يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى

1.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66212

⸱

مايو 17, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج فأر لحقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) - نقل الأجنة (ET) ، مما يسمح لنا بمراقبة التغيرات المرتبطة بالعمر في استقلاب الجلوكوز والتي قد تعزى إلى الحقن المجهري ، مما يوفر رؤى حول آثاره المحتملة طويلة المدى على التنمية البشرية.

الملخص

عمر الإنسان طويل إلى حد كبير ، في حين أن نماذج الفئران يمكن أن تحاكي عمر الإنسان بأكمله في فترة قصيرة نسبيا ، مع سنة واحدة من عمر الفأر تعادل تقريبا 40 سنة بشرية. حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) هو تقنية مساعدة على الإنجاب شائعة الاستخدام في الممارسة السريرية. ومع ذلك ، نظرا لظهورها الحديث نسبيا منذ حوالي 30 عاما ، فإن الآثار طويلة المدى لهذه التقنية على التنمية البشرية لا تزال غير واضحة. في هذه الدراسة ، أنشأنا الحقن المجهري جنبا إلى جنب مع طريقة نقل الأجنة (ET) باستخدام نموذج الفأر. أظهرت النتائج أن المنوية الطبيعية للفئران ، بعد الخضوع للزراعة في المختبر والحقن المجهري اللاحق ، أظهرت معدل إخصاب 89.57٪ ومعدل خليتين 87.38٪. بعد ET ، كان معدل ولادة النسل حوالي 42.50٪. علاوة على ذلك ، مع تقدم الفئران في العمر ، لوحظت تقلبات في مستويات استقلاب الجلوكوز ، والتي قد تكون مرتبطة بتطبيق تقنية الحقن المجهري. تشير هذه النتائج إلى أن تقنية الحقن المجهري للفأر توفر منصة قيمة لتقييم تأثير تشوهات المنوية على نمو الأجنة وآثارها طويلة المدى على صحة النسل ، لا سيما فيما يتعلق باستقلاب الجلوكوز. توفر هذه الدراسة رؤى مهمة لمزيد من البحث حول الآثار المحتملة لتقنية الحقن المجهري على التنمية البشرية ، مع التأكيد على ضرورة إجراء تحقيق متعمق في الآثار طويلة المدى لهذه التكنولوجيا.

المقدمة

برزت قضايا الخصوبة كمحور رئيسي للقلق الطبي والاجتماعي ، خاصة في المجتمع الحديث حيث برزت معدلات الخصوبة المنخفضة وزيادة شدة انتشار العقم وشدته. توفر تقنية المساعدة على الإنجاب (ART) مجموعة واسعة من الاحتمالات لمواجهة هذه التحديات ، مع استخدام حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) بشكل شائع كتدخل علاجي.

منذ أن أبلغت باليرمو عن أول حمل ناجح تم تحقيقه من خلال حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) في عام 1992 ، أصبح الحقن المجهري أسلوبا محوريا في تقنيات المساعدة على الإنجاب (ART) 1. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن الحقن المجهري قد تم استخدامه في البيئات السريرية لمدة 30 عاما فقط ، وهي فترة قصيرة نسبيا مقارنة بعمر الإنسان ، فإن الآثار طويلة المدى للحقن المجهري ، خاصة على نمو النسل ، لم يتم التحقيق فيها وتوضيحها على نطاق واسع. في الوقت الحاضر ، ظهرت الفئران التي تتميز بخلفيتها الجينية الموحدة وعمرها الأقصر كنموذج بديل يستخدم على نطاق واسع في البحث الطبي. علاوة على ذلك ، يمكن لنموذج الفأر تلخيص العمر الافتراضي للإنسان بالكامل ضمن إطار زمني مضغوط ، حيث تتوافق سنة واحدة في الفئران تقريبا مع 40 عاما في البشر2.

