يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

أخذ عينات دم الوريد تحت الترقوة في الفئران الواعية

5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66075

⸱

نوفمبر 3, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Urology, Lanzhou University Second Hospital, 2Key Laboratory of Gansu Province for Urological Diseases, 3Gansu Nephro-Urological Clinical Center, 4The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 5The Second Clinical Medical College of Lanzhou University, 6Medical Experimental Center of Lanzhou University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

نقدم هنا مزيجا من القيود الفعالة للفئران وطرق ثقب الوريد تحت الترقوة التي تمكن من جمع الدم بسرعة وأمان وتكرار في الفئران دون تخدير.

الملخص

هناك العديد من الطرق المعمول بها للحصول على عينات دم متكررة من الفئران ، مع أكثر الطرق المستخدمة شيوعا هي أخذ عينات الوريد الجانبي بدون تخدير وأخذ عينات الوريد الوداجي مع التخدير. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق تتطلب المساعدة ومعدات التخدير وأحيانا تشكل صعوبات من حيث جمع الدم أو رداءة نوعية عينات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، تستهلك طرق جمع الدم هذه وقتا كبيرا وموارد بشرية عندما يكون أخذ عينات الدم المتكررة مطلوبا لعدد كبير من الفئران. تقدم هذه الدراسة تقنية لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران غير المخدرة من قبل فرد واحد بارع. يمكن الحصول على عينات دم مرضية للغاية عن طريق ثقب الوريد تحت الترقوة. أظهرت الطريقة معدل نجاح إجمالي مثير للإعجاب بنسبة 95٪ ، مع متوسط وقت يبلغ 2 دقيقة فقط من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم. علاوة على ذلك ، فإن إجراء عمليات جمع دم متتالية ضمن النطاق المحدد لا يلحق أي ضرر بالفئران. هذه الطريقة تستحق الترويج لجمع الدم ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية واسعة النطاق.

المقدمة

الفئران هي واحدة من أكثر التجارب شيوعا ، وهناك العديد من الطرق للحصول على عينات الدم. بالنسبة للتجارب التي تتضمن جمع دم واحد في المرحلة الختامية ، يمكن الحصول على كمية كافية من الدم من خلال ثقب القلب أو جمع الدم من الشريان الأورطي البطني1. ومع ذلك ، تتطلب بعض الدراسات جمع الدم المتكرر من الفئران للدم الروتيني أو التحليل الكيميائي الحيوي ، خاصة في دراسات الحرائك الدوائية والسموم ، حيث يلزم جمع الدم المتكرر لتحديد امتصاص الأدوية وتوزيعها واستقلابها2.

حاليا ، على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم من الفئران ، على الرغم من عدم الحاجة إلى التخدير ، إلا أن هذه الطريقة يمكن أن تكون صعبة بالنسبة للمجموعات المتكررة ، وحجم الدم الذي تم جمعه صغير نسبيا 3,4. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يمكن جمع الدم من الأوردة الصافن والقضيب ، إلا أن كمية الدم التي تم الحصول عليها محدودة ، والتخدير مطلوب 1,5. علاوة على ذلك ، توفر عينات الدم التي تم جمعها من الضفيرة الوريدية تحت الفك السفلي ، وكذلك الأوردة تحت اللسان والوداجية وتحت الترقوة عينات عالية الجودة ولكنها تتطلب عادة تخديرا أو مساعدة عدة أفراد1،6،7،8،9. أخيرا ، لا يتطلب جمع الدم من الجيوب الأنفية / القناة خلف الحجاج تخديرا فحسب ، بل قد يتسبب أيضا في إصابة وإجهاد الفئران9.

عادة ما تكون جودة عينات الدم التي يتم الحصول عليها من الأوردة الرئيسية من أعلى المعايير1. في الوقت الحاضر ، وجدت بعض الدراسات أن أخذ العينات المجهرية المستمرة من خلال الوريد الوداجي هو طريقة مناسبة جدا للبحث السمي في الفئران على الرغم من أن هذه الطريقة تتطلب عادة قسطرة الوريد الوداجي10،11،12. لذلك ، يجدر استكشاف كيفية الحصول على عينات دم عالية الجودة وفقا لمبدأ 3R للبحوث الحيوانية دون تدخل جراحي. كان الهدف من هذه الدراسة هو تقديم طريقة لاستخراج الدم بكفاءة من الوريد تحت الترقوة في الفئران. تتيح هذه التقنية الجمع السريع للعينات المرضية من خلال إجراء شخص واحد دون الحاجة إلى التخدير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

