يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تمكين دراسات التعبير الجينات المعدلة وراثيا عالية الإنتاجية باستخدام معالجة السوائل الآلية للبروتوبلاستات المصنوعة من أوراق الذرة

968 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/65989

⸱

فبراير 16, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Syngenta Crop Protection, LLC

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول إنشاء تخطيط تعداء عشوائي باستخدام معالج سائل آلي ، وبروتوكول عزل البروتوبلاست لأوراق الذرة المبتذلة ، وإجراء تعداء 96 بئرا باستخدام معالج سائل.

الملخص

شهد مجال التكنولوجيا الحيوية النباتية تطورات ملحوظة في السنوات الأخيرة ، مما أحدث ثورة في القدرة على معالجة النباتات وهندستها لأغراض مختلفة. ومع ذلك ، مع زيادة التنوع في البحث في هذا المجال وتعقيدا بشكل متزايد ، فإن الحاجة إلى حلول فحص عابرة مبكرة وفعالة ويمكن الاعتماد عليها وعالية الإنتاجية لتضييق نطاق الاستراتيجيات التي تمضي قدما في التحول المستقر أصبحت أكثر وضوحا. إحدى الطرق التي عادت إلى الظهور في السنوات الأخيرة هي استخدام البروتوبلاست النباتي ، حيث تتوفر طرق العزل والتعداء في العديد من الأنواع والأنسجة ومراحل النمو. يصف هذا العمل بروتوكولا آليا بسيطا للتحضير العشوائي للبلازميد داخل صفيحة مكونة من 96 بئرا ، وطريقة لعزل بروتوبلاست أوراق الذرة المبطلة ، وإجراء التعداء الآلي. يمثل اعتماد الحلول الآلية في التكنولوجيا الحيوية النباتية ، والتي تتمثل في بروتوكولات مناولة السوائل الجديدة هذه لتعداء البروتوبلاست النباتي ، تقدما كبيرا على الطرق اليدوية. من خلال الاستفادة من الأتمتة ، يمكن للباحثين التغلب بسهولة على قيود الأساليب التقليدية ، وتعزيز الكفاءة ، وتسريع التقدم العلمي.

المقدمة

يعد تعداء البروتوبلاست النباتي ، وهو إدخال مادة وراثية غريبة في الخلايا النباتية الخالية من جدران الخلايا ، تقنية محورية ، وفي نصف القرن الماضي ، تشمل العديد من الأنواع لدعم أبحاث التكنولوجيا الحيوية النباتية. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه الطرق يمكن أن يكون مؤلما ومحدودا في النطاق ، حتى مع إنتاج ملايين البروتوبلاست في كل عزلة. غالبا ما تكون الطرق التقليدية لتعداء البروتوبلاست النباتي شاقة وتستغرق وقتا طويلا وعرضة للتباين ومتطلبة تقنيا ، مما يؤدي إلى أنظمة متخصصة ذات قابلية منخفضة للتكاثر1. ومع ذلك ، فإن الإمكانات التي أدخلتها الحلول الآلية في السنوات الأخيرة تسلط الضوء على إمكانية بث حياة جديدة في هذه التقنية الشابة البالغة من العمر 60 عاما 2,3. مع إمكانية أتمتة الخطوات الحاسمة والمتكررة مثل تحضير المواد ، وحضانة بولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، وتوزيع كاشف التعدي اللاحق ، يمكن للباحثين تقليل متطلبات المناولة المادية والمصادر المحتملة الأخرى للخطأ البشريبشكل كبير 4. علاوة على ذلك ، يضمن التحكم الدقيق والتوحيد الذي توفره أنظمة معالجة السوائل الآلية نتائج تعداء متسقة وقابلة للتكرار.

