Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

Shuyuan Wang; Haiyan Xiong; Qiyuan Chang; Xudong Zhuang; Yaochen Wu; Xinrui Wang; Congxian Wu; Zhifei Fu

doi:10.3791/66141

مقالة منهجية

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

DOI:

10.3791/66141

⸱

يناير 12, 2024

Shuyuan Wang^*¹ , Haiyan Xiong^*¹^,² , Qiyuan Chang^*¹^,³ , Xudong Zhuang^*⁴^,⁵^,⁶ , Yaochen Wu¹^,³ , Xinrui Wang⁴^,⁵^,⁶ , Congxian Wu¹ , Zhifei Fu¹^,⁷^,⁸

¹Public Technology Service Center, Fujian Medical University, ²The School of Pharmacy, Fujian Medical University, ³The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ⁴College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, ⁵Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁶NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁷Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, ⁸Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) هو فحص مجهري شامل يجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري (FM) وسياق البنية الخلوية الفائقة المكتسبة بواسطة المجهر الإلكتروني (EM). CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية ، وعادة ما تعرض البنية التحتية الفائقة التألق للخطر. بالمقارنة مع راتنجات التضمين المحبة للماء الأخرى ، مثل غليسيديل ميثاكريلات أو HM20 أو K4M ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم. في السابق ، أثبتنا أن mEosEM يمكن أن ينجو من تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم وتضمين Epon. باستخدام mEosEM ، حققنا ، لأول مرة ، Epon post تضمين CLEM ، الذي يحافظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هنا ، نقدم تفاصيل خطوة بخطوة حول إعداد عينة EM ، وتصوير FM ، والتصوير EM ، ومحاذاة الصورة. نقوم أيضا بتحسين إجراءات تحديد نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة تصوير FM أثناء التصوير الكهرومغناطيسي وتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. نعتقد أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق Epon بعد تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باتباع هذا البروتوكول الجديد في مرافق EM التقليدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام المجهر الفلوري (FM) للحصول على توطين وتوزيع البروتين المستهدف. ومع ذلك ، يتم فقدان السياق الذي يحيط بالبروتين المستهدف ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في البروتين المستهدف بدقة. يتمتع المجهر الإلكتروني (EM) بأعلى دقة تصوير ، حيث يوفر العديد من التفاصيل تحت الخلوية. ومع ذلك ، تفتقر EM إلى وضع العلامات المستهدفة. من خلال الدمج الدقيق للصورة الفلورية التي التقطتها FM مع الصورة الرمادية التي حصلت عليها EM ، يمكن للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) الجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال وضعيتي التصوير^{هذين 1}^،²^،³^،⁴.

CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية¹. نظرا لقيود البروتينات الفلورية الحالية وإجراءات تحضير عينات EM التقليدية ، وخاصة استخدام حمض الأسميك (OsO₄) والراتنجات الكارهة للماء مثل Epon ، فإن البنية التحتية الفائقة دائما ما تعرض التألق⁵ للخطر. OsO₄ هو كاشف لا غنى عنه في تحضير عينات EM ، والذي يستخدم لتحسين تباين صور EM. بالمقارنة مع راتنجات التضمين الأخرى ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم⁵. ومع ذلك ، لا يمكن لأي بروتينات فلورية الاحتفاظ بإشارة التألق بعد معالجة OsO₄ وتضمين Epon⁶. للتغلب على قيود البروتينات الفلورية ، تم تطوير CLEM قبل التضمين ، حيث يتم تصوير FM قبل تحضير عينة EM⁶. ومع ذلك ، فإن عيب التضمين المسبق CLEM هو التسجيل غير الدقيق بين صور FM و EM⁵.

على العكس من ذلك ، تقوم طريقة CLEM بعد التضمين بإجراء تصوير FM بعد تحضير عينة EM ، والتي يمكن أن تصل دقة تسجيلها إلى 6-7 نانومتر ^5,6. للاحتفاظ بمضان البروتينات الفلورية ، تم استخدام تركيزات منخفضة جدا من OsO₄ (0.001٪) ³ أو طرق تحضير EM المجمدة ذات الضغط العالي (HPF) واستبدال التجميد (FS) ^4,7 على حساب البنية التحتية المخترقة أو تباين صورة EM. يعزز تطوير mEos4b بشكل كبير تقدم CLEM بعد التضمين ، على الرغم من استخدام غليسيديل ميثاكريلات كراتننج^{التضمين 5}. مع تطوير mEosEM ، الذي يمكنه البقاء على قيد الحياة من تلطيخ OsO₄ وتضمين Epon ، تم تحقيق CLEM فائق الدقة لتضمين Epon اللاحق لأول مرة ، مع الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد⁶. بعد mEosEM ، تم تطوير العديد من البروتينات الفلورية التي يمكن أن تنجو من تلطيخ OsO₄وتضمين Epon⁸^،⁹^،¹⁰^،¹¹. هذا يعزز إلى حد كبير تطوير CLEM.

