يوضح البروتوكول هنا سير عمل سريع وموحد للتقييم الميكروبيولوجي السريع في الموقع (M-ROSE) ، بما في ذلك ثلاث خطوات: صنع الشرائح ، والتلوين ، والتفسير. سيساعد هذا البروتوكول الأطباء على اتخاذ قرارات سريرية سريعة.
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
يوضح البروتوكول هنا سير عمل سريع وموحد للتقييم الميكروبيولوجي السريع في الموقع (M-ROSE) ، بما في ذلك ثلاث خطوات: صنع الشرائح ، والتلوين ، والتفسير. سيساعد هذا البروتوكول الأطباء على اتخاذ قرارات سريرية سريعة.
يعد البدء الفوري للعلاج التجريبي المضاد للعدوى أمرا بالغ الأهمية في المرضى الذين يعانون من عدوى رئوية غير مبررة. على الرغم من أن الحصول على التصوير بسيط نسبيا في الممارسة السريرية ، إلا أن افتقاره إلى الخصوصية غالبا ما يتطلب اختبارات إضافية تستغرق وقتا طويلا مثل ثقافة البلغم أو ثقافة سائل غسل القصبات الهوائية أو التسلسل الجيني لتحديد المسببات الأساسية للمرض بدقة. علاوة على ذلك ، قد تساهم الفعالية المحدودة للعلاج التجريبي المضاد للعدوى في إساءة استخدام المضادات الحيوية. مكنت التطورات الحديثة في تفسير الخلفية الميكروبية في شرائح التقييم السريع في الموقع (ROSE) الأطباء من الحصول على عينات على الفور من خلال تنظير القصبات (على سبيل المثال ، غسل السنخية ، وتنظيف الغشاء المخاطي بالفرشاة ، ومشبك الأنسجة) ، مما يسهل تلطيخ السرير والتفسير الذي يوفر معلومات أساسية عن الخلفية الميكروبية. وبالتالي ، فإن هذا يضع أساسا لتطوير العلاج المستهدف المضاد للعدوى وخطط العلاج الدوائي الفردية. من خلال فهم أفضل لمسببات الأمراض التي تسبب العدوى في الوقت الفعلي ، يمكن للأطباء تجنب المضادات الحيوية واسعة الطيف غير الضرورية التي تساهم في مقاومة المضادات الحيوية. إن إنشاء سير عمل سريع وموحد ل M-ROSE داخل أقسام طب الجهاز التنفسي أو وحدات العناية المركزة سيساعد الأطباء بشكل كبير في صياغة استراتيجيات علاج دقيقة للمرضى ، والتي لها آثار سريرية كبيرة.
تقنية التقييم السريع في الموقع (ROSE) هي طريقة عالية الكفاءة تستخدم في مجال إجراءات أمراض الرئة. إنه يتيح أخذ العينات في الوقت الفعلي والتدخل التشخيصي ، مما يسهل التحليل الخلوي الفوري1. يتضمن هذا النهج المبتكر طباعة جزء من عينة الأنسجة على شريحة مع الحفاظ على سلامتها. تكمن إحدى المزايا الرئيسية ل ROSE في قدرتها على تسهيل التفسير الفوري للمعلومات السريرية من خلال تقنيات الفحص المجهري المتخصصة. وهذا يشمل تحليل مورفولوجيا الخلية ، والتصنيف ، والقياس الكمي ، وتحديد النسب المكونة ، وتقييم الترتيب ، وتحليل الارتباط ، وتقييم الخلفية ، وتحديد الأجسام الغريبة. من خلال دمج كل هذه البيانات مع المعلومات السريرية للمريض ، تلعب ROSE دورا محوريا في تقييم كفاية أخذ العينات وتوجيه الإجراءات والتقنيات التدخلية في الوقت الفعلي2.
