نقدم هنا طريقة بسيطة للمراقبة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana. تستفيد هذه الطريقة من جهاز تصوير الفم المحمول ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور المصمم لصور الأوراق التي يلتقطها الجهاز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الملاحظة المباشرة والقياس الآلي لاستجابات الثغور لحقنة الزائفة الكهروضوئية. طماطم DC3000 في أرابيدوبسيس تاليانا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الثغور هي مسام مجهرية توجد في بشرة أوراق النبات. يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا محوريا ليس فقط لموازنة امتصاص ثاني أكسيد الكربون لعملية التمثيل الضوئي وفقدان الماء الناتج عن النتح ولكن أيضا للحد من الغزو البكتيري. بينما تغلق النباتات الثغور عند التعرف على الميكروبات ، فإن البكتيريا المسببة للأمراض ، مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) ، أعد فتح الثغور المغلقة للوصول إلى داخل الورقة. في المقايسات التقليدية لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري ، يتم تعويم قشور البشرة الورقية أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على تعليق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي في ورقة متصلة بالنبات. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة دون فصلها عن النبات ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق المصمم لقياس فتحة الثغور تلقائيا من صور الأوراق التي يلتقطها الجهاز. هنا ، بناء على هذه التطورات التقنية ، يتم تقديم طريقة جديدة لتقييم استجابات الثغور للغزو البكتيري في Arabidopsis thaliana . تتكون هذه الطريقة من ثلاث خطوات بسيطة: التلقيح بالرش ل Pto الذي يحاكي عمليات العدوى الطبيعية ، والمراقبة المباشرة للثغور على ورقة النبات الملقح ب Pto باستخدام جهاز التصوير المحمول ، والقياس الآلي لفتحة الثغور بواسطة خط أنابيب تحليل الصور. تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لإثبات إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل ظروف تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النبات والبكتيريا.
المقدمة
الثغور مسام مجهرية محاطة بزوج من الخلايا الحارسة على سطح الأوراق والأجزاء الهوائية الأخرى من النباتات. في ظل البيئات المتغيرة باستمرار ، يعد تنظيم فتحة الثغور أمرا أساسيا للنباتات للتحكم في امتصاص ثاني أكسيد الكربون المطلوب لعملية التمثيل الضوئي على حساب فقدان الماء عن طريق النتح. وبالتالي ، كان القياس الكمي لفتحة الثغور مفيدا لفهم التكيف البيئي للنبات. ومع ذلك ، فإن تحديد فتحة الثغور بطبيعته يستغرق وقتا طويلا ومرهقا لأنه يتطلب عملا بشريا لتحديد وقياس مسام الثغور في صورة ورقة تم التقاطها بواسطة المجهر. للتحايل على هذه القيود ، تم تطوير طرق مختلفة لتسهيل القياس الكمي لفتحة الثغور في Arabidopsis thaliana ، وهو نبات نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الثغور1،2،3،4،5،6. على سبيل المثال، يمكن استخدام البورومتر لقياس معدل النتح باعتباره مقياسا للتوصيل الثغري. ومع ذلك ، لا توفر هذه الطريقة معلومات مباشرة عن عدد الثغور والفتحة التي تحدد التوصيل الثغري. استخدمت بعض الدراسات تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي تسلط الضوء على مسام الثغور باستخدام علامة الأكتين الفلورية أو صبغة الفلورسنت أو التألق الذاتيلجدار الخلية 1،2،3،4،5. في حين أن هذه الأساليب تسهل الكشف عن الثغور ، فإن تكلفة كل من تشغيل مرفق الفحص المجهري متحد البؤر وإعداد عينات الفحص المجهري يمكن أن تكون عقبة أمام التطبيق الروتيني. في عمل رائد قام به Sai et al. ، تم تطوير نموذج شبكة عصبية عميقة لقياس فتحة الثغور تلقائيا من الصور المجهرية ذات المجال الساطع لتقشير البشرة A. thaliana 6. ومع ذلك ، فإن هذا الابتكار لا يعفي الباحثين من مهمة إعداد قشر البشرة للمراقبة المجهرية. في الآونة الأخيرة ، تم التغلب على هذه العقبة من خلال تطوير جهاز تصوير محمول يمكنه مراقبة الثغور عن طريق قرص ورقة من A. thaliana ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور القائم على التعلم العميق الذي يقيس تلقائيا فتحة الثغور من صور الأوراق التي تم التقاطها بواسطة الجهاز7.