هناك ثلاثة جوانب رئيسية ل Epon بعد تضمين CLEM. الأول هو البروتين الفلوري ، الذي يجب أن يحافظ على إشارة الفلورسنت بعد تحضير عينة EM. وفقا لتجربتنا ، يتفوق mScarlet على بروتينات الفلورسنت الأخرى المبلغ عنها. والثاني هو كيفية العثور على نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة التصوير FM في التصوير الكهرومغناطيسي. لحل هذه المشكلة ، نقوم بتحسين الإجراء الخاص بهذه الخطوة حتى يتمكن المرء من العثور بسهولة على الخلية المستهدفة. الأخير هو طريقة محاذاة صورة FM مع صورة EM. هنا ، نقوم بتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. في هذا البروتوكول ، نعبر عن mScarlet في الخلايا العصبية VGLUT2 ونثبت أن mScarlet يمكن أن يستهدف الجسيمات الحالة الثانوية باستخدام Epon بعد تضمين CLEM. نحن نقدم تفاصيل خطوة بخطوة ل Epon بعد التضمين CLEM ، دون المساس بالتألق والبنية الفائقة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على تربية والتجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في المركز الطبي بجامعة فوجيان الطبية. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.

1. إعداد العينة

دماغ الفأر
1. شراء الفئران المعدلة وراثيا (انظر جدول المواد) وبادئات قليل النوكليوتيد (انظر جدول المواد) للنمط الوراثي لهذه الفئران.
2. قم بإخراج وإزالة الدماغ السليم من قبو الجمجمة باتباع البروتوكول^{المنشور مسبقا 12,13}.
3. ثبت دماغ الفأر باستخدام 10 مل من المحلول المثبت (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
4. اشطف المحلول المثبت لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام محلول فوسفات 0.1 متر (PB).
5. قم بتقطيع دماغ الفأر إلى أقسام بسمك 500 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم متذبذب (انظر جدول المواد).
6. قطع مناطق الفلورسنت إلى كتل صغيرة بمشرط باستخدام مجهر مجسم (انظر جدول المواد).
  ملاحظة: يجب ألا يزيد حجم الكتل الصغيرة عن 1 مم³.
الخلايا المستزرعة
1. قم بزرع خلايا HeLa في أطباق زراعة الخلايا 6 سم واحتفظ بها في وسط نمو (وسط النسر المعدل من Dulbecco [DMEM] منخفض الجلوكوز ، مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ [FBS]).
2. في اليوم التالي ، قم بنقل البلازميدات التي تحتوي على mScarlet إلى الخلايا باستخدام كاشف نقل الحمض النووي (انظر جدول المواد) باتباع كتاب التعليمات الخاص بمجموعة النقل.
3. بعد ثمان وأربعين ساعة من النقل ، يقوم التربسين بنقل الخلايا وأجهزة الطرد المركزي للحصول على كريات الخلايا عند 1000 × جرام. تسمى كريات الخلية كتل العينات.

2. إعداد عينة EM

تثبيت
1. ثبت كتل العينات باستخدام محلول مثبت (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
2. قم بإزالة المحلول المثبت واشطف المحلول المثبت لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام 0.1 M PB من كتل العينة.
رابع أكسيد الأوزميوم (OsO₄) تلطيخ
1. ثبت كتل العينة بمحلول OsO₄ (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
2. قم بإزالة محلول OsO₄ واشطف محلول OsO₄ 3 × 10 دقائق باستخدام ddH₂O من كتل العينة.
تلطيخ أسيتات اليورانيل (UA)
1. قم بتلطيخ كتل العينة باستخدام محلول UA 2٪ (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
2. قم بإزالة محلول UA وشطف كتل العينة باستخدام ddH₂O لمدة 3 × 10 دقائق.
الجفاف المتدرج
1. قم بتجفيف كتل العينة باستخدام الإيثانول المتدرج على النحو التالي: 50٪ لمدة 10 دقائق ، و 70٪ لمدة 10 دقائق ، و 80٪ لمدة 10 دقائق ، و 90٪ لمدة 10 دقائق ، و 2 × 10 دقائق في الإيثانول بنسبة 100٪.
2. جفف كتل العينة بالأسيتون اللامائي لمدة 3 × 10 دقائق.
تسلل الراتنج
1. تسلل كتل العينة باستخدام راتنج متدرج (انظر جدول المواد): الأسيتون إلى الراتنج 3: 1 لمدة ساعة واحدة ، الأسيتون إلى الراتنج 1: 1 لمدة 2 ساعة ، الأسيتون إلى الراتنج 1: 3 لمدة 3 ساعات.
2. استبدل بالراتنج النقي لمدة 3 × 12 ساعة.
تضمين الراتنج
1. انقل كتل العينات إلى كبسولات (انظر جدول المواد) باستخدام عود أسنان.
2. أضف الراتنج النقي إلى الكبسولة التي تحتوي على كتلة العينة وقم ببلمرة الراتنج في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 14-16 ساعة.

