Method Article

إنشاء خط خلوي RIP1 Knockout U937 باستخدام نظام CRISPR-Cas9

DOI:

10.3791/66077

⸱

April 11th, 2025

 ,  , 
1Department of Life Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences, 2Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لأن البروتوكولات المتعلقة بكريسبر أصبحت مفيدة بشكل متزايد ويمكن الوصول إليها ، فلا يزال من الممكن أن تنشأ المضاعفات والعقبات في ظل ظروف تجريبية محددة. يحدد هذا البروتوكول إنشاء خط خلية بشرية بالضربة القاضية من سيرين / بروتين ثريونين 1 (RIPK1 / RIP1) المتفاعل مع المستقبلات باستخدام CRISPR / Cas9 ويسلط الضوء على التحديات المحتملة التي تمت مواجهتها خلال هذه العملية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول إجراء لإخراج جين RIP1 باستخدام CRISPR / Cas9 في خط خلية U937 أحادية الخلية البشرية. تستخدم الطريقة بلازميدات الحمض النووي الريبي الموجهة المعينة وبلازميدات التعبئة والتغليف الفيروسية لتحقيق ضربة قاضية لجين RIP1. يعالج البروتوكول التحديات والتحسينات التي تطرأ على طرق كريسبر التقليدية ، مما يتيح تكراره لدراسات موت الخلايا المستقبلية. يمكن استخدام الخلايا الطافرة الناتجة للتحقيق في التغيرات الميكانيكية في موت الخلايا ، حيث تلعب بروتينات RIP1 الوظيفية دورا. أظهرت فحوصات الجدوى انخفاضا كبيرا في موت الخلايا في الخلايا بالضربة القاضية بعد تحريض التشريع. كشف الفحص المجهري الفلوري عن انخفاض ملحوظ في أنواع الأكسجين التفاعلي للميتوكوندريا (ROS) في الخلايا بالضربة القاضية في ظل نفس الظروف. تؤكد هذه المقايسات الوظيفية معا فقدان بروتين RIP1. تم تحسين هذا الإجراء للاستخدام مع الخلايا الوحيدة البشرية U937 ، ويمكن أيضا تكييفه لاستهداف منظمات موت الخلايا الرئيسية الأخرى ، مما ينتج عنه طفرات وظيفية غير قاتلة. تتم معالجة المزالق المحتملة في جميع الأنحاء لتقديم رؤى حول التحديات التي قد تنشأ أثناء توليد الطفر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطور استخدام تقنية تحرير الجينات CRISPR / Cas9 بسرعة منذ اكتشافها1،2،3. إن القدرة على ضرب الجينات أو ضربتها القاضية داخل خطوط الخلايا أو البكتيريا لا تقدر بثمن لتوجيه البحث وفهم الآليات داخل الخلايا1،2،3،4،5،6. يحسن نظام CRISPR-Cas9 طرق تحرير الجينات السابقة ، مثل نوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALEN) ، من خلال تبسيط هندسة خصوصية الجينات. يتضمن هذا الإجراء مكونين أساسيين: دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) المستخدم لتحديد الهدف الجيني المقصود ، و Cas9 ، وهو نوكلياز داخلي يعدل موقع الجينوم المقصودبكسر الحمض النووي المزدوج 3،4. سيعمل gRNA كدليل لنوكيلياز Cas9 لتحديد موقع الكسر المزدوج الشريطة وبدء التسلسل الجيني المقصود من خلال اقتران قاعدة Watson-Crick. تتضمن العملية الكاملة لتحرير الجينوم بواسطة نظام CRISPR / Cas9 الآلات الخلوية التي تصلح هذه الفواصل المزدوجة الشريطة في الحمض النووي من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) أو إعادة التركيب المتماثل3،7. من المرجح أن يحدث NHEJ ، مما يؤدي بشكل فعال إلى إنشاء طفرة في الجينوم تؤدي إلى فقدان التعبير عن الجين المستهدف3،4.