في حين أن عزل البروتوبلاست هو عملية دقيقة تتضمن التقطيع والهضم والحضانة والترشيح والطرد المركزي ، فإن جزء التعدي من هذه البروتوكولات مصمم خصيصا لمعالجات السوائل الآلية. يتم إجراء معظم بروتوكولات تعداء البروتوبلاست بوساطة PEG ، وخلط البروتوبلاست المعزول في وجود PEG والحمض النووي البلازميد المنقى لمدة محددة بتركيز دقيق (يعتمد على الأنواع والأنسجة) يسمح لهذه الخلايا بأخذ الحمض النووي البلازميد5. يتبع هذا التعدي سلسلة من خطوات الغسيل ، وتبلغ ذروتها في حضانةليلية 6. بعد فترة الحضانة ، إذا تم تصميم كل شيء وتسليمه بشكل صحيح ، فإن التجربة تؤدي إلى التعبير عن المكون محل الاهتمام و / أو إمكانية تقييم المكونات التنظيمية المختلفة7. عادة ما يتم التعامل مع جميع خطوات الشفط والاستغناء والتحريض / الخلط المرتبطة بهذا الإجراء بواسطة ماصة يدوية. يعد تنفيذ مثل هذا البروتوكول يدويا ، تفاعلا فرديا واحدا في كل مرة ، أمرا شاقا ويقدم تباينا غير ضروري بين العينات مع الحد أيضا من السعة التي يمكن تقييمها في أي وقت. كانت البروتوكولات الآلية للتلاعب بخلايا الثدييات أو الحشرات والتخليق الكيميائي في صناعة الأدوية قيد التنفيذ لعدة سنوات4،8،9. يتزايد استخدام البروتوبلاست والبروتوكولات التي تنطوي على مناولة السوائل الآلية للمواد النباتية10،11،12،13.

إن اعتماد بروتوكولات معالجة السوائل الآلية لتعداء البروتوبلاست النباتي يحمل وعدا كبيرا للتطبيقات البحثية. يمكن للباحثين استكشاف مكتبات وراثية أكبر ، وفحص وظائف جينية محددة بوتيرة متسارعة ، والتحقيق في التفاعلات الجينية المعقدة المتعلقة بإجهاد النبات بشكل أكثر شمولا14. تتيح قابلية التوسع للأساليب الآلية التي تستخدم كبسولات ذات 96 بئرا جنبا إلى جنب مع فحص التألق إجراء تجارب عالية الإنتاجية وتسمح للعلماء بتوليد البيانات والرؤى بسرعة التي يمكن أن تغذي التقدم في التكنولوجيا الحيويةالنباتية 11. ومع ذلك ، مع هذه الزيادة في الإنتاجية ، مما يؤدي إلى توليد مئات ، إن لم يكن الآلاف من نقاط البيانات ، يجب أن يكون هناك مراقبة جودة إضافية تفسر أي مصادر خطأ قد تربك النتائج15. أحد العناصر التي تم تحديدها كعامل مساهم في العديد من التخصصات العلمية هو تأثير الحافة. ستقترح بعض استراتيجيات التخفيف أفضل صفيحة لاستخدامها أو ملء المساحة بين الآبار أو الآبار الخارجية بالمياه لمكافحة هذه الظاهرة16،17. ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجيات تضيف الوقت ، وإذا لم يكن هناك شيء معين يمكن التخلص منه متاحا ، فإن الخيار الوحيد هو القبول بأقل أو تأجيله. بدلا من ذلك ، فإن النظر إلى الاستراتيجيات التي تأخذ في الحسبان هذا التأثير عبر مخطط الحظر لا يضحي بالإنتاجية أو يؤخر التنفيذ.

يسعى بروتوكول البروتوبلاست لأوراق الذرة المسبب وطريقتيه الآليتين الموضحين في الشكل 1 إلى معالجة التباين المتأصل في تجارب البروتوبلاست عن طريق أتمتة أجزاء متعددة من طريقة البروتوبلاست المتعارف عليها ، وتخصيص مادة البلازميد للوعاء المستخدم في التعدي ، والتعداء نفسها. يتم توضيح هذه الطرق لمنصة بروتوبلاست أوراق الذرة المبطلة لأنها منصة بروتوبلاست جيدة التميز وبسيطة وفعالة. يمكن الوصول إلى جميع الخطوات المفصلة على الفور من خلال بروتوكولات نقل البروتوبلاست ، والتي تستخدم حلول مؤقتة مماثلة أو نفسها. ومع ذلك ، يجب مراعاة اهتمام خاص للخصائص الفريدة لأنسجة وأنواع مصدر البروتوبلاست قبل اعتماد هذه التقنيات. تعمل هذه التحسينات من خلال الأتمتة على تبسيط إعداد المواد للتجارب الفردية وتحسين الإنتاجية بشكل كبير ، من التعداء المتسلسل واحدا تلو الآخر إلى 96 تعداء يتم التعامل معها في وقت واحد. سيظهر هذا العمل أيضا مبررا لاستخدام الكتل العشوائية غير المكتملة لحساب التحيز الموضعي للوحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إنشاء لوحة الإرسال