3. طلاء الغطاء الزجاجي بجزيئات الذهب النانوية

تنظيف الزجاج
1. اغسل أغطية النظارات بمخزن التنظيف المؤقت (انظر جدول المواد) لمدة 2 ساعة عند 142 درجة مئوية.
2. اشطف المخزن المؤقت للتنظيف 3 × 10 دقائق باستخدام ddH₂O.
3. انقل أغطية النظارات بعناية إلى دورق يحتوي على الكحول الإيثيلي اللامائي واحتضانه طوال الليل.
4. جفف النظارات في الهواء على مقعد نظيف لعدة دقائق.
قم بتغطية النظارات بجزيئات الذهب النانوية.
1. قم بتثبيت شريحة زجاجية في وسط دوران جهاز طرد مركزي لسطح المكتب (انظر جدول المواد) باستخدام الأسمنت الزجاجي.
2. قم بتركيب غطاء زجاجي في وسط الشريحة الزجاجية باستخدام ملاحظات لاصقة.
3. أضف 75 ميكرولتر من 1٪ بيولوفورم (انظر جدول المواد) على غطاء الزجاج.
  ملاحظة: لقد اختبرنا أيضا Formvar (انظر جدول المواد) وهو يعمل بشكل جيد.
4. تدور لمدة 3 دقائق عند 1360 × جم (الشكل 2 أ) لإنتاج طبقة رقيقة من البيولوفورم على سطح غطاء الزجاج.
5. احتضان سطح الغطاء الزجاجي ب 250 ميكرولتر من 0.1٪ بولي-L-ليسين (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 ب).
6. شطف مع ddH₂O وتجفيف الغطاء في الهواء لعدة دقائق.
7. قم بتخفيف جسيمات الذهب النانوية 80 نانومتر (انظر جدول المواد) مع ddH₂O إلى 25٪ (v / v ، OD₆₀₀ = 0.07) (انظر جدول المواد) وصوتنيكات لمدة 15 دقيقة.
8. احتضان سطح الغطاء الزجاجي بجسيمات الذهب النانوية المخففة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2C).
9. شطف مع ddH₂O وتجفيف الغطاء في الهواء لعدة دقائق.
  ملاحظة: يعمل بشكل جيد 2 أسابيع بعد أن تكون مغلفة مع pioloform والجسيمات النانوية الذهب. لكننا نوصي باستخدامه مباشرة بعد الطلاء.

4. التقسيم فائق النحافة

قم بقص سطح كتلة العينة إلى شبه منحرف قائم الزاوية. قطع المقاطع بسمك 100 نانومتر باستخدام سكين الماس (انظر جدول المواد) باستخدام ميكروتوم فائق (انظر جدول المواد). افصل قسما واحدا عن شريط القسم وقم بتعويم القسم الفردي في الحمام المائي.
أضف قطرة من ddH₂O إلى وسط غطاء الغطاء الذهبي المطلي بالجسيمات النانوية. التقط قسما باستخدام حلقة عينة واقلب حلقة العينة على سطح قطرة الماء. قم بإزالة حلقة العينة ، وترك القسم على سطح قطرة الماء.
جفف الغطاء في الهواء لعدة دقائق. ارسم حلقة حول القسم الموجود على الجانب الآخر من غطاء الزجاج باستخدام قلم تحديد.

5. التصوير المجهري الضوئي

استعادة مضان
ملاحظة: يظهر سير العمل في الشكل 3A.
1. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتركيب (انظر جدول المواد) إلى القسم فائق النحافة على غطاء الزجاج. ضع غطاء زجاجا نظيفا جديدا على المخزن المؤقت للتركيب.
  ملاحظة: المكون الرئيسي للمخزن المؤقت المتصاعد هو DABCO ، والذي يستخدم لاستعادة مضان البروتينات الفلورية. هذا مهم جدا لاستعادة مضان.
2. ضع هذين الغطاء مع القسم فائق النحافة في غرفة التصوير (انظر جدول المواد). تأكد من أن غطاء الغطاء مع الحلقة المرسومة في الأعلى.
اجمع خريطة الملاحة.
1. ابحث عن القسم باستخدام الحلقة المرسومة كعلامة في وضع التصوير الساطع لمجهر مضان مقلوب (انظر جدول المواد). الانتقال إلى أحد أركان القسم. قم بتشغيل الضوء الأبيض والتقط صورة برايتفيلد.
2. أطفئ الضوء الأبيض. قم بتشغيل الليزر (561 نانومتر) والتقط صورا فلورية لنفس مجال الرؤية (FOV).
3. قم بإيقاف تشغيل الليزر. انتقل إلى FOV المجاور ، مع التأكد من تداخل هذين FOVs بنسبة 10٪. التقط صورة برايت فيلد وصورة الفلورسنت لمجال الرؤية الثاني.
4. كرر هذه العملية حتى يتم تغطية القسم بأكمله. سجل مسار التصوير الذي يمكن استخدامه لغرز مجال الرؤية.
  ملاحظة: للحصول على جودة أعلى للصورة ، نوصي باستخدام المجهر متحد البؤر.
خلايا الصورة ذات الأهمية.
1. استخدم خريطة التنقل لاستهداف الخلايا المهمة بسهولة. قم بتشغيل الليزر (561 نانومتر) والتقط 300 إطار من صور الفلورسنت للخلية المعنية. قم بإيقاف تشغيل الليزر.
2. قم بتشغيل الضوء الأبيض والتقط صورا متسلسلة من حقول الألوان (~ 100 إطار).
3. الانتقال إلى خلية اهتمام أخرى.