تمكنت المصادر التجارية من إنشاء مكتبات لأهداف الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي التي يمكن التعبير عنها من خلال نمو البكتيريا وعزلها ، مما يحسن بشكل كبير من سهولة استخدامها. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لنظام CRISPR / Cas9 هو صعوبة توصيل مركب gRNA و Cas9 إلى خطوط الخلايا المستهدفة. تنشأ هذه القيود في خطوط الخلايا المعلقة ، حيث يشار إليها عموما باسم 8 التي يصعبنقلها. طرق التعدي النموذجية ليست فعالة بشكل عام في توصيل نظام CRISPR / Cas9 إلى خلايا التعليق ، وهذا هو السبب في أن طرق توصيل الفيروس مثل تعداء الفيروسات ونقلها مناسبة بشكل أفضل لهذا النوع من خط الخلايا8،9.

يتطلب هذا النوع من التعدي ناقلا للفيروسات العدسية يقوم بتشفير gRNA و Cas9 endonuclease جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة الفيروسية المضافة ، والتي يتم نقلها إلى خط خلوي قادر على تصنيع جزيئات الفيروسات العسسية. خط الخلايا المختار عادة لهذه العملية هو HEK293T الخلايا ، حيث يسهل نقلها وتعمل بكفاءة عالية في تجميع gRNA و Cas99،10. ثم يتم إطلاق هذه الجسيمات كفيروسات عدسية في المادة الطافية ، والتي يمكن استخدامها لنقل gRNA و Cas9 إلى خط الخلايا المعلقة المقصود ، مثل الخلايا الوحيدة البشرية U937. على هذا النحو ، يحتوي الإجراء الموصوف هنا على التغييرات التالية مقارنة بالطرق المعمول بها: (1) طريقة التعداء البديلة لخطوط الخلايا التي يصعب نقلها. (2) لا حاجة لتركيز الحمض النووي البلازميد كريسبر أو استخدام أجهزة الطرد المركزي الفائقة. و (3) يلغي الحاجة إلى الاستنساخ أحادي الخلية.

كان التركيز المباشر لهذه المقالة هو القضاء على جين RIP1 في الخلايا الوحيدة البشرية U937. يتم التحكم في الشكل الكنسي لتشريح مسار موت الخلايا شديد الالتهابات بواسطة RIP1 ، والذي يعمل كهدف محوري لدراسات موت الخلايا. 11،12،13،14 عندما يصبح RIP1 نشطا من خلال الفسفرة الذاتية ، فإنه يقوم بعد ذلك بتجنيد ويسبب الفسفرة المباشرة وتنشيط كيناز سيرين / بروتين ثريونين المتفاعل مع المستقبلات 3 (RIPK3 / RIP3) والسودوكيناز الشبيه بمجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) لتشكيل النيكروسوم. بعد هذا التكوين ، يكون النيكروسوم حرا في التحرك في جميع أنحاء الخلية للتفاعل مع العضيات مثل الميتوكوندريا12،13. في الميتوكوندريا ، يعمل RIP1 على تحفيز حلقة التغذية الراجعة الإيجابية مع التمثيل الغذائي الخلوي ، مما يؤثر بشكل مباشر على إنتاج ROS للميتوكوندريا ، والذي بدوره يعزز المزيد من الفسفرة الذاتية ل RIP1 ، وتكوين النيكروسوم ، والتنفيذ النهائي لداء التشريح11،12،13،14.

