قياس طول ذيل بولي أ من دماغ يرقة ذبابة الفاكهة وخط الخلية

ملخص

يصف البروتوكول طريقة فعالة وموثوقة لتحديد طول poly(A) للجين محل الاهتمام من الجهاز العصبي لذبابة الفاكهة ، والذي يمكن تكييفه بسهولة مع الأنسجة أو أنواع الخلايا من الأنواع الأخرى.

الملخص

Polyadenylation هو تعديل حاسم بعد النسخ يضيف ذيول poly (A) إلى الطرف 3 'من جزيئات mRNA. يتم تنظيم طول ذيل poly (A) بإحكام بواسطة العمليات الخلوية. ارتبط عدم تنظيم polyadenylation mRNA بالتعبير الجيني غير الطبيعي وأمراض مختلفة ، بما في ذلك السرطان والاضطرابات العصبية وتشوهات النمو. لذلك ، فإن فهم ديناميكيات polyadenylation أمر حيوي لكشف تعقيدات معالجة mRNA وتنظيم الجينات بعد النسخ.

يقدم هذا البحث طريقة لقياس أطوال ذيل poly (A) في عينات الحمض النووي الريبي المعزولة من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة وخلايا ذبابة الفاكهة شنايدر S2. استخدمنا نهج مخلفات جوانوزين / إينوزين (G / I) ، والذي يتضمن الإضافة الأنزيمية لبقايا G / I في نهاية 3 'من mRNA باستخدام بوليميراز الخميرة بولي (A). يحمي هذا التعديل نهاية الحمض النووي الريبي 3 'من التدهور الأنزيمي. ثم يتم نسخ ذيول poly (A) المحمية كاملة الطول بشكل عكسي باستخدام طبقة أولية عالمية مضادة للحساسية. بعد ذلك ، يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligo خاص بالجين يستهدف الجين محل الاهتمام ، جنبا إلى جنب مع oligo تسلسل عالمي يستخدم للنسخ العكسي.

هذا يولد منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تشمل ذيول بولي (أ) للجين محل الاهتمام. نظرا لأن polyadenylation ليس تعديلا موحدا وينتج عنه ذيول بأطوال متفاوتة ، فإن منتجات PCR تعرض مجموعة من الأحجام ، مما يؤدي إلى نمط تشويه على هلام الأغاروز. أخيرا ، تخضع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي للهلام الشعري عالي الدقة ، يليه القياس الكمي باستخدام أحجام منتجات poly (A) PCR ومنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالجينات. توفر هذه التقنية أداة مباشرة وموثوقة لتحليل أطوال ذيل poly (A) ، مما يمكننا من اكتساب رؤى أعمق حول الآليات المعقدة التي تحكم تنظيم mRNA.

المقدمة

معظم mRNAs حقيقية النواة هي polyadenylated بعد النسخ في نهايتها 3 ′ في النواة عن طريق إضافة الأدينوزينات غير المقولبة بواسطة بوليميراز بولي (A) الكنسي. يعد ذيل poly (A) السليم محوريا طوال دورة حياة mRNA ، لأنه ضروري لتصدير mRNA^{النووي 1} ، ويسهل التفاعل مع البروتينات المرتبطة ب poly (A) لتعزيز الكفاءة الانتقالية² ، ويضفي مقاومة ضد التدهور³. في بعض الحالات، يمكن أن يخضع ذيل بولي (أ) أيضا للتمدد في السيتوبلازم، الذي تسهله بوليميراز بولي (أ) غير المتعارف عليه⁴. في السيتوبلازم ، يتغير طول ذيل بولي (A) ديناميكيا ويؤثر على العمر الافتراضي لجزيء mRNA. تشتهر العديد من البلمرة و deade....