على مدى العقد الماضي ، أفادت العديد من الدراسات الصغيرة أن الأفراد الذين تم تصورهم من خلال الحقن المجهري قد يكونون أكثر عرضة للإصابة بمتلازمات التمثيل الغذائي ، مثل مستويات السكر في الدم غير الطبيعية ، في وقت لاحق من الحياة3،4. على الرغم من أن الأدلة ليست نهائية ، إلا أن هذه النتيجة أثارت مخاوف جدية داخل المجتمع العلمي فيما يتعلق بالآثار الصحية طويلة المدى للحقن المجهري. ويؤكد هذا الوضع الحاجة الملحة إلى إجراء تقييمات أكثر صرامة للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية وعواقبه الصحية طويلة الأجل. في ضوء القيود والاعتبارات الأخلاقية للدراسات البشرية على وجه الخصوص ، أصبح تطوير نماذج حيوانية يمكنها تلخيص تطور النسل البشري بدقة بعد الحقن المجهري أمرا بالغ الأهمية. في هذا السياق ، أصبح نموذج حقن المنوية داخل الهيولى (Intracytoplasmic Sperm Transfer-Embryo Transfer) ، نظرا لقدرته على تقليد الحقن المجهري البشري وتسهيل المراقبة طويلة الأجل للنتائج الصحية للنسل ، أداة فعالة لتقييم المخاطر الصحية المحتملة لتقنية الحقن المجهري على النسل5.

تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في تأثير تقنية الحقن المجهري على النمط الظاهري الأيضي السائد ، وهو صحة التمثيل الغذائي للجلوكوز في النسل ، من خلال استخدام المراقبة العشوائية لجلوكوز الدم ، واختبار جلوكوز الدم الصائم ، واختبارات تحمل الجلوكوز لتقييم حالة التمثيل الغذائي للجلوكوز للفئران. يتم استخدام المراقبة العشوائية لنسبة الجلوكوز في الدم لالتقاط التقلبات الطبيعية في استقلاب الجلوكوز أثناء الأنشطة الفسيولوجية الطبيعية ، بينما يتم استخدام اختبارات تحمل الجلوكوز في الدم أثناء الصيام لتقييم حالات ما قبل السكري المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتبع بروتوكول الحقن المجهري الملقح بالذكاء الاصطناعي الموضح أدناه المبادئ التوجيهية وقد تمت الموافقة عليه من قبل المراجعة الأخلاقية للحيوان التابع لمعهد شنغهاي لأبحاث تنظيم الأسرة. إجراءات السلامة: ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع المواد الكيميائية أو المواد البيولوجية. استخدام الشفاطات: قم بتنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على مواد كيميائية متطايرة أو توليد الهباء الجوي داخل غطاء دخان معتمد أو خزانة سلامة حيوية. استخدم إناث الفئران (سلالة B6D2F1 التي يبلغ عمرها 6-8 أسابيع) لإجراء الإباضة الزائدة.

