Method Article

تصور البروتينات منخفضة الوفرة والتعديلات اللاحقة للترجمة في أجنة ذبابة الفاكهة الحية عن طريق حقن الأجسام المضادة الفلورية

DOI:

10.3791/66080

⸱

January 19th, 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, SUSTech University, 2Shenzhen PKU-HKUST Medical Center, 3Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول وضع العلامات الفلورية المخصصة القائمة على الأجسام المضادة وحقنها في أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة لتمكين التصوير المباشر للبروتينات منخفضة الوفرة أو التعديلات اللاحقة للترجمة التي يصعب اكتشافها باستخدام أساليب GFP / mCherry-tag التقليدية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى تصور البروتينات في الخلايا الحية باستخدام GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) وعلامات الفلورسنت الأخرى إلى تحسين فهم توطين البروتين وديناميكياته ووظيفته بشكل كبير. بالمقارنة مع التألق المناعي ، يعكس التصوير الحي بشكل أكثر دقة توطين البروتين دون حدوث قطع أثرية محتملة ناتجة عن تثبيت الأنسجة. الأهم من ذلك ، يتيح التصوير الحي التوصيف الكمي والزمني لمستويات البروتين والتوطين ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات البيولوجية الديناميكية مثل حركة الخلية أو انقسامها. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لنهج وضع العلامات الفلورية هو الحاجة إلى مستويات تعبير عالية بما فيه الكفاية من البروتين لتحقيق تصور ناجح. وبالتالي ، لا يمكن اكتشاف العديد من البروتينات الفلورية الموسومة داخليا بمستويات تعبير منخفضة نسبيا. من ناحية أخرى ، يمكن أن يؤدي التعبير خارج الرحم باستخدام المروجين الفيروسيين في بعض الأحيان إلى سوء توطين البروتين أو تغيرات وظيفية في السياقات الفسيولوجية. لمعالجة هذه القيود ، يتم تقديم نهج يستخدم الكشف عن البروتين بوساطة الأجسام المضادة الحساسة للغاية في الأجنة الحية ، مما يؤدي بشكل أساسي إلى التألق المناعي دون الحاجة إلى تثبيت الأنسجة. كدليل على المبدأ ، يمكن تصور مستقبلات Notch الموسومة داخليا والتي بالكاد يمكن اكتشافها في الأجنة الحية بنجاح بعد حقن الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، تم تكييف هذا النهج لتصور تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) في الأجنة الحية ، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الزمنية في أنماط فسفرة التيروزين أثناء التطور الجنيني المبكر والكشف عن مجموعة فرعية جديدة من الفوسفوتيروزين (p-Tyr) تحت الأغشية القمية. يمكن تعديل هذا النهج لاستيعاب الأجسام المضادة الأخرى الخاصة بالبروتين أو العلامات أو PTM ويجب أن يكون متوافقا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى القابلة للحقن أو خطوط الخلايا. يفتح هذا البروتوكول إمكانيات جديدة للتصوير الحي للبروتينات منخفضة الوفرة أو PTMs التي كان من الصعب اكتشافها في السابق باستخدام طرق وضع العلامات الفلورية التقليدية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التألق المناعي هو تقنية أساسية لبيولوجيا الخلية الحديثة التي طورها في الأصل ألبرت كونز ، والتي تمكن من اكتشاف الجزيئات في مقصوراتها الخلوية الأصلية وتوصيف التركيبات الجزيئية للعضيات أو الآلات تحت الخلوية1. إلى جانب التلاعب الجيني ، يساعد التألق المناعي في تأسيس المفهوم المقبول الآن بأن توطين البروتين ضروري لوظيفته2. بصرف النظر عن الأجسام المضادة الأولية المحددة والأصباغ الفلورية الساطعة ، يعتمد نجاح هذه التقنية على عملية أولية تسمى التثبيت والنفاذية ، والتي تحافظ على التشكل الخلوي ، وتشل المستضدات ، وتزيد من إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة في المقصورات داخل الخلايا. حتما ، فإن عملية التثبيت والنفاذية ستقتل الخلايا وتنهي جميع العمليات البيولوجية3. لذلك ، يوفر التألق المناعي لقطات فقط لرحلة حياة البروتينات. ومع ذلك ، فإن العديد من العمليات البيولوجية مثل هجرة الخلايا والانقسامات ديناميكية بطبيعتها ، وتتطلب التحقيق في سلوكيات البروتين بطريقة مكانية زمانية 4,5.

