Method Article

القياس الكمي للخصائص المرنة للأغشية الحيوية البيئية باستخدام التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري

DOI:

10.3791/66118

⸱

March 1st, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Theoretical and Applied Mechanics Program, Northwestern University, 2Civil and Environmental Engineering Department, Northwestern University, 3Mechanical Engineering Department, Northwestern University, 4Black & Veatch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسلط هذا البحث الضوء على فعالية تقنية التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) في توصيف خصائص مرونة الأغشية الحيوية الرقيقة بسرعة ودون تدمير. نوضح إجراءات تنفيذ OCE الهامة لإجراء قياسات دقيقة ونقدم قيم معامل Young لاثنين من الأغشية الحيوية الحبيبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأغشية الحيوية هي مواد حيوية معقدة تضم شبكة جيدة التنظيم من الخلايا الميكروبية المغلفة بمواد بوليمرية خارج الخلية منتجة ذاتيا (EPS). تقدم هذه الورقة وصفا مفصلا لتنفيذ قياسات التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) المصممة خصيصا للتوصيف المرن للأغشية الحيوية. OCE هي تقنية بصرية غير مدمرة تتيح رسم الخرائط المحلية للبنية المجهرية والتشكل والخصائص اللزجة المرنة للمواد اللينة الشفافة جزئيا بدقة مكانية وزمانية عالية. نحن نقدم دليلا شاملا يوضح بالتفصيل الإجراءات الأساسية للتنفيذ الصحيح لهذه التقنية ، إلى جانب منهجية لتقدير معامل يونغ الأكبر للأغشية الحيوية الحبيبية من القياسات التي تم جمعها. تتكون هذه من إعداد النظام والحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة. في المناقشة ، نتعمق في الفيزياء الأساسية لأجهزة الاستشعار المستخدمة في OCE ونستكشف القيود الأساسية فيما يتعلق بالمقاييس المكانية والزمانية لقياسات OCE. نختتم بالاتجاهات المستقبلية المحتملة لتطوير تقنية OCE لتسهيل القياسات المرنة للأغشية الحيوية البيئية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في معالجة مياه الصرف الصحي واستعادة الموارد المائية ، يتم استخدام الأغشية الحيوية المفيدة في مفاعلات النمو المرفقة بشكل متزايد لتمكين الميكروبات من تحويل الملوثات غير المرغوب فيها ، مثل المواد العضوية والنيتروجين والفوسفات ، إلى أشكال مستقرة يمكن إزالتها بسهولة من الماء1. في هذه الأنظمة ، ترتبط الوظيفة الناشئة للغشاء الحيوي ، أي التحولات الكيميائية الحيوية ، ارتباطا وثيقا بتنوع الميكروبات الموجودة فيه والعناصر الغذائية التي تتلقاها هذه الميكروبات2. وبناء على ذلك، يمكن أن يشكل النمو المستمر للأغشية الحيوية تحديا للحفاظ على وظائف متسقة للمفاعل لأن نمو الأغشية الحيوية الجديدة قد يغير عمليات التمثيل الغذائي الشاملة للغشاء الحيوي، وخصائص نقل الكتلة، وتكوين المجتمع. إن استقرار بيئة الأغشية الحيوية قدر الإمكان يمكن أن يحمي من مثل هذه التغييرات3. ويشمل ذلك ضمان تدفق ثابت للمغذيات والحفاظ على استقرار بنية الغشاء الحيوي بسمك ثابت4. إن مراقبة صلابة الأغشية الحيوية وبنيتها الفيزيائية ستمكن الباحثين من اكتساب نظرة ثاقبة للصحة العامة وعمل الغشاء الحيوي.

تظهر الأغشية الحيوية خصائص لزجة مرنة5،6،7. ينتج عن هذه الطبيعة اللزجة المرنة مزيج من التشوه الفوري والبطيء المعتمد على الوقت استجابة للقوى الميكانيكية الخارجية. أحد الجوانب الفريدة للأغشية الحيوية هو أنها عندما تتعرض لتشوه كبير ، فإنها تستجيب مثل السوائل اللزجة. على العكس من ذلك ، عندما تتعرض لتشوه طفيف ، تكون استجابتها قابلة للمقارنة مع المواد الصلبة5. علاوة على ذلك ، داخل منطقة التشوه الصغيرة هذه ، يوجد نطاق تشوه تظهر تحته الأغشية الحيوية علاقة خطية بين القوة والإزاحة5،6،7. تعتبر التشوهات داخل هذا النطاق الخطي مثالية لتقييم الخصائص الميكانيكية للغشاء الحيوي لأن هذه القياسات قابلة للتكرار. يمكن للعديد من التقنيات تحديد الاستجابة المرنة ضمن هذا النطاق. التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) هو تقنية ناشئة يتم تكييفها لتحليل الأغشية الحيوية في هذا النطاق الخطي (سلالات بترتيب 10-4-10-5)8,9.