1. الحقن المجهري في الفئران

  1. الإباضة الفائقة للفئران
    1. تطبيق حقنة داخل الصفاق من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) بجرعة 7.5 وحدة دولية لكل فأر في حوالي الساعة 20:00 من اليوم الأول.
    2. يجب إعطاء حقنة داخل الصفاق من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) بجرعة 7.5 وحدة دولية لكل فأر في حوالي الساعة 20:00 (48 ساعة بعد حقن PMSG) في اليوم الثالث.
  2. قم بإعداد وسط HTF في 1 مل من الحصص واتركها مكشوفة للتوازن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ في نفس يوم حقن قوات حرس السواحل الهايتية في إناث الفئران.
  3. تحضير قطرات الإخصاب بالحقن المجهري
    1. في نفس يوم حقن قوات حرس السواحل الهايتية في إناث الفئران ، قسم غطاء طبق ثقافة الخلايا مقاس 50 × 9 مم إلى نصفين علويين وسفلين. استخدم النصف العلوي لإنشاء 4-6 قطرات سعة 5 ميكرولتر لكل منها ، باستخدام 10٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP) لوضع المنوية. استخدم النصف السفلي لإنشاء 8-10 قطرات سعة كل منها 5 ميكرولتر ، باستخدام وسط M2 لإجراء الحقن المجهري.
    2. قم بتغطية القطرات المتوسطة PVP و M2 بحوالي 3 مل من الزيت المعدني (الشكل 1).
  4. تحضير أطباق الثقافة
    1. في نفس يوم حقن هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية في إناث الفئران، قم بتوزيع 12 قطرة من وسط KSOM (MR-020P-D) بحجم 20 ميكرولتر بالتساوي في طبق زراعة الخلايا مقاس 35 × 10 مم. غطي القطرات بحوالي 3 مل من الزيت المعدني.
  5. حصاد المنوية:
    1. القتل الرحيم للفئران الذكور عن طريق خلع عنق الرحم في حوالي الساعة 9:00 صباحا في اليوم الرابع (13 ساعة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية).
    2. اعزل ذيلية البربخ وتنظيفها جيدا للتخلص من أي أنسجة دهنية وبقايا دم عن طريق النشاف برفق بشاش معقم والشطف في وسط HTF دافئ مسبقا.
    3. اقطع البربخ الذيل للسماح للحيوانات المنوية بالسباحة بحرية في وسط HTF. اضغط برفق على الذيل باستخدام ملقط لتحرير المنوية ، واجمعها في أنابيب HTF متوازنة مسبقا ، واحتفظ بها مكشوفة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لسعة المنوية لمزيد من الاستخدام.
  6. استرجاع البويضات
    1. تحفيز إناث الفئران الرحيم لاسترجاع البويضات عن طريق خلع عنق الرحم في حوالي الساعة 9:30 صباحا في اليوم الرابع. قم بعمل شق بعناية على طول خط الوسط لجلد البطن وطبقة العضلات لفضح تجويف البطن.
    2. استخدم ملقطا دقيقا لعزل الأنسجة برفق من جانبي قنوات البيض ، وخاصة مناطق الأمبولة المنتفخة ، ونقلها إلى وسط M2 في طبق مزرعة معقم. كرر هذا الإجراء حتى يتم جمع قنوات البيض من جميع الفئران المحددة.
    3. تحت مجهر تشريح ، استخدم إبرة حقنة سعة 1 مل لثقب الجزء الشفاف من الأمبولة المتورمة لقناة البيض برفق ، مما يسهل إطلاق مجمعات البويضات الركامية (COCs) في الوسط.
    4. باستخدام نفس المحقنة ، اختر COCs وانقلها بعناية إلى طبق جديد يحتوي على 100 ميكرولتر من وسط M2 الطازج. كرر هذه الخطوة حتى يتم نقل جميع COCs بنجاح من أجزاء قناة البيض الأصلية.
    5. امسح سوائل الدم والأنسجة ، وتحت المجهر التشريحي ، قم بتمزيق أمبولة قناة البيض باستخدام إبرة 25 جم ، مما يؤدي إلى إطلاق العديد من COCs.
    6. قم بإزالة قناة البيض وشظايا الأنسجة ، وانقل COCs إلى قطرات من وسط M2 يحتوي على الهيالورونيداز (HY) ، وقم بتسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
    7. بعد الحضانة لمدة 5 دقائق تقريبا ، قم بإجراء ماصة لطيفة لتسهيل فصل الخلايا الركامية والبويضات. نقل الطور الثاني (MII) البويضات من المحلول المحتوي على HY إلى وسط M2 الطازج ؛ ثم قم بإجراء النقل المتسلسل إلى قطرات متعددة من وسط M2.