تساهم الثغور في المناعة الفطرية للنبات ضد مسببات الأمراض البكتيرية. مفتاح هذه الاستجابة المناعية هو إغلاق الثغور الذي يقيد دخول البكتيريا من خلال المسام المجهرية إلى داخل الورقة ، حيث تتكاثر مسببات الأمراض البكتيرية وتسبب الأمراض8. يحدث إغلاق الثغور عند التعرف على الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات (MAMPs) ، وهي جزيئات مناعية غالبا ما تكون شائعة في فئة من الميكروبات ، بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط الموضعية بغشاء البلازما (PRRs) 9. حاتمة 22 من الأحماض الأمينية من السوط البكتيري المعروف باسم flg22 هو MAMP نموذجي يحفز إغلاق الثغور من خلال التعرف عليه من قبل PRR FLS210. كإجراء مضاد ، مسببات الأمراض البكتيرية مثل Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 (Pto) و Xanthomonas campestris الكهروضوئية. طورت الحويصلة آليات الفوعة لإعادة فتح الثغور9،11،12. تم تحليل استجابات الثغور هذه لمسببات الأمراض البكتيرية بشكل تقليدي في المقايسات التي يتم فيها تعويم قشور البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة على معلق بكتيري ، ثم يتم ملاحظة الثغور تحت المجهر متبوعا بالقياس اليدوي لفتحة الثغور. ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات مرهقة وقد لا تعكس استجابات الثغور للغزو البكتيري الطبيعي الذي يحدث في ورقة متصلة بالنبات.
هنا ، يتم تقديم طريقة بسيطة للتحقيق في إغلاق الثغور وإعادة فتحها أثناء غزو Pto في ظل حالة تحاكي عن كثب التفاعل الطبيعي بين النباتات والبكتيريا. تستفيد هذه الطريقة من جهاز التصوير المحمول للمراقبة المباشرة لثغور A. thaliana على ورقة متصلة بالنبات الملقح ب Pto ، جنبا إلى جنب مع خط أنابيب تحليل الصور للقياس الآلي لفتحة الثغور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. زراعة النباتات
- لكسر السكون ، أعد تعليق بذور A. thaliana (Col-0) في ماء منزوع الأيونات واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أيام في الظلام.
- زرع البذور على التربة وتنمو في غرفة مجهزة بضوء الفلورسنت الأبيض. حافظ على ظروف النمو التالية: درجة حرارة 22 درجة مئوية ، وشدة ضوء 6000 لوكس (حوالي 100 ميكرومول / م2 / ثانية) لمدة 10 ساعات ، ورطوبة نسبية 60٪.
- عند الحاجة ، سقي النباتات بأسمدة سائلة. الامتناع عن الري من 1 أسبوع إلى 2 أيام قبل التلقيح وبئر الماء 1 يوم قبل التلقيح.
2. تحضير اللقاح البكتيري
- قم بخط Pto من مخزون الجلسرين على وسط King's B (KB) الصلب (20 جم من التربتون ، 1.5 جم من K2HPO4 ، و 15 جم من الجلسرين ل 1 لتر ، 1.5٪ أجار) مع 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
- تلقيح مستعمرة واحدة إلى 5 مل من الوسط السائل KB مع 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين واحتضانها عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتأخر.
- أجهزة الطرد المركزي الثقافة في 6000 × غرام لمدة 2 دقيقة ، وتجاهل المادة الطافية ، وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الماء المعقم. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت لفتح الثغور (25 mM MES-KOH pH 6.15 ، 10 mM KCl) ، وقم بقياس OD600.
- تمييع التعليق إلى OD600 0.2 مع العازلة لفتح الثغور التي تحتوي على 0.04٪ سيليكون الفاعل بالسطح.
3. رذاذ التلقيح من البكتيريا
- من يوم واحد قبل التلقيح حتى نهاية التجربة ، قم بتعريض النباتات لشدة ضوء تبلغ حوالي 10000 لوكس (حوالي 170 ميكرومول / م2 / ثانية).
- للتأكد من أن معظم الثغور مفتوحة ، احتفظ بالنباتات على صينية مغطاة بغطاء شفاف تحت الضوء لمدة 3 ساعات على الأقل قبل التلقيح بالرش.