التطبيق الأكثر رسوخا ل OCE حتى الآن هو في المجال الطبي الحيوي ، حيث تم تطبيق التقنية لتوصيف الأنسجة البيولوجية التي تتطلب فقط الوصول البصري السطحي. على سبيل المثال ، استخدم Li et al. OCE لتوصيف الخصائص المرنة لأنسجة الجلد10. وصف مؤلفون آخرون الخصائص المرنة متباينة الخواص لأنسجة القرنية الخنازير والبشرية وكيف تتأثر بضغط العين11،12،13،14،15،16. بعض مزايا طريقة OCE لدراسة الأغشية الحيوية هي أنها غير مدمرة وتوفر دقة مكانية متوسطة الحجم ، ولا تتطلب أي تحضير للعينة ، والطريقة نفسها سريعة ؛ يوفر قياسات مسجلة بشكل مشترك للهيكل الفيزيائي وخصائص المرونة (على سبيل المثال ، المسامية وخشونة السطح والتشكل)8،9،17،18.

تقيس طريقة OCE الإزاحة المحلية لنشر الموجات المرنة في عينة باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري الحساس للطور (OCT). OCT هو مقياس تداخل بصري منخفض التماسك يحول التغيرات المحلية في إزاحة العينة إلى تغيير شدة يتم تسجيله باستخدام مطياف ضوئي. كما تم استخدام تقنية OCT في أبحاث الأغشية الحيوية لتوصيف بنية متوسطة الحجم ، وتوزيع المسامية في ثلاثة أبعاد ، وتشوه الأغشية الحيوية17،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، قام Picioreanu et al. بتقدير الخواص الميكانيكية للغشاء الحيوي باستخدام النمذجة العكسية لتفاعل بنية السوائل لصور تشوه المقطع العرضي OCT22.

من ناحية أخرى ، فإن قياسات OCE ، إلى جانب نمذجة الموجات المرنة العكسية ، تسفر عن سرعة موجة الموجات المرنة في العينة ، والتي تمكن من توصيف الخصائص المرنة واللزجة للعينة. قامت مجموعتنا بتكييف تقنية OCE للقياس الكمي لخصائص مرونة الأغشية الحيوية والمرونةاللزجة 8،9،18 والتحقق من صحة التقنية مقابل قياسات قياس ريومترية القص في عينات ألواح هلام الأغاروز18. يوفر نهج OCE تقديرات دقيقة وموثوقة لخصائص الأغشية الحيوية نظرا لأن سرعة الموجة المرنة المقاسة مرتبطة بالخصائص المرنة للعينة. علاوة على ذلك ، يمكن ربط الاضمحلال المكاني لسعة الموجة المرنة ارتباطا مباشرا بالخصائص اللزجة المرنة بسبب التأثيرات اللزجة في المادة. لقد أبلغنا عن قياسات OCE للخصائص اللزجة المرنة للأغشية الحيوية البكتيرية المختلطة المزروعة على كوبونات في مفاعل حلقي دوار (RAR) والأغشية الحيوية الحبيبية ذات الأشكال الهندسية المعقدة باستخدام نماذج الموجات المرنة18.

تعد تقنية OCE أيضا بديلا قويا لقياس الريومترية التقليدية18والتي تستخدم للتوصيف اللزج المرن. طرق قياس الروماتيروس هي الأنسب للعينات ذات الهندسة المستوية. على هذا النحو ، لا يمكن تمييز الأغشية الحيوية الحبيبية ، التي لها أشكال تعسفية وأشكال سطحية ، بدقة على مقياس ريومتر 8,23. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس OCE ، قد يكون من الصعب التكيف مع طرق قياس الريومتر للقياسات في الوقت الفعلي ، على سبيل المثال ، أثناء نمو الأغشية الحيوية في خلايا التدفق24,25.

في هذا البحث ، نوضح أنه يمكن استخدام قياسات OCE لسرعة الموجة المستقلة عن التردد للموجات السطحية لتوصيف خصائص مرونة الأغشية الحيوية دون الحاجة إلى نماذج معقدة. سيجعل هذا التطور نهج OCE في متناول مجتمع الأغشية الحيوية الأوسع لدراسة الخواص الميكانيكية للأغشية الحيوية.