6. التحضير للتصوير EM

ملاحظة: يظهر سير العمل في الشكل 3B.

انقل القسم فائق النحافة إلى شبكة الفتحة.
1. ملء جرة زجاجية مع ddH₂O.
2. قم بإزالة أغطية الغطاء من الحجرة وافصل بين نظارتي الغطاء بملاقط. قم بتثبيت غطاء الزجاج الذي يوجد عليه القسم ، واغسل المخزن المؤقت المتصاعد ، وجفف الهواء.
3. سجل # حول القسم فائق النحافة باستخدام شفرة أحادية الجانب وقم بإسقاط 10 ميكرولتر من حمض الهيدروفلوريك بنسبة 12٪ (انظر جدول المواد) في كل ركن من أركان #. ضع الغطاء ببطء في الماء.
  ملاحظة: يتفاعل حمض الهيدروفلوريك مع الزجاج ، مما يسهل إزالة فيلم pioloform من زجاج الغطاء. حمض الهيدروفلوريك سام. استخدامه في غطاء كيميائي مع قفازات. ملامسة الجلد يتطلب عناية طبية فورية.
4. تطفو فيلم pioloform وقسم فائق النحافة على سطح الماء معا. ضع شبكة فتحة غير مطلية على القسم لالتقاط القسم في وسط الشبكة.
5. قم بتغطية شريحة زجاجية ببارافيلم (انظر جدول المواد) والتقط الشبكة باستخدام فيلم pioloform. جفف الشبكة بالهواء في درجة حرارة الغرفة.
قسم تلطيخ
1. قم بتلطيخ القسم بنسبة 2٪ UA والرصاص الثلاثي لساتو. لمزيد من التفاصيل ، راجع البروتوكول² المنشور مسبقا.

7. تحليل الصور

غرزة خريطة التنقل.
1. ابحث عن موقع البيانات الأولية. افتح البرنامج ImageJ (انظر جدول المواد) لربط خريطة التنقل.
2. انقر فوق الإضافات | خياطة | خياطة الشبكة / المجموعة | (النوع) الشبكة: ثعبان بعمود | (طلب) أعلى ويسار (وفقا لتسلسل التصوير) | ضبط حجم الشريحة | تحديد مسار البيانات | تعيين اسم الملف | تحقق من دمج الشاشة. لاحظ النتيجة ، وهي خريطة ملاحة تتكون من عدة صور برايتفيلد لمجالات رؤية مختلفة.
3. استخدم نفس الطريقة لغرز خريطة الملاحة الفلورية.
دمج صور برايت فيلد مع الصور الفلورية.
1. في البرنامج ImageJ ، انقر فوق ملف | استيراد | تسلسل الصور لاستيراد صور برايت فيلد المتسلسلة للخلية محل الاهتمام.
2. انقر على الصورة | مداخن | Z الإسقاط | مجموع الشرائح للحصول على صورة إسقاط كثافة المجموع (SIP) لصور برايت فيلد المتسلسلة.
3. انقر فوق تحرير | عكس لعكس صورة SIP للحقل الساطع بحيث تصبح إشارات جسيمات الذهب النانوية نقاطا بيضاء ساطعة.
4. في ImageJ ، انقر فوق ملف | استيراد | تسلسل الصور لاستيراد صور FM المتسلسلة.
5. انقر على الصورة | مداخن | Z الإسقاط | مجموع الشرائح للحصول على صورة SIP لصور FM المتسلسلة.
6. انقر على الصورة | اللون | دمج القنوات لدمج صورة SIP brightfield مع صورة SIP FM كصورة مركبة.
7. جسيمات الذهب النانوية خضراء ، والبروتين الفلوري أحمر. انقر على الصورة | النوع | RGB Color لتحويل تنسيق الصورة المركبة إلى RGB.

