هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج فأر لحقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) - نقل الأجنة (ET) ، مما يسمح لنا بمراقبة التغيرات المرتبطة بالعمر في استقلاب الجلوكوز والتي قد تعزى إلى الحقن المجهري ، مما يوفر رؤى حول آثاره المحتملة طويلة المدى على التنمية البشرية.
مقالة منهجية
مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم في نسل الفأر بعد حقن المنوية داخل الهيولى
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عمر الإنسان طويل إلى حد كبير ، في حين أن نماذج الفئران يمكن أن تحاكي عمر الإنسان بأكمله في فترة قصيرة نسبيا ، مع سنة واحدة من عمر الفأر تعادل تقريبا 40 سنة بشرية. حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) هو تقنية مساعدة على الإنجاب شائعة الاستخدام في الممارسة السريرية. ومع ذلك ، نظرا لظهورها الحديث نسبيا منذ حوالي 30 عاما ، فإن الآثار طويلة المدى لهذه التقنية على التنمية البشرية لا تزال غير واضحة. في هذه الدراسة ، أنشأنا الحقن المجهري جنبا إلى جنب مع طريقة نقل الأجنة (ET) باستخدام نموذج الفأر. أظهرت النتائج أن المنوية الطبيعية للفئران ، بعد الخضوع للزراعة في المختبر والحقن المجهري اللاحق ، أظهرت معدل إخصاب 89.57٪ ومعدل خليتين 87.38٪. بعد ET ، كان معدل ولادة النسل حوالي 42.50٪. علاوة على ذلك ، مع تقدم الفئران في العمر ، لوحظت تقلبات في مستويات استقلاب الجلوكوز ، والتي قد تكون مرتبطة بتطبيق تقنية الحقن المجهري. تشير هذه النتائج إلى أن تقنية الحقن المجهري للفأر توفر منصة قيمة لتقييم تأثير تشوهات المنوية على نمو الأجنة وآثارها طويلة المدى على صحة النسل ، لا سيما فيما يتعلق باستقلاب الجلوكوز. توفر هذه الدراسة رؤى مهمة لمزيد من البحث حول الآثار المحتملة لتقنية الحقن المجهري على التنمية البشرية ، مع التأكيد على ضرورة إجراء تحقيق متعمق في الآثار طويلة المدى لهذه التكنولوجيا.
المقدمة
برزت قضايا الخصوبة كمحور رئيسي للقلق الطبي والاجتماعي ، خاصة في المجتمع الحديث حيث برزت معدلات الخصوبة المنخفضة وزيادة شدة انتشار العقم وشدته. توفر تقنية المساعدة على الإنجاب (ART) مجموعة واسعة من الاحتمالات لمواجهة هذه التحديات ، مع استخدام حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) بشكل شائع كتدخل علاجي.
منذ أن أبلغت باليرمو عن أول حمل ناجح تم تحقيقه من خلال حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) في عام 1992 ، أصبح الحقن المجهري أسلوبا محوريا في تقنيات المساعدة على الإنجاب (ART) 1. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن الحقن المجهري قد تم استخدامه في البيئات السريرية لمدة 30 عاما فقط ، وهي فترة قصيرة نسبيا مقارنة بعمر الإنسان ، فإن الآثار طويلة المدى للحقن المجهري ، خاصة على نمو النسل ، لم يتم التحقيق فيها وتوضيحها على نطاق واسع. في الوقت الحاضر ، ظهرت الفئران التي تتميز بخلفيتها الجينية الموحدة وعمرها الأقصر كنموذج بديل يستخدم على نطاق واسع في البحث الطبي. علاوة على ذلك ، يمكن لنموذج الفأر تلخيص العمر الافتراضي للإنسان بالكامل ضمن إطار زمني مضغوط ، حيث تتوافق سنة واحدة في الفئران تقريبا مع 40 عاما في البشر2.
على مدى العقد الماضي ، أفادت العديد من الدراسات الصغيرة أن الأفراد الذين تم تصورهم من خلال الحقن المجهري قد يكونون أكثر عرضة للإصابة بمتلازمات التمثيل الغذائي ، مثل مستويات السكر في الدم غير الطبيعية ، في وقت لاحق من الحياة3،4. على الرغم من أن الأدلة ليست نهائية ، إلا أن هذه النتيجة أثارت مخاوف جدية داخل المجتمع العلمي فيما يتعلق بالآثار الصحية طويلة المدى للحقن المجهري. ويؤكد هذا الوضع الحاجة الملحة إلى إجراء تقييمات أكثر صرامة للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية وعواقبه الصحية طويلة الأجل. في ضوء القيود والاعتبارات الأخلاقية للدراسات البشرية على وجه الخصوص ، أصبح تطوير نماذج حيوانية يمكنها تلخيص تطور النسل البشري بدقة بعد الحقن المجهري أمرا بالغ الأهمية. في هذا السياق ، أصبح نموذج حقن المنوية داخل الهيولى (Intracytoplasmic Sperm Transfer-Embryo Transfer) ، نظرا لقدرته على تقليد الحقن المجهري البشري وتسهيل المراقبة طويلة الأجل للنتائج الصحية للنسل ، أداة فعالة لتقييم المخاطر الصحية المحتملة لتقنية الحقن المجهري على النسل5.
تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في تأثير تقنية الحقن المجهري على النمط الظاهري الأيضي السائد ، وهو صحة التمثيل الغذائي للجلوكوز في النسل ، من خلال استخدام المراقبة العشوائية لجلوكوز الدم ، واختبار جلوكوز الدم الصائم ، واختبارات تحمل الجلوكوز لتقييم حالة التمثيل الغذائي للجلوكوز للفئران. يتم استخدام المراقبة العشوائية لنسبة الجلوكوز في الدم لالتقاط التقلبات الطبيعية في استقلاب الجلوكوز أثناء الأنشطة الفسيولوجية الطبيعية ، بينما يتم استخدام اختبارات تحمل الجلوكوز في الدم أثناء الصيام لتقييم حالات ما قبل السكري المحتملة.
البروتوكول
يتبع بروتوكول الحقن المجهري الملقح بالذكاء الاصطناعي الموضح أدناه المبادئ التوجيهية وقد تمت الموافقة عليه من قبل المراجعة الأخلاقية للحيوان التابع لمعهد شنغهاي لأبحاث تنظيم الأسرة. إجراءات السلامة: ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع المواد الكيميائية أو المواد البيولوجية. استخدام الشفاطات: قم بتنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على مواد كيميائية متطايرة أو توليد الهباء الجوي داخل غطاء دخان معتمد أو خزانة سلامة حيوية. استخدم إناث الفئران (سلالة B6D2F1 التي يبلغ عمرها 6-8 أسابيع) لإجراء الإباضة الزائدة.
1. الحقن المجهري في الفئران
- الإباضة الفائقة للفئران
- تطبيق حقنة داخل الصفاق من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) بجرعة 7.5 وحدة دولية لكل فأر في حوالي الساعة 20:00 من اليوم الأول.
- يجب إعطاء حقنة داخل الصفاق من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) بجرعة 7.5 وحدة دولية لكل فأر في حوالي الساعة 20:00 (48 ساعة بعد حقن PMSG) في اليوم الثالث.
- قم بإعداد وسط HTF في 1 مل من الحصص واتركها مكشوفة للتوازن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ في نفس يوم حقن قوات حرس السواحل الهايتية في إناث الفئران.
- تحضير قطرات الإخصاب بالحقن المجهري
- في نفس يوم حقن قوات حرس السواحل الهايتية في إناث الفئران ، قسم غطاء طبق ثقافة الخلايا مقاس 50 × 9 مم إلى نصفين علويين وسفلين. استخدم النصف العلوي لإنشاء 4-6 قطرات سعة 5 ميكرولتر لكل منها ، باستخدام 10٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP) لوضع المنوية. استخدم النصف السفلي لإنشاء 8-10 قطرات سعة كل منها 5 ميكرولتر ، باستخدام وسط M2 لإجراء الحقن المجهري.
- قم بتغطية القطرات المتوسطة PVP و M2 بحوالي 3 مل من الزيت المعدني (الشكل 1).
- تحضير أطباق الثقافة
- في نفس يوم حقن هرمون موجهة الغدد التناسلية المشيمائية البشرية في إناث الفئران، قم بتوزيع 12 قطرة من وسط KSOM (MR-020P-D) بحجم 20 ميكرولتر بالتساوي في طبق زراعة الخلايا مقاس 35 × 10 مم. غطي القطرات بحوالي 3 مل من الزيت المعدني.
- حصاد المنوية:
- القتل الرحيم للفئران الذكور عن طريق خلع عنق الرحم في حوالي الساعة 9:00 صباحا في اليوم الرابع (13 ساعة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية).
- اعزل ذيلية البربخ وتنظيفها جيدا للتخلص من أي أنسجة دهنية وبقايا دم عن طريق النشاف برفق بشاش معقم والشطف في وسط HTF دافئ مسبقا.
- اقطع البربخ الذيل للسماح للحيوانات المنوية بالسباحة بحرية في وسط HTF. اضغط برفق على الذيل باستخدام ملقط لتحرير المنوية ، واجمعها في أنابيب HTF متوازنة مسبقا ، واحتفظ بها مكشوفة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لسعة المنوية لمزيد من الاستخدام.
- استرجاع البويضات
- تحفيز إناث الفئران الرحيم لاسترجاع البويضات عن طريق خلع عنق الرحم في حوالي الساعة 9:30 صباحا في اليوم الرابع. قم بعمل شق بعناية على طول خط الوسط لجلد البطن وطبقة العضلات لفضح تجويف البطن.
- استخدم ملقطا دقيقا لعزل الأنسجة برفق من جانبي قنوات البيض ، وخاصة مناطق الأمبولة المنتفخة ، ونقلها إلى وسط M2 في طبق مزرعة معقم. كرر هذا الإجراء حتى يتم جمع قنوات البيض من جميع الفئران المحددة.
- تحت مجهر تشريح ، استخدم إبرة حقنة سعة 1 مل لثقب الجزء الشفاف من الأمبولة المتورمة لقناة البيض برفق ، مما يسهل إطلاق مجمعات البويضات الركامية (COCs) في الوسط.
- باستخدام نفس المحقنة ، اختر COCs وانقلها بعناية إلى طبق جديد يحتوي على 100 ميكرولتر من وسط M2 الطازج. كرر هذه الخطوة حتى يتم نقل جميع COCs بنجاح من أجزاء قناة البيض الأصلية.