يوضح الشكل 1 توضيحا تخطيطيا لنظام OCT المستخدم في هذه الدراسة. يشتمل النظام على العديد من الأدوات ، بما في ذلك نظام OCT التجاري الحساس للطور الطيفي ، ومولد التأخير ، ومولد الوظائف ، ومحول الطاقة الكهرضغطية. يعمل نظام OCT على مبدأ قياس التداخل من خلال استخدام مصدر ضوء عريض النطاق بطول موجي مركزي يبلغ 930 نانومتر. يتم تحليل شدة الضوء المجمعة ، والتي ترتبط بالتفاصيل الهيكلية المعقدة في العينة ، في وحدة المعالجة اللاحقة ثم تحويلها إلى صورة مقطعية للعينة - يشار إليها عادة باسم صورة OCT. يعتمد عمق التصوير المقطعي المحوسب على شدة التشتت البصري في العينة التي تنبع من التباين المحلي في معامل الانكسار ويقتصر على 1-3 مم في الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية. نظرا لأن الطور البصري في العينة وشدة التداخل يتم تشكيلهما بواسطة الحركة ، يمكن استخدام OCT للكشف عن إزاحة العينة المحلية. نحن نستفيد من حساسية الإزاحة ل OCT في طريقة OCE لتتبع مجال إزاحة الحالة المستقرة للموجات المرنة في العينة. على وجه التحديد ، يقوم مولد الوظيفة بإخراج جهد جيبي لتشغيل محول الطاقة الكهرضغطية. محول الطاقة ، بدوره ، يمتد ويتقلص مع تاريخ زمني تذبذبي. يضفي الإزاحة التذبذبية لمحول الطاقة قوة جيبية على سطح العينة من خلال طرف إسفين مطبوع 3D في قمة محول الطاقة ، مما يؤدي إلى توليد موجات مرنة توافقية في العينة. يتلامس طرف الإسفين مع العينة بالضوء ، بحيث تظل العينة سليمة بعد سحب المشغل من سطح العينة. لتسجيل الإزاحة المحلية في العينة، يتم الحصول على عمليات مسح العمق المجاورة المفصولة بتأخير زمني ثابت عند كل بكسل في العينة. يتناسب فرق الطور البصري بين عمليات المسح المتتالية عند كل نقطة بكسل مع الإزاحة الرأسية المحلية عند نفس النقطة. يتم تحقيق التزامن بين إزاحة محول الطاقة وبصريات المسح في نظام OCT من خلال نبضة الزناد التي تنشأ من مولد الوظائف وتتأخر في مولد التأخير. تسهل خطوة التزامن هذه الحصول على صور مقطعية متسقة لتوزيع الطور البصري المحلي في العينة. تتناسب هذه الصور طرديا مع الإزاحة التوافقية الرأسية المحلية في العينة وتعرف باسم صورة OCE. يتم الحصول على صور OCE بترددات تشغيل محول طاقة مختلفة للحصول على الطول الموجي المرن وسرعة الموجة كدالة للتردد. يتم تحليل سرعات الموجة المقاسة باستخدام نموذج ديناميكي مرن لتحديد الخصائص المرنة للعينة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد النظام

  1. اجمع مكونات النظام التي تشمل نظام OCT التجاري (الوحدة الأساسية ، والحامل ، ورأس التصوير ، والكمبيوتر) ، ومولد الشكل الموجي ، ومحول الطاقة ، ومولد التأخير / النبض ، ومفتاح مع وصلات BNC ، وكابلات ومحولات BNC ، والمشاركات البصرية ، والمشابك.
  2. قم بتوصيل إشارة المزامنة من مولد الوظائف بمحول. قم بتوصيل المنفذ الآخر للمفتاح بمولد التأخير.
  3. قم بتوصيل خرج مولد الوظائف بأسلاك محول الطاقة.
  4. قم بتوصيل مخرجات مولد التأخير بقناة الزناد في الجزء الخلفي من وحدة قاعدة OCT. إشارة الخرج من مولد التأخير هي نبضة الزناد لبدء حركة بصريات المسح في نظام OCT.
  5. قم بتشغيل مكونات النظام (وحدة OCT الأساسية والكمبيوتر ومولد الوظائف ومولد التأخير) وقم بتشغيل برنامج OCT.
  6. قم بتكوين مولد التأخير لإرسال إشارة تشغيل منطقية ترانزستور ترانزستور إلى وحدة OCT الأساسية. راجع دليل نظام OCT لمعرفة متطلبات إشارة الزناد.
  7. ضع الترجام أسفل عدسة OCT. يحتوي محول الطاقة على طرف إسفين مطبوع 3D يتم لصقه على أحد نهاياته والذي يعمل كمصدر خط للموجات المرنة.