8. التصوير الكهرومغناطيسي

ضع الشبكة في تعليق العينة ، مع الحفاظ على جانب القسم من الشبكة لأعلى.
استخدم خريطة الملاحة لتحديد موضع الخلايا المقابلة تقريبا تحت المجهر الإلكتروني عبر أربع مسافات نسبية إلى الزوايا الأربع المختلفة لشبه المنحرف الأيمن للمقطع فائق النحافة.
تأكد من الخلايا باستخدام جسيمات الذهب النانوية.
التقط صور EM بتكبيرات مختلفة (4200x أو 6000x أو 8200x) باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) (انظر جدول المواد).

9. تسجيل صورة FM مع صورة EM

افتح برنامج التسجيل (انظر جدول المواد). اكتب easyCLEMv0¹⁴في نافذة البحث. انقر فوق easyCLEMv0 لفتح easyCLEMv0. انقر على الصورة / التسلسل | افتح لاستيراد صورة EM والصورة المركبة إلى لوحة البرنامج.
في نافذة EasyCLEMv0 ، انقر فوق 2D (x ، y ، [T]) لاختيار غير جامد (2D أو 3D) كوضع المحاذاة.
في نافذة EasyCLEMv0 ، انقر فوق المربع المنسدل الموجود على يمين تحديد الصورة التي سيتم تحويلها وتغيير حجمها (من المحتمل أن يكون FM) لاختيار مركب (RGB) color.tif. ثم ، انقر فوق المربع المنسدل الموجود على يمين تحديد الصورة التي لن يتم تعديلها (من المحتمل أن تكون EM) لاختيار EMimage. tif.
انقر فوق ابدأ لبدء التسجيل.
في نافذة صورة EM المسماة EMimage. tif ، انقر فوق جسيم نانوي ذهبي واحد لوضع النقطة 1 على جسيم الذهب النانوي. في نافذة صورة FM المسماة Composite (RGB) color.tif ، انقر فوق جسيم الذهب النانوي المقابل لوضع النقطة 1 على جسيم الذهب النانوي.
انقر فوق تحديث التحويل لتأكيد إشارة LM مع إشارة EM لجسيمات الذهب النانوية.
كرر العملية المذكورة أعلاه في نافذة صورة EM المسماة EMimage. tif وقم بمطابقة إشارة LM مع إشارة EM لنفس جسيم الذهب النانوي واحدا تلو الآخر.
انقر فوق إيقاف لإنهاء التسجيل.
بعد محاذاة الصورة ، انقر فوق الصورة المتراكبة وانقر فوق الصورة / التسلسل | حفظ باسم لتصدير حزمة صور تحتوي على أربع صور قنوات (أحمر، أخضر، أزرق، رمادي).
افتح ImageJ وانقر على ملف | فتح لاستيراد الصورة المتراكبة . انقر على الصورة | مداخن | رص إلى الصور لفصل الصورة المتراكبة إلى أربع صور قنوات.
انقر على الصورة | اللون | دمج القنوات لدمج الصور من ثلاث قنوات (الأحمر والأخضر والرمادي) في صورة مركبة.
انقر على الصورة | النوع | RGB Color لتحويل الصورة المركبة إلى صورة CLEM.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت التقارير السابقة أن mScarlet يمكن أن يستهدف الليزوزوم¹⁵. في هذا البروتوكول ، تم حقن AAV المعرب عن mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) في M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) من دماغ الفأر Vglut2-ires-cre باستخدام أدوات مجسمة. باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تظهر الصورة النهائية المرتبطة في الشكل 4 أ. يمكن محاذاة صورة FM بدقة مع صورة EM باستخدام جسيمات الذهب النانوية (النقاط الخضراء) كعلامات إيمانية. كما هو موضح في صورة EM (الشكل 4C ، F) ، استهدف mScarlet الليزوزوم ، والمحتويات الموجودة داخل الليزوزومات غير متجانسة ، وهي الخصائص النموذجية للليزوزوم الثانوي.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني. أ: تحضير دماغ الفأر. تم حقن الفيروسات المرتبطة بالغدي في دماغ الفأر. بعد 30 يوما ، تم تقطيع المناطق الفلورية لشرائح دماغ الفأر إلى كتل صغيرة لإعداد عينة EM. (ب) تحضير عينة EM. (ج) مقطع فائق النحافة باستخدام سكين ماسي والرسم التخطيطي لزجاج الغطاء. د: التصوير FM والتصوير TEM. الاختصارات: EM = المجهر الإلكتروني. FM = المجهر الفلوري ؛ TEM = المجهر الإلكتروني النافذ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: طلاء النظارات بجسيمات الذهب النانوية. (أ) تغطية الغطاء الزجاجي بالبيوتوفورم بالطرد المركزي. (ب) احتضان سطح الغطاء الزجاجي باستخدام بولي-إل-ليسين. (ج) احتضان سطح الغطاء الزجاجي بجسيمات الذهب النانوية المخففة. (د) رسم تخطيطي للغطاء المطلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الجدول الزمني للتحضيرات للتصوير FM والتصوير الكهرومغناطيسي. (أ) يتكون سير عمل الاستعدادات لتصوير FM من خمس خطوات: (i) غرف القسم فائق النحافة ، (ii) التجفيف بالهواء ، (iii) وضع غطاء زجاجي ثان بعد إضافة المخزن المؤقت ، (iv) تثبيت كل من أغطية النظارات في الغرفة ، وتصوير FM. (ب) يتكون سير عمل الاستعدادات للتصوير الكهرومغناطيسي أيضا من خمس خطوات: (i) فصل نظارتي الغطاء ، (ii) تعويم القسم فائق النحافة ، (iii) جرف القسم فائق النحافة ، (iv) تحريك القسم فائق النحافة على شبكة الفتحة ، و (v) التصوير الكهرومغناطيسي. الاختصارات: EM = المجهر الإلكتروني. FM = المجهر الفلوري ؛ TEM = المجهر الإلكتروني النافذ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: صورة CLEM التمثيلية للميقرزي. أ: صورة CLEM للخلية العصبية بأكملها. (ب، ه) صور CLEM للأقحم. (ج، و) صور EM للأقحم. (د، ز) الصور الفلورية للأقحم. تشير النقاط الخضراء إلى جسيمات الذهب النانوية. شريط المقياس = 5 ميكرومتر (A) ، 1 ميكرومتر (الصور الداخلية). الاختصارات: EM = المجهر الإلكتروني. FM = المجهر الفلوري ؛ CLEM = الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المقدم هنا هو طريقة تصوير متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات توطين البروتين المستهدف من المجهر الضوئي (LM) والسياق المحيط بالبروتين المستهدف من المجهر الإلكتروني (EM) ⁶. مع قيود البروتينات الفلورية الحالية ، فإن الطريقة المستخدمة على نطاق واسع هي التضمين المسبق للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) ، مما يعني أن التصوير LM يتم قبل تحضير عينة EM. يمكن فحص جميع البروتينات الفلورية الموجودة تقريبا في CLEM قبل التضمين. ومع ذلك ، بسبب التشوهات والانكماشات التي لا مفر منها ، فإن المحاذاة الدقيقة للصورة النهائية مستحيلة⁶. لذلك ، فإن المعلومات المقدمة من خلال التضمين المسبق CLEM هي التحقق من البنى التحتية لنفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة LM في التصوير الكهرومغناطيسي.