- قم بإزالة الغطاء واستخدم البخاخة لرش الجانب المحوري من الأوراق ب 2.5 مل من المعلق البكتيري لكل ثلاثة نباتات في وعاء واحد.
- احتضان النباتات الملقحة على صينية مغطاة بغطاء شفاف للحفاظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 85٪.
- الحصول على صور للثغور عند 1 ساعة و 3 ساعات بعد التلقيح بالرش باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 4.
4. المراقبة المباشرة للثغور باستخدام جهاز التصوير المحمول
ملاحظة: تم تجهيز جهاز تصوير الثغور المحمول بضوء LED ووحدة كاميرا ويمكنه الحصول على 2,592 × 1,944 صورة (ارتفاع × عرض ؛ بكسل) بدقة حوالي 0.5 ميكرومتر / بكسل.
- قم بتوصيل جهاز تصوير الثغور المحمول بجهاز كمبيوتر شخصي (PC) مزود ببرنامج الحصول على الصور.
- قم بإزالة قطرات الماء برفق ولكن بالكامل من الأوراق الملقحة بقطعة من الورق.
- افتح الغطاء العلوي للجهاز ، ضع الورقة على المسرح ، وأغلق الغطاء العلوي (الشكل 1).
- اضبط تركيز الصورة عن طريق معالجة برغي الضبط ، ثم انقر فوق الزر حفظ الصورة على شاشة الكمبيوتر. سيتم الحصول على الصورة على الفور. عادة ما تحتوي الصورة المركزة على 10 ثغور قابلة للتحليل تقريبا. للحصول على نتائج قوية ، احصل على صور ثغور من ست أوراق من ثلاثة نباتات مختلفة (ورقتان لكل نبات).
5. القياس اليدوي لفتحة الثغور
ملاحظة: يمكن تنزيل برنامج ImageJ على https://imagej.nih.gov/ij/download.html
- افتح ملف صورة في ImageJ.
- افتح مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار.
- استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لرسم خط يتوافق مع عرض الفغرة (الشكل 2) وتسجيل عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار.
- ارسم خطا يتوافق مع طول نفس الفغرة (الشكل 2 أ) وسجل عائد الاستثمار كما هو موضح في الخطوة 5.3.
- انقر على قياس في مدير عائد الاستثمار لقياس العرض والطول.
- اقسم العرض على الطول للحصول على فتحة الثغور (النسبة). للحصول على تقدير كمي قوي، استخدم 60 ثغورا أو أكثر لكل علاج ونقطة زمنية. لا تختار الثغور المبكرة أو الغامضة للتحليل (الشكل 2 ب ، ج).
6. القياس الآلي لفتحة الثغور
ملاحظة: يتم تشغيل خط أنابيب تحليل الصور في Google Colaboratory، وهي بيئة قابلة للتنفيذ بلغة برمجة Python سحابية. يجب أن يكون لدى المستخدمين حساب Google صالح مع Google Drive يعمل ومتصفح Google Chrome واتصال إنترنت ثابت كشرط أساسي.
- قم بتنزيل دفتر ملاحظات Google Colaboratory من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ، وافتح دفتر الملاحظات.
- أنشئ نسخة محلية من دفتر الملاحظات إلى Google Drive عن طريق اختيار ملف > حفظ نسخة في Drive. بعد ظهور علامة تبويب جديدة، أغلق علامة تبويب دفتر الملاحظات الأصلي بأمان.
- اضغط على الزر تنفيذ مرة واحدة أسفل قسم الإعداد البيئي في دفتر الملاحظات دون فتح كتل الخلايا لاستيراد المكتبات المطلوبة.
- نفذ قسم إعدادات الدليل لإنشاء ثلاثة مجلدات تستخدم للتحليل (على سبيل المثال ، example_result و inference_results و model) في Google Drive.
ملاحظة: في هذه الحالة، يتم استخدام المجلدات المسماة example_result و inference_results و Model كدليل أصلي، وتخزين نتائج الاستدلال والنماذج المدربة، على التوالي. يعرض دفتر الملاحظات هذا مثالا على إنشاء الدليل كإجراء تمثيلي. لتغيير الاسم، أعد كتابة مسار pardir أو infdir أو modeldir . - وفقا لقسم إعداد الصور ، انقل الصور التي تم الحصول عليها إلى example_result ، مجمعة في عناوين الصور حسب المعالجة أو العينة (على سبيل المثال ، mock_1h_XXXXXX.jpg) لإنشاء الرسم البياني النهائي. تتوفر عينات من الصور من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528).