2. الحصول على الصور

  1. في برنامج OCT ، حدد وضع اكتساب دوبلر وقم بتمكين المشغل الخارجي.
  2. ضع الغشاء الحيوي الحبيبي تحت العدسة في حامل عينة وحركه نحو طرف الترجام باستخدام مرحلة الترجمة. تأكد من أن محول الطاقة يتلامس بلطف مع سطح العينة ، كما هو موضح في الشكل 2. استخدمنا اثنين من الأغشية الحيوية الحبيبية (المعروفة أيضا باسم الحمأة الحبيبية) بأقطار اسمية مختلفة (4.3 مم و 3.3 مم). تم إجراء هذا الاختيار للتحقيق في تأثير حجم الأغشية الحيوية على خواصها الميكانيكية. تم الحصول عليها تجاريا.
    ملاحظة: يتكون حامل العينة المستخدم في هذه الدراسة من لوحة بلاستيكية مطبوعة 3D مع مسافات بادئة نصف كروية متعددة. لا يسمح هذا الحامل بالقياسات في ظل الظروف الأصلية. لذلك ، أدخلنا الماء من البيئة الطبيعية أثناء القياسات لمنع العينة من الجفاف.
  3. حدد منطقة المسح الضوئي بالنقر فوق نقطتي البداية والنهاية لخط الاهتمام (مسار انتشار الموجة) في نافذة شاشة العينة. قم بتوسيط هذا الخط فيما يتعلق بطرف محول الطاقة وتأكد من أنه عمودي على حافة الطرف.
  4. حدد عدد وحدات البكسل على طول منطقة المسح الضوئي وعمق العينة وقم بزيادة عدد عمليات المسح الضوئي B (صور المقطع العرضي 2D) التي سيتم تسجيلها لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لصور OCE. تم الحصول على النتائج المقدمة باستخدام 1523 بكسل على طول مسار المسح و 1024 بكسل على طول العمق. تم أخذ ما مجموعه 50 مسح B.
  5. انقر فوق الزر Scan وقم بتشغيل المفتاح. يجب أن تظهر صور OCT و OCE على الشاشة. قم بتنشيط المفتاح خلال وقت مهلة التشغيل ووقت إعداد الفحص.
  6. تأكد من أن الكثافة المرجعية ضمن النطاق الأمثل ووضع العينة داخل المنطقة البؤرية لهدف مجهر OCT. يجب أن تكون العينة المركزة بشكل صحيح حافتها العلوية قريبة من أعلى الصورة.
  7. اضبط محيط الطور في صورة OCE على شريط أدوات العرض عن طريق زيادة القيمة الأعلى لشريط ألوان الجانب الأيسر وتقليل القيمة الأقل لشريط الألوان على الجانب الأيمن. سيؤدي ذلك إلى زيادة التباين الهامشي.
  8. قم بتكوين مولد الوظائف لإنتاج جهد جيبي أحادي التردد عن طريق الضغط على زر الجيب في اللوحة الأمامية وتحديد تردد إثارة البدء للقياسات. تبدأ القياسات في هذه الدراسة عند 4 كيلو هرتز وتنتهي عند 9.6 كيلو هرتز. قم بتمكين موصل الإخراج بالضغط على مفتاح الإخراج.
  9. اضبط جهدا مقبولا للقياس. يجب أن تزيد هذه القيمة من الرؤية الهامشية ولكن أيضا تجنب التفاف الطور. بالنسبة للأغشية الحيوية في هذه الدراسة ومدى تردد القياسات ، ينتج عن الجهد بين 5 و 10 فولت عادة خريطة طور ذات تباين جيد.
  10. احصل على صور OCT و OCE بالنقر فوق الزر تسجيل .
  11. كرر القياسات على ترددات مختلفة للحصول على صور مقطعية لمجال الموجة المرنة بأطوال موجية مختلفة (أو فترات هامشية).

3. تحليل الصور

  1. احصل على الحجم الفعلي للبكسل. يتم الحصول على حجم البكسل الفعلي في x بقسمة مجال الرؤية في الاتجاه x على حجم الصورة في اتجاه x ثم الضرب في عامل اثنين. يتم الحصول على حجم البكسل الفعلي في z بقسمة مجال الرؤية في الاتجاه z على حجم الصورة في الاتجاه z. يتم تخزين قيم مجال الرؤية وحجم الصورة في صفيف الهيكل مع معلومات الصورة التي يمكن الوصول إليها باستخدام وظيفة OCTFileOpen المتوفرة في MATLAB SDK في حزمة ThorImageOCT.
  2. احصل على مصفوفات OCT و OCE باستخدام وظائف OCTFileGetIntensity و OCTFileGetPhase ، على التوالي ، وخذ متوسط الإطارات المسجلة. يتم توفير هذه الوظائف في MATLAB SDK في حزمة ThorImageOCT.
  3. احصل على مواقع البكسل للحافة العلوية للعينة عن طريق تقسيم الصورة واكتشاف وحدات البكسل البيضاء من أعلى إلى أسفل لكل عمود.
  4. استخرج توزيع الطور لصورة OCE على طول هذه الحافة باستخدام وظيفة improfile واحسب طول القوس التراكمي بأبعاد حقيقية. احسب طول القوس بأخذ المجموع التراكمي لمعيار الاختلافات المقاسة بين النقاط المتتالية في الاتجاهين x و z.
  5. احسب تحويل فورييه المكاني السريع لتوزيع طور OCT المقاس (أي من صور OCE) فيما يتعلق بطول القوس التراكمي باستخدام دالة plomb.
  6. تحديد موقع الذروة في الطيف. يمثل هذا الموقع التردد المكاني للموجة. احسب سرعة الموجة (أو سرعة الطور) من نسبة تردد إثارة محول الطاقة (وحدات هرتز) والتردد المكاني (وحدة الطول العكسي).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، استخدمنا الأغشية الحيوية الحبيبية (المعروفة أيضا باسم الحمأة الحبيبية) ، والتي تم الحصول عليها تجاريا. الحبيبات هي أغشية حيوية كروية تتشكل من خلال التجميع الذاتي ، مما يعني أنها لا تتطلب حاملا أو سطحا تنمو عليه26. يوضح الشكل 3 أ صورة OCT مقطعية تمثيلية تنشأ بسبب التباين المكاني لمعامل الانكسار المحلي في غشاء حيوي حبيبي. يبلغ قطر الغشاء الحيوي الرقيق 3 مم. تظهر في الصورة بعض السمات الداخلية، بما في ذلك المسام والفراغات القريبة من سطح العينة. يمنع التشتت البصري المتزايد على طول عمق العينة مصدر ضوء OCT من الوصول إلى مركز العينة ، مما يجعل المنطقة المركزية خالية من أي معلومات يمكن تمييزها. يوضح الشكل 3B صورة OCE المستعرضة للعينة لتردد إثارة محول الطاقة البالغ 5.1 كيلو هرتز. يرتبط التباين المحلي في الصورة بالإزاحة الرأسية المحلية الناتجة عن انتشار الموجة المرنة في العينة. يتوافق التباعد المادي للأطراف على طول مسار الانتشار مع الطول الموجي لموجة السطح المرنة. تنتشر الموجة السطحية بالقرب من سطح العينة ، ولها عمق اختراق قريب من الطول الموجي. لا يظهر المدى المكاني لإزاحة الموجة السطحية في الصورة بسبب الاختراق البصري المحدود لمصدر ضوء OCT في العينة. يستخدم توزيع الطور البصري على طول مسار انتشار الموجة المرنة (الشكل 4 أ) لتحديد التردد المكاني للموجة السطحية. يتم الحصول على التردد المكاني عن طريق أخذ تحويل فورييه السريع (FFT; الشكل 4 ب) من البيانات واختيار التردد الذي يكون فيه حجم طيف FFT أكبر.