- امسح سوائل الدم والأنسجة ، وتحت المجهر التشريحي ، قم بتمزيق أمبولة قناة البيض باستخدام إبرة 25 جم ، مما يؤدي إلى إطلاق العديد من COCs.
- قم بإزالة قناة البيض وشظايا الأنسجة ، وانقل COCs إلى قطرات من وسط M2 يحتوي على الهيالورونيداز (HY) ، وقم بتسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة لمدة 5 دقائق تقريبا ، قم بإجراء ماصة لطيفة لتسهيل فصل الخلايا الركامية والبويضات. نقل الطور الثاني (MII) البويضات من المحلول المحتوي على HY إلى وسط M2 الطازج ؛ ثم قم بإجراء النقل المتسلسل إلى قطرات متعددة من وسط M2.
- بعد 2-3 جولات من الغسيل ، انقل البويضات إلى قطرات من وسط استزراع KSOM واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمزيد من الاستخدام.
- حوالي الساعة 10:00 صباحا في اليوم الرابع ، صوتنة 100 ميكرولتر من المنوية السعوية (انظر الخطوة 1.5.2.) لمدة 5 ثوان لفصل الرؤوس عن الذيل بتردد 46 كيلو هرتز ، مع إعداد طاقة يبلغ 50 واط.
ملاحظة: عند صوتنة المنوية لاقتطاع الذيل ، كن حذرا للتحكم في الوقت ، والذي يجب ألا يتجاوز 5 ثوان. بعد ثوان قليلة من صوتنة ، يمكن ملاحظة المنوية تحت المجهر المقلوب. توقف عن صوتنة عندما يظهر ما يقرب من نصف المنوية ذيول مقطوعة. - إجراء الحقن المجهري
- استخدم إبرة معالجة دقيقة متوفرة تجاريا بطرف مسطح وقطر داخلي يبلغ 6 ميكرومتر، مثبتة بزاوية 25 درجة، للحقن. املأ الإبرة بسائل التشغيل بالجزء المملوء بطول 0.5 سم داخل الإبرة. تأكد من أن مستوى السائل يصل إلى ~ 0.5 سم.
ملاحظة: حافظ على درجة حرارة الغرفة عند 19 درجة مئوية أثناء الحقن لتجنب درجات الحرارة المرتفعة التي قد تقلل من معدل بقاء البويضات المخصبة. تعد الدقة في ضمان وصول مستوى السائل إلى 0.5 سم أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة عملية الحقن وضمان بقاء البويضات. - قم بتثبيت إبرة الحقن على الذراع الأيمن للمناور الدقيق ، ويتم تثبيتها بإحكام عن طريق شد غطاء الإمساك. قم بتركيب ماصة تثبيت معالجة دقيقة ذات رؤوس مسطحة متوفرة تجاريا ومصممة لبويضات الفأر على الذراع الأيسر للمعالج المجهري، ووضع إبرة الحقن والماصة المثبتة في مجال رؤية المجهر.
- أضف 1 ميكرولتر من المنوية الصوتية إلى قطرة من محلول PVP باستخدام ماصة.
- ضع 20 بويضة MII في قطرة من وسط M2.
- استخدم إبرة الحقن لشفط 10-20 رأس منوي في محلول PVP. ثم حرك إبرة الحقن إلى القطرة التي تحتوي على البويضات.
- حدد مباشرة موضع مغزل الطور داخل البويضة تحت مجهر الاستقطاب للتأكد من أن جهاز المغزل ليس على جانب الحقن ، حيث يقع الجسم القطبي عادة إما في موضع الساعة 12 أو الساعة 6 بالنسبة لاتجاه البويضة.
- حافظ على البويضة على اتصال بقاع طبق الاستزراع. اضبط المستوى البؤري بحيث تكون المنطقة الشفافة للبويضة وإبرة الحقن في نفس المستوى.
- عند ملامسة إبرة الحقن مع المنطقة الشفافة ، قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف على إبرة الحقن ، مما يؤدي إلى سحب جزء من المنطقة الشفافة.
- قم بتنشيط نبضات بيزو في وقت واحد بإعداد شدة 5 وتردد 1 ، مما يؤدي بشكل فعال إلى إنشاء ثقب في المنطقة الشفافة والسماح لإبرة الحقن بالمرور.
- ادفع إبرة الحقن إلى مساحة perivitelline ، وادفع رأس المنوية إلى طرف الإبرة. أدخل إبرة الحقن في البويضة حتى تصل إلى الجانب الآخر من المنطقة الشفافة.
- استخدم نبضات بيزو مضبوطة على شدة 1 وتردد 1 لإنشاء مسام صغيرة في غشاء البلازما ، مما يضمن حقن رأس المنوية في الأوبلازم مع الحد الأدنى من دخول PVP والحفاظ الأمثل على سلامة البويضة.
- كرر الخطوة 1.8.11 حتى يتم حقن جميع البويضات ال 20 ، متبوعة بحضانة لمدة 15 دقيقة عند 19 درجة مئوية.
- انقل البويضات الباقية إلى وسط KSOM وضعها في الحاضنة. راقب معدلات تكوين الخلايا 2 ، 4 الخلايا ، المورولا ، والكيسة الأريمية.
ملاحظة: يجب التحكم في توقيت حقن المنوية المفردة داخل الهيولى (ICSI) في البويضة ، بهدف إكمال الإجراء في غضون 14-18 ساعة بعد حقن قوات حرس السواحل الهايتية.