    8. بعد 2-3 جولات من الغسيل ، انقل البويضات إلى قطرات من وسط استزراع KSOM واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمزيد من الاستخدام.
  7. حوالي الساعة 10:00 صباحا في اليوم الرابع ، صوتنة 100 ميكرولتر من المنوية السعوية (انظر الخطوة 1.5.2.) لمدة 5 ثوان لفصل الرؤوس عن الذيل بتردد 46 كيلو هرتز ، مع إعداد طاقة يبلغ 50 واط.
    ملاحظة: عند صوتنة المنوية لاقتطاع الذيل ، كن حذرا للتحكم في الوقت ، والذي يجب ألا يتجاوز 5 ثوان. بعد ثوان قليلة من صوتنة ، يمكن ملاحظة المنوية تحت المجهر المقلوب. توقف عن صوتنة عندما يظهر ما يقرب من نصف المنوية ذيول مقطوعة.
  8. إجراء الحقن المجهري
    1. استخدم إبرة معالجة دقيقة متوفرة تجاريا بطرف مسطح وقطر داخلي يبلغ 6 ميكرومتر، مثبتة بزاوية 25 درجة، للحقن. املأ الإبرة بسائل التشغيل بالجزء المملوء بطول 0.5 سم داخل الإبرة. تأكد من أن مستوى السائل يصل إلى ~ 0.5 سم.
      ملاحظة: حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 19 درجة مئوية أثناء الحقن لتجنب درجات الحرارة المرتفعة التي قد تقلل من معدل بقاء البويضات المخصبة. تعد الدقة في ضمان وصول مستوى السائل إلى 0.5 سم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة عملية الحقن وضمان بقاء البويضات.
    2. قم بتثبيت إبرة الحقن على الذراع الأيمن للمناور الدقيق ، ويتم تثبيتها بإحكام عن طريق شد غطاء الإمساك. قم بتركيب ماصة تثبيت معالجة دقيقة ذات رؤوس مسطحة متوفرة تجاريا ومصممة لبويضات الفأر على الذراع الأيسر للمعالج المجهري، ووضع إبرة الحقن والماصة المثبتة في مجال رؤية المجهر.
    3. أضف 1 ميكرولتر من المنوية الصوتية إلى قطرة من محلول PVP باستخدام ماصة.
    4. ضع 20 بويضة MII في قطرة من وسط M2.
    5. استخدم إبرة الحقن لشفط 10-20 رأس منوي في محلول PVP. ثم حرك إبرة الحقن إلى القطرة التي تحتوي على البويضات.
    6. حدد مباشرة موضع مغزل الطور داخل البويضة تحت مجهر الاستقطاب للتأكد من أن جهاز المغزل ليس على جانب الحقن ، حيث يقع الجسم القطبي عادة إما في موضع الساعة 12 أو الساعة 6 بالنسبة لاتجاه البويضة.
    7. حافظ على البويضة على اتصال بقاع طبق الاستزراع. اضبط المستوى البؤري بحيث تكون المنطقة الشفافة للبويضة وإبرة الحقن في نفس المستوى.
    8. عند ملامسة إبرة الحقن مع المنطقة الشفافة ، قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف على إبرة الحقن ، مما يؤدي إلى سحب جزء من المنطقة الشفافة.
    9. قم بتنشيط نبضات بيزو في وقت واحد بإعداد شدة 5 وتردد 1 ، مما يؤدي بشكل فعال إلى إنشاء ثقب في المنطقة الشفافة والسماح لإبرة الحقن بالمرور.
    10. ادفع إبرة الحقن إلى مساحة perivitelline ، وادفع رأس المنوية إلى طرف الإبرة. أدخل إبرة الحقن في البويضة حتى تصل إلى الجانب الآخر من المنطقة الشفافة.
    11. استخدم نبضات بيزو مضبوطة على شدة 1 وتردد 1 لإنشاء مسام صغيرة في غشاء البلازما ، مما يضمن حقن رأس المنوية في الأوبلازم مع الحد الأدنى من دخول PVP والحفاظ الأمثل على سلامة البويضة.
    12. كرر الخطوة 1.8.11 حتى يتم حقن جميع البويضات ال 20 ، متبوعة بحضانة لمدة 15 دقيقة عند 19 درجة مئوية.
    13. انقل البويضات الباقية إلى وسط KSOM وضعها في الحاضنة. راقب معدلات تكوين الخلايا 2 ، 4 الخلايا ، المورولا ، والكيسة الأريمية.
      ملاحظة: يجب التحكم في توقيت حقن المنوية المفردة داخل الهيولى (ICSI) في البويضة ، بهدف إكمال الإجراء في غضون 14-18 ساعة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية.