من الأهمية بمكان تحديد جهد مولد دالة بحجم كاف لإنتاج نمط هامشي يظهر تباينا مثاليا في صورة OCE. ومع ذلك ، يجب تجنب الفولتية الكبيرة بشكل مفرط لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى التفاف الطور في صورة OCE ، كما هو موضح في الشكل 5A. ينشأ التفاف الطور لأن فرق الطور البصري في القياس يقتصر على الفترة الفاصلة بين -π و π. عندما تتجاوز المرحلة أحد هذه الحدود ، يتم طيها إلى الحد المعاكس ، مما يؤدي إلى توزيع طور متقطع. وبالتالي ، تنشأ الحاجة إلى فك التغليف المرحلي ، مما يطرح تحديات ويمكن أن يؤدي إلى عدم دقة محتملة. هناك عامل آخر يجب مراعاته للحصول على قياسات دقيقة للموجة وهو عدد الأهداب الموجودة داخل صورة OCE. عند ترددات محول الطاقة المنخفضة ، الموضحة في الشكل 5B ، قد لا يتم التقاط دورة تذبذب كاملة للموجة السطحية بالكامل بسبب صغر حجم الحبيبة ، وقد ينتج عن طيف FFT تقديرات خاطئة للتردد المكاني (أو الطول الموجي العكسي). مصدر آخر للخطأ في تقدير التردد المكاني هو وجود أوضاع موجة مرنة متداخلة مكانيا ، مثل الموجات السطحية وموجات القص السائبة ، في صورة OCT. تختلط أوضاع الموجات هذه ، مما يؤدي إلى إنشاء أنماط تداخل معقدة قد يكون من الصعب تحليلها. يمكن أن يؤدي وجود أوضاع موجية مختلفة تتجاوز الموجات السطحية إلى تأثيرات تداخل بالقرب من محول الطاقة ، اعتمادا على العينة المحددة وتردد الإثارة والسعة. الشكل 6 هو مثال على صورة OCE تم الحصول عليها بتردد إثارة يبلغ 5.5 كيلو هرتز ، حيث تتداخل موجة القص السائبة بالقرب من نقطة الإثارة المحلية مع مجال الموجة السطحية. يصور الشكل 7 أ توزيعا طوريا يتباعد عن نمط الموجة الجيبية المتحللة الملاحظ في الشكل 4 أ ، ويعزى ذلك إلى مزيج من أنماط الموجة. وبالتالي ، فإن FFT الناتج يظهر ذروة أوسع ، كما هو موضح في الشكل 7B. يمكن أن تحدث نفس الظاهرة بالقرب من العيوب مثل الفراغات أو المناطق ذات الاختلافات الملحوظة في الخصائص المرنة / اللزجة. في هذه المناطق ، يتم تعديل مجال الإزاحة المحلي بسبب تداخل الموجة الساقطة أو السطحية والموجات المتناثرة من العيب.

قمنا بحساب سرعة الموجة للموجة السطحية بترددات تتراوح بين 4.0 و 9.6 كيلو هرتز لاثنين من الأغشية الحيوية الحبيبية بأقطار اسمية مختلفة (4.3 مم و 3.3 مم). تسمى مخططات سرعة الموجة منحنيات التشتت. بالنسبة للإعدادات المستخدمة ، استغرق كل قياس تشتت حوالي 15 دقيقة. ضمن فترة التردد المحددة ، توجد دورات متعددة من ملف تعريف الإزاحة الجيبية في صور OCE ، مما يتيح التحديد الدقيق للتردد المكاني جنبا إلى جنب مع تباين الطور الملحوظ. يوضح الشكل 8 منحنيات التشتت التي تم الحصول عليها. تمثل هذه المنحنيات متوسط منحنيات التشتت لثلاثة مواقع داخل كل عينة. تقترب سرعات الموجة السطحية من قيمة ثابتة ، تسمى سرعة موجة رايلي ، cR ، والتي ترتبط بمعامل القص للعينة من خلال العلاقة ،

جص = ((0.862 + 1.14ν) / (1 + ν)) × (G / r) 1/2

حيث ، G هو معامل القص ، r هي كثافة الكتلة ، و ν هي نسبة بواسون27,28. إنه ثابت لأن عمق اختراق الموجة المرنة أقصر من قطر العينة. بشكل أساسي ، تنتقل الموجة المرنة بالقرب من سطح العينة بسرعة موجة تتناسب طرديا مع مربع معامليونغ 28. ومع ذلك ، بسبب ضوضاء القياس ، فإن سرعة الموجة ليست ثابتة تماما في نطاق التردد هذا. نأخذ متوسط سرعات الموجة للترددات بين 6.0 و 9.6 كيلو هرتز للعينة الأصغر وبين 4.0 و 9.6 كيلو هرتز للعينة الأكبر. ثم يتم استخدام متوسط سرعة الموجة لتقدير معامل يونغ للعينة.

نفترض أن العينة غير قابلة للانضغاط بسبب محتواها المائي العالي. على هذا النحو ، ν = 0.5. وبالتالي ، يرتبط cR ارتباطا مباشرا ب E = 3G لمادة صلبة غير قابلة للضغط ، حيث E هو معامل Young للعينة27,28. تمثل الخطوط المتقطعة في الشكل 8 سرعات موجة رايلي للعينات المختلفة. نفترض أن تركيبة الأغشية الحيوية تتكون أساسا من الماء ، مما ينتج عنه كثافة 1000 كجم / م3. وبالتالي ، فإن معامل يونغ المحسوب للأغشية الحيوية الحبيبية هو 85 كيلو باسكال و 205 كيلو باسكال للأغشية الحيوية الحبيبية ذات الأقطار الاسمية 4.3 مم و 3.3 مم على التوالي. يؤكد هذا القياس قدرة التقنية على تمييز اختلافات الخصائص الميكانيكية بين الأغشية الحيوية.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري. يظهر الرسم التخطيطي للنظام المستخدم هنا في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عينة مركبة. يتم وضع الغشاء الحيوي الحبيبي على حامل العينة بينما يتلامس معه محول الطاقة بلطف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: صور OCT و OCT للغشاء الحيوي الحبيبي. (أ) صورة OCT. (B) صورة OCE لموجة سطحية تنتشر عند kHz 5,1 تظهر تباينا جيدا للهامش. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: توزيع الطور و FFT. بالنسبة للصورة الموضحة في الشكل 3B ، (A) توزيع فرق الطور على طول الحافة العلوية للعينة و (B) FFT لتوزيع فرق الطور الذي يوضح قمة ضيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: صور OCT و OCT للأغشية الحيوية الحبيبية. (أ) صورة OCE لموجة سطحية تنتشر عند kHz 5.1 تظهر التفاف الطور. (B) صورة OCE لموجة سطحية تنتشر عند kHz 1.3 بدون دورة كاملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: صورة OCE توضح مجموعة من الأوضاع. هذه الصورة مأخوذة من موقع مختلف للعينة وتوضح مجموعة من أنماط انتشار موجة بسرعة 5.5 كيلو هرتز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: توزيع الطور و FFT. بالنسبة للصورة الموضحة في الشكل 6، (أ) توزيع فرق الطور على طول الحافة العلوية للعينة و(ب) FFT لتوزيع فرق الطور الذي يوضح قمة أوسع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: منحنيات التشتت. تظهر سرعة الموجة في عينتين بأحجام مختلفة على ترددات مختلفة مع أشرطة الانحراف المعياري. يتم رسم سرعة موجة رايلي المقابلة للجزء المسطح من المنحنيات في الأعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تحديد عمق التصوير الذي يمكن تحقيقه في نظام OCT من خلال درجة تغلغل الضوء من مصدر الضوء ، والذي يعتمد على الطول الموجي للمصدر. علاوة على ذلك ، يحدد الطول الموجي الدقة المحورية. يمكن للأطوال الموجية الأطول أن تخترق العينة بعمق أكبر ولكن على حساب الدقة المحورية المنخفضة مقارنة بالأطوال الموجية الأقصر. من ناحية أخرى ، تعتمد الدقة المستعرضة على كل من الفتحة العددية للنظام والطول الموجي ، مع أطوال موجية أقصر توفر دقة أعلى. تؤدي زيادة فتحة العدسة العددية إلى إجراء مقايضة عن طريق الحد من عمق المجال29. تقتصر الدقة المكانية على أقصر طول موجي مرن يمكن اكتشافه بنسبة إشارة إلى ضوضاء كافية. تقتصر منهجية OCE الحالية على 0.5 مم 9,30. في حين أن هذه التقنية محدودة بحجم العينة ، إلا أنها يجب أن تكون قابلة للتطبيق على أنواع الأغشية الحيوية المختلفة. شكل الغشاء الحيوي ، الحبيبي أو المسطح ، لن يمنع هذه التقنية. تلعب شفافية العينة أيضا دورا في تحديد عمق الاختراق. تمكن المواد ذات الشفافية العالية الضوء من المرور عبر جميع العينات ، مما يجعلها غير محسوسة للمراقبة ، في حين أن العينات غير الشفافة تعيق تغلغل الضوء ، مما يؤدي إلى الحد الأدنى من التفاصيل حول هيكلها الداخلي 9,28. في سياق هذه الدراسة ، يكفي عمق الاختراق في نطاق المليمتر.