- استخدم إبرة معالجة دقيقة متوفرة تجاريا بطرف مسطح وقطر داخلي يبلغ 6 ميكرومتر، مثبتة بزاوية 25 درجة، للحقن. املأ الإبرة بسائل التشغيل بالجزء المملوء بطول 0.5 سم داخل الإبرة. تأكد من أن مستوى السائل يصل إلى ~ 0.5 سم.
2. زرع الرحم من الأكياس الأريمية في الفئران
- تحضير الفئران الذكور الدافقة
ملاحظة: استخدم ذكور ICR الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع للدراسة.- تحفيز التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ 2،2،2-ثلاثي البروم الإيثانول بجرعة 0.2 مل / 10 جم من وزن الجسم. يشير عدم وجود أي استجابة للألم إلى التخدير الناجح.
ملاحظة: في حين أن البروتوكول الحالي لا يتضمن تطبيق مرهم بيطري على عيون المخدرة ، إلا أنه يوصى به كأفضل ممارسة لمنع جفاف العين وضمان صحة وراحتها أثناء الإجراءات. طوال عملية الجراحة والتعافي ، تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام ، وتم تحضير المنطقة الجراحية باستخدام محاليل مطهرة لضمان بيئة تشغيل نظيفة. - للحماية من الإجهاد أو الإصابة المحتملة ، قم بإيواء الفئران التي خضعت لعملية جراحية بشكل فردي خلال مرحلة التعافي الأولية.
- تطبيق البوبرينورفين بجرعة 0.05 ملغ/كغ من وزن الجسم لضمان تخفيف الألم الأمثل.
ملاحظة: لضمان رفاهية الفئران ، راقب الفئران عن كثب خلال فترة التعافي ولا تتركها دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. - تحضير موقع الجراحة في منطقة أسفل البطن ، متفوقة على الخصيتين. قم بإزالة الفراء وتطهيره باستخدام بوفيدون اليود. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق طولي بطول 1 سم على طول الخط ألبا. قم بإزالة أي دم برفق باستخدام ورق معقم وخالي من الغبار واستمر في تشريح عضلات البطن بصراحة على طول خط ألبا والوصول إلى تجويف البطن.
- باستخدام ملقط منحني ، أمسك الخصية اليسرى ووسادة الدهون المرتبطة بها برفق وفضحها. حدد الأسهر وعزلها بعناية باستخدام ملقط مدبب ، مما يؤدي إلى إنشاء جزء 10 مم للتلاعب.
- عقم الملقط المنحني عن طريق تثبيتها في اللهب الخارجي لمصباح الكحول لعدة ثوان. أمسك الأسهر برفق ، مما يتسبب في تسويته وتبييضه بسبب الكي. قم بإنشاء نقطة كي ثانية 3-5 مم بعيدة عن الأولى. باستخدام مقص جراحي معقم ، قم باستئصال جزء الأسهر بين نقطتي الكي.
- افحص بعناية الأطراف المقوية للأسرية ، مع التأكد من بقاء جزء قصير ومسطح ومبيض. باستخدام ملقط منحني ، أعد الخصية ووسادة الدهون المرتبطة بها برفق إلى تجويف البطن.
- كرر الإجراء الموضح في الخطوة 2.1.6 على الجانب المقابل (الأيمن).
- أغلق موقع الجراحة باستخدام الغرز ، وعادة ما تضع غرزة واحدة في طبقة العضلات وثلاث غرز في الجلد. تأكد من المحاذاة المناسبة للشق الجراحي وتطهيره ببوفيدون اليود. انقل إلى وسادة تدفئة للمراقبة ، وراقب لمدة 10-15 دقيقة حتى يستعيد وعيه. بمجرد التعافي ، أعد إلى قفص السكن الخاص به.
ملاحظة: بعد جراحة قطع القناة الدافقة ، تحتاج الفئران إلى فترة نقاهة مدتها 14 يوما ، تليها تجربة تزاوج تجريبية لمدة أسبوع واحد. - خلال هذا الأسبوع ، قم بتزاوج الذكور الدافقة مع الإناث باستمرار وراقب حالة الحمل لجميع الإناث اللواتي يظهرن مع سدادات جماعية. يشار إلى التزاوج الناجح من خلال وجود سدادة مهبلية ممتلئة اللون بيضاء مصفرة عند فتحة المهبل للفأر الأنثوي.
- قم بإقران الفئران بين الساعة 4:00 مساء و 6:00 مساء في اليوم الأول وتحقق من السدادات المهبلية بين الساعة 7:00 صباحا و 9:00 صباحا في اليوم الثاني. ضع في اعتبارك أن الإناث اللواتي لديهن سدادات مهبلية في حالة حمل كاذب في عمر 0.5 يوم واستخدمهن في تجارب نقل الأجنة اللاحقة. إعادة الإناث بدون سدادات مهبلية إلى المجموعة المتلقية.
ملاحظة: يمكن الاستمرار في استخدام هذه الإناث بدون سدادات مهبلية للتزاوج لتحضير الإناث الحوامل الزائفة. تأكد من أن جميع الإناث المسدودات لا يصبحن حوامل ؛ عندها فقط يمكن استخدام الذكور الدافقة في التجارب الرسمية. - بينما يمكن للذكور الدافقة أن تتزاوج يوميا ، اترك يوما واحدا من الراحة بين جلسات التزاوج.