كشركة تابعة لتقنية ROSE ، تركز تقنية M-ROSE بشكل أساسي على اكتساب الخلفية الميكروبيولوجية للآفات المستهدفة بدلا من التمييز بين الخلايا الحميدة والخبيثة 3,4. من ناحية ، يتيح M-ROSE التحديد المجهري لمسببات الأمراض مثل Aspergillus و Cryptococcus و Pneumocystis و Candida5. من ناحية أخرى ، فإنه يحمل آثارا إرشادية كبيرة في تقييم جودة عينات الجهاز التنفسي ، والتمييز بين الأمراض المعدية وغير المعدية ، والتمييز بين العدوى والتلوث ، وكذلك تقييم شدة العدوى والتشخيص 6,7. على سبيل المثال ، داخل عينة الجهاز التنفسي ، يشير تعايش البكتيريا التي تظهر مورفولوجيا متطابقة جنبا إلى جنب مع الخلايا الالتهابية المتسللة إلى وجود عدوى. على العكس من ذلك ، فإن وجود بكتيريا متعددة متنوعة شكليا مصحوبة بخلايا ظهارية يشير إلى التلوث. إن القدرة على التحليل الشامل للمعلومات السريرية والتنبؤ بالنتائج تجعل M-ROSE أداة لا تقدر بثمن في إجراءات أمراض الرئة.
في الختام ، يعمل ROSE كناقل خلوي حاسم يعزز بشكل كبير كفاءة ودقة تشخيص أمراض الرئة. تساهم قدراتها متعددة الأوجه في تحسين نتائج المرضى من خلال ضمان التدخل في الوقت المناسب وتسهيل التشخيص الدقيق من خلال أخذ العينات في الوقت الفعلي وتقنيات التدخل التشخيصي. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه التطورات تعتمد على الحصول على عينات مؤهلة. هنا ، نقدم بروتوكول M-ROSE موحدا يشمل تحضير الشرائح وتقنيات التلوين وإرشادات التفسير. يعمل هذا البروتوكول كمرجع لا يقدر بثمن للأطباء لوضع خطط تقييم وعلاج دقيقة مع تسهيل اتخاذ القرار فيما يتعلق بالتعامل اللاحق مع العينات المستهدفة.
تمت الموافقة على التجربة السريرية من قبل لجنة الموافقة في مستشفى تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي (رقم 2022-ky-31). تضمنت الحالة النموذجية مريضا تم تشخيصه بالالتهاب الرئوي المتكيسة الرئوية ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المريض.
1. متطلبات المعدات والمواد ل ROSE
2. سير عمل M-ROSE
في حالة نموذجية ، قدم رجل يبلغ من العمر 63 عاما إلى المستشفى مصابا بسعال وحمى وألم في الصدر. تم تشخيص المريض سابقا بالمتلازمة الكلوية ، التي تتميز بالبيلة البروتينية والوذمة ، وتلقى العلاج مع بريدنيزون وتاكروليموس لفترة طويلة. أظهرت النتائج المختبرية الأولية أن عدد خلايا الدم البيضاء يبلغ 10.49 × 109 / لتر ، وعدد العدلات 8.87 × 109 / لتر ، والبروتين التفاعلي C في الدم الكامل و (1-3) -β-D-glucan تركيزات 155.81 مجم / لتر و 249.7 بيكوغرام / مل. أظهر فحص التصوير المقطعي المحوسب للصدر (CT) عتامة الزجاج الأرضي مع موقع منتشر وثنائي ومركزي (الشكل 3 أ). كان العلاج الأولي المضاد للعدوى باستخدام سيفوبيرازون تازوباكتام غير فعال ، وتفاقمت أعراضه بسبب التعب القلبي وضيق التنفس وضيق التنفس بعد التمرين. لم يظهر التصوير المقطعي المحوسب المتكرر أي تحسن كبير (الشكل 3 ب). ثم تم نقل المريض إلى وحدة العناية المركزة (ICU) للتهوية الميكانيكية وخضع لتنظير القصبات. تم الوصول إلى أخذ عينات التركيز تحت إشراف الملاحة الافتراضية ، وتم جمع ثلاث عينات خزعة ملقط (الشكل 4). كان ROSE متاحا للتقييم المجهري الفوري للأنسجة ، وتم تأكيد تشخيص المتكيسة الرئوية jiroveci (الشكل 5A). تلقى المريض على الفور العلاج المضاد للفطريات مع سلفاميثوكسازول (1.92 غرام ، q6h) ؛ أكد تلطيخ لاحق (الشكل 5B-E) هذا التشخيص. ومع ذلك ، لا يزال التصوير المقطعي المحوسب المتكرر لا يظهر أي تحسن كبير (الشكل 3C). تلقى المريض الكاربوفونجين (اليوم الأول من 70 ملغ وتليها 50 ملغ يوميا) ، وميثيل بريدنيزولون (80 ملغ يوميا) ، والغلوبولين المناعي (10 غرام يوميا) للعدوى الفطرية. تم تخفيف الأعراض بسرعة ، واستمر المريض في متابعة العلاج.