الطريقة التي توفرها هذه الدراسة هي CLEM بعد التضمين ، حيث يتم إجراء التصوير LM بعد تحضير عينة EM. لا يؤثر الانكماش الناجم عن التثبيت الكيميائي في تحضير عينة EM على المحاذاة الدقيقة للصورة النهائية. علاوة على ذلك ، نظرا لأن كلا من التصوير LM والتصوير EM يتم إجراؤهما في نفس القسم وبمساعدة جسيمات الذهب النانوية ، يمكن أن تكون محاذاة الصورة النهائية دقيقة للغاية. يتطلب CLEM بعد التضمين أن تحتفظ البروتينات الفلورية بإشارة الفلورسنت بعد تحضير عينة EM التقليدية. في السابق ، أبلغنا عن أول بروتين فلوري يسمى mEosEM ، والذي يمكنه الاحتفاظ بإشارات الفلورسنت باستخدام Epon كراتنج^{مضمن 8}. بالمقارنة مع الراتنجات الأخرى مثل راتنجات التضمين ، تتمتع Epon بخصائص فائقة للحفاظ على البنية التحتية وتقسيمها. بعد mEosEM ، تم الإبلاغ عن بروتينات فلورية أخرى مقاومة لتضمين Epon، مثل mKate2^11,16 و mCherry2^10,17 و mWasabi^10,18 و CoGFPv0^10,19 و mEosEM-E⁸ و mScarlet ^8,20 و mScarlet-I ^8,20 و mScarlet-H ^8,20 و HfYFP⁹.

وفقا لتجربتنا ، يتفوق mScarlet على البروتينات الفلورية الأخرى. يمكن أن يؤثر المحلول المثبت على مضان البروتينات الفلورية. بشكل عام ، تكون سرعة تثبيت بارافورمالدهيد (PFA) أبطأ بكثير من سرعة الجلوتارالدهيد (GA) ؛ على العكس من ذلك ، يخترق PFA العينة بسرعة أكبر من GA الأكبر. يوفر مزيج من PFA و GA توازنا بين تثبيت العينة بسرعة كافية بحيث يتم الحفاظ على جودتها ولكن ببطء كاف بحيث لا يحدث تلف العينة مثل الأكسدة. سيؤدي تركيز GA العالي إلى زيادة التألق الذاتي. من تجربتنا ، يمكن اكتشاف مضان mScarlet في كتلة الراتنج بعد 6 أشهر من البلمرة. لكننا نوصي بإجراء تصوير CLEM مباشرة بعد البلمرة.