التزمت هذه الدراسة بالمبادئ التوجيهية الموضحة في الطبعة الثامنة من دليل رعاية واستخدام المختبر13. حصل البحث على موافقة من لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة لانتشو الثاني وتم توثيقه وفقا لإرشادات REACH 2.014. تم إيواء اثني عشر فأرا من Wistar الأصحاء (ستة ذكور تزن 290-330 جم وست إناث تزن 250-280 جم) تتراوح أعمارهم بين 12-16 أسبوعا في مختبر GLP للحيوانات بجامعة Lanzhou لمدة 3 أيام قبل التجربة الفعلية. كانت أقفاص الفئران المستخدمة من النوع R5 ، بقياس 545 مم × 395 مم × 200 مم ، وكانت مجهزة بمواد فراش معقم. تم تزويد جميع الفئران بإمكانية الوصول غير المقيد إلى كل من الطعام والماء. حافظ المختبر على متوسط رطوبة يبلغ 25٪ ، ومتوسط درجة حرارة 24 درجة مئوية ، ودورة ضوئية تتناوب بين النهار والليل (7:00 صباحا / 7:00 مساء). في ختام الدراسة ، تم القتل الرحيم لجميع بشكل إنساني باستخدام جرعة زائدة من الأيزوفلوران. للحصول على معلومات شاملة بشأن المواد والأدوات المستخدمة في هذه الدراسة ، يرجى الرجوع إلى جدول المواد.

1. حساب حجم العينة واختيار

  1. اختر طريقة معادلة الموارد15 لتقدير حجم عينة باستخدام المعادلة (1).
    E = إجمالي عدد - إجمالي عدد المجموعات (1)
    حيث E هي درجة حرية تحليل التباين (ANOVA) وتتراوح من 10 إلى 20.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تقسيم 12 إلى مجموعتين A و B (ثلاثة ذكور وثلاث إناث لكل مجموعة).
  2. حدد النتيجة الأولية لهذه الدراسة على أنها معدل النجاح واستهلاك الوقت لأخذ عينات الدم المتكررة من قبل فرد واحد.
  3. حدد مقاييس النتائج الثانوية على أنها تغيرات في وزن جسم الفئران ، وتناول الطعام والماء ، بالإضافة إلى حدوث الأحداث الضائرة (مثل كسور الترقوة ، والأورام الدموية تحت الجلد ، واسترواح الصدر ، والوفيات).
  4. تعريف أخذ عينات الدم الناجحة على أنها تستوفي المعايير التالية: ط) أقل من ثلاث ثقوب لجمع دم واحد ؛ ب) إجمالي الوقت (من ضبط الفئران إلى الانتهاء من جمع الدم) لا يتجاوز 5 دقائق ؛ و iii) تحقيق حجم الدم المستهدف مع الحصول على بلازما واضحة. اعتبر أي انحراف عن هذه المعايير فشلا في أخذ العينات.

2. ضبط النفس وجمع الدم

ملاحظة: تم جمع عينات الدم من فئران المجموعة A و B من قبل باحثين ذوي خبرة ، وكلاهما سحب ما لا يقل عن 100 عينة دم. تم جمع عينات الدم من كلا المجموعتين من الفئران لما مجموعه 96 مرة على مدار 4 أيام. لا تتطلب طريقة جمع الدم هذه تخديرا أو أجهزة تقييد إضافية للفئران. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تقنيات معالجة بارعة.