الشكل 1: المعدات والمواد. أ: المجهر الخلوي ونظام التصوير الجرافيكي. (ب) محلول تلطيخ Diff Quik (DQ) أ. (ج) محلول تلطيخ Diff Quik (DQ) ب. (د) قفازات لاتكس خالية من المسحوق. ه: شرائح زراعة الخلايا العقيمة. (F) إبر حقنة يمكن التخلص منها 2.5-5 مل. (ز) ورق ماص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير عمل M-ROSE. أ: طباعة الشريحة. (ب) اغمر الشريحة في محلول الفرق A لمدة 10-30 ثانية. (ج) اشطف الشريحة في حمام صبغة PBS لإزالة محلول الفرق A الزائد. (د) تنشف السائل المتبقي وتمسحه من الشريحة بورق ماص. (ه) اغمر الشريحة في محلول الفرق B لمدة 20-40 ثانية. (و) نظف الشريحة في خزان صباغة المياه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: صور التصوير المقطعي المحوسب للصدر. (أ) عند القبول. (ب) في يوم النقل إلى وحدة العناية المركزة. (ج) بعد علاج سلفاميثوكسازول الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: توطين الجزء القاعدي الخلفي من الفص السفلي للرئة اليمنى بواسطة VBN. أ: القصبة الهوائية الرئيسية اليمنى. ب: القصبات الهوائية الوسطى اليمنى. ج: الجزء القاعدي الخلفي من القصبات الهوائية في الفص السفلي للرئة اليمنى. (د) خريطة 3D من VBN. ه: الخريطة الإكليلية للتصوير المقطعي المحوسب للصدر. (و) الخريطة المحورية للتصوير المقطعي المحوسب للصدر. (ز) الخريطة السهمية للتصوير المقطعي المحوسب للصدر الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: صور توثق ظهور المتكيسة الرئوية بطرق تلطيخ مختلفة. (أ) وردة 100 × 10؛ السهم الأبيض: الخراجات التي تحتوي على ascospores. ب: الهيماتوكسيلين والإيوزين (H-E)، 60 × 10. (ج) أزرق ألسيان، 60 × 10. د: جيمسا، 40 × 10. ه: الفضة الهكسامية، ٢٠ × ١٠. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أمراض الرئة التداخلية هي فرع قيم من أمراض الجهاز التنفسي الحديثة. على وجه الخصوص ، تم استخدامه على نطاق واسع في تشخيص أمراض الرئة 8,9. في السنوات الأخيرة ، ازدهر طب الرئة التدخلي التشخيصي بسبب زيادة انتشار الأورام الخبيثة الرئوية ، والمزيد من عدوى مسببات الأمراض المقاومة للأدوية التي تحدث في الجهاز التنفسي السفلي ، والطلبات المطلوبة لتشخيص أمراض الجهاز التنفسي المحيرة والحرجة10،11،12. تعتمد كفاءة التشخيص التدخلي على عوامل مثل الحجم والموقع التشريحي للمناطق البؤرية ، ومعدلات المضاعفات وعدد مواقع الخزعة ، والأمراض الكامنة ، مما يعزز الاستخدام السريري للعديد من التقنيات والمرافق المتقدمة13. حظي ROSE باهتمام ملحوظ وظهر بسرعة ك "تقنية مرافقة في الوقت الفعلي" للتشخيص في أمراض الرئة التداخلية.