عامل رئيسي آخر في تضمين CLEM هو كيفية تسجيل صورة LM مع صورة EM بدقة. استنادا إلى الطرق⁶^،²¹ التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، أجرينا بعض التعديلات على البروتوكول. الأول هو كيفية العثور على نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة LM في التصوير الكهرومغناطيسي. أخذنا FOVs مختلفة لغرز خريطة الملاحة للقسم فائق النحافة بالكامل باستخدام DIC ووضع التصوير الفلوري. باستخدام خريطة التنقل ، يمكن تحديد الخلايا ذات الأهمية بسهولة. تحسين آخر هو محاذاة الصورة بدقة. في السابق ، استخدمنا إشارة الفلورسنت في وضع التصوير الفلوري وإشارة تباين الإلكترون العالية في وضع التصوير الكهرومغناطيسي لجسيمات الذهب النانوية كعلامات محاذاة إيمانية⁶. ومع ذلك ، عند استخدام mScarlet ، كانت إشارة الفلورسنت ل mScarlet أعلى بكثير من إشارة الفلورسنت لجسيمات الذهب النانوية وكان من الصعب اكتشاف إشارة الفلورسنت لجسيمات الذهب النانوية. لحل هذه المشكلة ، استخدمنا إشارة برايت فيلد لجسيمات الذهب النانوية للتسجيل بدلا من إشارة الفلورسنت. باتباع هذا البروتوكول المعدل ، كان من السهل إجراء CLEM بعد التضمين.

ومع ذلك ، هناك بعض القيود على البروتوكول الحالي ، والتي يجب أخذها في الاعتبار قبل استخدامه. على الرغم من أنه يعمل بشكل جيد في نظام التعبير المفرط ، إلا أن التألق يكون باهتا تماما إذا كانت البروتينات المستهدفة تحت مروجها الأصلي²². هناك قيد آخر وهو أنه على الرغم من أن mScarlet هو أفضل بروتين فلوري (وفقا لتجربتنا) يمكنه الاحتفاظ بإشارات مضان كافية بعد تحضير عينة EM ويعمل بشكل جيد في خلايا الثدييات ، إلا أنه سيكون مشكلة عند استخدام mScarlet كعلامة فلورية في الخلايا العصبية ، مما قد يؤدي إلى الموقع الخاطئ للبروتينات المستهدفة¹⁵. في هذه الحالات ، نقترح استخدام oScarlet¹⁵ ، وهي طفرة في mScarlet ، والتي تعمل بشكل جيد في الخلايا العصبية.