لفحص ديناميات البروتين في الكائنات الحية ، تم تطوير طرق التصوير الحية القائمة على البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) 6 والمجاهر عالية السرعة متحدة البؤر. باختصار ، يمكن التلاعب بالبروتين محل الاهتمام وراثيا ليتم دمجه مع GFP7 ، ثم يتم التعبير عنه خارجيا من المروجين الفيروسي أو الخميرة مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) 8 أو تسلسل التنشيط المنبع (UAS)9. نظرا لأن GFP ذاتي الفلورسنت بطبيعته ، فلا يلزم وجود أجسام مضادة مقترنة بالفلوروفور للكشف عن توطين البروتينات المستهدفة ، والتي تتجاوز ضرورة العمليات الأولية للتثبيت أو النفاذية. على مدى العقدين الماضيين ، تم تطوير علامات الفلورسنت التي تغطي الطيف الكامل للأطوال الموجية10 ، مما يتيح التصوير الحي متعدد الألوان للعديد من البروتينات المستهدفة في نفس الوقت. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الأصباغ الفلورية المهندسة كيميائيا مثل AlexaFluor أو ATTO ، فإن التألق الذاتي لهذه البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا ضعيف نسبيا وغير مستقر عند التعبير عنه من المروجين الداخليين ، خاصة أثناء التصوير المباشر على نطاقات زمنية أطول10. في حين يمكن التخفيف من هذا النقص عن طريق الإفراط في التعبير عن البروتينات المستهدفة الموسومة بالفلورسنت ، فإن العديد من الأنشطة الأنزيمية مثل الكينازات والفوسفاتاز تعطل بشدة العمليات البيولوجية الطبيعية إذا لم يتم التعبير عنها على المستويات الفسيولوجية.

يقدم هذا البروتوكول طريقة تتيح إضاءة الهدف القائمة على الأجسام المضادة الضوئية في إعداد صورة حية ، مما يسمح بشكل أساسي بالتألق المناعي دون عملية التثبيت أو النفاذية (الشكل 1). من خلال تفاعل أمين أولي بسيط قائم على NHS11 ، يمكن للمرء أن يقترن الأصباغ الفلورية مثل AlexaFluor 488 أو 594 مع أي جسم مضاد أولي أو GFP / HA / Myc nanobody12. بالاستفادة من ميزة تطورية تتمثل في أن جميع الخلايا الجنينية لذبابة الفاكهة تشترك في سيتوبلازم مشترك خلال المرحلة13 من المخلوي ، يمكن للمرء تحقيق ارتباط المستضد والإضاءة عبر الأجنة بأكملها بعد حقن الأجسام المضادة المترافقة بالصبغة. مع توسيع مكتبات البروتينات الموسومة داخليا المتوفرة في ذبابة الفاكهة وأنظمة النماذجالأخرى 14 ، يمكن لهذه الطريقة توسيع تطبيقات هذه المكتبات من خلال الكشف عن ديناميكيات البروتينات الموسومة بالفلورسنت منخفضة الوفرة وغيرها من البروتينات غير الموسومة بالفلورسنت (HA / Myc-tagged) في الأنسجة الحية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة كلية علوم الحياة ، جامعة SUSTech. الكائن الحي المستخدم هو ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، والأنماط الجينية هي Notch-Knockin-GFP (الكروموسوم X) و Sqh-sqh-GFP (الكروموسوم الثاني) ، التي توفرها بسخاء مختبرات الدكتور فرانسوا شويسغوث (معهد باستور) والدكتورة جنيفر زالين (معهد سلون كيترينج) ، على التوالي. بينما يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على جوانب وضع العلامات على الأجسام المضادة والتصوير الحي ، يرجى الرجوع إلى التقارير المنشورة للحصول على أوصاف أكثر تفصيلا لجمع أجنة ذبابة الفاكهة وحقنها15،16.