2. زرع الرحم من الأكياس الأريمية في الفئران

  1. تحضير الفئران الذكور الدافقة
    ملاحظة: استخدم ذكور ICR الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع للدراسة.
    1. تحفيز التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ 2،2،2-ثلاثي البروم الإيثانول بجرعة 0.2 مل / 10 جم من وزن الجسم. يشير عدم وجود أي استجابة للألم إلى التخدير الناجح.
      ملاحظة: في حين أن البروتوكول الحالي لا يتضمن تطبيق مرهم بيطري على عيون المخدرة ، إلا أنه يوصى به كأفضل ممارسة لمنع جفاف العين وضمان صحة وراحتها أثناء الإجراءات. طوال عملية الجراحة والتعافي ، تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام ، وتم تحضير المنطقة الجراحية باستخدام محاليل مطهرة لضمان بيئة تشغيل نظيفة.
    2. للحماية من الإجهاد أو الإصابة المحتملة ، قم بإيواء الفئران التي خضعت لعملية جراحية بشكل فردي خلال مرحلة التعافي الأولية.
    3. تطبيق البوبرينورفين بجرعة 0.05 ملغ/كغ من وزن الجسم لضمان تخفيف الألم الأمثل.
      ملاحظة: لضمان رفاهية الفئران ، راقب الفئران عن كثب خلال فترة التعافي ولا تتركها دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
    4. تحضير موقع الجراحة في منطقة أسفل البطن ، متفوقة على الخصيتين. قم بإزالة الفراء وتطهيره باستخدام بوفيدون اليود. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق طولي بطول 1 سم على طول الخط ألبا. قم بإزالة أي دم برفق باستخدام ورق معقم وخالي من الغبار واستمر في تشريح عضلات البطن بصراحة على طول خط ألبا والوصول إلى تجويف البطن.
    5. باستخدام ملقط منحني ، أمسك الخصية اليسرى ووسادة الدهون المرتبطة بها برفق وفضحها. حدد الأسهر وعزلها بعناية باستخدام ملقط مدبب ، مما يؤدي إلى إنشاء جزء 10 مم للتلاعب.
    6. عقم الملقط المنحني عن طريق تثبيتها في اللهب الخارجي لمصباح الكحول لعدة ثوان. أمسك الأسهر برفق ، مما يتسبب في تسويته وتبييضه بسبب الكي. قم بإنشاء نقطة كي ثانية 3-5 مم بعيدة عن الأولى. باستخدام مقص جراحي معقم ، قم باستئصال جزء الأسهر بين نقطتي الكي.
    7. افحص بعناية الأطراف المقوية للأسرية ، مع التأكد من بقاء جزء قصير ومسطح ومبيض. باستخدام ملقط منحني ، أعد الخصية ووسادة الدهون المرتبطة بها برفق إلى تجويف البطن.
    8. كرر الإجراء الموضح في الخطوة 2.1.6 على الجانب المقابل (الأيمن).
    9. أغلق موقع الجراحة باستخدام الغرز ، وعادة ما تضع غرزة واحدة في طبقة العضلات وثلاث غرز في الجلد. تأكد من المحاذاة المناسبة للشق الجراحي وتطهيره ببوفيدون اليود. انقل إلى وسادة تدفئة للمراقبة ، وراقب لمدة 10-15 دقيقة حتى يستعيد وعيه. بمجرد التعافي ، أعد إلى قفص السكن الخاص به.
      ملاحظة: بعد جراحة قطع القناة الدافقة ، تحتاج الفئران إلى فترة نقاهة مدتها 14 يوما ، تليها تجربة تزاوج تجريبية لمدة أسبوع واحد.
    10. خلال هذا الأسبوع ، قم بتزاوج الذكور الدافقة مع الإناث باستمرار وراقب حالة الحمل لجميع الإناث اللواتي يظهرن مع سدادات جماعية. يشار إلى التزاوج الناجح من خلال وجود سدادة مهبلية ممتلئة اللون بيضاء مصفرة عند فتحة المهبل للفأر الأنثوي.
      1. قم بإقران الفئران بين الساعة 4:00 مساء و 6:00 مساء في اليوم الأول وتحقق من السدادات المهبلية بين الساعة 7:00 صباحا و 9:00 صباحا في اليوم الثاني. ضع في اعتبارك أن الإناث اللواتي لديهن سدادات مهبلية في حالة حمل كاذب في عمر 0.5 يوم واستخدمهن في تجارب نقل الأجنة اللاحقة. إعادة الإناث بدون سدادات مهبلية إلى المجموعة المتلقية.