يمكن تقسيم التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول المعدل إلى فئتين. الأول هو تكبير المستوى دون الخلوي ، مما يعني دراسة البروتين المستهدف في السياق دون الخلوي. في تقاريرنا المنشورة سابقا ، استخدمنا CLEM بعد التضمين لفحص تكوين مقصورات تجميع virion السيتوبلازمية (cVACs) أثناء الإصابة بفيروس الهربس γ²³. في التطبيقات المستقبلية ، يمكن دمج CLEM بعد التضمين مع التصوير المقطعي الإلكتروني للحصول على توزيع ثلاثي الأبعاد للبروتينات المستهدفة وحل بنية 3D أصلا²⁴. النوع الثاني من التطبيقات المحتملة هو التصغير إلى المستوى الخلوي ، والذي يمكن استخدامه لرسم وتحليل الدوائر العصبية. نظرا لقدرته عالية الدقة ، أصبح EM وسيلة فعالة لرسم خرائط اتصالات الدماغ الدقيقة. ومع ذلك ، لا يمكن ل EM توفير هويات الخلايا العصبية بدقة ، مما يحد من التحليل المتعمق للدائرة العصبية. لدى Epon بعد التضمين CLEM القدرة على جلب هويات الخلايا العصبية إلى الدائرة العصبية دون المساس بالبنى الفائقة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32201235 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (2022J01287 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في جامعة فوجيان الطبية ، الصين (XRCZX2021013 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم المالية الخاصة بمقاطعة فوجيان ، الصين (22SCZZX002 إلى Zhifei Fu) ، تأسيس مختبر NHC الرئيسي للتقييم الفني لتنظيم الخصوبة للرئيسيات غير البشرية ، ومستشفى فوجيان لصحة الأمومة والطفل (2022-NHP-04 إلى Zhifei Fu). نشكر Linying Zhou و Minxia Wu و Xi Lin و Yan Hu في مركز خدمة التكنولوجيا العامة بجامعة فوجيان الطبية على الدعم في إعداد عينات EM والتصوير الكهرومغناطيسي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.2 م عازلة الفوسفات (PB) NaH2PO			sub>4 < / sub > middot ؛ 2H2O + Na _{2< / sub>HPO_{4 < / sub> middot ؛ 12H _{2< / sub>O}}}
0.2 M Tris-Cl (درجة الحموضة 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25٪ Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	مادة كيميائية خطرة
Abbelight 3D	Nanolnsights
الأسيتون	SCR	10000418
هيدروكسيد الأمونيوم	J& K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
تنظيف المخزن المؤقت لزجاج			50 مل هيدروكسيد الأمونيوم ، 50 مل بيروكسيد الهيدروجين ، 250 مل H_{2< / sub>O}
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO & nbsp ؛	شركة Sigma	290734	المواد الكيميائية الخطرة
DDSA	SPI	GS02827	المركزي السطحية الكيميائية الخطرة
	WIGGENS	MINICEN 10E
سكين الماس	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI GS02823		الحمض النووي الكيميائي الخطير
	Thermo Fisher ؛	2696953	Lipofectamine 3000 طقم تعداء
Epon 812 & nbsp ؛	شركة SPI	GS02659	مادة كيميائية خطرة
للإيثانول	SCR	10009218
صورة فيجي J	المعاهد الوطنية للحل المثبت الصحي
			4٪ PFA + 0.25٪ GA + 0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
الجسيمات النانوية الذهبية	الجسدية	790120-010
راتنج			الأسيتون إلى الراتنج 3: 1 ، 1: 1 ، 1: 3
حمض الهيدروفلوريك	SCR	10011118
بيروكسيد	الهيدروجينSCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) Easy			CLEMv0 Plugin
Imaging	Chamber Thermo Fisher ؛	A7816
كبسولات الجيلاتين الكبيرة	علوم المجهر الإلكتروني	70117
عازلة			Mowiol 4-88 ، الجلسرين ، 0.2 M Tris-Cl (درجة الحموضة 8.5) ، DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO_{4< / sub> ž12H2O}	SCR	10020318
NaH2PO₄ ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI	GS02828	كيميائية خطرة
	تاكارا للتكنولوجيا الطبية الحيوية (بكين)		تم استخدام ثلاثة بادئات قليلة النوكليوتيدات للكشف عن Vglut2-ires-Cre والنوع البري في وقت واحد. تهدف الاشعال 5^{، < / sup>-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3^{، < / sup> و 5^{، < / sup>-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^{، < / sup> إلى اكتشاف Vglut2-ires-Cre. الاشعال 5^{،< / sup>-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^{,< / sup> و 5^{,< / sup>-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3^{,< / sup> يهدف إلى الكشف عن النوع البري.}}}}}}}}
تذبذب ميكروتوم	Leica	VT1000S
أوزميوم رابع أكسيد	SCR	L01210302	مادة كيميائية خطرة
OsO_{4< / sub> محلول}			1٪ رابع أكسيد الأوزميوم + 1.5٪ K _{4< / sub>Fe (CN) _{6< / sub>& middot ؛ 3H₂O}}
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	محلول نضح
			4٪ PFA + 0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	مادة كيميائية
خطرة Poly-L-lysine	سيجما	25986-63-0
فيروسيانيد البوتاسيوم (K₄Fe (CN)₆· 3H₂O)	SCR	10016818
شفرات مشرط	Merck	S2771
مقابض مشرط	Merck	S2896-1EA
مجهر مجسم	OLYMPUS	MVX10
الفئران المعدلة وراثيا	المختبرية		جاكسون Vglut2-ires-Cre (السلالة: 129S6 / SvEvTac) في ظروف قياسية (25 درجة ؛ C ، دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة ، مع إعطاء الماء والطعام المجاني. تم استخدام الفئران من الذكور والإناث في 2 & - - - 3 أشهر ، نطاق الوزن 20-30 جم ؛
مجهر إلكتروني ناقل الحركة (TEM) FEI			TECNAL G2
UA محلول UA (2٪ UA) محلول			مائي
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
أسيتات يورانيل (UA)	TED PELLA	19481	مادة كيميائية خطرة

< الغطاء أجهزة الطرد كاشف تعداء التدرج التركيب شركة مواد أولية أوليغونوكليوتيدات كيميائي خطير تم إيواء الفئران

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583(2015).
Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077(2022).
Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871(2020).
Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314(2020).
MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246(2023).
Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24(2023).
Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257(2017).
Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741(2008).
Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17(2023).
Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Correlative Light Microscopy Electron Microscopy Epon Embedding Fluorescence Preservation Sample Preparation Mouse Brain Tissue Ultra Thin Section Image Registration Gold Nanoparticles Fluorescence Imaging

Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة