مقالة منهجية

تمايز سلالات الجهاز العصبي المعوي عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

DOI:

10.3791/66133

⸱

مايو 17, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 2Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, 3Program in Craniofacial Biology, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،3،4،5،6،7. هنا ، نقدم تفاصيل عن طريقة تدريجية وقوية في المختبر للحصول على ثقافات ENS من hPSCs. تفتح هذه الثقافات المشتقة من hPSC القابلة للتطوير سبلا للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ويمكن أن توفر خلايا قابلة للزرع للطب التجديدي.

يتم اشتقاق سلالات الخلايا العصبية المعوية من خلايا القمة العصبية (NC) التي تتبع مسار تطور ENS أثناء التطور الجنيني. في الأجنة ، تظهر خلايا NC على طول هوامش الصفيحة العصبية القابلة للطي. تتكاثر وتهاجر وتؤدي إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية الحسية وخلايا شوان والخلايا الصباغية والهيكل العظمي القحفي الوجهي والخلايا العصبية المعوية والدبقية8،9،10. يعتمد قرار مصير الخلية على المنطقة المميزة على طول المحور الأمامي الخلفي الذي تخرج منه خلايا NC ، أي NC القحفي ، NC المبهم ، الجذع NC و NC العجزي. يتطور ENS من خلايا NC المبهمة والعجزية مع سيطرة الأولى على سكان الخلايا العصبية المعوية بسبب الهجرة الواسعة على طول الأمعاء واستعمار الأمعاء11.

عادة ما يتضمن اشتقاق خلايا NC من PSCs مزيجا من تثبيط SMAD المزدوج وتنشيط مسار WNT12,13. حتى وقت قريب ، تضمنت جميع بروتوكولات تحريض NC المصل وإضافات المنتجات الحيوانية الأخرى في ظروف الاستزراع. لا تقلل الوسائط غير المحددة كيميائيا من قابلية استنساخ تحريض NC فحسب ، بل تتحدى أيضا الدراسات التنموية الآلية. للتغلب على هذه التحديات ، طور Barber etal 14 بروتوكول تحريض NC باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا ، وبالتالي كان مفيدا على الطرق البديلة التي تعتمد على عوامل استبدال المصل (على سبيل المثال ، KSR) 13،14. تم الحصول على هذا عن طريق استبدال الوسائط القاعدية وتحسين بروتوكول قدمه في الأصل Fattahi et al لاشتقاق خلايا NC المعوية من hPSCs. هذا النظام المحسن هو أساس بروتوكول التمايز hPSC المعروض هنا. يبدأ بتحريض خلايا القمة العصبية المعوية (ENC) في فترة 15 يوما عن طريق التعديل الدقيق لإشارات BMP و FGF و WNT و TGFβ بالإضافة إلى حمض الريتينويك (RA). ثم نشتق سلالات ENS عن طريق علاج الخلايا بعامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF). يتم تعريف جميع تركيبات الوسائط كيميائيا وتنتج ثقافات عصبية معوية قوية في غضون 30-40 يوما.

بالإضافة إلى نظام زراعة الخلايا أحادية الطبقة الموصوف هنا ، تم تطوير مناهج تحريض NC بديلة تستخدم الأجسام الجنينية العائمةالحرة 15,16. وقد تبين أن الخلايا المهاجرة في هذه الثقافات تعبر عن علامات NC مع مجموعة فرعية تمثل NC المبهم. تم استخدام الثقافات المشتركة مع أنسجة الأمعاء الأولية لإثراء سلائف NC المعوية في هذه الثقافات. تحتوي تركيبات الوسائط في هذه الدراسات على مجموعة من العوامل المختلفة مثل عامل نمو الأعصاب و NT3 وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. في هذه المرحلة ، ليس من الواضح تماما كيف يمكن أن تؤثر هذه العوامل على هويات الالتزام بسلائف الخلايا العصبية المعوية. لإجراء مقارنة فعالة لتحريض NC المعوي في الطبقة الأحادية والثقافات القائمة على الجسم الجنيني ، يلزم المزيد من البيانات. بالنظر إلى تخطيطات الثقافة المختلفة في هذه الاستراتيجيات ، يجب النظر في استخدام كل طريقة وتحسينها وفقا لتطبيق محدد في الاعتبار.