        ملاحظة: يمكن الاستمرار في استخدام هذه الإناث بدون سدادات مهبلية للتزاوج لتحضير الإناث الحوامل الزائفة. تأكد من أن جميع الإناث المسدودات لا يصبحن حوامل ؛ عندها فقط يمكن استخدام الذكور الدافقة في التجارب الرسمية.
      2. بينما يمكن للذكور الدافقة أن تتزاوج يوميا ، اترك يوما واحدا من الراحة بين جلسات التزاوج.
        ملاحظة: بناء على تجربتنا ، يمكن للذكور الذين تم تقطيع القناة الدافقة الحفاظ على معدل سدادات جماعية مرتفع لأكثر من عام. ومع ذلك ، يجب إزالة الذكور الذين تم تقطيع القناة الدافقة الذين يفشلون في إنتاج سدادات جماعية في إناث التزاوج لمدة 4-6 محاولات متتالية من الدراسة.
  2. تحضير الإناث الحوامل الزائفة
    1. قم بتوليد إناث الفئران الحوامل الزائفة عن طريق تزاوج إناث الفئران ICR (التي تتراوح أعمارها بين 7-10 أسابيع ، ووزنها أكثر من 25 جم) مع الفئران الذكور الدافقة (3-6 أشهر من العمر) بنسبة 1: 1.
      ملاحظة: تم استخدام الذكور الدافقة الدافقة لتحفيز عنق الرحم من إناث الفئران ، مما أدى إلى تنشيط الجسم الأصفار.
  3. تحضير الماصة لنقل الأكياس الأريمية
    1. خذ الأجنة المراد زرعها من الحاضنة وانقلها إلى قطرة من وسط M2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    2. استخدم ماصة نقل لشفط كمية صغيرة من السائل ، وسحب كمية صغيرة من الهواء ، وشفط 6-10 أجنة. أخيرا ، استنشق كمية صغيرة أخرى من الهواء لإغلاق الماصة.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز طول السائل في ماصة النقل 0.5 سم.
  4. زرع الرحم (الكيسات الأريمية)
    1. قم بوزن إناث الفئران الحوامل الزائفة (بعد 2.5 يوم من التزاوج) وتخديرها عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ 2،2،2-ثلاثي البروم إيثانول بجرعة 0.2 مل / 10 جم من وزن الجسم. اضغط برفق على الأذن باستخدام ملقط.
    2. بعد إعطاء التخدير للفئران والتأكد من التعقيم من خلال تطهير الكحول ، قم بعمل شق طولي في خط الوسط على البطن البطني. الاستفادة من الأنسجة الرخوة تحت الجلد ، قم بتحويل الشق إلى الجانب الأيسر أو الأيمن كما هو مطلوب للزرع. استخدم مقصا صغيرا لإجراء تشريح حاد لطبقة عضلة جدار البطن عند ~ 0.5 سم جانبيا للعمود الفقري القطني للوصول إلى التجويف البريتوني.
    3. باستخدام ملقط غير رضحي ، قم بإخراج المبايض وقنوات البيض والرحم بعناية.
    4. باستخدام طرف إبرة حقنة ، قم بعمل شق صغير بزاوية تصاعدية على جدار الرحم أسفل تقاطع الرحم والبوق ، مع تجنب الأوعية الدموية. يوفر هذا الشق الوصول إلى تجويف الرحم. أدخل قناة البيض برفق 2-3 مم من خلال الفتحة الصغيرة.
    5. قم بطرد فقاعة الهواء الصغيرة بعناية في نهاية ماصة النقل مع مراقبة ماصة النقل بحذر أثناء الحقن البطيء للأجنة. بمجرد التأكد من طرد الجزء المركزي من وسط الاستزراع، أوقف الإجراء وقم بإزالة ماصة النقل برفق.
    6. أعد وضع المبايض وقنوات البيض والرحم مرة أخرى في تجويف البطن. خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل. ضع الفئران على وسادة تدفئة حتى تتعافى من التخدير. لضمان رفاهية الفئران ، راقب الفئران عن كثب خلال فترة التعافي ولا تتركها دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
  5. مراقبة الحمل
    1. بعد الجراحة ، راقب الفئران لمدة 18-21 يوما لمراقبة عدد النسل المولود. في حالة عسر ولادة (صعوبة الولادة) ، قم بإجراء عملية قيصرية. اسمح للفئران حديثي الولادة بالتبني من خلال السدود المرضعة من نفس الفئة العمرية.