  1. في الساعة 8:00 صباحا في اليوم السابق لأخذ عينات الدم (اليوم 1) ، قم بتعيين كل فأر في قفصه الفردي أثناء وزن طعامه وماءه. بعد ذلك ، اطلب من باحث آخر ، أعمى عن القياسات ، تسجيل وزن الفئران واستهلاكها للطعام واستهلاك المياه كل يوم في الساعة 8:00 صباحا من اليوم 1 فصاعدا.
  2. لاتباع هذا البروتوكول ، قم أولا بسحب الدم في الساعة 10:00 صباحا ثم في الساعة 10:00 مساء كل يوم ، وجمع 0.15 مل من الدم بالتناوب من الأوردة تحت الترقوة على كلا الجانبين.
    ملاحظة: تم تحديد كمية الدم التي سيتم جمعها من خلال الحد الأقصى للحجم الذي يمكن أن يتحمله الجرذ الأقل وزنا في غضون أسبوع.
  3. اغسل حقنة تحتوي على هيبارين الصوديوم (25 وحدة / مل) وعقم موقع الحقن بالكحول.
  4. قم بضرب جلد ظهر الجرذ برفق وقرص رقبته بشكل متكرر لمساعدة الفئران على الاسترخاء (فيديو 1).
  5. باستخدام إبهام اليد غير المهيمنة والسبابة ، أمسك جلد رقبة الجرذ وارفعه بقوة (الشكل 1 أ والفيديو 1).
  6. بالتنسيق مع اليد المهيمنة ، استخدم الأصابع الثلاثة المتبقية وراحة اليد غير المهيمنة لتأمين الجلد الخلفي للفأر وشل حركة أطرافه الأمامية (الشكل 1B و C والفيديو 2).
    ملاحظة: إذا قاوم الجرذ أو كافح ، يمكن تكرار هذا الإجراء عدة مرات لمساعدة الفئران على التعود على المناولة. الخطوات التالية هي مفتاح جمع الدم بنجاح.
  7. باستخدام السبابة غير المهيمنة ، اضغط برفق على جلد رأس الجرذ بينما تساعد الأصابع الأخرى ، جنبا إلى جنب مع راحة اليد ، في تدوير مفصل الكتف للخارج. خلال هذه العملية ، استخدم اليد المهيمنة لتمديد مفصل كتف الجرذ بالكامل (الشكل 1D-F والفيديو 2).
  8. أمسك الجرذ بقوة باليد غير المهيمنة لمحاذاة رأس الجرذ وجسمه في خط مستقيم (الشكل 1G ، H). بعد ذلك ، استخدم اليد المهيمنة لتحديد موضع الترقوة وتأكيد موقع البزل (الشكل 1I والفيديو 2 والفيديو 3).
    ملاحظة: حلق الفئران ليست ضرورية. في الشكل 1 ، تم إجراء الحلاقة فقط لإظهار موضع الترقوة والثقب إلى حد كبير. عند تقييد الفئران ، وخاصة الفئران >350 جم ، فإن السماح للفأر بإراحة قدميه على سطح صلب سيساعد في دعم وزن الجسم. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المقيد مراقبة معدل التنفس لكل فأر أثناء جمع الدم للتأكد من أن ضبط النفس ليس ضيقا جدا ، مما قد يسبب ضائقة تنفسية.
  9. إمساك المحقنة بالتوازي مع جسم الجرذ في اليد المهيمنة ، مع توجيه طرف الإبرة لأعلى ومقياس المحقنة نحو المجرب ، والحفاظ على زاوية 15 درجة تقريبا مع خط الوسط لجسم الجرذ. أدخل الإبرة 0.5 سم أسفل الشق الترقوي (عند تقاطع الثلث القريب من الترقوة والقص) ، مع التأكد من بقاء الإبرة موازية لجسم الجرذ (الشكل 1J والفيديو 3).
    ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص لزاوية وعمق إدخال الإبرة لتجنب ثقب الأوعية الدموية أو التسبب في تلف غير مقصود للأوعية المجاورة.
  10. اسحب المحقنة برفق قليلا لخلق ضغط سلبي ، وغالبا ما يكون مصحوبا بإحساس واضح بالاختراق عند دخول الأوعية الدموية (واضح بشكل خاص أثناء جمع الدم الأولي). حافظ على هذا الوضع واجمع 0.1-1.0 مل من الدم بسرعة ثابتة حسب الحاجة (باتباع إرشادات IACUC لحوالي 4-5.3 مل / كجم من الدم أسبوعيا1) (الشكل 1K والفيديو 3).
  11. إذا لم يكن هناك دم عند الثقب ، فحاول ضبط زاوية الإبرة وعمقها برفق أو قم بتدوير المحقنة برفق (فيديو 3). إذا لم تنجح ثلاث محاولات متتالية على نفس الجانب ، أوقف كل النزيف ثم انتقل إلى الجانب الآخر للثقب.
    ملاحظة: ينصح بالثقب السريع عبر الجلد لمنع الفئران من النضال بسبب عدم الراحة.
  12. ضع قطعة قطن للإرقاء وأعد الفئران إلى قفصها (فيديو 4).
  13. معالجة عينات الدم وفقا للمتطلبات التجريبية.