في حين أن تركيز مجموعة البحث الحالية ينصب على دور RIP1 في موت الخلايا ، فإن الأسباب الأخرى لدراسة RIP1 تشمل أدواره في الالتهاب والعدوى. عند التنشيط بواسطة مستقبلات الموت مثل مستقبلات TNF ، يعزز RIP1 تنشيط مسار إشارات NF-κB ، مما يؤدي إلى نسخ السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والكيموكينات والجزيئات الأخرى الضرورية لتجنيد الخلايا المناعية وتضخيم الاستجابة الالتهابية15. بالإضافة إلى تنشيط NF-κB ، يمكن ل RIPK1 أيضا إشراك مسارات إشارات MAPK ، مما يزيد من تعزيز الالتهاب15،16. فيما يتعلق بدوره في الاستجابات للعدوى ، يعمل RIP1 كوسيط محوري للاستجابة الالتهابية للمضيف ، لا سيما في الاستجابة للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) المعترف بها بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) مثل المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs) 17. علاوة على ذلك ، أثناء تعفن الدم ، يتم تنشيط RIP1 عن طريق إرسال إشارات من خلال مستقبلات الموت مثل مستقبلات عامل نخر الورم ، مما يؤدي إلى بدء شلالات مؤيدة للالتهابات. يتوسط RIPK1 في تنشيط مسارات NF-κB و MAPK ، مما يعزز إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل TNF-α و IL-1β و IL-6 ، والتي تعد محركات رئيسية للاستجابة الالتهابية الجهازية المميزة للتعفنالدموي 18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير تمثيل تخطيطي للإجراء في الشكل 1. دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) والتسلسل المستهدف مذكور في الجدول 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. حصاد ناقلات التعبير الفيروسي RIP1 التي تستهدف CRISPR gRNA التي تحتوي على نوكلياز داخلي Cas9 ومقاومة البيرومايسين من الإشريكية القولونية

  1. الإشريكية القولونية ذات الخط الرباعي التي تؤوي gRNA الناقلة الفيروسيةعلى ألواح أجار LB مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
  2. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام حتى تظهر المستعمرات الفردية في المنطقة الأكثر تمييعا على اللوحة.
  3. حدد مستعمرة واحدة بحلقة معقمة وأضف كل مستعمرة بشكل فردي إلى 5 مل من مرق LB مكمل ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تأكد من وضع الماصة جيدا لأعلى ولأسفل بعد إضافة المستعمرة الفردية لضمان التجانس.
  4. قم بتنفيس ولصق غطاء الأنبوب المخروطي سعة 50 مل واحتضانه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة لمدة 8 ساعات.
  5. خلال فترة الحضانة لمدة 8 ساعات عند 37 درجة مئوية ، أضف 40 مل من مرق LB مكملا ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين إلى كل من أربعة أنابيب مخروطية منفصلة سعة 50 مل.
  6. بعد الحضانة لمدة 8 ساعات عند 37 درجة مئوية ، خذ 40 ميكرولتر من E المزروعة. زراعة القولونية وإضافتها إلى جميع الأنابيب المخروطية الأربعة سعة 50 مل.
  7. قم بتنفيس ولصق أغطية الأنابيب المخروطية سعة 50 مل واحتضانها في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة لمدة 12-16 ساعة.
  8. بعد هذا الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بتدوير جميع الأنابيب عند 3220 × جم في دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة لحبيبات بكتيريا الإشريكية القولونية المزروعة.
  9. صب المواد الطفية إلى دورق نفايات ، ثم امزج جميع الكريات الأربعة في 10 مل من مرق LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
  10. قم بتدوير الكريات المدمجة مرة أخرى بأقصى سرعة في دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة للحصول على حبيبات مفردة.
  11. تخلص من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية في دورق النفايات ، واستمر في أحد الخيارات التالية: (1) قم بتجميد الحبيبات الرطبة كما هي عند -80 درجة لمدة تصل إلى 1 شهر. (2) المضي قدما في تنقية البلازميد الناقلات الفيروسية.
    ملاحظة: إذا تم اختيار الخيار 1، فقد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. تعداء الخلايا HEK293T باستخدام ناقل التعبير الفيروسي المنقى CRISPR gRNA الذي يستهدف RIP1