  1. إنشاء تخطيط سطح السفينة: لإنشاء طريقة عشوائية للوحة DNA ، افتح برنامج معالج السوائل. انقر على طريقة جديدة زر من شريط القائمة لإنشاء طريقة جديدة. أضف خط إعداد الأداة بين خطي البداية والانتهاء بالضغط على زر إعداد الأداة على اللوحة اليسرى.
    ملاحظة: يمكن العثور على لقطات الشاشة ذات الصلة التي تتبع هذا البروتوكول الآلي في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3.
  2. انقر فوق سطر إعداد الأداة ، وابحث عن أدوات المختبر الصحيحة من قائمة فئة Labware ، واسحبها إلى تخطيط سطح السفينة كما هو موضح في الشكل التكميلي 1.
    ملاحظة: إذا لم يتم تعريف أدوات المختبر مسبقا ، فستحتاج إلى برمجتها في معالج السوائل وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، ولكن هذه التعليمات خارج نطاق هذا البروتوكول.
  3. نقل من إعداد الملف: اضغط على زر Transfer From File في لوحات الخطوات وضع سطر Transfer From File أسفل سطر إعداد الأداة. تأكد من أن اختيار الطرف واستبداله كما هو موضح في الشكل التكميلي 3.
  4. حدد أن الملف يحتوي على صف رأس وتأكد من صحة معلومات العمود.
  5. اضغط على منطقة المصدر لتنشيطها وانقر فوق لوحة المصدر من تخطيط سطح السفينة ، وحدد اللوحة المستهدفة ، وأدخل كمية الحمض النووي المراد سحب العينات.
  6. اضغط على زر التخصيص لتحديد تقنية سحب العينات بالتفصيل، مثل لمسات الأطراف على الحائط.
  7. حدد كمية الحمض النووي البلازميد المراد نقلها. يستخدم هذا البروتوكول 20 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد لكل تعداء (جيد).
    ملاحظة: ستعتمد كمية الحمض النووي البلازميد التي يتم نقلها إلى لوحة التعداء قبل تعداء البروتوبلاست على منصة البروتوبلاست المستخدمة.
  8. إنشاء مستند نقل من ملف .csv.
    1. يتكون هذا المستند من عمودين. قم بإعداد العمود الأول ، أي العمود من ، والذي يشير إلى موقع الحمض النووي البلازميد للمخزون داخل رف الأنبوب ، أي للعينة 1 ؛ سيكون هذا جيدا A01. نظرا لأن هذا النقل يحدث ثلاث مرات (ثلاثة ممثلين) ، يجب أن تشير ثلاثة صفوف إلى A01 في العمود من.
    2. قم بإعداد العمود الثاني ، أي إلى العمود ، المستخدم لتحديد بئر وجهة بناء البلازميد للوحة 96 بئرا. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون العينة 1 (A01) B02 و D04 و H07. احفظ هذا كملف .csv ليكون متوافقا مع برنامج معالج السوائل.
  9. قبل تشغيل البروتوكول ، تحقق من تحميل مواضع سطح السفينة ، وتحديد برامج المختبر بشكل صحيح ، ويتضمن مستند التوزيع العشوائي مواقع جيدة لجميع عينة الحمض النووي في رف الأنبوب ، وأن هناك عينة بلازميد كافية في الأنابيب لتنفيذ البروتوكول.
  10. قم بتوسيع قائمة خصائص الملف لخطوة النقل من الملف، وحدد الملف .csv الذي تم إنشاؤه وقم بتشغيل البروتوكول.
  11. قم بتغطية ألواح التعداء بختم من رقائق الألومنيوم عند اكتمال البروتوكول بنجاح. قم بتخزين ألواح الإرسال عند -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. ستتم إضافة بروتوبلاست أوراق الذرة المعزولة إلى لوحة التعداء هذه في الخطوة 3.3.