3. معالجة عينات الدم

  1. تخلص من إبرة المحقنة في وعاء الأدوات الحادة. نقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل تم شطفه مسبقا بالهيبارين. ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي ، واضبطه على 4 درجات مئوية و 1200 × جم ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق لفصل البلازما. انقل المصل باستخدام ماصة باستور سعة 1.0 مل إلى أنبوب طرد مركزي نظيف وقم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: لمنع انحلال الدم بسبب الضغط ، قم بإزالة طرف الإبرة عند الضرورة. أثناء شفط البلازما ، تجنب سحب خلايا الدم من أسفل الأنبوب. في بعض الأحيان ، قد يجمع سطح المحقنة فراء الفئران. احرص على عدم السماح لأي فرو بدخول الأنبوب ، لأنه قد يؤدي إلى التخثر.

4. التحليل الإحصائي

  1. عرض جميع البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري واختبارها للتأكد من تجانس التباين.
  2. استخدم اختبار فيشر الدقيق لمقارنة معدلات النجاح بين المجموعات.
  3. استخدم اختبار t المستقل المكون من عينتين لمقارنة المتوسط العام بين المجموعتين.
  4. استخدم تحليل التباين (ANOVA) للقياسات المستمرة مثل وقت أخذ عينات الدم ووزن الجسم وتناول الطعام واستهلاك المياه. ضع في اعتبارك P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر عينات البلازما عالية الجودة لونا أصفر باهتا ووضوحا وشفافية ، خالية من أي مسحة حمراء أو تخثر ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. يوضح الشكل 2B انحلال الدم (الجانب الأيسر) أو التخثر (الجانب الأيمن) نتيجة لإجراءات غير لائقة ، على التوالي. على مدار 96 جلسة جمع دم في غضون 4 أيام ، كان متوسط أوقات جمع الدم الفردي للمجموعتين A و B 119.87 ± 33.62 ثانية و 123.28 ± 30.96 ثانية على التوالي. لم يكن هناك فرق كبير في أوقات جمع الدم بين المجموعتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن جمع الدم في الوريد الذيل هو الطريقة الأكثر شيوعا لأخذ عينات الدم المتكررة في الفئران ، إلا أنه قد يتأثر بأدوية التخدير ، وبسبب صغر حجم الوريد الذيل ، فإن كمية الدم التي يمكن جمعها في حالة واحدة محدودة ، مما يؤدي إلى مدة أطول لجمع الدم 4,5. على الرغم من أن أنظمة قياس الطيف الكتلي الترادفية (MS / MS) عالية الأداء للكروماتوغرافيا السائلة (HPLC) جنبا إلى جنب مع أخذ العينات المجهرية الشعرية (CMS) لأوردة ذيل الفئران يمكن أن تقلل من كمية الدم المستخدمة ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للكشف عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مشروع خطة Cuiying للمستشفى الثاني بجامعة لانتشو (Grant No. PR0121015) والمختبر الرئيسي لمقاطعة قانسو لبحوث أمراض الجهاز البولي (المنحة رقم 0412D2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.75٪ محلول ملحي عاديGansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co.، Ltd.و [مدش] و [مدش]محلول الهيبارين الصوديوم المحضر
1 مل ماصة باستور BiosharpBS-XG-01-NSجمع الدم
حقنة 1 مل (26 جم ، 0.45 مم × 12 مم)Shinva Medical Instrument Co.، Ltd.0.45 * 12RWLBجمع الدم   ؛
1.5 مل أنبوب EppendorfBiosharpBS-15-Mتخزين وجمع الدم
75٪ كحول طبيشاندونغ ليركون للتكنولوجيا الطبية المحدودةو [مدش] و [مدش]تطهير موقع جمع دم الفئران
حامل أنبوب الطرد المركزيBiosharpBS-05 / 15-SM60&[مدش] ؛ و [مدش]
مقياس إلكترونيشنغهاي PUCHUN قياس الصك المحدودةJE1002وزن
حقن الصوديوم الهيبارينخبى تشانغشان الكيمياء الحيوية الصيدلانية المحدودةو [مدش] و [مدش]اشطف المحقنة وأنبوب EP ؛ خفف بمحلول ملحي عادي إلى 25 وحدة / مل
أجهزة الطرد المركزي ذات درجة الحرارة المنخفضةHuNan Xiang Yi الطرد المركزي Instrument  Co., Ltd.  H1750Rفصل المصل

المراجع

  1. UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
  2. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  3. Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513(2019).
  4. Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
  5. Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513(2023).
  6. Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439(2022).
  7. Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
  8. Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
  9. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
  10. Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
  11. Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
  12. Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167(2021).
  13. National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  14. Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  15. Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
  16. Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
  17. Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
  18. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 3/21/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66075

الوسوم

أخذ عينات دم الوريد تحت الترقوة في الفئران الواعية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.