3. اختبار الجلوكوز في الدم العشوائي ، وجلوكوز الدم الصائم ، واختبار تحمل الجلوكوز

  1. تتبع مستويات الجلوكوز في الدم العشوائية أثناء نمو الفئران
    1. منذ ولادة الفئران ، راقب مستوى الجلوكوز العشوائي في الدم كل 4 أسابيع في الساعة 9 صباحا بعد ليلة جيدة من التغذية والمرح.
      1. ثقب طرف ذيل الفأر للحصول على دم وريد الذيل.
      2. تحتوي القطرة الأولى من الدم على قيمة قياس أعلى للسكر بسبب وجود سائل الأنسجة الممزوج بها. لذلك ، امسح أول قطرة دم باستخدام ورق ماص نظيف برفق.
      3. قم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم من القطرة الثانية (~ 4 ميكرولتر) من الوريد الذيل باستخدام جهاز قياس السكر المحمول باليد.
  2. تتبع التغيرات في نسبة الجلوكوز في الدم الصائم وتحمل الجلوكوز أثناء نمو الفئران
    ملاحظة: بالنظر إلى أن النقطة الزمنية الأولى لأخذ عينات الدم هي 15 دقيقة ، يجب حقن جميع الفئران في غضون 15 دقيقة. نظرا لأن كل حقنة فأر استغرقت 20-30 ثانية ، لضمان اكتمال الحقن خلال هذا الإطار الزمني ، لا يمكن أن يتجاوز الحد الأقصى لعدد الفئران التي يمكن استخدامها في كل اختبار 30.
    1. قم بإجراء اختبارات تحمل الجلوكوز والجلوكوز في الدم الصائم كل 4 أسابيع بعد الولادة في الفئران الصائمة طوال الليل.
      1. في اليوم الأول ، قم بإعداد نشارة طازجة مشععة ، وأقفاص نظيفة ، وأغطية ، وزجاجات مياه. انقل الفئران إلى قفص طازج بدون طعام. أضف علامات عدم التغذية إلى الأقفاص.
      2. تحضير حقن الجلوكوز بنسبة 10٪ كافية (معقمة وخالية من البيروجين) و 1 مل من المحاقن.
      3. تأكد من أن الفئران في كل مجموعة تصوم لمدة 16 ساعة ، من الساعة 5:00 مساء في اليوم الأول إلى 9:00 صباحا في اليوم 2 ، ولكن اسمح بالوصول المجاني إلى الماء. قم بقياس مستويات الجلوكوز في الدم أثناء الصيام كما هو موضح في الخطوات 3.1.1.1-3.1.1.3 باستخدام مقياس الجلوكوز.
    2. قم بوزن الفئران ووضع علامة على ذيولها لتسهيل التعرف عليها بسرعة. تحضير محاقن الجلوكوز بوزن 10 ميكرولتر / غرام من الفأر.
    3. على فترات 30 ثانية، قم بحقن 10 ميكرولتر/غرام من الجلوكوز في التجويف داخل الصفاق للفأر.
      ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص لتقنيات الحقن هنا لتجنب حجم حقن السائل غير الدقيق. النقاط الرئيسية للعملية هي كما يلي:
      1. شل حركة الماوس وكبح الذيل بيد واحدة. حافظ على الرأس أقل قليلا من الأرداف بحيث تتحول الأعضاء الموجودة في تجويف البطن نحو الرأس ، مما يترك مساحة كافية للحقن.
      2. ضع الإبرة بين خط الوسط وعظم الورك ، وأدخلها عبر الجلد بزاوية 45 درجة ، ثم قم بتوجيه الإبرة برفق إلى عمق تجويف البطن مع إبقائها محاذاة موازية لسطح الجلد لمدة ~ 0.5 سم.
        ملاحظة: انتبه إلى أي مقاومة أثناء الحقن لتحديد ما إذا كانت الأعضاء الداخلية قد تم ثقبها عن طريق الخطأ.
      3. اخرج المحقنة في تجويف البطن.
      4. سجل الوقت الذي بدأ فيه الحقن واستخدم مؤقتا للتحكم في معدل الحقن. اضبط المؤقت على 90 ثانية لثلاثة فئران لتجنب إضاعة الوقت في التعامل مع المؤقت.
    4. خذ قياس الجلوكوز في الدم من الوريد الذيل على الفترات الزمنية المرغوبة (0 قبل إعطاء الجلوكوز ، 15 ، 30 ، 60 ، 90 ، و 120 دقيقة بعد تحميل الجلوكوز).
      ملاحظة: يجب أن يستغرق اختبار جلوكوز الدم اللاحق أيضا من 20 إلى 30 ثانية لكل فأر.
    5. أعد الفئران إلى أقفاص منزلها المجهزة بالطعام والماء بعد التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في مختبرنا ، حققنا معدل إخصاب بنسبة 89.57٪ ومعدل خليتين بنسبة 87.38٪ باستخدام الحقن المجهري مع المنوية الذيلية البربخية في الفئران. يبلغ معدل ولادة النسل بعد ET حوالي 42.50٪. ومن اللافت للنظر أن جميع معدلات الإخصاب ومعدلات الخلية ومعدلات ولادة النسل قابلة للمقارنة مع المستويات التي تم تحقيقها في العلاج المضاد للفيروسات القهقرية البشرية ، مما يتيح محاكاة شاملة لمراحل مختلفة من تقنيات العلاج المضاد للفيروسات القهقرية البشرية في الفئران. ويرد مزيد من التفاصيل في الجدول 1 والجدول 2. لم يكن ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

