هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء عيب تجويف صندوقي في أنسجة الحجاب الحاجز الفخذي للفئران. يمكن لهذا النموذج تقييم أداء المواد الحيوية تحت الضغط الميكانيكي الحيوي واستكشاف آليات تجديد العظام المتعلقة بتكوين العظم داخل الغشاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء نموذج عيب تجويف صندوقي في العظم القشري لفأر الفخذ
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تؤدي عيوب العظام الشديدة أو الكسور المعقدة إلى مضاعفات خطيرة مثل عدم الاتحاد أو عدم كفاية التئام العظام. تعتبر هندسة الأنسجة ، التي تتضمن تطبيق الخلايا والسقالات والسيتوكينات ، حلا واعدا لتجديد العظام. وبالتالي ، تلعب النماذج الحيوانية المختلفة التي تحاكي عيوب العظام دورا حاسما في استكشاف الإمكانات العلاجية لهندسة الأنسجة لشفاء العظام. في هذه الدراسة ، أنشأنا نموذجا لعيب العظم القشري على شكل صندوق في منتصف عظم الفخذ للفئران ، والذي يمكن أن يكون بمثابة نموذج مثالي لتقييم وظيفة المواد الحيوية في تعزيز شفاء العظام. تم حفر هذا العيب العظمي القشري على شكل صندوق باستخدام قبضة فموية منخفضة السرعة وشكلها بواسطة إبرة مخرطة. تم إجراء تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق بعد الجراحة على الفور لتأكيد الإنشاء الناجح لعيب العظم القشري في تجويف الصندوق. ثم تم حصاد عظم الفخذ على الجانب الذي تم تشغيله من الفئران في نقاط زمنية متعددة بعد الجراحة (0 أيام ، 2 أسابيع ، 4 أسابيع ، و 6 أسابيع). تم تقييم عملية الشفاء لمنطقة عيب كل عينة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ، وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان. أظهرت هذه النتائج نمطا للشفاء يتوافق مع التعظم داخل الغشاء ، مع اكتمال الشفاء بشكل أساسي لمدة 6 أسابيع. يوفر تصنيف عملية الشفاء لهذا النموذج الحيواني طريقة فعالة في الجسم الحي للتحقيق في المواد الحيوية والأدوية الجديدة التي تستهدف التعظم داخل الغشاء أثناء التئام عيوب الأنسجة العظمية.
المقدمة
غالبا ما ينتج العظم المكسور والمعيب عن الصدمات والأورام والالتهابات والتشوهات الخلقية 1,2. على الرغم من أن الأنسجة العظمية لدى الأفراد الأصحاء الشباب تمتلك عادة قدرات تجديد قوية3 ، إلا أن العيوب التي تتجاوز الحجم الحرج أو عوائق الشفاء بسبب الأمراض الجهازية (مثل مرض السكري وهشاشة العظام والالتهابات) قد تؤدي إلى مضاعفات مثل انقطاع العظام أو ضعف الشفاء4. لمواجهة هذا التحدي السريري ، يتم استخدام تطعيم العظام أو المواد الحيوية بشكل شائع لاستبدال العظام المعيبة بشدة أو لإعادة بناء أجزاء العظام الكبيرة. ومع ذلك ، فإن هذه العلاجات لها قيود. على سبيل المثال ، على الرغم من اعتباره المعيار الذهبي ، إلا أن تطعيم العظام الذاتي يعاني من تقييد إمدادات المتبرعين والمضاعفات المحتملة لموقع المتبرع 5,6. تمثل الطعم الخيفي أيضا مخاطر معينة ، مثل الرفض المناعي ، والانتقال المحتمل للأمراض ، والآثار السلبية على الخصائص الميكانيكية الحيوية والبيولوجية للكسب غير المشروع7.
شهدت السنوات الأخيرة طفرة في الأبحاث التي تركز على آليات شفاء عيوب العظام. برز استخدام المواد الحيوية البديلة والتطورات في هندسة الأنسجة كمواضيع بارزة في مجال تجديد العظام8. قبل أن يتم تطبيق هذه المواد الحيوية على العلاج البشري ، يجب اختبارها في المختبر وفي الجسم الحي لضمان فعاليتها وسلامتها. ومع ذلك ، فإن انخفاض تعقيد البيئات في المختبر وغياب الاستجابات المناعية والالتهابية يحد من تقييم المواد الحيوية المختلفة في المختبر. وبالتالي ، هناك حاجة إلى إنشاء نماذج حيوانية لأنواع مختلفة من عيوب الأنسجة العظمية9. تسمح النماذج الحيوانية بتقييم المواد الحيوية في ظل ظروف تحميل مختلفة ، وتسهيل فهم خصائص العظام الخاصة بالأنواع ، وتوفير نظرة ثاقبة للتشابه بين النماذج الحيوانية والحالات السريرية البشرية. هذه المزايا ضرورية لدراسة تفاعلات سقالة العظام وترجمة نتائج الأبحاث إلى ممارسة سريرية 9,10.