1. وضع العلامات الفلورية للأجسام المضادة

  1. على نحو مفضل ، استخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الأجسام النانوية للبروتين محل الاهتمام. تحضير تركيز مخزون الأجسام المضادة عند 1 مجم / مل أو أعلى.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام الجسم النانوي GFP (انظر جدول المواد) كمثال. يتم تعبئة الجسم النانوي GFP المتاح تجاريا بتركيز 1.0 مجم / مل وحجم 250 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام مجموعة لصق الأجسام المضادة المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) ، والتي تقارن Alexa Fluor 594 بالأمينات الأولية للبروتينات من خلال تفاعل إستر succinimidyl11. الأهم من ذلك ، أن عملية وضع العلامات هذه لا تغير بشكل كبير تركيز الأجسام المضادة.
  2. قم بإعداد محلول بيكربونات الصوديوم 1 متر عن طريق تعليق المكون B (المتوفر في مجموعة وضع العلامات على الأجسام المضادة) في 1 مل من الماء منزوع الأيونات.
  3. اضبط تركيز الجسم المضاد على 1.0 مجم / مل ، ثمأضف حجم 1 /10 (10 ميكرولتر ل 100 ميكرولتر GFP nanobody) من محلول بيكربونات الصوديوم 1 M.
  4. أضف 110 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة (من الخطوة 1.3) مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على صبغة Alexa Fluor 594. عكس لخلط (لا دوامة) واحتضان على الدوار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتجميع عمود التنقية من مجموعة الاقتران (انظر جدول المواد). قم بإعداد سرير راتينج سعة 1.5 مل (متوفر في مجموعة وضع العلامات على الأجسام المضادة) وطرد مركزي العمود عند 1100 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة السائل الزائد من الراتنج.
  6. أضف مزيج التفاعل (من الخطوة 1.4) بالتنقيط إلى أعلى عمود الراتنج وأجهزة الطرد المركزي عند 1100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع الجسم المضاد المسمى. يجب أن يظهر الجسم المضاد الذي تم جمعه باللون الوردي ، ويجب أن يكون الحجم أقل بقليل من 100 ميكرولتر. يخزن في أنابيب مغلفة بالرقائق أو داكنة اللون عند 4 درجات مئوية.

2. إعداد أجنة ذبابة الفاكهة

  1. ضع 200 ذبابة الفاكهة البالغة حديثة الفقس في قفص بلاستيكي على شكل أسطوانة (القطر = 5 سم ، الارتفاع = 8 سم) بنسبة ذكر إلى أنثى تبلغ 1: 10. أغلق أحد الجانبين بشبكة معدنية مسامية للتهوية والجانب الآخر بطبق أجار عصير الفاكهة / معجون الخميرة.
  2. تغيير لوحة كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام قبل جمع الجنين. هذا يسمح بمزامنة وضع بيض ذبابة الفاكهة ويحسن كفاءة التجميع.
  3. في يوم الحقن ، قم بتغيير القفص إلى طبق عصير الفاكهة مع الحد الأدنى من معجون الخميرة وجمع الأجنة عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إذا لم تسفر الجولة الأولى من الجمع عن أجنة كافية (<50 جنينا) ، فتخلص من اللوحة الأولى وكرر هذه الخطوة لجولة ثانية من الجمع حتى يتم وضع أكثر من 100 جنين في غضون 1 ساعة.
  4. أخرج الطبق من القفص لإيقاف وضع البيض واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة ساعتين أخريين للحصول على أجنة عمرها 2-3 ساعات. المرحلة الصحيحة من الأجنة أمر بالغ الأهمية لنجاح حقن الأجسام المضادة.
  5. لإزالة قشر الأجنة ، أضف 2 مل من المبيض بنسبة 50٪ إلى طبق عصير الفاكهة وقم بإخراج الأجنة برفق من الطبق باستخدام فرشاة الرسم (الشكل 2A-4). في كثير من الأحيان ، سيتم وضع الأجنة مباشرة فوق معجون الخميرة. في هذه الحالة ، من المقبول تنظيف معجون الخميرة في محلول التبييض لجمع كل الأجنة.
  6. احتضان الأجنة العائمة في مبيض بنسبة 50٪ لمدة 2 دقيقة وقم بتدوير طبق عصير الفاكهة كل 30 ثانية لتحسين كفاءة إزالة قشر البيض.
  7. انقل مزيج الجنين / المبيض عن طريق سكبه في مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرومتر (الشكل 2A-7). اغسل الأجنة جيدا باستخدام زجاجة ماء لإزالة أي مبيض متبقي ومعجون خميرة. جفف مصفاة الخلية تماما باستخدام مناشف ورقية ، مع ضمان إزالة أي ماء زائد حول الأجنة.