هناك مشكلة أخرى محتملة لهذه القياسات وهي أنه في العينات الأكبر ، حيث لا يحد الحجم من عدد دورات الموجات المرنة ، قد يكون مجال الرؤية (FOV) لمجهر OCT هو العامل المحدد لعدد الدورات المقاسة. للقياسات هنا ، يقتصر مجال الرؤية على 9 مم × 9 مم ؛ وبالتالي ، لا يمكن حل الأطوال الموجية المرنة التي يزيد طولها عن 9 مم في مجهر OCT هذا. إن استخدام عدسة ذات مجال رؤية أوسع سيمكن من تصوير عينات أكبر ، مما ينتج عنه المزيد من الهوامش عند هذه الترددات المنخفضة. تنشأ التحديات على ترددات أعلى أيضا. بالنسبة للعينات في هذه الدراسة ، بعد 10 كيلو هرتز ، تتعرض الموجة لتوهين كبير ، مما يقلل من حجم توزيع فرق الطور ويعقد تحديد التردد المكاني. يمكن تخفيف هذا القلق عن طريق زيادة جهد مولد الوظيفة ، وبالتالي زيادة إزاحة محول الطاقة. ومع ذلك ، فإن زيادة الإزاحة مفيدة فقط حتى نقطة معينة لأن هذا سينتهي في النهاية في التفاف الطور9. بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي تعزيز حساسية النظام من خلال تنفيذ مصدر ضوء ذي طاقة أعلى إلى مواجهة التفاف الطور الناجم عن الإزاحات الأكبر وتسهيل اكتشاف الاستجابة الديناميكية للإثارة الأصغر. تسهل الحساسية العالية تنفيذ طرق OCE الصوتية التي توفر ميزة التحميل غير المتصل ولكنها تتأثر بشكل أعمق بالتوهين العالي31.

عند إجراء هذه القياسات على الأغشية الحيوية ، من الضروري الحفاظ على رطوبة العينات. يؤدي التجفيف إلى زيادة غير مرغوب فيها في الصلابة ، وهو أمر غير ذي صلة لأن التركيز ينصب على تقييم خصائص العينة في بيئتها الأصلية. لم ندرس التجفيف الناجم عن الإضاءة. ومع ذلك ، نلاحظ أن الماء من البيئة الطبيعية تمت إضافته بشكل دوري طوال فترة القياس ، وخلال ذلك الوقت ، تمت مراقبة مورفولوجيا العينة من خلال صور OCT ، ولم يلاحظ أي تغييرات ملحوظة في التشكل. بالإضافة إلى ذلك ، عند وضع محول الطاقة والتقاط صور OCE ، من الضروري مراعاة الميزات المميزة في صورة OCT. إن عدم التجانس على طول مسار انتشار الموجة لديه القدرة على تشويه مجال الموجة وبالتالي يجب تجنبه9. علاوة على ذلك ، فإن الحفاظ على اتصال لطيف مع الأغشية الحيوية أمر بالغ الأهمية ، حيث أن الضغط المفرط على العينة ، بصرف النظر عن احتمال تعديل خصائصها الميكانيكية ، يمكن أن يؤدي أيضا إلى تشويه مجال الموجة. أخيرا ، يجب أن تكون منطقة المسح عمودية على الجبهات الموجية لضمان تحديد التردد المكاني للموجة التوافقية بدقة من القياس.

بالنسبة لبعض الترددات ، لوحظت اختلافات كبيرة في سرعات الموجات في كلتا العينتين ، والتي يمكن أن تعزى إلى عدم تجانسها المتأصل ، وحقل الموجة عند هذا التردد المحدد ، ومورفولوجيا مسارات الانتشار. لقد أظهرنا سابقا أن ملف تعريف سرعة الموجة المقاسة عبر غشاء حيوي حبيبي مقسم غير منتظم بسبب البنية المجهرية غير المتجانسة9. وبالتالي ، عند استخدام هذه التقنية على الأغشية الحيوية الحبيبية ، من الضروري إجراء قياسات في مواقع متعددة عبر العينة لاشتقاق تمثيل متوسط.

ملاحظة مهمة فيما يتعلق بمنحنيات التشتت هي أنها تظهر سلوكيات مميزة لأحجام العينات المختلفة. في حالة العينة الأكبر ، يظل المنحنى ثابتا نسبيا عبر النطاق المقاس. ومع ذلك ، بالنسبة للعينة الأصغر ، هناك اتجاه تصاعدي في سرعة الموجة مع زيادة التردد ، خاصة في الجزء السفلي من النطاق. يمكن أن تعزى هذه الظاهرة إلى وجود تأثيرات لزجة مرنة عند ترددات منخفضة وتوليد أوضاع الدليل الموجي المرنة. لقد أخذنا هذه التأثيرات في الاعتبار في عملنا السابق باستخدام نماذج معكوسة أكثر تطورا8،9،18.