  1. HEK293T البذور الخلايا طوال الليل بتركيز 3 × 106 إلى 5 × 106 خلايا في صفيحة 10 سم تحتوي على DMEM مع 4.5 جم / لتر من جلوكوز D ، و L-glutamine ، و 110 مجم / لتر من بيروفات الصوديوم ، و 10٪ FBS معطل للحرارة.
  2. في اليوم التالي ، تأكد من أن اللوحات تحتوي على ما يقرب من 70٪ -90٪ من التقاء ، ثم تابع البروتوكول.
  3. قم بإعداد تعداء الخلايا بنسبة 1: 1: 1: 1 من البلازميدات (بلازميد كريسبر التجريبي: pLP1: pLP2: pLP / VSVG) باستخدام كاشف التعدي بنسبة 3: 1 (كاشف 3 أجزاء: جزء واحد من الحمض النووي البلازميد) ، جنبا إلى جنب مع وسط المصل المخفض.
    ملاحظة: جزء pLP1: pLP2: pLP / VSVG من النسبة عبارة عن مزيج تغليف عدسي فيروسي.
    1. قم بموازنة كاشف التعداء ، ووسط المصل المنخفض ، والحمض النووي البلازميد CRISPR ، ومزيج التعبئة والتغليف الفيروسي إلى درجة حرارة الغرفة قبل إعداد التعدين.
    2. امزج معا 75 ميكرولتر من كاشف التعدي ، و 2500 ميكرولتر من وسط المصل المختزل ، و 25 ميكروغرام من الحمض النووي الكلي (الحساب على أساس تحليل مقياس الطيف الضوئي للحمض النووي البلازميد CRISPR ونسبة 1: 1: 1: 1 مع مزيج التعبئة والتغليف الفيروسي).
    3. اترك هذا الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة. قم بتقطيع الحجم الكامل لهذا الخليط بعناية إلى لوحة الخلية المتقاربة HEK293T مباشرة في الوسائط (لا حاجة لتغيير الوسائط).
  4. قم بتدوير اللوحة برفق لضمان التجانس الكافي لمزيج الإرسال ووسائط اللوحة. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

3. نقل الفيروسات العدسية لخلايا U937 أو الخلايا المستهدفة

  1. بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، انقل الوسائط من المنتج HEK293T لوحة الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  2. الطرد المركزي الحجم عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكبيل أي خلايا HEK293T متبقية. قم بإزالة جميع المواد الطافية المحتوية على الفيروسات ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا HEK293T المحببة ، واحتفظ بها في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل. بعد ذلك ، قم بتطهير الأنبوب المحتوي على الحبيبات والتخلص منه في حاوية النفايات البيولوجية المناسبة.
    ملاحظة: يمكن تخزين المواد الطافية المستندة إلى فيروس العقيد البشري عند -80 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، فإن القيام بذلك ينطوي على خطر فقدان استقرار الفيروس بنسبة تصل إلى 55٪ بعد دورة التجميد / الذوبان الأولى19.
  3. عد واحصل على حبيبات من 2 × 106 خلايا U937 في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق الطرد المركزي بحجم مناسب عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وصب المادة الطافية ، وترك حبيبات الخلية في الأنبوب.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية U937 مع كل المادة الطافية المحتوية على الفيروس ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 290 × جم لمدة 60 دقيقة.
  5. بعد الطرد المركزي ، استخدم ماصة لإعادة تعليق الحبيبات مع المادة الطافية المحتوية على الفيروس الموجودة بالفعل في الأنبوب.
  6. ضع الأنبوب على دوار من طرف إلى طرف (أو جهاز دوار مشابه) لمدة 60 دقيقة.
    1. بعد هذا الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية بخليط وسائط بنسبة 1:1 من كل من المواد الطفية المحتوية على الفيروسات ووسائط RPMI-1640 الكاملة المكملة بنسبة 10٪ FBS المعطلة بالحرارة.
  7. انقل خليط الخلية إلى صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 10 سم واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  8. بعد هذا الحضانة ، قم بالطرد المركزي لخلايا U937 عند 400 × جم لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
    1. أعد تعليق الحبيبات بوسائط RPMI-1640 كاملة مكملة بنسبة 10٪ FBS معطلة بالحرارة و 5 ميكروغرام / مل من بورومايسين وانقل الخلايا إلى قارورة T25.
    2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية دون أن تمس لمدة 2-3 أسابيع ، مع التأكد من فحصها كل 1-2 أيام بحثا عن علامات نمو الخلايا.
      ملاحظة: بمجرد أن تصبح الخلايا متقاربة وتتمتع بوقت دوران صحي بعد المرور الأولي ، يمكن اختبارها للتأكد من فعالية البروتوكول المكتمل.