2. عزل البروتوبلاست من أوراق الذرة المسخنة

  1. لبدء عزل بروتوبلاست أوراق الذرة المعطلة ، احصل على خلفية وراثية متوافقة مع البروتوبلاست مثل NP222 التي تم استخدامها هنا18. قم بإعداد 3 مخازن مؤقتة فقط ، وهي المخازن المؤقتة MMg و W5 و WI ، المدرجة في الجدول 1 قبل بدء التجربة واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية. قم بإعداد محلول الهضم و PEG في يوم التجربة للحصول على أفضل النتائج.
  2. يقوم السطح بتعقيم 25 بذرة عن طريق غمرها أولا في محلول مبيض تجاري بنسبة 25٪ ورجها على شاكر منصة دوارة لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد التقليب ، اشطف البذور جيدا باستخدام الماء المعقم (DI). كرر خطوة الشطف 5x. تشرب البذور في ماء معقم طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  4. زرع البذور على تربة رطبة معقمة في اليوم التالي. أضف كريات الطين الجافة لإزالة الرطوبة الزائدة من التربة لمنع التلوث الفطري.
  5. قم بزراعة شتلات الذرة في غرفة نمو خفيفة لمدة 16 ساعة عند 28 درجة مئوية (الرطوبة النسبية (RH) 30٪) لمدة 3 أيام تقريبا حتى يصل القمر إلى 1-2 سم فوق التربة ثم انقله إلى غرفة مظلمة بنفس درجة الحرارة والرطوبة النسبية لمدة 5-7 أيام إضافية.
  6. احصد أول نسيج ورقي حقيقي عن طريق قصه فوق الطوق الأول مباشرة.
  7. يعقم السطح أنسجة الأوراق لفترة وجيزة في 25٪ مبيض تجاري و 250 ميكرولتر من محلول 20٪ Tween 20 لمدة 1 دقيقة. اشطف مادة الأوراق جيدا 5 مرات بماء DI.
  8. جفف أنسجة أوراق الذرة (برفق) بأنسجة خالية من النسالة ، وباستخدام شفرة حادة ، قم بإزالة ~ 1.5 سم من طرف وقاعدة كل شفرة ورقة.
  9. قطع أنسجة الأوراق المتبقية إلى شرائح عرضية ضيقة (0.5 مم - 1 مم) وضعها في طبق بتري مقاس 100 × 25 مم.
  10. قم بتعقيم 25 مل من محلول الهضم من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة في طبق بتري الذي يحتوي على الأنسجة المقطعة.
  11. يتسلل الفراغ إلى أنسجة الأوراق بمحلول الهضم عن طريق تطبيق الفراغ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مجفف فراغ عند ضغط -75 ملي بار تقريبا.
    ملاحظة: يجب أن يكون ضغط الفراغ المنزلي للعديد من المختبرات الأكاديمية والخاصة كافيا لهذه الخطوة.
  12. ضعه على شاكر منصة دوار ورجه عند 25 درجة مئوية في الظلام عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 إلى 3 ساعات. عندما يتبقى 10 دقائق حتى نهاية فترة الهضم ، قم بزيادة السرعة إلى 90 دورة في الدقيقة.
  13. صب محلول الهضم وأي مادة نباتية غير مهضومة من خلال قمع فوق مرشح غربال 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل.
  14. الطرد المركزي المحلول داخل أنبوب 50 مل عند 150 × جم لمدة 4 دقائق لحبيبات البروتوبلاست. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 10-15 مل من محلول MMg Buffer.
  15. كرر الطرد المركزي وقم بإزالة المادة الطافية. أعد التعليق في 5 - 10 مل من المخزن المؤقت MMg الطازج.
  16. باستخدام مقياس كثافة الدم ، قم بقياس كثافة البروتوبلاست المعزول بعناية. أعد التعليق إلى كثافة تقريبية تبلغ 5 × 105 بروتوبلاست لكل مل.
  17. اسمح للعزل بالراحة على الجليد لمدة ~ 30 دقيقة قبل التعداد. خلال هذا الوقت ، قم بإعداد محلول PEG. قم بإذابة PEG تماما في محلول باستخدام حمام مائي 37 درجة مئوية واتركه هناك حتى التعداد.