حاليا ، تستخدم النماذج الحيوانية لعيوب العظام الميكانيكية على نطاق واسع للتحقق من أداء المواد الحيوية ، مع نماذج عيوب عظام الجمجمة ونماذج عيوب العظام المقطعية هي الطرق الأكثر شيوعا11. تعد نماذج عيوب العظام المقطعية ، التي تستخدم غالبا لتقليد صدمة العظام أو الظنبوب الطويلة الشديدة التي تنتهي بعدم اتحاد العظام ، مفيدة بسبب أبعادها الموحدة ومواقعها التشريحية المحددة ، مما يبسط التقييمات الإشعاعية أو النسيجية لتكوين العظام الجديدة وإعادة التوعي. ومع ذلك ، تتطلب هذه النماذج غرسات معدنية لتثبيت أجزاء الكسر الثنائية وتتطلب عملية شفاء معقدة تشمل كلا من التعظم داخل الغضروفوداخل الغشاء 12. من ناحية أخرى ، أصبحت نماذج عيوب العظام الكالفارية أداة فحص أساسية لتقييم المواد الحيوية بسبب أقطار عيوبها الموحدة ، والوصول الجراحي المريح ، والوظيفة الداعمة للأم الجافية والأنسجة الرخوة13. على الرغم من أنها تستخدم على نطاق واسع لنمذجة تكوين العظام داخل الغشاء في السيناريوهات ذات الصلة سريريا ، إلا أنها غير مناسبة لتقييم شفاء العظام في ظل ظروف التحميل الميكانيكية الحيوية بسبب طبيعتها غير الحاملة أثناء عملية الشفاء14.
لمعالجة هذه القيود ، أنشأنا نموذجا لعيب العظم القشري ذو التجويف الصندوقي في أنسجة الحجاب الحاجز الفخذي للفئران. باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT) إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) ، وتلطيخ الأنسجة المرضية (الهيماتوكسيلين ويوزين [HE] وماسون) ، قمنا بتحليل عملية الشفاء لهذا النموذج في ظل ظروف الإرقاء. نهدف إلى تقديم رؤى جديدة لتقييم أداء المواد الحيوية في ظل ظروف التحميل الميكانيكية الحيوية ولدراسة الهندسة الحيوية وآلية تجديد العظام مقابل التعظم داخل الغشاء.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2021-597). تم استخدام فئران Sprague-Dawley (ذكر ، وزن الجسم 300 جم) في هذه الدراسة.
1. التحضير قبل الجراحة
- إعداد الصك
- راجع الشكل 1 أ للأدوات الجراحية المستخدمة في هذه الدراسة: ماكينة حلاقة كهربائية ، مقص أنسجة ، مقص عيون ، ملقط عيون ، مشرط يمكن التخلص منه ، فاصل السمحاق ، قبضة فموية منخفضة السرعة ، مسبار فموي ، فراغ ري يمكن التخلص منه ، حامل إبرة ، خياطة 3.0.
- قم بإعداد مسبار عن طريق الفم وقم بتمييز الطرف المنحني الكبير للمسبار بقلم تحديد وفقا لقطر العيب (الشكل 1 ب). استخدم هذا لتحديد حجم العيب أثناء الجراحة.
- تعقيم جميع المواد والأدوات الجراحية المستخدمة لإجراء العملية قبل الاستخدام. قم بتعبئة المواد المطلوبة بقطعة قماش مطوية أو ورق تغليف وختمها بشريط الأوتوكلاف للتعقيم بالبخار (125-135 درجة مئوية لمدة 20-25 دقيقة).
- تحضير المنطقة الجراحية: تطهير طاولة العمليات والبيئة المحيطة بالطاولة عن طريق الرش بنسبة 75٪ كحول. قم بإنشاء منطقة معقمة بمساحة 60 سم × 90 سم تقريبا مع ستائر معقمة على طاولة العمليات.
- إعداد التخدير
- تخدير الفئران داخل الصفاق ب 10٪ هيدروكلوريد الكيتامين (50-100 ملغم / كغم) و 2٪ زيلازين 2 ملغم / كغم). استخدم حقن كاربروفين تحت الجلد (5 ملغ/كغ) لعلاج التسكين قبل الجراحة وأثناء العملية. فحص عمق التخدير عن طريق اختبار قرصة إصبع القدم. بعد التخدير ، ضع مرهم معقم للعين على العينين لمنع جفاف العين وإصابة القرنية.