البروتوكول المقدم هنا قابل للتكرار وقد تم اختباره بنجاح من قبلنا ومن قبل الآخرين باستخدام خطوط hPSC المختلفة (المستحثة والجنينية)8،14،16.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: التركيزات المذكورة في البروتوكول هي التركيزات النهائية لمكونات الوسائط. قم بإعداد جميع الوسائط في ظروف معقمة في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. استخدم في غضون 2 أسابيع.

  1. وسيط صيانة hPSC: مكمل وسيط صيانة hPSC خال من وحدة التغذية (20 ميكرولتر / مل) مع وسطه الأساسي.
  2. الوسط أ: أضف البروتين المورفولوجي العظمي 4 (BMP4 ؛ 1 نانوغرام / مل) ، SB431542 (10 ميكرومتر) ، و CHIR99021 (600 نانومتر) إلى وسط قاعدة التمايز.
  3. الوسط B: أضف SB431542 (10 μM) و CHIR99021 (1.5 μM) إلى وسط قاعدة التمايز.
  4. الوسط C: أضف SB431542 (10 ميكرومتر) و CHIR99021 (1.5 ميكرومتر) و RA (1 ميكرومتر) إلى وسط قاعدة التمايز.
  5. الذروة العصبية الكاملة (NCC) المتوسطة: أضف FGF2 (10 نانوغرام / مل) ، CHIR99021 (3 ميكرومتر) ، مكمل N2 (10 ميكرولتر / مل) ، مكمل B27 (20 ميكرولتر / مل) ، مكمل L-glutamine (10 ميكرولتر / مل) ، و MEM NEAAs (10 ميكرولتر / مل) إلى الوسط العصبي القاعدي.
  6. وسط ENC: أضف GDNF (10 نانوغرام / مل) ، وحمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر) ، ومكمل N2 (10 ميكرولتر / مل) ، ومكمل B27 (20 ميكرولتر / مل) ، ومكمل L-glutamine (10 ميكرولتر / مل) ، و MEM NEAAs (10 ميكرولتر / مل) إلى الوسط العصبي القاعدي.
  7. حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) 1x: تمييع 500 mM EDTA (1000x) إلى تركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر في PBS.
    ملاحظة: استخدم برنامج تلفزيوني مجاني Ca2+ و Mg2+ في هذا البروتوكول ما لم ينص على خلاف ذلك.

2. طلاء لوحات الثقافة

  1. الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي: قم بإذابة الجليد بسرعة ، وقم بتخفيف حصة مجمدة سعة 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 50 مل من DMEM: F12 المبرد عن طريق السحب بقوة باستخدام ماصة مصلية سعة 50 مل. قم بتغطية الآبار بمحلول مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية. نضح وسط الطلاء قبل الاستخدام. لمنع جلتنة مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بتنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن واستخدم DMEM: F12 البارد لإذابة القسمة المجمدة.
    ملاحظة: يجب أن تبقى درجة حرارة مصفوفة الغشاء القاعدي باردة أثناء الذوبان (على الجليد) و aliquoting (أنابيب على الجليد) لمنع التخثر.
  2. ألواح مطلية ب PO / FN / laminin: قم بإعداد محلول بوليرنيثين (PO) 15 ميكروغرام / مل في PBS عن طريق تخفيف مخزون 1000x. قم بتغطية الآبار ب 100 ميكرولتر من محلول PO / PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر واحتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بنضح PO / PBS وقم بتغطية الآبار عند 100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر بمحلول FN / laminin / PBS الطازج الذي يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين (FN) و 2 ميكروغرام / مل من اللامينين. يمكن استخدام الألواح بعد حضانة لا تقل عن 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. نضح FN / laminin / PBS قبل الاستخدام.

3. الحفاظ على ثقافة hPSC

ملاحظة: جميع خطوات حضانة الخلايا عند 5٪ CO2 وعند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة.