3. تعداء البروتوبلاست الآلي

ملاحظة: تتم إدارة الخطوات من 3.6 إلى 3.15 بالكامل بواسطة معالج السوائل الآلي، باستثناء توقفي المستخدم مؤقتا عند الخطوتين 3.10 و3.13، اللتين تتطلبان الطرد المركزي اليدوي. يمكن العثور على لقطات الشاشة ذات الصلة التي تتبع هذا البروتوكول الآلي في الملحق ، الشكل التكميلي 1 ، الشكل التكميلي 3 ، الشكل التكميلي 4 ، والشكل التكميلي 5.

  1. قم بإعداد تخطيط سطح السفينة لمعالج السائل للتعداء وفقا لطريقة تعداء البروتوبلاست الموضحة في الخطوات التالية. قم بتجميع المواد التالية: لوحة الوجهة (في هذه الحالة ، ستكون سوداء سعة 96 بئرا مع صفيحة دقيقة سفلية شفافة لقياس التألق) ، صندوق واحد من 25 - 250 ميكرولتر نصائح أتمتة عريضة التجويف لخطوة شفط PEG ، خمسة صناديق من 25 - 250 ميكرولتر أطراف أتمتة الماصة لخطوات معالجة السوائل المتبقية ، ثلاثة أحواض بلاستيكية كخزانات كاشف ، لوحة واحدة فارغة من 96 بئرا لجمع النفايات ، ومحاليل الغسيل العازلة المتبقية ، W5 و WI.
  2. مباشرة قبل بدء إجراء التعدي ، قم بتصفية تعقيم محلول PEG من خلال وحدة تصفية فراغ معقمة يمكن التخلص منها 0.22 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.
  3. من البروتوبلاست المعلق في المخزن المؤقت MMg ، أضف 100 ميكرولتر (حوالي 50.000 بروتوبلاست) إلى كل بئر من لوحة التعداء المعدة مسبقا والمذابة. للقيام بذلك ، اسكب محلول المخزن المؤقت المحتوي على البروتوبلاست في حوض معقم سعة 10 مل واستخدم ماصة متعددة القنوات. استمر في التقليب اللطيف للحوض الصغير لمنع البروتوبلاست من الاستقرار خارج المحلول أثناء خطوة النقل اليدوي هذه.
  4. صب محلول PEG في الحوض المناسب ووضع لوحة التعداء ، التي تحتوي الآن على البروتوبلاست والحمض النووي البلازميد الذي يحتوي على لوحة تعداء ، محضرة باستخدام الخطوة 1 ، في الموقع المحدد وفقا لتخطيط السطح.
  5. لإنشاء طريقة تعداء البروتوبلاست ، افتح برنامج معالج السوائل وقم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه.
    1. نقل أدوات المختبر بين الطوابق: استبدل صندوق الطرف الفارغ على سطح تحميل الأطراف بآخر جديد باستخدام الأمر Move Labware. حدد المجموعتين من وإلى من طريقة عرض التكوين .
    2. بالنسبة للأحجام التي تزيد عن 200 ميكرولتر: لا تستبدل الأطراف بين عمليات النقل. تلميحات التحميل لخطوة النقل الأولى وإلغاء التحميل بعد خطوة النقل الأخيرة، والتي تتطلب تحديد خيارات التحميل/التفريغ بشكل صحيح لكل خطوة نقل كما في الشكل التكميلي 3.
  6. إنشاء تخطيط سطح السفينة: مثل طريقة إنشاء لوحة الإرسال ، لإنشاء طريقة تعداء آلية للحمض النووي ، افتح برنامج معالج السوائل. انقر فوق طريقة جديدة زر من شريط القائمة لإنشاء طريقة جديدة. أضف خط إعداد الأداة بين خطي البدء والانتهاء بالضغط على زر إعداد الأداة على اللوحة اليسرى. قم بإنشاء تخطيط سطح السفينة وفقا لتخطيط سطح السفينة الموضح في الشكل التكميلي 1.
  7. خلط الخلية / الحمض النووي: أضف خطوة لخلط البروتوبلاست والحمض النووي قبل إضافة PEG باستخدام زر إجراء الجهاز وإعداد الجهاز (اهتزاز محدد موضع أدوات المختبر الآلي أو ALP) ، وسرعة الاهتزاز (1500 دورة في الدقيقة) ، ووقت الاهتزاز (10 ثوان).
  8. إضافة وخلط PEG: لبدء التعدي ، أضف خطوة نقل لإضافة 110 ميكرولتر من PEG من خزان PEG باستخدام ماصة 96 جرابا. تأكد من برمجة مواضع المصدر والوجهة الصحيحة وفقا لتخطيط سطح السفينة المحدد. قم ببرمجة خطوة النقل لشفط PEG 1 مم من قاع الخزان وإيداع PEG 3 مم من قاعدة الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على خليط البروتوبلاست / الحمض النووي. أضف خطوة اهتزاز أخرى بعد إضافة PEG عن طريق نسخ ولصق الخطوات المبرمجة مسبقا.
  9. حضانة PEG: أضف خطوة إيقاف مؤقت عن طريق تحديد زر الإيقاف المؤقت ، وحدد شاكر ، وأدخل وقت الحضانة المحدد مسبقا ، والذي يبدأ من إضافة PEG.
    ملاحظة: سيستمر مؤقت الإيقاف المؤقت ما لم يكن هناك أي انقطاعات أو انقطاعات في الستائر الخفيفة قد تؤدي إلى ظهور رسالة خطأ. تأكد من أنه إذا كان التلاعب بسطح السفينة ضروريا ، مسح هذه الرسائل قبل الابتعاد.