2. الإجراء الجراحي
- ضع الجرذ في وضع الاستلقاء الجانبي على الطاولة الجراحية المعقمة وقم بإزالة شعر الطرف السفلي باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.
- استخدم محلول يودوفور 5٪ وكحول 75٪ لتطهير أنسجة الجلد في منطقة الجراحة.
- حدد موقع عظم الفخذ القريب والبعيد وقم بعمل شق 2.5 سم على طول المحور الطويل لعظم الفخذ لقطع أنسجة جلد الفئران.
- افصل طبقة الجلد عن اللفافة باستخدام ملقط العيون ومقص الأنسجة ، وكشف النهج الجانبي لعظم الفخذ من خلال العضلة ذات الرأسين الفخذية وعضلات الفخذ الجانبية.
- حدد موقع تقاطع الحاجز العضلي (خط نسيج أبيض) وافصله بعناية بشفرة جراحية يمكن التخلص منها على طول حدود العضلات حتى يتم الوصول إلى سطح الفخذ.
ملاحظة: عند استخدام شفرة يمكن التخلص منها لفصل العضلات ، من المهم الفصل على طول الحاجز العضلي وتوخي الحذر من التسبب في إصابة الأوعية الدموية داخل الأنسجة الرخوة. يجب على المبتدئين وأولئك الذين ليسوا على دراية بالتشريح استخدام ملقط العيون وفواصل السمحاق في تشريح حاد بين كتلتي العضلات.
- ضع فاصل السمحاق لفصل عضلات سطح الفخذ بصراحة وكشف منتصف الحجاب الحاجز الفخذي.
- استخدم قلم تحديد معقم لتحديد منطقة موقع العيب على السطح الأوسط للحاجز الفخذي ، الموجود في الجزء العلوي من القمة المائلة الجانبية لرأس عظم الفخذ.
- استخدم قبضة الفم منخفضة السرعة مع مثقاب كروي بطيء الحركة بقطر 1.2 مم لحفر ثقب صغير عمودي على سطح العظم في الموقع المحدد ، مما يؤدي إلى تدمير السمحاق والقشرة العظمية بعمق كاف للوصول إلى تجويف نخاع العظم. عند مستوى عمق الحفر هذا ، قم بتوسيع حجم الفتحة الموازية لهذا العمق في جميع الاتجاهات ، مع التشذيب لتحقيق شكل تجويف صندوقي.
- استخدم مسبارا فمويا مسمى موازيا لحافة العيب لتحديد قطر العيب والتشكل أثناء التحضير وبعده.
- أغلق طبقات العضلات والجلد باستخدام 3-0 خيوط أحادية قابلة للامتصاص ، على التوالي ، وقم بتطهير المنطقة الجراحية باستخدام 5٪ يودوفور من الداخل إلى الخارج.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- بعد الجراحة، يتم تطبيق كاربروفين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد ويوضع الجرذ على ضمادة تسخين بدرجة حرارة ثابتة حتى التعافي من التخدير. عندما يستعيد الجرذ وعيه ، انقله برفق إلى قفص يحتوي على فراش جاف معقم.
- مواصلة تسكين لمدة 24 ساعة ومراقبة ما بعد الجراحة لمدة 1 أسبوع بعد الجراحة.
4. جمع العينات وتحليلها
- القتل الرحيم للفأر بشريا بعد الجراحة عن طريق حقن بنتوباربيتال الصوديوم 100-200 ملغم / كغم داخل الصفاق. افصل بعناية العضلات والأنسجة اللفافية على سطح عظم الفخذ وقم بإزالة عظم الفخذ على الجانب الذي يتم تشغيله تماما. اجمع العينات في 0 يوم (الشكل 2 أ ، ب) ، أسبوعان ، 4 أسابيع ، و 6 أسابيع بعد الجراحة.
- إصلاح العينات الفخذية في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة. تحليل بنية الفخذ باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. اضبط معلمات المسح على النحو التالي: جهد أنبوب الأشعة السينية ، 70 كيلو فولت ؛ مرشح ، AL 0.5 مم ؛ شدة الأشعة السينية ، 0.2 مللي أمبير ؛ حجم فوكسل ، 17 ميكرومتر ؛ ووقت التكامل ، 1 × 300 مللي ثانية. إعادة بناء صور نموذج 3D باستخدام البيانات النقطية.
- قم بإزالة الكلالس من العينات في 10٪ EDTA لمدة 8 أسابيع قبل تجفيف عينات الفخذ في سلسلة متدرجة من تخفيفات الإيثانول. ثم قم بتضمين العينات في شمع البارافين15.
- قطع العينات المضمنة إلى أقسام البارافين 5 ميكرومتر من المستوى السهمي.