3. محاذاة الجنين والجفاف

  1. تحضير هلام أغاروز 5 سم × 5 سم × 0.5 سم (العرض والطول والارتفاع) 4٪ (الشكل 2A-9) واترك الجل يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. قم بقطع كتلة أغاروز 1 سم × 3 سم × 0.5 سم (العرض والطول والارتفاع) باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وضع الكتلة على شريحة زجاجية (الشكل 2A-2). افحص كتلة الهلام تحت نطاق التشريح للتأكد من قطع الحواف بشكل مستقيم ، وأن السطح مسطح وجاف.
  2. نقل الأجنة من المصفاة إلى كتلة هلام باستخدام فرشاة الرسم. انشر الأجنة بالتساوي على طول خط الوسط للكتلة عن طريق تنظيف الأسنان بالفرشاة برفق. من الناحية المثالية ، يتم فصل مجموعات الأجنة إلى مجموعات مفردة أو مزدوجة دون لمس بعضها البعض.
  3. قم بإعداد ملقط بساقين مثبتتين بإحكام معا لإنشاء طرف رفيع واحد (الشكل 2A-5). تحت نطاق تشريح ، التقط الأجنة الفردية باستخدام الملقط وضعها على طول الحافة الطويلة لكتلة الهلام. قم بمحاذاة 20-30 جنينا ، مع التأكد من أن محورها الأمامي الخلفي مواز للحافة (الشكل 2C).
  4. ماصة 10 ميكرولتر غراء هيبتان (انظر جدول المواد) في وسط غطاء 24 مم × 50 مم (الشكل 2A-1) وانشر الغراء في منطقة مستطيلة 0.5 سم × 3 سم باستخدام طرف ماصة. انتظر حتى يجف الغراء تماما قبل الاستخدام.
  5. ضع الشريحة الزجاجية مع كتلة الهلام على حافة المكتب ، مع توجيه الأجنة للخارج. ارفع الغطاء بالغراء باستخدام ملقط مسطح الطرف (الشكل 2A-6) وثبته فوق الأجنة ، مع توجيه جانب الغراء نحو الأجنة بزاوية مائلة تبلغ حوالي 45 درجة.
    ملاحظة: اضغط برفق على غطاء الغطاء على كتلة الهلام حتى تكون الأجنة على اتصال بالغراء ، ثم حرر الضغط بسرعة وارفع غطاء الغطاء. يعد مقدار التوتر المطبق أمرا بالغ الأهمية بحيث يمكن ربط الأجنة بثبات بالغراء دون الضغط عليها بشدة وانفجارها.
  6. ماصة 10 ميكرولتر ماء في وسط شريحة زجاجية جديدة ووضع غطاء الغطاء مع الأجنة فوقه ، مع توجيه جانب الجنين لأعلى (الشكل 2 ب). تأكد من استخدام الماء بدلا من طلاء الأظافر أو أي غراء لاصق آخر لربط غطاء الغطاء بالشريحة الزجاجية ، حيث سيتم وضع هذا الجانب من غطاء الغطاء مباشرة أعلى العدسة متحدة البؤر للتصوير الحي.
  7. جفف الأجنة في غرفة التجفيف (الشكل 2A-3) (انظر جدول المواد) لمدة 10-15 دقيقة حتى يتجعد غشاء vitelline (الشكل 2E). قد يختلف الوقت المطلوب باختلاف رطوبة الغرفة ويجب اختباره تجريبيا لكل حالة معملية.
  8. ماصة 40 ميكرولتر من زيت الهالو كربون (مزيج من النوع 27 والنوع 700 بنسبة 1: 1 في الحجم ، انظر جدول المواد) في أحد طرفي شريط الجنين. قم بإمالة الشريحة حتى يغطي زيت الهالو كربون سطح الأجنة بالكامل.

4. حقن الأجسام المضادة والتصوير

  1. قم بإعداد عدد قليل من إبر زجاج الحقن باستخدام مجتذب ماصة دقيقة (انظر جدول المواد لإعدادات المعلمات) وقم بتحميل كل إبرة ب 5 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المسمى AlexaFluor (من الخطوة 1.6).
  2. ضع غطاء مقاس 25 مم × 25 مم فوق شريحة زجاجية. ماصة 40 ميكرولتر من زيت الهالو ونشرها على طول حافة الغطاء.
  3. تحت نطاق الحقن ، قم بمحاذاة طرف الإبرة على حافة غطاء الغطاء أسفل الزيت. اضبط ضغط هواء الحقن للمضخة البيكوبية (انظر جدول المواد) بحيث تولد مضخة واحدة فقاعة واحدة مملوءة بالأجسام المضادة. يجب أن يقتصر قطر الفقاعة على 20-50 ميكرومتر (الشكل 2F).
  4. استبدل الشريحة الزجاجية الفارغة بأخرى تحتوي على أجنة تحت الزيت. قم بمحاذاة طرف إبرة الحقن بشكل عمودي على المحور الأمامي الخلفي للأجنة (الشكل 2D ، G).
  5. تحقق من مرحلة الأجنة للتأكد من أن معظمها قد بدأ في عملية النسيج الخلوي ولكنه لم يبدأ بعد في المعدة(المرحلة 4 والمرحلة 5) ، ويبقى كخلية اصطناعية (الشكل 2F ، G).
    ملاحظة: السمة المميزة لهذه المرحلة هي عدم وجود أي أخاديد أو طيات ووجود كيس صفار بيضاوي الشكل داكن اللون مرئي في مركز الجنين. يعتمد التوصيف المورفولوجي لمرحلة الجنين تحت الزيت على فصل كتاب "مراحل التطور الجنيني لذبابة الفاكهة" بقلم فولكر هارتنشتاين17.
  6. استخدم مناور المرحلة X-Y لتحريك الأجنة نحو الإبرة حتى يصل الطرف إلى مركز صفار البيض. ضخ مرتين إلى ثلاث مرات لحقن الأجسام المضادة في صفار البيض. يشار إلى الحقن الناجح من خلال الاختفاء السريع لتجاعيد غشاء vitelline حيث تكتسب الأجنة حجما من محلول الأجسام المضادة (الشكل 2G).
  7. استخدم مناور المرحلة X-Y لنقل الأجنة بعيدا عن الإبرة بعد الحقن والانتقال لأسفل إلى الجنين التالي. كرر الخطوة 6 حتى يتم حقن جميع الأجنة الموجودة على الشريحة.
  8. انقل الشريحة الزجاجية ذات الأجنة المحقونة إلى غرفة الرطوبة (الشكل 2A-8). احتضان في 25 درجة مئوية حتى يتم تحقيق المرحلة المطلوبة من تطور الجنين.
  9. ارفع الغطاء مقاس 24 مم × 50 مم عن الشريحة الزجاجية وضعه مباشرة في حامل الشريحة في المجهر. الجانب بدون أجنة سيواجه الأهداف. حدد موقع الأجنة باستخدام عدسة منخفضة التكبير تحت إضاءة المجال الساطع وانتقل إلى عدسة 40x أو 63x للتصوير الحي بالفلورسنت عالي الدقة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات مزايا طريقة حقن الأجسام المضادة على التصوير الحي القائم على علامة الفلورسنت أو التألق المناعي ، تم توفير دراستي حالة تميزان التوطين الديناميكي لمستقبل الغشاء منخفض الوفرة ، Notch ، ونوع من التعديل بعد الترجمة يسمى فسفرة التيروزين في الأجنة الحية.

يلعب نشاط إشارات الشق دورا رئيسيا في تحديد مصير الخلية أثناء التطور الجنيني وتوازن الأعضاء البالغة18,19. عند التنشيط بواسطة روابطها Delta / Jagged20 ، يتم شق المجال داخل الخلايا لمستقبلات الغشاء Notch وإطلاقه في النواة21 ، مما يؤدي إلى بدء برامج النسخ النهائية لدفع تغييرات مصير الخلية22. تم تمييز التوطين الثابت لمستقبلات الشق بشكل جيد من خلال التألق المناعي في الأنسجة الثابتة بالفورمالديهايد. ومع ذلك ، فإن التوطين الديناميكي للشق أثناء ربط الرباط أو عملية الانقسام داخل الخلايا لا يزال غير معروف إلى حد كبير23 ، بسبب عدم وجود طريقة للتصوير الحي لهذا البروتين منخفض الوفرة نسبيا بطريقة عالية السرعة. هنا ، قمنا بحقن الجسم النانوي GFP المترافق AlexaFluor في الأجنة التي تعبر عن الشق الموسوم ب GFP من الموضعالداخلي 20. بدون الحقن ، بالكاد يمكن اكتشاف Notch-GFP في ظل ظروف التصوير المباشر القياسية ، وتبيض إشارة الفلورسنت بسرعة أثناء التصوير بفاصل زمني. بعد الحقن ، تتحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء لمستقبل الشق بشكل كبير ، مقارنة بجودة إشارة التألق المناعي (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، يسمح حقن الأجسام المضادة بالتوصيف الزمني لتوطين الشق على فترات 45 ثانية ، دون فقدان واضح لشدة الإشارة خلال نافذة تصوير مدتها 5 دقائق (الشكل 3 ب).

فسفرة التيروزين هي نوع رئيسي من تعديل البروتين بعد الترجمة الذي يتوسط نقل الإشارة في العديد من المسارات البيولوجية24. تم تطوير أجسام مضادة وحيدة النسيلة عالية التحديد (مثل PY20 و 4G10) ضد الفوسفوتيروزين (p-Tyr) لتوصيف توطين ومستويات فسفرة التيروزين الكلية باستخدام التألق المناعي والبقع الغربية25. في حين لا يمكن لأي علامات فلورية تتبع تغيرات الفسفرة ، يجب تثبيت الأنسجة أو الخلايا وتلوينها أو تحللها ومسحها في نقاط زمنية مختلفة لتوفير لقطات لحالة الفسفرة بمرور الوقت ، لدراسة حركية فسفرة التيروزين عند تنشيط الإشارة26 (على سبيل المثال ، معالجة عامل النمو). الفاصل الزمني لهذا النهج هو على الأقل بضع دقائق طويلة وغير دقيق بطبيعته بسبب الوقت المتغير المطلوب لإجراءات مثل التثبيت أو تحلل الخلية.

هنا ، يتم تقديم أدلة على أن طريقة حقن الأجسام المضادة تمكن من التصور المباشر لحالة الفسفرة في الأجنة الحية ، وتتبع توطين وتغيرات شدة فسفرة التيروزين على فترات زمنية منتظمة على مستوى الثواني. تم حقن الجسم المضاد PY20 المترافق AlexaFluor في الأجنة التي تعبر عن سلسلة ضوء الميوسين الموسومة ب GFP وأجرى تصويرا حيا ثنائي اللون على فترات 45 ثانية. كما هو موضح سابقا ، يتم إثراء فسفرة التيروزين بدرجة عالية عند التقاطعات ثلاثية الخلايا27 ، وهو نمط يتم تلخيصه أيضا عن طريق التألق المناعي (الشكل 4 أ). ومن المثير للاهتمام أن التصوير الحي كشف أيضا عن مجموعة ثانية جديدة من إشارة p-Tyr تحت مركز الغشاء القمي ، والتي لم يتم ملاحظتها باستخدام التألق المناعي (الشكل 4B). من خلال التصوير ثنائي اللون ، وجد أن هذه المجموعة من إشارة p-Tyr قريبة من الميوسين الإنسي (الشكل 4B ، عن قرب) ، وهي مجموعة فرعية من الميوسين28 يتم نطقها بالمثل فقط في ظروف التصوير الحية ولكن بالكاد يمكن اكتشافها باستخدام التألق المناعي. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر السكان الإنسيون ل p-Tyr أنماط اندماج وتبديد نابضة مماثلة (الشكل 4C) ، كما هو موضح سابقا للميوسينالإنسي 28. لا تزال هوية ووظيفة مجموعة فرعية وسطية من p-Tyr غير معروفة. معا ، تظهر هذه النتائج أن طريقة حقن الأجسام المضادة يمكن أن تكمل إلى حد كبير الأساليب التقليدية لتوصيف سلوكيات البروتينات منخفضة الوفرة والكشف عن أنماط توطين جديدة ربما تكون قد تعطلت أثناء عملية التألق المناعي.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل حقن الأجسام المضادة. سير عمل تخطيطي يوضح الخطوات المتبعة في طريقة حقن الأجسام المضادة. تستغرق العملية بأكملها ، من جمع الأجنة إلى حقن الأجسام المضادة ، عادة حوالي 4-5 ساعات حتى تكتمل. بعد حقن الأجسام المضادة ، يمكن تحضين الأجنة في غرفة الرطوبة إلى المرحلة المطلوبة من التطور قبل التصوير الحي. AEL ، بعد وضع البيض ؛ RT ، درجة حرارة الغرفة ؛ Ab ، الأجسام المضادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: محاذاة الجنين والحقن. (أ) نظرة عامة على العناصر المطلوبة قبل الحقن ، بما في ذلك غطاء الغطاء ، والشريحة الزجاجية ، وصندوق التجفيف ، وفرشاة الرسم ، والملاقط ، ومصفاة الخلايا ، وغرفة الرطوبة ، وهلام الأغاروز. (ب) أجنة محاذاة متصلة بغراء هيبتان في وسط غطاء الغطاء وموضوعة فوق حبات التجفيف. ج: محاذاة المحور الأمامي الخلفي للأجنة على التوازي مع حافة هلام الأغاروز. (د) نظرة عامة على إعداد الحقن. (ه) مقارنة مورفولوجيا الجنين قبل وبعد عملية الجفاف ، مع التركيز على تجعد غشاء فيتيلين بعد الجفاف. (F) حجم فقاعة الحقن بعد ضغطة واحدة على picopump. (ز) مقارنة مورفولوجيا الجنين قبل وبعد حقن الأجسام المضادة ، مع تسليط الضوء على اختفاء تجاعيد الغشاء بعد الحقن. (E-G) تحت عدسة هدف تكبير 10x باستخدام المجهر الساطع المجال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التصوير الحي لمستقبلات الشق في الأجنة المبكرة. (أ) توطين مستقبلات الشق الموسومة داخليا ب GFP من خلال التألق المناعي (يسار) ، والتصوير المباشر المباشر على أساس التألق الذاتي GFP (الأوسط) ، وحقن الجسم النانوي GFP المترافق AlexaFluor 594 (يمين). (ب) التوطين الديناميكي ل Notch-GFP المصور على فترات 45 ثانية بعد حقن الأجسام المضادة. تم التقاط جميع الصور مع الجزء الأمامي من الأجنة إلى اليسار والجانب البطني متجها لأسفل. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التصوير الحي لأنماط الفوسفوتيروزين الجنينية. أ: توطين التيروزين المفسفر (p-Tyr) في الأجنة الثابتة من خلال التألق المناعي. (ب) توطين p-Tyr (أرجواني) في الأجنة الحية التي تعبر عن سلسلة ضوء الميوسين الموسومة ب GFP (أخضر). يشير المربع الأبيض المتقطع إلى مناظر مقربة لتجمعات الفوسفوتيروزين والميوسين الإنسية تحت الغشاء القمي. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. (ج) توطين p-Tyr و GFP-myosin المصور كل 45 ثانية في الأجنة الحية. تشير الأسهم البيضاء إلى السكان الإنسيين ل p-Tyr والميوسين. تم التقاط جميع الصور مع الجزء الأمامي من الأجنة إلى اليسار والجانب البطني متجها لأسفل. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا الإجراء المقدم الطريقة المتخصصة لوضع العلامات الفلورية بالأجسام المضادة المخصصة والحقن اللاحق في أجنة ذبابة الفاكهة في المراحل المبكرة. تسهل هذه التقنية التصور في الوقت الفعلي للبروتينات أو التعديلات اللاحقة للترجمة الموجودة بكميات منخفضة والتي يصعب ملاحظتها عادة من خلال طرق وضع العلامات التقليدية GFP / mChere.

يجب توخي الحذر عند توسيع هذه الطريقة لإجراء مقارنات كمية بين الأجنة البرية والأجنة الطافرة. في حين أن تركيز الأجسام المضادة الأولية والثانوية يمكن أن يظل كما هو بين المجموعات الضابطة والتجريبية في التألق المناعي ، فإن كمية الأجسام المضادة المحقونة وكفاءة وضع العلامات يمكن أن تختلف بين الأجنة. لذلك ، يجب أن يقتصر التحليل الكمي على تتبع تغيرات شدة الفلورسنت بمرور الوقت أو إجراء تحليل الارتباط مع إشارات القنوات الأخرى في نفس الجنين عند إجراء تصوير حي متعدد الألوان. على سبيل المثال ، يمكن إجراء تحليل التمركز المشترك والارتباط باستخدام شدة p-Tyr والميوسين27 ، في حين لا يمكن مقارنة شدة p-Tyr مباشرة بين أجنة الضربة القاضية من النوع البري والجين X باستخدام طريقة حقن الأجسام المضادة.

على غرار الأساليب الأخرى القائمة على علامة الفلورسنت لفحص ديناميكيات البروتين ، يمكن أن يؤدي ارتباط الأجسام المضادة إلى تغيير نشاط البروتينات المستهدفة أو الاتجار بها أو توطينها. لذلك ، تفضل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الأجسام النانوية على الأجسام المضادة متعددة النسيلة للحقن. نظرا لأن حواتم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو الأجسام النانوية محددة جيدا ، فإن ما إذا كان منع هذه الحواتم بالأجسام المضادة يغير نشاط البروتين يمكن نمذجته بناء على هياكل أضعاف ألفا12,25. من ناحية أخرى ، لم يتم تحديد حوامل الأجسام المضادة متعددة النسيلة بدقة ، ويمكن أن يؤدي ارتباطها إلى تغيير توطين البروتين أو نشاطه إذا تم حظر الجيوب التحفيزية أو ببتيدات الإشارة للبروتينات المستهدفة. ثانيا ، يمكن للأجسام المضادة التعرف على الحواتم غير المحددة بخلاف البروتينات المستهدفة ، خاصة بالنظر إلى أنه لا توجد خطوات "غسل" هنا ، كما هو الحال في التألق المناعي ، لإزالة الروابط غير المحددة ذات التقارب المنخفض. لذلك ، من المهم أن يكون لديك مجموعات تحكم ، مثل حقن الأجسام المضادة في الخلايا التي تفتقر إلى الحاتم ، للتحقق مما إذا كانت الإشارة التي لوحظت تعكس حقا البروتينات المستهدفة أو غيرها من الحواتم غير المحددة.

لا يختلف حقن الأجسام المضادة عن حقن siRNA أو CRISPR gRNAs من حيث الإعداد التجريبي. لذلك ، يجب أن تكون معظم الأنظمة الخلوية القابلة للحقن متوافقة مع طريقة حقن الأجسام المضادة. في أجنة ذبابة الفاكهة ، تكون الأجسام المضادة المترافقة بفلور Alexa مستقرة أثناء التطور ، وتظل إشارات الفلورسنت قابلة للاكتشاف بعد ساعات من التطور الجنيني. بالنسبة للأنظمة الأخرى مثل أجنة Xenopus أو Zebrafish ، يجب اختبار تركيز وحجم حقن الأجسام المضادة تجريبيا من خلال التخفيفات التسلسلية لتحقيق كفاءة وضع العلامات المثالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر الأصباغ الفلورية البديلة مثل ATTO10 نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل وقابلية ذوبان في الماء.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر الدكتورة جينيفر أ. زالن على توفير خط ذبابة الفاكهة Sqh-GFP ودعم التطوير الأولي لهذه التقنية ، والدكتور فرانسوا شويسغوث لتوفير خط ذبابة الفاكهة Notch-GFP. تم دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32270809) إلى H.H.Yu ، ودعم مالي سخي وموظفين من كلية علوم الحياة ، SUSTech ، وتمويل ل Y. Yan من لجنة Shenzhen للعلوم والابتكار التكنولوجي / JCYJ20200109140201722.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSangon Biotech  A620014 
Alexa Fluor 594 طقم وضع العلامات على الأجسام المضادةInvitrogen A20185من الخطوة 1.6 في هذه المجموعة
عدسة العدسة العينية المجهر البيولوجيSOPTOPEX20: PL 10X / 20. العدسة الموضوعية: 10x / 0.25
BleachClorox & reg ؛
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكاتالعالمية للأدواتالدقيقة TW100F-4
أجهزة الطرد المركزيEppendorf5245
مصفاة الخليةFALCON352350
غرفة التجفيف  قفل & LOCKHSM8200320 مل
مجهر تشريحعدسة MshotMZ62العدسة: WF10X / 22mm.
شريط على الوجهينسكوتش665
غرامة سوبر ملاقطVETUSST-14
فيشربراند & التجارة ؛ نظارات الغطاء: مستطيلاتFisherbrand12-545F
Fisherbrand & trade ؛ سوبر فروست & تجارة; Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
PlumpVETUS33A-SA
زيت الهالوكربون 27Sigma-AldrichH8773-100ML
زيت الهالوكربون 700Sigma-AldrichH8898-100ML
HeptaneSigma-AldrichH2198-1Lالغراء الهبتان مصنوع من شريط على الوجهين مغمور في السباع
كاشف الجفاف TOKAI1-7315-01ملء إلى 90٪ من حجم غرفة التجفيف
مناور دقيق يدويأدوات الدقة العالميةM3301R
مجتذب الماصاتالدقيقة العالميةPUL-1000الإجراء: < / قوي> الخطوة 1 ، الحرارة: 290 ، القوة: 300 ، المسافة: 1.00 ، التأخير: 50.
الخطوة 2 ، الحرارة: 290 ، القوة: 300 ، المسافة: 2.21 ، التأخير: 50 & nbsp ؛
الدقة العالمية للمضخة الهوائيةالكهروضوئية 830الإخراج: 20 رطل لكل بوصة مربعة ؛   المدى: 100 مللي ثانية. المدة:
PY20سانتا كروزSC-508
أطباق بتري مربعةBiosharpBS-100-SD
GFP nanobodyChromotekgt
يتم تضمين عمود التنقية أدوات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
  2. Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
  3. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
  4. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
  5. Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
  6. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
  7. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  8. Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
  9. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  10. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
  11. Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
  12. Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
  13. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  14. Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
  15. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477(2011).
  16. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503(2011).
  17. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
  18. Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
  19. Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
  20. Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
  21. Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
  22. Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148(2019).
  23. Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
  24. Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
  25. Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
  26. Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
  27. Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528(2020).
  28. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent Antibody InjectionLive Protein ImagingDrosophila EmbryosLow Abundance ProteinsPost Translational ModificationsTyrosine PhosphorylationGFP NanobodyNotch Receptor LocalizationEmbryo MicroinjectionFluorescent Live Imaging

Related Articles