  10. إضافة / خلط المخزن المؤقت W5: أضف ثلاثة خطوط نقل سعة 200 ميكرولتر لنقل ما مجموعه 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت W5 إلى لوحة التعداء لإخماد تفاعل حضانة PEG. اتبع إضافة المخزن المؤقت W5 عن طريق الاهتزاز وإيقاف المستخدم مؤقتا للسماح بالطرد المركزي للوحة النقل.
  11. إيقاف المستخدم مؤقتا 1: جهاز الطرد المركزي للوحة تعداء البروتوبلاست عند 100 × جم لمدة 4 دقائق. أعد لوحة التعدي ، الآن مع البروتوبلاست المحبب ، إلى موضع السطح المناسب. أضف إيقاف مؤقت للمستخدم بالنقر فوق الزر إيقاف مؤقت ، باستثناء الآن مع تحديد خيار إيقاف النظام مؤقتا للنظام بأكمله .
    ملاحظة: يجب مسح النافذة المنبثقة لرسالة الإيقاف المؤقت قبل أن يستمر معالج السائل مع بقية البروتوكول.
  12. إزالة المادة الطافية: أضف سطرين من النقل لإزالة 400 ميكرولتر من المادة الطافية ونقلها إلى صفيحة النفايات. لتجنب شفط الخلية أثناء إزالة المادة الطافية ، اضبط المسافة من القاع على 6 مم.
  13. إضافة / خلط WI أضف 3 خطوط نقل لنقل 580 ميكرولتر من المخزن المؤقت WI إلى لوحة التعداد. أضف خطوة اهتزاز أخرى بعد إضافة WI عن طريق نسخ ولصق الخطوات المبرمجة مسبقا. انتقل إلى إيقاف المستخدم المؤقت التالي.
  14. إيقاف المستخدم مؤقتا 2: جهاز الطرد المركزي للوحة تعداء البروتوبلاست عند 100 × جم لمدة 4 دقائق. أعد لوحة التعدي ، الآن مع البروتوبلاست المحبب ، إلى موضع السطح المناسب.
  15. إزالة المادة الطافية: أضف أربعة أسطر من النقل لإزالة 680 ميكرولتر من المادة الطافية ونقلها إلى صفيحة النفايات. لتجنب شفط الخلية أثناء إزالة المادة الطافية ، اضبط المسافة من القاع على 6 مم.
  16. نقل البروتوبلاستات إلى صفيحة دقيقة: يتكون النقل النهائي لهذا البروتوكول من خطوتي نقل سعة 150 ميكرولتر. قبل كل خطوة فردية ، قم بشفط البروتوبلاستات بشكل متكرر عند 50 ميكرولتر / ثانية عند 2 مم من أسفل لوحة التعدي واستغرضها عند 3 مم. بعد ذلك، باستخدام نفس أطراف الماصة، انقلها إلى الصفيحة الدقيقة للوجهة.
    ملاحظة: سيؤدي الشفط والاستغناء عن حجم المخزن المؤقت فوق الحبيبات قبل نقلها إلى الصفيحة الدقيقة إلى إزعاج أي بروتوبلاست متبقي محبوب في الجزء السفلي من لوحة التعدي لضمان عدم فقدان العينة. نظرا لأن التوزيع العشوائي قد تم أثناء إنشاء لوحة التعدي ، فإن هذا يختتم البروتوكول الآلي.
  17. احتضان الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 24 إلى 48 ساعة قبل قياس التألق الأول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الحصول على بيانات الرصد التي تدعم أن تأثيرات الحواف قد تؤثر على قياسات الاستجابة؛ تم إجراء دراسة تجريبية لتأكيد هذه الشكوك. في هذه الدراسة ، تم تطبيق الطرق المذكورة أعلاه على ثلاث ألواح مكررة مكونة من 96 بئرا بمستوى معالجة واحد فقط. تم نقل جميع البروتوبلاستات باستخدام pSYN1125019 ، وهو بلازميد يعبر بشكل أساسي عن ZsGreen ، بهدف إظهار وجود اختلافات منهجية في مستوى الاستجابة للوحدات الموجودة على حافة اللوحة مقارنة بالصف الثاني ، والمناطق المركزية من اللوحة. يتم تعريف الآبار ال 36 الموجودة على الحافة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لأتمتة إنشاء لوحة تعداء وعزل بروتوبلاست أوراق الذرة الممتدة مع تعداء آلي. من أجل الإكمال الناجح لجزء إنشاء لوحة الإرسال من البروتوكول ، فإنه يتطلب روبوتا آليا لمعالجة السوائل مزود بجراب من 8 قنوات. بالنسبة لبروتوكول التعداء ، يوصى باستخدام جراب 96 بئرا لتعداء الألواح الكاملة والموحدة المكونة من 96 بئرا. يمكن إكمال طريقة التعدي باستخدام جراب من 8 قنوات ، ولكن يجب إيلاء اعتبار خاص لمقدار الوقت الذي تستغرقه خطوات الشفط والاستغناء ، بالإضافة إلى الوقت الذي يمكن أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يتم توظيف جميع المؤلفين من قبل شركة Syngenta ، وهي شركة دولية للتكنولوجيا الحيوية الزراعية ، تستخدم بشكل روتيني تقنية التحويل لتوليد منتجات السمات المعدلة وراثيا (GM).