ملاحظة: بناء على تجربتنا ، يمكن للذكور الذين تم تقطيع القناة الدافقة الحفاظ على معدل سدادات جماعية مرتفع لأكثر من عام. ومع ذلك ، يجب إزالة الذكور الذين تم تقطيع القناة الدافقة الذين يفشلون في إنتاج سدادات جماعية في إناث التزاوج لمدة 4-6 محاولات متتالية من الدراسة.
- قم بإقران الفئران بين الساعة 4:00 مساء و 6:00 مساء في اليوم الأول وتحقق من السدادات المهبلية بين الساعة 7:00 صباحا و 9:00 صباحا في اليوم الثاني. ضع في اعتبارك أن الإناث اللواتي لديهن سدادات مهبلية في حالة حمل كاذب في عمر 0.5 يوم واستخدمهن في تجارب نقل الأجنة اللاحقة. إعادة الإناث بدون سدادات مهبلية إلى المجموعة المتلقية.
- تحفيز التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ 2،2،2-ثلاثي البروم الإيثانول بجرعة 0.2 مل / 10 جم من وزن الجسم. يشير عدم وجود أي استجابة للألم إلى التخدير الناجح.
- تحضير الإناث الحوامل الزائفة
- قم بتوليد إناث الفئران الحوامل الزائفة عن طريق تزاوج إناث الفئران ICR (التي تتراوح أعمارها بين 7-10 أسابيع ، ووزنها أكثر من 25 جم) مع الفئران الذكور الدافقة (3-6 أشهر من العمر) بنسبة 1: 1.
ملاحظة: تم استخدام الذكور الدافقة الدافقة لتحفيز عنق الرحم من إناث الفئران ، مما أدى إلى تنشيط الجسم الأصفار.
- قم بتوليد إناث الفئران الحوامل الزائفة عن طريق تزاوج إناث الفئران ICR (التي تتراوح أعمارها بين 7-10 أسابيع ، ووزنها أكثر من 25 جم) مع الفئران الذكور الدافقة (3-6 أشهر من العمر) بنسبة 1: 1.
- تحضير الماصة لنقل الأكياس الأريمية
- خذ الأجنة المراد زرعها من الحاضنة وانقلها إلى قطرة من وسط M2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- استخدم ماصة نقل لشفط كمية صغيرة من السائل ، وسحب كمية صغيرة من الهواء ، وشفط 6-10 أجنة. أخيرا ، استنشق كمية صغيرة أخرى من الهواء لإغلاق الماصة.
ملاحظة: يجب ألا يتجاوز طول السائل في ماصة النقل 0.5 سم.
- زرع الرحم (الكيسات الأريمية)
- قم بوزن إناث الفئران الحوامل الزائفة (بعد 2.5 يوم من التزاوج) وتخديرها عن طريق الحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ 2،2،2-ثلاثي البروم إيثانول بجرعة 0.2 مل / 10 جم من وزن الجسم. اضغط برفق على الأذن باستخدام ملقط.
- بعد إعطاء التخدير للفئران والتأكد من التعقيم من خلال تطهير الكحول ، قم بعمل شق طولي في خط الوسط على البطن البطني. الاستفادة من الأنسجة الرخوة تحت الجلد ، قم بتحويل الشق إلى الجانب الأيسر أو الأيمن كما هو مطلوب للزرع. استخدم مقصا صغيرا لإجراء تشريح حاد لطبقة عضلة جدار البطن عند ~ 0.5 سم جانبيا للعمود الفقري القطني للوصول إلى التجويف البريتوني.
- باستخدام ملقط غير رضحي ، قم بإخراج المبايض وقنوات البيض والرحم بعناية.
- باستخدام طرف إبرة حقنة ، قم بعمل شق صغير بزاوية تصاعدية على جدار الرحم أسفل تقاطع الرحم والبوق ، مع تجنب الأوعية الدموية. يوفر هذا الشق الوصول إلى تجويف الرحم. أدخل قناة البيض برفق 2-3 مم من خلال الفتحة الصغيرة.
- قم بطرد فقاعة الهواء الصغيرة بعناية في نهاية ماصة النقل مع مراقبة ماصة النقل بحذر أثناء الحقن البطيء للأجنة. بمجرد التأكد من طرد الجزء المركزي من وسط الاستزراع، أوقف الإجراء وقم بإزالة ماصة النقل برفق.
- أعد وضع المبايض وقنوات البيض والرحم مرة أخرى في تجويف البطن. خياطة طبقة العضلات والجلد بشكل منفصل. ضع الفئران على وسادة تدفئة حتى تتعافى من التخدير. لضمان رفاهية الفئران ، راقب الفئران عن كثب خلال فترة التعافي ولا تتركها دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
- مراقبة الحمل
- بعد الجراحة ، راقب الفئران لمدة 18-21 يوما لمراقبة عدد النسل المولود. في حالة عسر ولادة (صعوبة الولادة) ، قم بإجراء عملية قيصرية. اسمح للفئران حديثي الولادة بالتبني من خلال السدود المرضعة من نفس الفئة العمرية.
3. اختبار الجلوكوز في الدم العشوائي ، وجلوكوز الدم الصائم ، واختبار تحمل الجلوكوز
- تتبع مستويات الجلوكوز في الدم العشوائية أثناء نمو الفئران
- منذ ولادة الفئران ، راقب مستوى الجلوكوز العشوائي في الدم كل 4 أسابيع في الساعة 9 صباحا بعد ليلة جيدة من التغذية والمرح.