تم تصميم ROSE للتقييم السريع والتشخيص الأولي وتحديد أولويات رضا العينات أثناء إجراءات مثل البزل والخزعة وتنظيف الأسنان بالفرشاة. يوفر ملاحظات لتوجيه التطورات التكنولوجية اللاحقة14،15،16،17. يركز M-ROSE ، وهو فرع من ROSE ، بشكل أساسي على تقييم الخلفية الميكروبية بدلا من تقييم الأورام الخبيثة في خلايا الأنسجة5. طريقة M-ROSE هي تقنية تقييم سريع وليست أداة تشخيصية ، وبالتالي لا ينبغي المبالغة في فعاليتها التشخيصية. يشمل تطبيقه السريري في المقام الأول الجوانب التالية: التحديد البصري لبعض الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض ، والتفريق بين العدوى والتلوث ، والتمييز بين العدوى وغير العدوى7.
بعد التلوين السريع ، أظهرت نواة الخلية في الأنسجة لونا أحمر أرجوانيا ، بينما أظهر السيتوبلازم لونا أرجوانيا مزرقا. ظهرت البكتيريا والفطريات باللون الأزرق ، مما أدى إلى تباين واضح بين خلايا الأنسجة ومسببات الأمراض7. يمكن أن تظهر M-ROSE مستوى معينا من القدرة في تحديد البكتيريا والفطريات. على وجه التحديد ، فإنه يظهر معدل إيجابي مرتفع ل Aspergillus ، المكورات الخفية ، المتكيسة الرئوية jiroveci ، والفطرياتالأخرى 3,18. ومع ذلك ، فإن لها قيودا عندما يتعلق الأمر بالتعرف على مسببات الأمراض ذات الحجم والقطر الصغير أو العوامل المسببة للأمراض داخل الخلايا. من الأهمية بمكان التأكيد على أن تشخيص أي مرض يجب أن يستند إلى تقييم شامل يشمل الحالة الأساسية للمريض ، والمظاهر السريرية ، وفحوصات التصوير ، وعوامل أخرى بدلا من الاعتماد فقط على التحديد المجهري للكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض.
تقدم M-ROSE أيضا مزايا في تحديد العدوى والتلوث ، مثل تقييم جودة عينات سائل الغسيل السنخي. في الأقسام التي تسمح الظروف ، يمكن إجراء تقييم بجانب السرير لسائل الغسيل من خلال الطرد المركزي وتلطيخ. تظهر العينات المؤهلة من سائل الغسيل السنخي أن نسبة الخلايا الحرشفية بين جميع الخلايا (باستثناء خلايا الدم الحمراء) تحت المجهر منخفض الطاقة أقل من 1٪ ، والخلايا الظهارية العمودية أقل من 5٪ ، وخلايا الدم الحمراء أقل من 10٪ (باستثناء العوامل المتعلقة بالصدمة أو النزيف)19. الفحص المجهري لخلفية علم الخلايا سيسهل علينا إجراء التقييمات في الوقت المناسب.
علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد M-ROSE في التمييز بين الآفات المصابة وغير المصابة5. في الآفات المصابة ، غالبا ما يكون هناك تسلل للعدلات والبلاعم والخلايا الليمفاوية بواسطة الخلايا الالتهابية ، مع ملاحظة عرضية لبلعمة العدلات. على العكس من ذلك ، تفتقر الآفات غير المصابة عادة إلى تسلل الخلايا الالتهابية.