من المهم ملاحظة أنه في الأنظمة الحبيبية الهوائية ، لا يتم توزيع الكتلة الحيوية بالتساوي في جميع أنحاء ارتفاع المفاعل. خلال مراحل عدم التهوية ، تميل الحبيبات الأكبر إلى الاستقرار في قاع المفاعل. ينتج عن هذا التوزيع غير المتكافئ مجاميع بأحجام مختلفة يمكنها الوصول إلى كميات متفاوتة من الركيزة. نتيجة لذلك ، تظهر المجاميع ذات الأحجام المختلفة تكوينا مجتمعيا متميزا. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لإزالة الحمأة الزائدة بشكل انتقائي ، تميل الحبيبات الأكبر إلى الاحتفاظ بها في المفاعل لفترات أطول ، بينما يتم إزالة الحبيبات الأصغر بسهولةأكبر 32. يشير الاختلاف الملحوظ في معامل يونغ إلى وجود صلة محتملة بين تكوين الأغشية الحيوية والعمر والخصائص الميكانيكية.

باختصار ، توفر طريقة التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري (OCE) وسيلة سريعة وغير مدمرة لتقييم سرعة الموجة المرنة في الأغشية الحيوية. تتغلب هذه الطريقة على قيود القياسات الريولوجية وتظهر سمات محسنة مقارنة بتقنيات التصوير الإلستوجرافي البديلة 8,18. علاوة على ذلك ، تمتد قابلية تطبيقه إلى ما هو أبعد من الأغشية الحيوية الحبيبية لتشمل أي عينة شفافة جزئيا ذات عمق اختراق بصري مناسب وحجم كبير بما يكفي لحله بواسطة النظام ، بما في ذلك أمثلة مثل الهلاميات المائية33 والقرنية34 والجلد35. تشمل التطورات المستقبلية للطريقة عدة جوانب رئيسية. أولا ، ستسمح زيادة تردد الموجات المرنة التوافقية إلى نطاق مئات kHz بأطوال موجية تبلغ بضعة ميكرومترات ، وبالتالي تحقيق الدقة المكانية على نطاق مماثل. ثانيا ، سيتم تعزيز نسبة الإشارة إلى الضوضاء لنظام الكشف البصري عن طريق زيادة الطاقة الضوئية لنظام OCT من 2 ميجاوات (الحالية) إلى 20 ميجاوات. أخيرا ، سنستبدل المشغل التوافقي التلامسي بمصدر ضغط إشعاع صوتي غير متصل. ستسهل هذه الإضافة التشغيل غير الجراحي وغير المدمر وتسمح باستجواب عينات الأغشية الحيوية في بيئاتها الأصلية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون شركة Aqua-Aerobic Systems، Inc. (روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير الأغشية الحيوية الحبيبية التي تمت دراستها في هذا العمل. يعترف المؤلفون أيضا بدعم المؤسسة الوطنية للعلوم من خلال جائزة #210047 و #193729.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حامل عينة
ثلاثية الأبعاد 3D مطبوعة إسفين تلميحمم عرض
كابلات BNCأي مولد تأخير العلامة التجارية
ستانفورد أنظمة الأبحاثDG535DG535 التأخير الرقمي / مولد النبض   ؛
مولد الوظيفةAgilent Technologies33250A 80 ميجاهرتز وظيفة / مولد الشكل الموجي التعسفي
أنظمة الأغشية الحيوية الحبيبيةAqua-Aerobicالتي تم الحصول عليها من مفاعل الحمأة الحبيبية الهوائية (Aqua-Aerobic Systems، Inc.)
MATLABMathWorksالإصدار 2022a (MATLAB 9.12)
محول الطاقة الكهرضغطيةThorlabsPK2JUP1مكدس بيزو منفصل ، 75 فولت ، 30.0 وميكرو ؛ م الإزاحة
SD-OCT نظامThorlabsGanymede II ، عدسة المسح الضوئي LSM03
ThorImageOCTThorlabsالإصدار: 5.5.5
مطبوعة 3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476(2022).
  2. Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
  3. Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
  4. Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935(2023).
  5. Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
  6. Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
  7. Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
  8. Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
  9. Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394(2021).
  10. Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
  11. Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366(2020).
  12. Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635(2019).
  13. Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
  14. Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
  15. Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
  16. Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
  17. Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
  18. Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
  19. Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
  20. Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020(2017).
  21. Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
  22. Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
  23. Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
  24. Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
  25. Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032(2022).
  26. Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M. Intensifying existing urban wastewater. Science. 375 (6579), 377-378 (2022).
  27. Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
  28. Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
  29. Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
  30. Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
  31. Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
  32. Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
  33. Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822(2022).
  34. Kirby, M. A., et al. Optical coherence elastography in ophthalmology. J Biomed Opt. 22 (12), 1-28 (2017).
  35. Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical Coherence ElastographyBiofilm ElasticityEnvironmental BiofilmsMechanical PropertiesYoung s ModulusViscoelastic PropertiesOptical Coherence TomographyGranular BiofilmsInverse ModelingDoppler Acquisition

Related Articles