- ثقب طرف ذيل الفأر للحصول على دم وريد الذيل.
- تحتوي القطرة الأولى من الدم على قيمة قياس أعلى للسكر بسبب وجود سائل الأنسجة الممزوج بها. لذلك ، امسح أول قطرة دم باستخدام ورق ماص نظيف برفق.
- قم بقياس نسبة الجلوكوز في الدم من القطرة الثانية (~ 4 ميكرولتر) من الوريد الذيل باستخدام جهاز قياس السكر المحمول باليد.
- منذ ولادة الفئران ، راقب مستوى الجلوكوز العشوائي في الدم كل 4 أسابيع في الساعة 9 صباحا بعد ليلة جيدة من التغذية والمرح.
- تتبع التغيرات في نسبة الجلوكوز في الدم الصائم وتحمل الجلوكوز أثناء نمو الفئران
ملاحظة: بالنظر إلى أن النقطة الزمنية الأولى لأخذ عينات الدم هي 15 دقيقة ، يجب حقن جميع الفئران في غضون 15 دقيقة. نظرا لأن كل حقنة فأر استغرقت 20-30 ثانية ، لضمان اكتمال الحقن خلال هذا الإطار الزمني ، لا يمكن أن يتجاوز الحد الأقصى لعدد الفئران التي يمكن استخدامها في كل اختبار 30.- قم بإجراء اختبارات تحمل الجلوكوز والجلوكوز في الدم الصائم كل 4 أسابيع بعد الولادة في الفئران الصائمة طوال الليل.
- في اليوم الأول ، قم بإعداد نشارة طازجة مشععة ، وأقفاص نظيفة ، وأغطية ، وزجاجات مياه. انقل الفئران إلى قفص طازج بدون طعام. أضف علامات عدم التغذية إلى الأقفاص.
- تحضير حقن الجلوكوز بنسبة 10٪ كافية (معقمة وخالية من البيروجين) و 1 مل من المحاقن.
- تأكد من أن الفئران في كل مجموعة تصوم لمدة 16 ساعة ، من الساعة 5:00 مساء في اليوم الأول إلى 9:00 صباحا في اليوم 2 ، ولكن اسمح بالوصول المجاني إلى الماء. قم بقياس مستويات الجلوكوز في الدم أثناء الصيام كما هو موضح في الخطوات 3.1.1.1-3.1.1.3 باستخدام مقياس الجلوكوز.
- قم بوزن الفئران ووضع علامة على ذيولها لتسهيل التعرف عليها بسرعة. تحضير محاقن الجلوكوز بوزن 10 ميكرولتر / غرام من الفأر.
- على فترات 30 ثانية، قم بحقن 10 ميكرولتر/غرام من الجلوكوز في التجويف داخل الصفاق للفأر.
ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص لتقنيات الحقن هنا لتجنب حجم حقن السائل غير الدقيق. النقاط الرئيسية للعملية هي كما يلي:- شل حركة الماوس وكبح الذيل بيد واحدة. حافظ على الرأس أقل قليلا من الأرداف بحيث تتحول الأعضاء الموجودة في تجويف البطن نحو الرأس ، مما يترك مساحة كافية للحقن.
- ضع الإبرة بين خط الوسط وعظم الورك ، وأدخلها عبر الجلد بزاوية 45 درجة ، ثم قم بتوجيه الإبرة برفق إلى عمق تجويف البطن مع إبقائها محاذاة موازية لسطح الجلد لمدة ~ 0.5 سم.
ملاحظة: انتبه إلى أي مقاومة أثناء الحقن لتحديد ما إذا كانت الأعضاء الداخلية قد تم ثقبها عن طريق الخطأ. - اخرج المحقنة في تجويف البطن.
- سجل الوقت الذي بدأ فيه الحقن واستخدم مؤقتا للتحكم في معدل الحقن. اضبط المؤقت على 90 ثانية لثلاثة فئران لتجنب إضاعة الوقت في التعامل مع المؤقت.
- خذ قياس الجلوكوز في الدم من الوريد الذيل على الفترات الزمنية المرغوبة (0 قبل إعطاء الجلوكوز ، 15 ، 30 ، 60 ، 90 ، و 120 دقيقة بعد تحميل الجلوكوز).
ملاحظة: يجب أن يستغرق اختبار جلوكوز الدم اللاحق أيضا من 20 إلى 30 ثانية لكل فأر. - أعد الفئران إلى أقفاص منزلها المجهزة بالطعام والماء بعد التجربة.
- قم بإجراء اختبارات تحمل الجلوكوز والجلوكوز في الدم الصائم كل 4 أسابيع بعد الولادة في الفئران الصائمة طوال الليل.
النتائج
في مختبرنا ، حققنا معدل إخصاب بنسبة 89.57٪ ومعدل خليتين بنسبة 87.38٪ باستخدام الحقن المجهري مع المنوية الذيلية البربخية في الفئران. يبلغ معدل ولادة النسل بعد ET حوالي 42.50٪. ومن اللافت للنظر أن جميع معدلات الإخصاب ومعدلات الخلية ومعدلات ولادة النسل قابلة للمقارنة مع المستويات التي تم تحقيقها في العلاج المضاد للفيروسات القهقرية البشرية ، مما يتيح محاكاة شاملة لمراحل مختلفة من تقنيات العلاج المضاد للفيروسات القهقرية البشرية في الفئران. ويرد مزيد من التفاصيل في الجدول 1 والجدول 2. لم يكن هناك تذبذب دلالي في مستويات الجلوكوز في الدم العشوائية بين الفئران المولودة بشكل طبيعي والفئران المجهرية أثناء عملية النمو والتطور (الشكل 2). ومع ذلك ، أظهرت ذكور الحقن المجهري مستويات عالية باستمرار من جلوكوز الدم الصائم طوال التجربة (الشكل 3) ، مما يشير إلى ضعف توازن جلوكوز الدم أثناء الصيام. ومن المثير للاهتمام أن إناث الفئران في الحقن المجهري لم تظهر أي تغييرات مقارنة بالمجموعة الضابطة. في GTT ، أظهر مستوى الجلوكوز في الدم تغيرا كبيرا بين ذكور الفئران المجهرية والمجموعة الضابطة (الشكل 4) ، ولم يكن هناك مثل هذا الاختلاف في إناث الفئران. أشارت هذه النتائج إلى أن النسل الذي تم الحصول عليه باستخدام تقنية الحقن المجهري قد يعاني من مرض السكري ، وكانت النتيجة مرتبطة بالجنس. على الرغم من أن إناث الفئران لم تظهر النمط الظاهري لمرض السكري ، إلا أن النمط الظاهري ذو الوزن الزائد لكل من ذكور وإناث الفئران المجهرية كان ثابتا (الشكل 5).
باستخدام بروتوكول حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) الموصوف هنا ، حققنا معدلات عالية من الإخصاب وتطور الأجنة في الفئران. في تجربة تمثيلية ، تم تخصيب 89.57٪ من البويضات بعد الحقن المجهري ، كما يتضح من تكوين نوتين. بعد 24 ساعة من الحقن المجهري ، تطورت 87.38٪ من البيضة البيضية إلى مرحلة الجنين المكون من خلية. بعد نقل الأجنة إلى الإناث المتلقية ، كان معدل ولادة الجراء الحية 42.50٪ (نتائج إيجابية). باستخدام بروتوكول حقن المنوية داخل الهيولى المحسن (ICSI) الموضح هنا ، قمنا بإنشاء ذرية بكفاءة من بويضات الفئران المنوية. الأهم من ذلك ، أن التوصيف الشامل للحيوانات المشتقة من الحقن المجهري كشف عن اضطرابات أيضية في غياب عيوب نمو جسيمة.
بالمقارنة مع الضوابط التي تم تربيتها بشكل طبيعي ، أظهرت الفئران من الذكور وليس الإناث في الحقن المجهري ضعف في توازن الجلوكوز ، كما يتضح من ارتفاع نسبة الجلوكوز في الدم أثناء الصيام (الشكل 3) وانخفاض تحمل الجلوكوز في اختبارات تحمل الجلوكوز داخل الصفاق (الشكل 4). قد تنبع هذه التعديلات من أوجه القصور في إعادة البرمجة أثناء الإخصاب بوساطة الحقن المجهري أو التشوهات الجينية / اللاجينية الدقيقة التي تحدث أثناء التلاعب بالحيوانات المنوية.
بالإضافة إلى ذلك ، أظهر كل من الحقن المجهري من الذكور والإناث زيادة في وزن الجسم مقارنة بالضوابط (الشكل 5) ، مما يشير إلى الميل إلى السمنة. في حين أن تقنية الحقن المجهري للفأر تصمم بشكل موثوق نتائج الحقن المجهري البشري ، فإن الأنماط الظاهرية الأيضية المرصودة تؤكد الحاجة إلى تفسير النتائج بحذر من نماذج الحقن المجهري الحيواني. يعد التقييم الشامل للنمو والصحة والسلوك أمرا ضروريا لتحديد مدى ملاءمة فئران الحقن المجهري للتطبيقات النهائية
توضح هذه البيانات مجتمعة فائدة بروتوكول الحقن المجهري للفأر لتوليد ذرية للدراسات بكفاءة ، مع تسليط الضوء أيضا على أهمية التقييم الشامل لنتائج النمط الظاهري في المشتقة من الحقن المجهري. تؤكد التشوهات الأيضية الخاصة بالجنس التي لوحظت في هذا المثال على الحاجة إلى تفسير دقيق للنتائج من نماذج فأر الحقن المجهري.