4. اختبار فعالية البروتوكول المكتمل في إنشاء خلايا RIP1 CRISPR الطافرة باستخدام تحليل اللطخة الغربية

  1. قم بتوليد محللات البروتين الخلوي للخلايا الوحيدة U937 من النوع البري (WT) ، وخلايا CRISPR غير المستهدفة (NTC) ، والخلايا الطافرة RIP1 CRISPR11،12،13.
  2. قم بتشغيل هذه المحللات على جل SDS-PAGE واستمر في تحليل اللطخة الغربية14.
    1. تطبيع العينات إلى بروتين التدبير المنزلي أولا.
    2. بعد التطبيع ، قم بتحليل العينات لمستويات تعبير البروتين RIP1 لتحديد نجاح إنشاء خط خلية RIP1 CRISPR14 بشكل مناسب.
  3. بعد تشكيل تحليل اللطخة الغربية ، يمكن استخدام الخلايا لأغراض التجريب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد إنتاج مجموعة متجمعة من خلايا U937 الطافرة RIP1 CRISPR ، تم إجراء تحليل SDS-PAGE و Western blot. تم استخدام تحليل اللطخة الغربية لتحديد الإنشاء الناجح لخط الخلايا الطافرة RIP1 CRISPR من خلال تقييم فقدان مستويات التعبير عن بروتين RIP1. تم إجراء هذا القرار بناء على النتيجة المقارنة للخلايا الوحيدة WT U937 وخلايا NTC. في الشكل 2 ، لم يتم الكشف عن تعبير RIP1 للخلايا الطافرة 5 ميكروغرام / مل من بورومايسين RIP1 CRISPR ولكن تم اكتشافه لكل من خلايا WT U937 و NTC. توضح ه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى توفير تعليمات وتحليل مفصل للمزالق المحتملة في كفاءة وموثوقية تعدين الفيروسات العدسية ونقلها لإنشاء خط خلية RIP1 بالضربة القاضية U937. على الرغم من أن طريقة التعدين والتحويل هذه تتطلب عمالة ووقتا طويلا ، إلا أنها تعتبر عموما طريقة فعالة لدمج gRNA و Cas9 endonuclease المختار في خطوط الخلايا التي يصعب نقلها8،9،20. كما هو الحال مع الخلايا الوحيدة مثل خلايا U937 والخل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، رقم المنحة NIH 2R15-HL135675-02 إلى T.J.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
متوسط DMEM المعدلجيبكو11995-040
الأمبيسيلينسيغماأ 1593
مكرر بنزيميد هوشست 33342 ثلاثي هيدروكلوريدسيغماب2261
أكمل RPMI-1640 متوسطسيغما6504 راند
سلالة كريسبر NTC gRNA الإشريكية القولونيةترانسوميكTELA1011
كريسبر ريب1 جرنا سلالة الإشريكية القولونيةترانسوميكتيف -1162203
نهاية فوق نهاية الدوارثيرمو ساينتفيك
مجهر مضان EVOS FLتقنيات الحياة
GenElute Plasmid Maxiprep Kitسيغمابي إكس 15
الماعز المضادة للأرانب IgG الجسم المضاد ، (H + L) HRP المقترنسيغماAP307P
HEK293T الخلاياATCC
شاكر الحاضنةنيو برونزويك العلمية
إل بي أجاردينار بحريني244520
مرق رطلدينار بحريني244610
LV-MAX مزيج التعبئة والتغليف Lentiviralجيبكوأ 43237
ميتوسوكس أحمرميدكيم اكسبرسHY-D1055
مقياس الطيف الضوئي NanoDropثيرمو ساينتفيك
نيكروستاتين-1ميدكيم اكسبرسHY-14622A
أوبتي ميمجيبكو31985-062
بورومايسينسيغماص 7255
أرنب مضاد للإنسان RIP1 mAbتقنية إشارات الخلية3493
SDS-PAGE ومعدات الوصخة الغربيةبيوراد
TNF- &ميدكيم اكسبرسHY-P7058
U937 الخلايا الوحيدة البشريةATCC
نظام فحص تكاثر الخلايا WST-1تقراMK400
كاشف تعداء الحمض النووي X-tremeGENE 9روش للتشخيص6365779001
z-VAD-FMKAPExBIOأ 1902