  1. نضح وسط hPSC من ثقافة hPSC وأضف وسطا جديدا (200 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) كل يوم حتى تصبح المستعمرات ~ 80٪ متقاربة.
  2. للمرور ، قم بنضح وسط hPSC واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر.
    ملاحظة: من المهم استخدام برنامج تلفزيوني مجاني من Ca2+ و Mg2+ لغسل الخلايا.
  3. أضف 500 ميكرومتر EDTA (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر). استبدل غطاء اللوحة. راقب من خلال مجهر مقلوب وراقب الخلايا لانفصال حواف المستعمرة (2-4 دقائق).
  4. استخدم ماصة مصلية سعة 5 أو 10 مل لنقل نفس الحجم من وسط hPSC إلى كل بئر وحصاد الخلايا ميكانيكيا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل عدة مرات.
    ملاحظة: يعتمد وقت حضانة EDTA الأمثل على خط iPSC. تجنب السحب القوي لفصل المستعمرات لأنه يمكن أن يؤدي إلى تفكك مفرط للمستعمرة وموت الخلايا. عند المرور لبدء لوحة تمايز ، احتضان الخلايا مع EDTA لمدة 1-2 دقيقة أطول.
  5. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية.
  6. أعد تعليق الخلايا في حجم مناسب من وسط hPSC وانقلها إلى آبار صفيحة مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي جديدة.
    ملاحظة: لصيانة hPSC المنتظمة ، استخدم نسبة مرور 1:18 - 1:24 (1:18 تعني نقل ثلث الخلايا المنفصلة من بئر واحد من صفيحة 6 آبار إلى لوحة جديدة كاملة). لبدء لوحة التمايز ، اتبع نسبة مرور 5: 6.
  7. احتضان في 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.

4. تحريض القمة العصبية

ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1 أ. ابدأ تمايز NC عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا. سيتم تحقيق ذلك في غضون 1-2 أيام عندما يتم تمرير الخلايا بنسبة 5: 6 (انظر أعلاه). ابدأ تمايز NC في اليوم 0 بخلايا hPSC متعددة القدرات وغير متمايزة تماما. لتحقيق كفاءة عالية ، يجب أن تحتوي حدود المستعمرة على الحد الأدنى من الخلايا المميزة. ممر ولوحة hPSC للتمايز عندما تكون المستعمرات كبيرة ، أو يبدأ مركز المستعمرة في التكاثف / التغميق عند مراقبته باستخدام مجهر مقلوب. يميل الانتباه إلى الالتقاء والتشكل إلى أن يكون أكثر موثوقية من عدد الخلايا المطلية لأن هذا قد يختلف اعتمادا على خط الخلية ويمكن أن يختلف من 50000-200000 لكل سم2.

  1. في اليوم 0 ، استبدل وسط صيانة hPSC بوسط A يحتوي على 1 نانوغرام / مل BMP4 ، 10 ميكرومتر SB431542 ، 600 نانومتر CHIR99021 (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).
  2. في اليوم 2 ، يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة 100٪. قم بشفط الوسط A المستهلك برفق وتغذية الخلايا ذات الوسط B التي تحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 ، 1.5 ميكرومتر CHIR99021 (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).
    ملاحظة: مع نمو الثقافات أثناء تحريض NC ، قد تنفصل الخلايا عن الطبقة الأحادية الأساسية. تجنب فقدان الخلايا الزائد عن طريق إزالة الوسائط القديمة برفق وإضافة وسائط جديدة إلى جانب البئر.
  3. في اليوم 4 ، قم بتغذية الخلايا مرة أخرى بمتوسط B (200 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).
  4. في اليوم 6 ، استبدل الوسط B بالوسط C الذي يحتوي على 10 ميكرومتر SB431542 و 1.5 ميكرومتر CHIR99021 و 1 ميكرومتر من حمض الريتينويك (400 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).
  5. في اليومين 8 و 10 ، قم بالتغذية كيوم 6.

5. تشكيل كروي ENC

ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1B.

  1. في اليوم 12 ، قم بشفط Medium C برفق واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من PBS لكل سم2 من مساحة سطح البئر. أضف نفس الحجم من محلول انفصال الخلايا واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.
  2. قم بتخفيف محلول انفصال الخلايا عن طريق إضافة نفس الحجم من وسط NCC الذي يحتوي على 10 نانوغرام / مل FGF2 ، 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 10 ميكرولتر / مل مكمل N2 ، 20 ميكرولتر / مل مكمل B27 ، 10 ميكرولتر / مل مكمل L-glutamine ، و 10 ميكرولتر / مل MEM NEAA. باستخدام ماصة مصلية ، قم بحصاد التعليق أحادي الخلية وإضافته إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  3. أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية.
  4. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف 12 مل (للوحة كاملة من 6 آبار) من وسط NCC وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب ميكانيكيا لأعلى ولأسفل 1-2 مرات. انقل تعليق الخلية إلى لوحة تثبيت منخفضة للغاية.
    ملاحظة: يتم إعادة تعليق ما يقرب من 10 سم2 من خلايا ENC أحادية الطبقة في 2 مل من وسط NCC ونقلها إلى بئر واحدة من لوحة ربط منخفضة للغاية. هذا يساوي لوحة حثية NC كاملة من 6 آبار يتم نقلها إلى لوحة تثبيت كاملة منخفضة للغاية من 6 آبار.
  5. في اليوم 14 ، قم بتدوير الألواح برفق حتى يتم تجميع كرويات صغيرة في وسط كل بئر. باستخدام ماصة P1000 الدقيقة وفي حركة دائرية بطيئة ، قم باستنشاق وسيط NCC المستهلك حول محيط كل بئر. حاول تجنب إزالة الأجسام الكروية العائمة الحرة.
  6. قم بتغذية الخلايا بالحجم الأصلي لوسط NCC.

6. EN التعريفي

ملاحظة: يتم تمثيل هذه الخطوة بشكل تخطيطي في الشكل 1B.

  1. في اليوم 15 ، قم بتطبيق نفس التقنية المستخدمة في اليوم 14 لإزالة الوسط برفق وغسل الأجسام الكروية باستخدام برنامج تلفزيوني. إزالة أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني تجنب كروية.
  2. أضف محلول انفصال الخلايا (100 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) وافصل الكرات إلى خلايا مفردة عن طريق الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية.
  3. باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف حجما متساويا من وسط ENC (يحتوي على 10 نانوغرام / مل GDNF ، 100 ميكرومتر حمض الأسكوربيك ، 10 ميكرولتر / مل N2 ملحق ، 20 ميكرولتر / مل B27 ملحق ، 10 ميكرولتر / مل مكمل L-glutamine ، و 10 ميكرولتر / مل MEM NEAA في الوسط العصبي القاعدي) إلى كل بئر وكسر الكرويات المتبقية بمقدار 2-3 جولات من الماصات الميكانيكية. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: تجنب الإجهاد المفرط وموت الخلايا الذي يمكن أن يحدث من السحب القسري أو استخدام الماصات ذات فتحة الطرف الأصغر.
  4. أدر الخلايا (دقيقتان ، 290 × جم ، 20-25 درجة مئوية) وتخلص بعناية من المادة الطافية. باستخدام ماصة مصلية 10 مل ، أضف ~ 5-10 مل من وسط ENC وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 1-2 مرات.
  5. عد تركيز الخلايا القابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق وطريقة عد الخلايا مثل مقياس الدم.
    تنبيه: تريبان الأزرق هو مادة مسرطنة مشتبه بها. تعامل بحذر ، تخلص بشكل مناسب.
  6. أضف حجما كافيا من وسط ENC بهدف صفيحة ما يقرب من 300000-400000 خلية قابلة للحياة لكل سم2 من مساحة السطح بكثافة حوالي ~ 1000000 خلية لكل مل. نضح محلول FN / laminin / PBS من آبار اللوحة.
    ملاحظة: اختر تنسيق اللوحة وفقا للفحوصات المخطط لها لثقافات EN لأن هذه المرحلة تمثل خطوة إعادة الطلاء النهائية للبروتوكول. يمكن تجميد أسلاف الخلايا العصبية المعوية في اليوم 15. بعد فصل الكرات بمحلول انفصال الخلايا ، أعد تعليق السلف عند حوالي 5 × 106 خلايا / مل في وسط التجمد مثل 10٪ DMSO أو Stem-cellbanker. عند الحاجة ، قم بإذابة الثلج في وسائط ENC الدافئة باستخدام مثبط 5 μM Y-27632 ROCK. خلايا اللوحة بتنسيق اللوحة المطلوب. استبدل الوسائط ب ENC جديد بعد بضع ساعات.
  7. أضف الخلايا برفق إلى الآبار المطلية ب PO / FN / laminin. تجنب حبس الفقاعات تحت تعليق الخلية مما يمنع الخلايا من الالتصاق بطلاء PO / FN / laminin ، خاصة عند استخدام الألواح ذات حجم البئر الأصغر مثل ألواح 384 بئرا. هذا يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا.
  8. تغذية الخلايا كل يومين بوسط ENC (200 ميكرولتر لكل سم2 من مساحة سطح البئر) حتى اليوم 30-40 ، وبعد ذلك تقليل تردد التغذية (مرة أو مرتين في الأسبوع) ولكن مضاعفة حجم التغذية (إلى 400 ميكرولتر من الوسط لكل سم2 من مساحة سطح البئر).
    ملاحظة: هذا مهم لأن الإفراط في إزالة وإضافة الوسائط يمكن أن يسهل انفصال الثقافة العصبية عن سطح الآبار. لمنع الانفصال بشكل مستقبلي خاصة بالنسبة للمزارع طويلة الأجل ، استكمل ENC ب FN (2 ميكروغرام / مل) ولامينين (2 ميكروغرام / مل) مرة واحدة في الأسبوع.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة لاشتقاق القمة العصبية المعوية والخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا (الشكل 1A-B). يعتمد توليد خلايا عصبية عالية الجودة على خطوة تحريض قمة عصبية معوية فعالة. يمكن تقييم ذلك بصريا عن طريق التحقق من مورفولوجيا الكرات العائمة الحرة التي يجب أن تبدو مستديرة مع الأسطح الملساء بحجم 0.1 - 0.4 مم تقريبا كما هو موضح في الشكل 1C. يجب أن تعبر هذه الكرويات أيضا عن علامة القمة العصبية عامل النسخ SRY-Box 10 (SOX10) 17,18 ، كما يتضح من الشكل 1D. خلال مرحلة تحريض الخلايا العصبية المعوية ، يمكن أن تصبح الخلايا العصبية مرئية في وقت مبكر من اليوم 25-30 (الشكل 1E). ومع ذلك ، يمكن أن يتأخر هذا في التمايز مع انخفاض الكفاءة التي تحتوي على تلوث الخلايا الوسيطة غير المرغوب فيها. الجهاز العصبي المعوي البشري عبارة عن مجموعة من الخلايا العصبية المتنوعة التي تعبر عن ناقلات عصبية مختلفة. يتم تلخيص عدم التجانس هذا في البروتوكول في المختبر المقدم ويمكن تقييم التعبير عن العلامات الرئيسية بطرق تلطيخ الخلايا مثل التصوير المناعي وقياس التدفق الخلوي وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا13،14،19،20،21 (الشكل 1F ، G).

figure-results-1
الشكل 1: اشتقاق خلايا ENC البشرية والأنواع الفرعية للخلايا العصبية المعوية من hPSCs. (أ) تحريض القمة العصبية المعوية (ENC) من hPSC. بروتوكول (أيام 0-12) يعرض تركيبات الوسائط لاشتقاق خلايا ENC من hPSCs. (ب) تكوين كروي ENC وتحريض الخلايا العصبية المعوية من بروتوكول ENC. (الأيام 12-15) يظهر التركيب المتوسط لتشكيل كروي ENC. بعد ذلك ، يتم إنشاء الخلايا العصبية المعوية ومزجها عن طريق المعالجة بوسط يحتوي على GDNF و AA. (ج) صور تباين الطور التمثيلي للتمييز بين المحطات العمودية ثنائية السلسلة في نقاط زمنية مختلفة من البروتوكول. شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. (D) SOX10::GFP يعبر عن كرويات ENC المشتقة من H9 iPSC في اليوم 14. شريط المقياس: 1000 ميكرومتر. (ه) صورة عقد الطور للخلايا العصبية في اليوم 33. شريط المقياس: 400 ميكرومتر (F-G) التصوير المناعي (F) وقياس التدفق الخلوي (G) لعلامات الناقل العصبي في اليوم 40 من الخلايا العصبية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الاختصارات: BMP4 = بروتين BMP4 البشري المؤتلف. RA = حمض الريتينويك ؛ FGF2 = FGF البشري المؤتلف الأساسي ؛ GDNF = عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية البشرية المؤتلفة ؛ AA = حمض الاسكوربيك. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،19،22. يتم تحفيز هذه الخلايا العصبية والدبقية عن طريق التمايز التدريجي ل hPSCs إلى خلايا قمة عصبية مبهمة ومعوية تليها الخلايا العصبية المعوية وأسلاف الخلايا الدبقية13,14. تعبر خلايا القمة العصبية عن علامات القمة العصبية ، عامل النسخ AP-2 alpha و beta ، TFAP2A و TFAP2B ، على التوالي21. لقد أظهرنا سابقا أنه يمكن استخدام CD49 كعلامة للإشارة إلى كفاءة خلايا القمة العصبية المشتقة من hPSC14. تعتمد كفاءة ونجاح هذه الطريقة على مجموعة من العوامل. أولا ، من الأهمية بمكان تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. يعد اختبار مزارع hPSC بحثا عن تلوث الميكوبلازما أمرا مهما لأنه يمكن أن يؤثر سلبا على نمو الخلايا الجذعية ولا يمكن اكتشافه بصريا. ثانيا ، يقلل استخدام الألواح المطلية بالتساوي وبشكل صحيح من فرصة نمو ثقافة hPSC غير المكتمل وانفصال ثقافات NC والخلايا العصبية القديمة عن سطح الآبار. ثالثا ، لتحقيق كفاءة عالية في التمايز ، من الضروري البدء بخلايا hPSC متعددة القدرات وغير متمايزة تماما. يجب أن تحتوي مستعمرات hPSC على الحد الأدنى من الخلايا المتمايزة على حدود المستعمرة. يجب تمرير hPSCs أو طلائها للتمايز عندما تكون المستعمرات كبيرة ، أو يبدأ مركز المستعمرة في التكاثف / التغميق في اللون كما لوحظ من خلال مجهر تباين الطور. الخلايا المتمايزة غير المرغوب فيها (عادة خلايا اللحمة المتوسطة) ، لا تسقط فقط كفاءة التمايز الكلية ، ولكنها يمكن أن تؤدي إلى انفصال الخلايا العصبية عن سطح البئر مع تقدم الثقافات في السن. لذلك يوصى بمراقبة ثقافات ENC في أول 15 يوما بعناية. في ظل ظروف التمايز الفعالة ، تظهر الأقراص المظلمة على سطح الثقافة ~ اليوم 6 مما يشير إلى تكوين كروي فعال في الأيام 12-15. بالإضافة إلى ذلك ، في المرحلة الكروية (اليوم 12-15) يجب أن يكون للكرات العائمة الحرة أسطح ناعمة (الشكل 1 د). الحفاظ على المرحلة الكروية ثلاثية الأبعاد في الأيام 12-15 يكفي بشكل عام لتحسين نقاء ENCs من أجل تمايز الثقافات في اتجاه مجرى النهر إلى سلالات ENS. ومع ذلك ، بالنسبة للدراسات التي تتطلب مجموعات مبكرة ونقية من الخلايا السلفية ENC ، يوصى باستخدام FACS باستخدام CD49D. CD49D هو علامة سطح محددة لسلالات NC المشتقة من SOX10: hPSC وقد تم استخدامه بنجاح عبر خطوط الخلايا13,14. لمزيد من المعلومات حول عزل خلايا CD49D + باستخدام FACS وتوصيات بشأن قراء استراتيجية البوابات ، تمت الإشارة إلى الورقة التي أعدها Barber et al ، الشكل 2D ، Box1 والشكل التكميلي 614. رابعا ، لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ، يجب أن يبدأ التمايز عندما تكون ثقافات hPSC أحادية الطبقة و ~ 80٪ متقاربة. هذا يعني وجود ثقافة متقاربة تماما في اليوم 2. يؤثر انخفاض الالتقاء سلبا على الكفاءة وتميل الثقافات الكثيفة جدا إلى أن يكون لها معدل أعلى من موت الخلايا ويمكن أن يؤدي إلى ظهور خلايا متمايزة غير مرغوب فيها.

تمثل إعادة طلاء الخلايا في اليوم 15 خطوة مهمة في هذا البروتوكول. هذه هي خطوة نقل الخلايا الأخيرة لثقافة عصبية أحادية الطبقة ، وبالتالي يجب اختيار تخطيط اللوحة وفقا للفحوصات المخطط لها. يمكن أن يؤثر عدد الخلايا المنقولة إلى كل بئر بشكل كبير على التنوع العصبي والخلايا العصبية القديمة المتبقية متصلة بسطح الآبار. بشكل عام ، من المستحسن وجود كثافة خلية في حدود 250,000-350,000 خلية لكل سم2 (حوالي 75,000-100,000 خلية لكل بئر من صفيحة 96 بئرا أو 500,000-700,000 لكل بئر من صفيحة 24 بئرا). بدءا من اليوم 30-40 ، قد يفكر المرء في إضافة الفبرونيكتين واللامينين إلى وسط التغذية (ليس أكثر من مرة واحدة في الأسبوع) لمنع انفصال الخلايا العصبية بشكل مستقبلي خاصة بالنسبة للخلايا المخطط لها لمزارع الخلايا العصبية الأطول. في هذه المرحلة ، يوصى بتقليل تكرار التغذية إلى مرة واحدة كل 5-7 أيام وترك بعض الوسط في كل بئر قبل إضافة وسط طازج إضافي. هذا يقلل من فرصة تطبيق الإجهاد البدني غير الضروري على الإسقاطات العصبية. بالنظر إلى تبخر الوسط (خاصة بالنسبة للآبار الموجودة على حدود اللوحة) ، يمكن للمرء إزالة 75 ميكرولتر وإضافة 100 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى كل بئر. بناء على الخبرة ، تميل الثقافات المزروعة على ألواح التصوير السفلية ذات الغطاء البوليمر إلى العيش والبقاء ملتصقا بسطح البئر لفترة أطول. لذلك ، يوصى بالنظر في لوحات التصوير السفلية لغطاء البوليمر للتجارب التي تتطلب ثقافات عصبية قديمة جدا مثل الثقافات المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى. على الرغم من أن الألواح المطلية ب PO / FN / laminin المجففة بالهواء قد لا تزال تنتج تمايزا فعالا ، إلا أن هذا لم يتم اختباره بشكل منهجي لغرض هذا البروتوكول. وبالتالي ، يوصى باستخدام الألواح المطلية حديثا.

يعتمد البروتوكول الموصوف هنا على بروتوكول تم نشره مسبقا بواسطة Barber etal 14. بالمقارنة مع طرق تحريض ENC القديمة التي تستخدم وسائط تحتوي على عوامل استبدال المصل (على سبيل المثال ، KSR) 13،14 ، يتم تعريف ظروف وسائط البروتوكول الحالية كيميائيا. هذا مفيد نحو تمايزات أكثر اتساقا ويسمح بدراسات تنموية أكثر دقة من خلال التلاعب بظروف الثقافة. يولد هذا البروتوكول القوي بشكل متكرر مزارع الخلايا العصبية المعوية من خطوط الخلايا الجذعية المستحثة والجنينية المستقلة التي تم اختبارها ، مثل H9 و UCSF4 و WTC11. أحد الجوانب القوية للبروتوكول المقدم هو قدرته على توليد مجموعة متنوعة من الأنواع الفرعية العصبية ENS تشبه تلك الموجودة في ENS. على سبيل المثال ، يمكن التحقق من التعبير عن علامات محددة لهويات كيميائية عصبية مختلفة من ENS عن طريق قياس التدفق الخلوي والتصوير الفلوري (الشكل 1F ، G). النطاق النموذجي للمجموعات العصبية المعوية المشتقة من hPSC الإيجابية لسينسيز أكسيد النيتريك 1 (NOS1) هو 5٪ -20٪. الكولين O-أسيتيل ترانسفيراز (الدردشة) هو 40٪ -60٪; حمض جاما أمينوبتيريك (GABA) هو 15٪ -30٪ والسيروتونين (5-HT) هو 15٪ -30٪. ومع ذلك ، فإن مدى دقة الاتصال الهيكلي والوظيفي في المختبر بين هذه الأنواع الفرعية في نمذجة الشبكات الخلوية في الجسم الحي يتطلب مزيدا من الدراسات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تحليلات الخلية الواحدة لتوسيع التنميط النسخي للأنواع الفرعية الفردية لن تساعد فقط في مقارنة الهويات الخلوية في الجسم الحي وفي المختبر بشكل أفضل ، بل ستفيد أيضا الدراسات التنموية والجزيئية بالإضافة إلى تحسينات البروتوكول المستقبلية نحو إثراء أنواع فرعية محددة لاكتشاف الأدوية والطب التجديدي.

على الرغم من الثقافات التي تحتوي على خلايا عصبية مختلفة ، وفي الثقافات القديمة الخلايا الدبقية ، فإن هذا البروتوكول لا يولد أنواع الخلايا الأخرى الموجودة بشكل طبيعي في مكانة الجسم الحي ل ENS، مثل خلايا العضلات والخلايا الظهارية والخلايا المناعية. تتطلب دراسة تفاعل ENS مع هذه الأنواع من الخلايا في سياق الصحة والمرض الاستثمار في تحسين أنظمة الاستزراع المشترك والعضوية المعوية. بشكل عام ، يتم وصف طريقة قوية لإنشاء أنواع فرعية مختلفة من ENS من hPSCs في المختبر هنا. الثقافات القابلة للتطوير مناسبة للدراسات التنموية ل ENS، واختبار السموم وتجارب نمذجة الأمراض التي تهدف إلى تطوير العلاجات الدوائية وتوفير الخلايا القابلة للزرع لعلاج اعتلالات الأعصاب المعوية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسكوربيكSigma-AldrichA5960
B27 (خالي من المصل ، ناقص فيتامين أ)مصفوفة غشاء القاعدية Gibco12587-010
، GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R & أنظمة D314-BP
جهاز طرد مركزي لثقافة الخلاياEppendorf ، موديل رقم 5810R02262501
محلول انفصال الخلايا ، AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
أنابيب مخروطية الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1475-0511 ، 1500-1211
وسط قاعدة التمايز ، Essential 6Life تقنياتA1516401
DMEM / F-12 No GlutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
وسيط صيانة hPSC خال من المغذي ، Essential 8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
FGF2R& أنظمة D233-FB / CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
مقياس الدمHausser Scientific1475
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، H9 ESCWiCellRRID: حاضنة CVCL_1240
مع الرطوبة ودرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربونفيشر العلميHerralcell 150i
مجهر مقلوبThermo Fisher ScientificEVOS FL
التدفق الصفحيThermo Fisher Scientific1300 سلسلة الفئة الثانية ، النوع A2
LamininCultrex3400-010
مكمل L-glutamine ، GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
لوحات متعددة الآبار ، FalconBD353934 ، 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
تقنيات العمر المتوسط العصبي21103049
PBS (خالية من Ca و Mg) LifeTechnologies10010023
حشو الماصةEppendorfZ768715-1EA
نصائح الماصةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1111-2830
ماصاتفيشربراند13-678-11E ، 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
لوحات التصوير السفلية للغطاء البوليمر ، المرجع نفسه81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R & أنظمة D1614
صبغة زرقاء Trypan ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250-061
لوحات مرفقة منخفضة للغايةFisher Scientific07-200-601
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريدR & أنظمة D1254
مكمل Kit الحراري غطاء

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
  3. Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
  5. Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
  8. Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
  9. Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
  10. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  11. Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
  12. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
  13. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  14. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  15. Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
  16. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
  17. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
  18. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
  19. Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
  20. Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
  21. Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
  22. Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SOX10

مقالات ذات صلة