دمجت هذه الدراسة تقنيات حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) ونقل الأجنة (ET) لتلخيص شامل لتكنولوجيا الإنجاب بمساعدة الإنسان (ART) وفحص تأثير الحقن المجهري بالاقتران مع ET على نمو النسل. أسفر تطبيق تقنية الحقن المجهري مع المنوية الطبيعية للفئران عن إخصاب مرتفع (86.76٪) ومعدلات خليتين (88.48٪). بعد ET ، بلغ معدل ولادة الفئران ذات النسل حوالي 42.50٪ ، مما يشير إلى متانة المنصة التقنية. كانت النتيجة الأكثر شهرة لهذه الدراسة هي التذبذب المرتبط بالعمر في مستويات استقلاب الجلوكوز في نسل الحقن المجه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال خطة المشروع الرئيسية لصندوق التنمية الخاصة لمنطقة عرض الابتكار الوطنية المستقلة في شنغهاي تشانغجيانغ (ZJ2022-ZD-006) ، ومشروع التمويل المستهدف للجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (22DX1900400) ، وبرنامج الشباب التابع للجنة الصحة ببلدية شنغهاي (20204Y0276). المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070849).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.25٪ أفيرتين (2،2،2-ثلاثي بروموإيثانول)نانجينغ أيبيM2960للتخدير
أطباق بتري البكتريولوجية 35 × 10 مم مع غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ،بكتريولوجية BD353001
50 × 9 مم نمط مع غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ،الحيوية BD 351006
ESCOالفئة figure-materials-1عمليات BSC المعقمة ، وصنع أطباق الاستزراع ، ونقل الكواشف ، وما إلى ذلك.
حاضنة CO2Thermo8000DHمجهر تشريح ثقافة الأجنة
أوليمبوسSZX16يستخدم في نقل أجنة الفأر
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 عبارة عن سائل مفلور بالكامل مستقر حراريا مع قوة عازلة عالية ومقاومة ، ويستخدم كجهاز قياس السكر المحمول
باليد RocheAccuChek performaBlood قياس الجلوكوز
HTFMerckMR-070-Dيتوفر سائل البوق البشري EmbryoMax (HTF) (1x) ، السائل المصمم للاستخدام مع Mouse IVF بتنسيق 50 مل وقد تم تحسينه والتحقق من صحته لزراعة الأجنة.
حاقن دقيق هيدروليكيEppendorfCellTram 4r Oil ، 5196000030لحقن المنوية
المجهر المقلوبNikonTI2-Uمضيف مراقبة التلاعب الدقيق
KSOMMerckMR-020P-D(1x) ، مسحوق ، بدون فينول أحمر ، 5 × 10 مل
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 متوسط (1x) ، سائل ، مع معالج دقيق أحمر الفينول
NARISHIGENTX-N4ذراع التلاعب
الزيوت المعدنية  SIGMAM8410مناسبة للاستخدام كطبقة غطاء للتحكم في التبخر والتلوث المتبادل في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة.
قاطع إبرةنانجينغ أيبيسوتر MF-800استخدم لتصنيع إبر التلاعب الدقيق
مجتذب إبرةنانجينغ أيبيسوتر موديل p-100استخدم لصنع إبر التلاعب الدقيق
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087تطبيق إبرة حقن الحقن المجهري.
معالج دقيق كهرضغطية (قاطع الغشاء)EppendorfEppendorf PiezoXpertاستخدام النبضات الدقيقة لكسر المنطقة الشفافة وأوليما البويضة
حاقن دقيق هوائيEppendorfCellTram 4r Air ، 5196000013لتثبيت البويضة
موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية الجاهزة للاستخدام (Hcg) كاشفالتعقيم Nanjing AibeiM2520، الحقن داخل الصفاق. 50 وحدة دولية / مل
مصل الفرس الحامل جاهز للاستخدام (PMSG)التعقيم Nanjing AibeiM2620، الحقن داخل الصفاق. 50 وحدة دولية / مل
مجهر مجسمأوليمبوسSZX7استرجاع البويضات ومراقبة تطور الجنين
أطباق بتري معقمة خزانة السلامة معقمة الدقيق الزيوت المعدنية كاشف

المراجع

  1. Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
  2. Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
  3. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
  4. Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
  5. Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
  6. De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
  7. Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
  8. Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
  9. Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
  10. Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
  11. Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
  12. Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
  13. Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
  14. Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
  15. Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مراقبة غلوكوز الدماختبار تحمل الغلوكوزنقل الأجنةتكنولوجيا التكاثر المساعدةتمكين الحيوانات المنويةاضطراب أيضيغلوكوز الدم الصياميتتبع وزن الجسم
مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.