البروتوكول

1. تربية واختيار يرقات ذبابة الفاكهة

1. الحفاظ على / استزراع سلالة الذباب (w¹¹¹⁸ ، wildtype) على وسط طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.
2. حدد 10 تجول 3 يرقات^{داخلية بعد} 72 ساعة من وضع البيض.
3. ضع اليرقات في طبق بتري فارغ 35 مم واغسلها برفق عن طريق نقل اليرقات إلى الطبق الجديد الذي يحتوي على ماء الصنبور باستخدام ملقط. افعل هذا 2x لإزالة أي طعام متبقي.

2. عزل الدماغ من يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 1)

النتائج

هنا ، قمنا بتحليل طول ذيل poly (A) ل Dscam1 و GAPDH من أدمغة يرقات ذبابة الفاكهة (الشكل 4). تم تصور الحمض النووي الريبي المعزول على هلام الأغاروز لمراقبة الجودة. يشير نطاق الحمض النووي الريبي الواحد بحجم 600 نيوكليوتيد تقريبا إلى تحضير الحمض النووي الريبي السليم (الشكل 2 أ). تم إخضاع الحمض النووي الريبي لمخلفات G / I والرحلان الكهربائي الشعري عالي الدقة باستخدام محلل حيوي Agilent 2100. تم تصدير صور الجل باستخدام برنامج Agilent 2100 Exp.......

المناقشة

في هذا البروتوكول ، نصف تقنية تشريح دماغ يرقات ذبابة الفاكهة من تجول^{3 المرحلة الداخلية} بالإضافة إلى تحضير العينة من خلايا ذبابة الفاكهة S2. نظرا للطبيعة المرنة ل mRNAs ، يتطلب جمع العينات مزيدا من الحذر. بالنسبة لتشريح دماغ اليرقات ، يجب عدم تلف الأدمغة أثناء العزلة ويجب عدم الاحتفاظ بها في محلول لفترة طويلة. من الضروري الحفاظ على وقت التشريح إلى 8-10 دقائق لجولة من التشريح. قد يكون من المفيد أيضا استكمال محلول التشريح بمثبطات RNAase. أما بالنسبة لزراعة الخلايا S2 ونقلها ، فقم بتنفيذ جميع الخ.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS) منتج	البحث الدولي (RPI)	M92020
مجموعة الحمض النووي عالية الحساسية	Agilent Technologies	؛ 5067-4626
برنامج Agilent 2100 خبير تحميل مجاني تجريبي	Agilent Technologies		https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA سلم	Genesee Scientific	19-109
Bioanalyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)البحث	المنتج الدولي (RPI)	صبغة الحمض النووي D43060
(صبغة تحميل الجل ، أرجواني (6x)	مختبرات نيو إنجلاند الحيوية   ؛	B7024S
ذبابة الفاكهة < / em>S2 خط الخلية	ذبابة الفاكهة مركز موارد الجينوم مخزون # 181
ذبابة الفاكهة شنايدر s متوسطة	الحرارية فيشر علمية	21720024
Ehidium بروميد	Genesee علمي	20-276
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135
ملقط Dumont 5	أدوات العلوم الجميلة	11254-20
مياه خالية من النويذ	ثيرمو فيشر علمي	AM9932
PBS 10x	منتجات البحث الدولية (RPI)	P32200
بولي (A) طقم فحص طول الذيل	Thermo Fisher Scientific   ؛	764551KT
RiboRuler سلم الحمض النووي الريبي منخفض	المدى ثيرمو فيشر العلمي	SM1833
صبغة تحميل هلام الحمض النووي الريبي (2x) ثيرمو	فيشر العلمي   ؛	R0641
RNA microprep kit	Zymoresearch	R1050
طقم التحضير المصغر للحمض النووي الريبي	Zymoresearch	R1055
مقص - مقص زنبركي Vannas - 2.5 مم	أدوات العلوم الدقيقة المتطورة	15000-08
أقراص TopVision Agarose	Thermo Fisher Scientific	R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE)Thermo	Fisher Scientific	B49