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gostimskaya, I. CRISPR–Cas9: A History of its discovery and ethical considerations of its use in genome editing. Biochem (Mosc.). 87 (8), 777-788 (2022).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  4. Redman, M., King, A., Watson, C., King, D. What is CRISPR/Cas9. Arch Dis Child Educ Pract Ed. 101 (4), 213-215 (2016).
  5. Ebrahimi, S., et al. In vitro evaluation of CRISPR PX-LmGP63 vector effect on pathogenicity of Leishmania major as a primary step to control leishmaniasis. Microb Pathog. 161 (Pt A), 105281(2021).
  6. Ebrahimi, S., Alipour, H., Azizi, K., Kalantari, M. Construction of px-lmgp63 using crispr-cas9 as primary goal for gp63 gene knockout in Leishmania major and leishmanization. Jundishapur J Microbiol. 14 (1), 112965(2021).
  7. Lim, J. M., Kim, H. H. Basic principles and clinical applications of CRISPR-based genome editing. Yonsei Med J. 63 (2), 105-113 (2022).
  8. Han, X., et al. CRISPR-Cas9 delivery to hard-to-transfect cells via membrane deformation. Sci Adv. 1 (7), 1500454(2015).
  9. Sano, S., et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. (152), e59977(2019).
  10. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Front Bioeng Biotechnol. 9, 796991(2021).
  11. Mccaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Dis. , 1-14 (2018).
  12. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial ROS prime the hyperglycemic shift from apoptosis to necroptosis. Cell Death Dis. 6 (1), (2020).
  13. Deragon, M. A., et al. Mitochondrial trafficking of MLKL, Bak/Bax, and Drp1 Is mediated by RIP1 and ROS which leads to decreased mitochondrial membrane integrity during the hyperglycemic shift to necroptosis. Int J Mol Sci. 24 (10), 8609(2023).
  14. LaRocca, T. J., Sosunov, S. A., Shakerley, N. L., Ten, V. S., Ratner, A. J. Hyperglycemic conditions prime cells for RIP1-dependent necroptosis. J Biol Chem. 291 (26), 13753-13761 (2016).
  15. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  16. Yang, Y., et al. A Cytosolic ATM/NEMO/RIP1 complex recruits TAK1 To mediate the NF-κB and p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)/MAPK-activated protein 2 responses to DNA damage. Mol Cell Biol. 31 (14), 2774-2786 (2011).
  17. Eng, V. V., Wemyss, M. A., Pearson, J. S. The diverse roles of RIP kinases in host-pathogen interactions. Semin Cell Dev Biol. 109, 125-143 (2021).
  18. Liu, X., et al. RIPK1 in the inflammatory response and sepsis: Recent advances, drug discovery and beyond. Front Immunol. 14, 1114103(2023).
  19. Kowolik, C. M., Yee, J. -K. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 5 (6), 762-769 (2002).
  20. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 11165(2021).
  21. Keller, A. A., Maeß, M. B., Schnoor, M., Scheiding, B., Lorkowski, S. Transfecting Macrophages. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1784, 187-195 (2018).
  22. Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. THP-1 and U937 cells. The impact of food bioactives on health: In vitro and ex vivo. models. 159 (147), (2015).
  23. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 495-505 (2009).
  24. Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17 (3), 441-450 (2008).
  25. Swainson, L., Mongellaz, C., Adjali, O., Vicente, R., Taylor, N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 415, 301-320 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RIP1 KnockoutCRISPR Cas9U937 CellsGene KnockoutLentiviral PackagingGuide RNACell DeathNecroptosis InductionFluorescence MicroscopyReactive Oxygen Species

Related Articles