يوضح البروتوكول المقدم هنا عملية تشغيل M-ROSE. من خلال تفسير الخلفية الميكروبيولوجية ، يمكن إجراء التشخيص الأولي أو تضييق التشخيص التفريقي. كما تشير النتائج التي توصلنا إليها ، فإن تشخيص PCP يتطلب دليلا مؤكدا على Pneumocystis jiroveci ، والذي لا ينبغي أن يعتمد على المظاهر السريرية والتصوير ، حتى في المرضى الذين يعانون من أعراض عالية الخطورة. التحديد المجهري للأشكال الغذائية والأشكال الغذائية هو الدليل الأكثر بديهية. يتم تحديد كفاءة التشخيص إلى حد كبير من خلال طريقة تلطيخ العينة. تاريخيا ، تتوفر البقع التقليدية مثل Wright's-Giemsa وفضة الهيكسامين والأزرق التولويدين ل PCP ولكنها تستغرق وقتا طويلا ولها حساسية أقل. في هذه الحالة ، تم تأكيد التشخيص الفوري ل PCP في اليوم الأول من نقل المريض إلى وحدة العناية المركزة باستخدام ROSE. أظهر Diff-quick ميزته في تحديد المتكيسة الرئوية ، التي تتميز ببنية واضحة ، وتباين حاد ، وسهولة التعرف على ascus (الشكل 5أ).
في تطبيق الطب العرقي ، يحمل ROSE أيضا قيمة كبيرة. على سبيل المثال ، في الأمراض القيحية ، يمكن للأطباء تحديد مجموعة متنوعة من الخلايا الالتهابية التي تهيمن عليها العدلات في المقام الأول ضمن الخلفية الميكروبيولوجية5. وبالتالي ، يمكن اختيار الأدوية ذات خصائص إزالة الحرارة وإزالة السموم كعلاجات محتملة لهذه الحالات ، مثل زهر العسل ، الهندباء ، وباترينيا ، من بين أمور أخرى.
نظرا لأن ROSE هو برنامج إضافي لا يلزم اختياره في أمراض الرئة التداخلية ، فإن تنفيذ ROSE لا بد أن يزيد من تكاليف العمالة والتكاليف الاقتصادية. من المثير للجدل أنه يجب استخدام ROSE على أساس منتظم. من حيث فوائد الاقتصاد ، فإن الوقت وتكاليف العمالة هي ما يهمنا. الحاجة الرئيسية للعمالة الإضافية هي المقيم. يمكن إجراء تقييم ROSE بواسطة أخصائي تكنولوجيا الخلايا أو أخصائي علم الأمراض أو الطبيب. علماء التكنولوجيا الخلوية هم الموظفون الأكثر احتمالا لإجراء ROSE. ومع ذلك ، في الممارسة السريرية ، يحل الأطباء محل الدور ، لكنه قد يتطلب أساسا تدريبيا معينا15. أظهرت دراسة سابقة أن البرنامج التدريبي يمكن أن يساعد في تحسين دقة تقييم الكفاية الذي يقوم به الأطباء ، والقضاء على المتغيرات المربكة20. بالإضافة إلى ذلك ، فإن M-ROSE ، كتقنية تشخيصية مورفولوجية ، لها عوامل ذاتية في تقرير نتائجها. يجب على الأطباء إجراء تقييم شامل بناء على معلومات سريرية إضافية.
نوصي بأن تفكر المستشفيات التي لديها مرافق مناسبة ومهنيون مدربون في تنفيذ إجراء ROSE في أقسام الجهاز التنفسي أو وحدات العناية المركزة ، حيث يمكن أن يسهل التقييم المبكر للأمراض التنفسية الحرجة الصعبة وتوجيه العلاج السريري بشكل فعال.
لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
نحن نقدر مشروع حوافز الأداء والتوجيه لمؤسسة تشونغتشينغ للبحث العلمي (jxyn-2021-1-15 و jxyn-2021-2-6) للحصول على الدعم المالي.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المجهر الخلوي | أوليمبوس كوربوريشن | CX43 | |
| Diff Quik (DQ) حلول تلطيخ | Besso Biotechnology Co. LTD | G1541 | |
| إبر حقنة يمكن التخلص منها 2.5-5 مل | شاندونغ تشو المجموعة الصيدلانية | 20183150304 | |
| قفازات اللاتكس الخالية من المسحوق | Henan Yadu Industrial Co.، LTD | 20182140728 | |
| خلية معقمة شرائح الثقافة جينان | بريرت للصناعة والتجارة المحدودة | 7101 |
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن