للتحضير إلى تقليل التباين بمرور الوقت وتحسين قابلية استنساخ هذه التجارب عالية الإنتاجية. أيضا ، يمكن تحضير الأطباق في وقت مبكر. سيخفف هذا المستحضر من إجهاد عالم التعدي في يوم التجربة. ومع ذلك ، من المهم تجنب تخزين هذه الألواح من الحمض النووي البلازميد عند 4 درجات مئوية لفترات طويلة من الزمن حيث قد تتبخر العينات. يجب تخزين العينات في ثلاجة -20 درجة مئوية ويمكن بعد ذلك إذابة الثلج في الثلاجة 4 درجات مئوية قبل التعداد. بمجرد برمجة بروتوكول إنشاء لوحة الإرسال هذا ، يجب أن يكون قابلا للتكرار بسهولة عن طريق توفير .csv نقل جديد من ملف واحتلال نفس مواقع سطح السفينة للعينات وأدوات المختبر والكواشف.

بالنسبة لإجراء التعدين الآلي (الخطوة 3) ، يتم إعداد فائض من محلول PEG لضمان الشفط المتساوي للسائل اللزج من الحوض الصغير ، وعادة ما يكون فائضا بمقدار 40 مل لحساب الحجم الميت. يمكن أن يؤدي استخدام الكمية المطلوبة بالضبط للتعداء إلى سحب الهواء إلى الماصات وشفط الأحجام غير المتساوية من PEG عبر رأس 96 قناة. بينما يمكن أيضا تحضير هذا المحلول في وقت مبكر ، يوصى بإعداده في يوم التعداد. يمكن تعقيم محلول PEG باستخدام مرشح حقنة ، ولكن بسبب اللزوجة قد يكون صعبا. يعد استخدام وحدة التصفية الفراغية أسرع ويمكن أن يخفف من أي إحباط أو ألم مرتبط بهذا النشاط. مثل محلول PEG ، يتم أيضا توفير فائض من محاليل المخزن المؤقت للتعداء الأخرى (W5 ، WI) لضمان سحب العينة المتساوي عبر رأس 96 قناة. يمكن تحضير حلول المخزن المؤقت (W5 و WI) في وقت مبكر بكميات كبيرة لاستخدامها في عمليات معالجة السوائل المستقبلية. في حين أن الكواشف ليست مكلفة ، إلا أن هناك قدرا كبيرا من التضحية بالمحلول العازلة. مع تزايد عدد عمليات التشغيل يوميا ، قد يكون من الأفضل استخدام بدائل للخزان من شأنها تقليل الفائض الذي يتم التخلص منه في نهاية التشغيل. أثناء تشغيل بروتوكول معالج السائل ، يمكن إضافة W5 و WI إلى أحواض كل منهما قبل بدء البروتوكول ، أو أثناء الحضانة لمدة 15 دقيقة ، أو أثناء خطوات إيقاف المستخدم مؤقتا في البروتوكول. كن حذرا عند إضافة مخازن مؤقتة خلال فترة الحضانة بسبب ميزات الأمان مثل الستارة الخفيفة. تأكد من مسح أي رسائل تحذير من البرنامج لمنع أي انقطاع غير مقصود للبروتوكول.

يعكس هذا البروتوكول تحسينا موثوقا به وقابلا للتكرار وقابلا للتطبيق على نطاق واسع على البروتوكولات الآلية الموثقة مسبقا للتعامل مع protoplast^12،13. هذه الطريقة قابلة للتكيف مع الذخيرة التي لا نهاية لها على ما يبدو من بروتوكولات البروتوبلاست حيث يعتمد العديد منها على نفس السلسلة من خطوات معالجة المخزن المؤقت. يقلل التخفيف من تأثير الحافة من خلال RICBD أثناء إنشاء لوحة التعداء الآلي في نفس الوقت من مقدار الجهد والتباين مع تطبيق تصحيح ذي دلالة إحصائية لتأثير الحافة. إن تعداء الكبسولة المكونة من 96 بئرا للبروتوبلاست يلغي إمكانية حدوث أي اختلاف مرتبط بوقت حضانة PEG ، مما يؤدي إلى إجراء التفاعل داخل جميع الآبار البالغ عددها 96 بئرا في وقت واحد. في حين أن البروتوكول كان يهدف إلى تحقيق الأتمتة الكاملة لخطوات التعدي ، فإن توقف المستخدم مؤقتا سيتطلب تدخلا ماديا من قبل عالم التعدي. في السنوات الأخيرة ، كان هناك العديد من التطورات في أجهزة الطرد المركزي المتسامحة مع عدم التوازن والمتوافقة مع الأتمتة. باستخدام هذه المعدات ، سيكون من الممكن أتمتة الطريقة بأكملها دون تدخل المستخدم. بدلا من ذلك ، تجنبت البروتوكولات الأخرى الطرد المركزي من خلال السماح للبروتوبلاست بالاستقرار في قاع البئر بعد التعدي^12،13. ومع ذلك ، فإن هذا سيضيف وقتا إضافيا لإجراء التعدي وزيادة الوقت في الحضانة في المخزن المؤقت W5 قبل الحضانة الليلية في WI.

في أماكن عديدة في طريقة التعدي ، يصف التعامل مع الأحجام التي تتجاوز 200 ميكرولتر حيث يجب أن تتم معالجة السائل باستخدام عمليات نقل متعددة. اعتمادا على عمر وطراز معالج السوائل ، يمكن ويجب القيام بهذه الخطوة كحجم واحد. بالنسبة لمعالجات السوائل القديمة ، مثل النموذج الموضح هنا ، فإن أكثر ما يمكن استنزاقه باستخدام رأس 96 بئرا هو 200 ميكرولتر. ومن التحسينات الواضحة التي أدخلت على الطريقة من حيث الكفاءة والدقة على حد سواء تقليل عدد عمليات النقل للتقليل إلى أدنى حد من أي خطر محتمل للانسكاب أو التنقيط أو التلوث. تم تحديد اعتبارات أخرى لتحسين بروتوكولات مناولة السوائل في استعراضات هذه التقنيات واستخدامها في مجال التكنولوجيا^{الحيوية 23}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)&بيتا;-mercaptoethanol	Sigma	M6250
2- (N-Morpholino) حمض الإيثان سلفونيك (MES) أحادي الهيدرات	Sigma	69892
50 مل أنابيب الطرد المركزي مع غطاء مسطح معقم	فيشر	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase أسود مع غطاء ثقافة خلية معقمة PS .4 مل بئر	فيشر	12-566-70
نصائح روبوتية Axygen Biomek FX / NX ، غير معقمة ، واسعة التجويف	فيشر	14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL مرشح ، معقم ، أرفف	فيشر	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style فراغ المجففات	فيشر	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 قدم مختبر لفة Parafilm   ؛	فيشر	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences مقياس الدم القابل للتصرف	فيشر	50-131-1352
كلوركس مبيض مبيد للجراثيم ، فيشر المركز		NC1871274
كورنينج شريط ختم الألومنيوم Microplate   ؛	فيشر	07-200-684
كتل فحص كورنينج 96 بئر ، 2 مل ، 96 بئر قياسي	فيشر	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol & nbsp ؛	Sigma	M9546
Fisherbrand 60 مل حقنة بلاستيكية	فيشر	14-955-461
مصفاة خلية معقمة من فيشربراند 40um	فيشر	22-363-547
أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، قابلة للتكديس ، 100 مم × 25 مم ، علبة 325	فيشر	FB0875711
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات	سيجما	M2670
وحدة تصفية مدفوعة بالحقنة Millex معقمة 33 مم PES .22um	وحدة تصفية مدفوعة	SLGPR33RS
Millex معقمة 33 مم PVDF.45um	فيشر	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip وحدات تصفية فراغ معقمة يمكن التخلص منها 50 مل PES	فيشر	SCGP00525
بولي (إيثيلين جلايكول) 4000 & nbsp ؛	سيجما	81240
ريدي-إيرث التوصيل & مزيج الشتلات	وايت كوارلز	GP92747
شفرات حلاقة أحادية الحافة للخدمة العادية من الصلب الخلفي .009RD	فيشر	12-640
منتجات الأبحاث الدولية شركة Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
كلوريد الصوديوم	Sigma	S7653
درج إدراج - 36 خلية - 6x6 متداخلة	Hummert	11635000
Tween-20	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 ، 100-120 فولت ، 50/60 هرتز ، قابس أمريكي	VWR	97058-164