- قم بإجراء جزء تنزيل النماذج المدربة لتنزيل ملفات ONNX للنماذج المدربة من Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8062528) ووضعها ضمن دليل النموذج .
- قم بتشغيل جزء الاستدلال وقياس فتحة الثغور لتحديد فتحة الثغور من الصور الفردية. سيتم تصدير الصور الناتجة ذات الاستدلال المتراكب وملف csv المسمى example_result.csv إلى دليل inference_results.
- قم بتنفيذ قسم إنشاء الرسم البياني لإنشاء رسم بياني حول نسبة فتحة الثغور ، وتصديرها إلى دليل inference_results .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد التلقيح بالرش ل Pto ، تمت ملاحظة الثغور على الأوراق المرتبطة بالنباتات الملقحة مباشرة بواسطة جهاز تصوير الثغور المحمول. باستخدام القياسات اليدوية والآلية ، تم استخدام نفس صور الأوراق لحساب فتحة الثغور عن طريق أخذ نسب العرض إلى الطول حوالي 60 ثغور. أشارت القياسات اليدوية والآلية باستمرار إلى انخفاض في فتحة الثغور في النباتات الملقحة ب Pto مقارنة بالنباتات الملقحة بالوهمية في 1 ساعة بعد التلقيح (hpi) (الشكل 3A ، B) ، مما يشير إلى أن نباتات الثاليانا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
استخدمت الدراسات السابقة تقشير البشرة أو أقراص الأوراق أو الأوراق المنفصلة للتحقيق في استجابات الثغور للغزوات البكتيرية9،11،12. في المقابل ، فإن الطريقة المقترحة في هذه الدراسة تستفيد من جهاز تصوير الثغور المحمول لمراقبة الثغور مباشرة على ورقة متصلة بالنبات بعد تلقيح رذاذ Pto ، مما يحاكي الظروف الطبيعية للغزو البكتيري. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذه الطريقة لا تتضمن عمليات تحضير العينات المدمرة مثل انفصال الأوراق واستئ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
شكر وتقدير
نشكر جميع أعضاء المشروع البحثي ، "الإنشاء المشترك للسمات التكيفية للنبات من خلال تجميع holobiont الميكروب النباتي" ، على المناقشات المثمرة. تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (21H05151 و 21H05149 إلى AM و 21H05152 إلى YT) و Grant-in-Aid لتحدي البحث الاستكشافي (22K19178 إلى A. M.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطقم البخاخة Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| البخاخة | ANEST IWATA | MX2900 | مجموعات الملحقات ل SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & الأدوات الكيميائية | LPH-411S | غرفة نمو النبات مع ضوء الفلورسنت الأبيض |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| نصف صينية | Sakata | 72000113 | مجموعة من الدرج والغطاء |
| Hyponex | Hyponex | لا يوجد رقم كتالوج متاح | تمييع محلول Hyponex بنسبة 1: 2000 في الماء منزوع الأيونات لمحطات الري |
| Image J | معهد Natinal of تنزيل الصحة | في https://imagej.nih.gov/ij/download.html | يستخدم للقياس اليدوي لفتحة الفم |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | ل MES-KOH |
| MES | WAKO | 343-01621 | ل MES-KOH |
| جهاز التصوير الفموي المحمول | ترتيب القياسات النباتية | في https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al. (2023) doi: 10.1093 / pcp / pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | يذوب في DMSO |
| Silwet-L77 | العلوم الطبية الحيوية | BMS-SL7755 | السيليكون الخافض للتوتر السطحي المستخدم في التلقيح بالرش |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | البخاخة المستخدمة في التلقيح بالرش |
| SuperMix A | Sakata 72000083 البذور | تخلط مع الفيرميكوليت G20 بنسب متساوية لتحضير التربة | |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | لا يوجد رقم كتالوج متاح | امزج مع Super Mix A بنسب متساوية لتحضير التربة |
| ضوء الفلورسنت الأبيض | NEC | FHF32EX-N-HX-S | المستخدم في Biotron |
المراجع
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291(2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576(2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185(2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