- أقسام البقع مع كل من مجموعة تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ومجموعة تلطيخ ماسون. مراقبة شفاء منطقة العيب عن طريق علم التشريح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا البروتوكول ، نجحنا في إنشاء نموذج عيب تجويف صندوق الفخذ للفئران بأبعاد 4.5 مم × 1.5 مم عن طريق الحفر. من أجل تحليل عملية الشفاء ، قمنا بجمع أنسجة الفخذ على الجانب الذي تم تشغيله في 0 أيام وأسبوعين و 4 أسابيع و 6 أسابيع بعد الجراحة ، وهي النقاط الزمنية الرئيسية للتعظم داخل الغضروف ، والتعظم داخل الغشاء ، وإعادة تشكيل العظام أثناء عملية الشفاء من صدمة الفخذ في الفئران2. في اليوم 0 بعد الجراحة ، أظهرت إعادة بناء النموذج ثلاثي الأبعاد من بيانات الصورة النقطية ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
النماذج الحيوانية قبل السريرية حيوية لفحص شفاء العظام وتأثير المواد الحيوية على تجديد العظام. يوضح هذا البروتوكول نموذج عيب تجويف صندوق الفخذ الذي يكرر عملية تكوين العظام داخل الغشاء المرتبطة بتجديد العظام السريري. تم توحيد منطقة العيب أثناء الجراحة باستخدام مسبار فموي محدد مسبقا. أظهرت نتائج التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والتلوين النسيجي المرضي الشفاء التدريجي على مدى 6 أسابيع ، مع سمحاق سميك وتكوين عظم تربيقي جديد ، يليه تكوين عظم قشري كثيف. لم يلاحظ أي نسيج غضروفي أثناء عملية الشفاء ، مما يشير إلى تكوين العظم داخل ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يتم تضمين جميع البيانات والصور الأصلية في هذه الورقة. المؤلفون يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح
شكر وتقدير
تم تمويل هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 82101000 (HW) و U21A20368 (L. Y.) و 82100982 (FL) ، وبدعم من برنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا 2023NSFSC1499 (H. W.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.2 مم بطيئة السرعة الكرة الحفر | Dreybird المعدات الطبية المحدودة | RA3-012 | لإعداد عيوب تجويف الصندوق |
| 3.0 خياطة | تشنغدو شيفنغ المحدودة | لا شيء | لخياطة الجروح |
| 4٪ بارافورمالدهايد | Biosharp | BL539A | لإصلاح عينات الفخذ |
| كرات القطن Haishi | Hainuo Group Co., Ltd. | 20120047 | لتعقيم الجلد وتنظيف المجال الجراحي |
| القطن العصي | لاكونغ للأجهزة الطبية المحدودة | M6500R | لتطهير الجلد |
| آلة طحن فني الأسنان | ماراثون | N3-140232 | لإعداد عيوب تجويف الصندوق |
| مشرط يمكن التخلص | منه Hangzhou Huawei Medical Supplies Co.، Ltd. | 20100227 | لإنشاء شقوق جلدية وكذلك لفصل الأنسجة العضلية بشكل حاد |
| ماكينة حلاقة كهربائية | JASE | BM320210 | إزالة أنسجة الشعر من المنطقة الجراحية |
| بقع الهيماتوكسيلين والإيوسين | Biosharp | C1005 | للتحليل النسيجي للعينات |
| Masson ' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | للتحليل النسيجي للعينات Micro |
| CT | Scanco medical ag | & micro ؛ CT 45 | لتحليل التئام العيوب في عينات الفخذ |
| حامل الإبرة | Chengdu Shifeng Co.، Ltd. | لا شيء | لإبر الخياطة |
| Olympus Research Grade نظام مسح الشرائح بالكامل VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | لتحليل نتائج تلطيخ HE وملقط تلطيخ ماسون |
| ملقط العيون | Chengdu Shifeng Co.، Ltd. | لا شيء | لقط الجلد ، مقص الأنسجة العضلية |
| للعيون | Chengdu Shifeng Co.، Ltd. | لا شيء | لتشكيل شق الجلد |
| قبضة ماراثون منخفضة السرعة عن طريق الفم | Y221101003 | لإعداد عيوب تجويف الصندوق | |
| مسبار عن طريق الفم | شنغهاي سانغدا للتأمين الطبي المحدودة. | 20000143 | لقياس قطر العيوب فاصل |
| السمعاق | Chengdu Shifeng Co.، Ltd. | لا شيء | للفصل الحاد للأنسجة العضلية |
| Sprague & ndash; Dawley rats | Byrness Weil Biotech Ltd | لا شيء | لإنشاء عظام الفخذ صندوقية عيب التجويف |
| مقص الأنسجة | Chengdu Shifeng Co.، Ltd. | لا شيء | لتشكيل شق الجلد |
المراجع
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193(2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66(2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084(2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977(2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