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا العديد من العلماء في Syngenta الذين يدعمون هذا العمل وفريقنا يوميا. يجب منح تقدير خاص للعائلة والأصدقاء الذين يعد دعمهم غير المرئي في كثير من الأحيان أمرا بالغ الأهمية لاستمرار نجاح فريق الفحص العابر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(2)&بيتا;-mercaptoethanol SigmaM6250
2- (N-Morpholino) حمض الإيثان سلفونيك (MES) أحادي الهيدراتSigma69892
50 مل أنابيب الطرد المركزي مع غطاء مسطح معقمفيشر22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase أسود مع غطاء ثقافة خلية معقمة PS .4 مل بئرفيشر12-566-70
نصائح روبوتية Axygen Biomek FX / NX ، غير معقمة ، واسعة التجويففيشر14-222-096
Axygen Robotic Tips 30uL مرشح ، معقم ، أرفففيشر14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Round Style فراغ المجففاتفيشر08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 قدم مختبر لفة Parafilm   ؛فيشر13-374-16
Biomek FXPBeckman Coulter902508
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتSigmaC5080
Chemglass Life Sciences مقياس الدم القابل للتصرف  فيشر50-131-1352
كلوركس مبيض مبيد للجراثيم ، فيشر المركزNC1871274
كورنينج شريط ختم الألومنيوم Microplate   ؛فيشر07-200-684
كتل فحص كورنينج 96 بئر ، 2 مل ، 96 بئر قياسيفيشر07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
D-Mannitol & nbsp ؛SigmaM9546
Fisherbrand 60 مل حقنة بلاستيكيةفيشر14-955-461
مصفاة خلية معقمة من فيشربراند 40umفيشر22-363-547
أطباق فيشربراند بتري بغطاء شفاف ، قابلة للتكديس ، 100 مم × 25 مم ، علبة 325فيشرFB0875711
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجماM2670
وحدة تصفية مدفوعة بالحقنة Millex معقمة 33 مم PES .22umوحدة تصفية مدفوعةSLGPR33RS
Millex معقمة 33 مم PVDF.45umفيشرSLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip وحدات تصفية فراغ معقمة يمكن التخلص منها 50 مل PESفيشرSCGP00525
بولي (إيثيلين جلايكول) 4000 & nbsp ؛سيجما81240
ريدي-إيرث التوصيل & مزيج الشتلات وايت كوارلزGP92747
شفرات حلاقة أحادية الحافة للخدمة العادية من الصلب الخلفي .009RDفيشر12-640
منتجات الأبحاث الدولية شركة Cellulase RSFisher50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10Fisher50-213-444
كلوريد الصوديومSigmaS7653
درج إدراج - 36 خلية - 6x6 متداخلة Hummert11635000
Tween-20 SigmaP1379
VACUUBRAND ME1 ، 100-120 فولت ، 50/60 هرتز ، قابس أمريكيVWR97058-164
بالحقنة مضخة فراغ

المراجع

  1. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Prog Mol Biol Transl Sci. 149, 1-26 (2017).
  2. Torres-Acosta, M. A., Lye, G. J., Dikicioglu, D. Automated liquid-handling operations for robust, resilient, and efficient bio-based laboratory practices. Biochem Eng J. 188, 108713(2022).
  3. Cocking, E. C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
  4. Genzen, J. R., et al. Challenges and opportunities in implementing total laboratory automation. Clin. Chem. 64 (2), 259-264 (2018).
  5. Reed, K. M., Bargmann, B. O. R. Protoplast regeneration and its use in new plant breeding technologies. Front Genome Ed. 3, 734951(2021).
  6. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  7. Yang, Y., et al. Synthetic promoter screening using Poplar mesophyll protoplast transformation. Bio Protoc. 13 (8), e4660(2023).
  8. Estes, S., Melville, M. Mammalian cell line developments in speed and efficiency. AdvBiochem Eng Biotechnol. 139, 11-33 (2014).
  9. Possee, R. D., et al. Generation of baculovirus vectors for the high-throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1115-1122 (2008).
  10. Xu, Y., et al. Protoplasts: small cells with big roles in plant biology. Trends Plant Sci. 27 (8), 828-829 (2022).
  11. Rigoulot, S. B., et al. Automated, high-throughput protoplast transfection for gene editing and transgene expression studies. Methods Mol Biol. 2653, 129-149 (2023).
  12. Occhialini, A., et al. High-throughput transfection and analysis of Soybean (Glycine max) protoplasts. Methods Mol Biol. 2464, 245-259 (2022).
  13. Lenaghan, S. C., Stewart, C. N. Jr An automated protoplast transformation system. Methods Mol Biol. 1917, 355-363 (2018).
  14. Gilliard, G., et al. Protoplast: A valuable toolbox to investigate plant stress perception and response. Front Plant Sci. 12, 749581(2021).
  15. Marx, V. Plants: A toolbox of cell-asbed assays. Nat. Methods. 13, 551-554 (2016).
  16. Mansoury, M., et al. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  17. Maxwell, C. B., et al. The edge effect in high-throughput proteomics: A cautionary tale. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (6), 1065-1072 (2023).
  18. Zhong, H., et al. Advances in Agrobacterium-mediated maize transformation. Methods Mol Biol. 1676, 41-59 (2018).
  19. Wenck, A., et al. Reef-coral proteins as visual, non-destructive reporters for plant transformation. Plant Cell Rep. 22 (4), 244-251 (2003).
  20. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jian, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physiol Plant. 36, 1271-1281 (2014).
  21. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149 (3), 1231-1239 (2009).
  22. Coy, M. R., Abbitt, S. E., Frank, M. J. Protoplast isolation and transfection in Maize. Methods Mol Biol. 2464, 91-104 (2022).
  23. Jessop-Fabre, M. M., Sonnenschein, N. Improving Reproducibility in Synthetic Biology. Front Bioeng Biotechnol. 7 (18), (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الفحص عالي الإنتاجيةعزل البروتوبلاستترنسفكشن البروتوبلاستالتكنولوجيا الحيوية النباتيةصفيحة ذات 96 بئراًالتعبير العابرتحضير البلازميد

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.