الشكل 1: رسم تخطيطي لتحضير الطبق لحقن المنوية داخل الهيولى في الفئران. تم تقسيم غطاء طبق زراعة الخلايا إلى نصفين علويين وسفلين. احتوى النصف العلوي على قطرات من محلول بولي فينيل بيروليدون بنسبة 10٪ لوضع المنوية. احتوى النصف السفلي على قطرات من وسط M2 لإجراء إجراء الحقن المجهري. تم تغطية جميع القطرات بالزيت المعدني لمنع التبخر. سمح إعداد الطبق هذا بالنقل المتسلسل للحيوانات المنوية والبويضات بين قطرات PVP و M2 لتمكين عملية الحقن المجهري. منعت المناطق المنفصلة خلط الوسائط أثناء العملية. الاختصارات: الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى. PVP = بولي فينيل بيروليدون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مستويات الجلوكوز العشوائية الأسبوعية في الدم في الفئران التي يتم تربيتها بشكل طبيعي (ن = 5) والحقن المجهري (ن = 5) أثناء تطور ما بعد الولادة. تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم أسبوعيا بعد الصيام طوال الليل من الوريد الذيل للفئران الضابطة والحقن المجهري باستخدام مقياس السكر تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل تحليل البيانات ثنائي الاتجاه ، ns ، P ±> 0.05. الاختصارات: SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى ؛ ns = غير مهم ؛ NM = التزاوج الطبيعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مستويات الجلوكوز في الدم الصائم الأسبوعية في السيطرة الطبيعية (ن = 7 للذكور ، ن = 7 للإناث) والفئران المعالجة بالحقن المجهري (ن = 7 للذكور ، ن = 7 للإناث) أثناء تطور ما بعد الولادة. بعد الصيام طوال الليل ، تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم أسبوعيا من الوريد الذيل للفئران الصائمة والمعالجة بالحقن المجهري باستخدام جهاز قياس السكر. لوحظ أن ذكور الفئران المعالجة بالحقن المجهري ، ولكن ليس الإناث ، أظهرت مستويات عالية بشكل كبير من الجلوكوز في الدم أثناء الصيام مقارنة بعناصر التحكم المتطابقة مع الجنس بدءا من 8 أسابيع من العمر. تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل تحليل الانبعاثات ± اتجاهين ، ns ، P > 0.05 ، ***P < 0.001 ، **** P < 0.0001). الاختصارات: SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى ؛ ns = غير مهم ؛ NM = التزاوج الطبيعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق في التحكم الطبيعي (ن = 5) والفئران الذكور المعالجة بالحقن المجهري (ن = 5) في عمر 16 أسبوعا. بعد صيام بين عشية وضحاها ، تلقت الفئران حقنة الجلوكوز داخل الصفاق (2 جم / كجم من وزن الجسم). ثم تم قياس مستويات الجلوكوز في الدم بعد 0 و 30 و 60 و 120 دقيقة بعد الحقن. أظهرت ذكور الفئران المعالجة بالحقن المجهري مستويات أعلى بكثير من الجلوكوز في الدم عند 30 و 60 و 120 دقيقة أثناء IPGTT مقارنة بالتحكم الطبيعي. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليلات باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. ns ، ص > 0.05. * ص < 0.05. الاختصارات: IPGTT = اختبار تحمل الجلوكوز داخل الصفاق ؛ SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى ؛ ns = غير مهم ؛ NM = التزاوج الطبيعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تتبع وزن الجسم للتحكم الذي يتم تربيته بشكل طبيعي (ن = 5 ذكور ، ن = 5 إناث) والفئران المعالجة بالحقن المجهري (ن = 5 ذكور ، ن = 5 إناث) من 4 إلى 20 أسبوعا من العمر. كشفت القياسات الأسبوعية أن كلا من الفئران التي عولجت بالحقن المجهري أظهرت زيادة كبيرة في وزن الجسم مقارنة بالضوابط المتطابقة بين الجنسين ، بدءا من عمر 8 أسابيع. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليلات باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. P < 0.001. ص < 0.0001. الاختصارات: SEM = الخطأ المعياري للمتوسط ؛ الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى ؛ ns = غير مهم ؛ NM = التزاوج الطبيعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البويضات | البيضة الملقحة | معدل التسميد (٪) | 2 خلية | معدل 2 خلية (٪) | 4-8 خلايا | 4-8 معدل الخلايا (٪) | مورلي | معدل مورولا | الكيسات الأريمية | معدل الكيسات الأريمية | |
| ذيل المنوية الحقن المجهري 1 | 90 | 84 | 93.33 | 76 | 90.48 | 72 | 85.71 | 69 | 82.14 | 64 | 76.19 |
| ذيل المنوية الحقن المجهري 2 | 80 | 72 | 90 | 62 | 86.11 | 59 | 81.94 | 53 | 73.61 | 46 | 63.89 |
| ذيل المنوية الحقن المجهري 3 | 60 | 50 | 83.33 | 42 | 84 | 37 | 74 | 32 | 64 | 28 | 56 |
| مجموع | 230 | 206 | 89.57 | 180 | 87.38 | 168 | 81.55 | 154 | 74.76 | 138 | 66.99 |
الجدول 1: الحصائل النمائية بعد الحقن المجهري للفأر. الاختصار: الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى.
| لا. | لا. من الأجنة المنقولة | لا. من الولادة (٪) | ذكر | أنثى | معدل المواليد (٪) |
| 1 | 6 | 3 | 3 | 0 | |
| 2 | 6 | 1 | 1 | 0 | |
| 3 | 5 | 2 | 0 | 2 | |
| 4 | 8 | 4 | 2 | 2 | |
| 5 | 8 | 2 | 1 | 1 | |
| 6 | 7 | 5 | 3 | 2 | |
| مجموع | 40 | 17 | 10 | 7 | 42.5 |
الجدول 2: حصائل الولادة بعد زرع الرحم لأجنة الفئران المجهرية. الاختصار: الحقن المجهري = حقن المنوية داخل الهيولى.
المناقشة
دمجت هذه الدراسة تقنيات حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) ونقل الأجنة (ET) لتلخيص شامل لتكنولوجيا الإنجاب بمساعدة الإنسان (ART) وفحص تأثير الحقن المجهري بالاقتران مع ET على نمو النسل. أسفر تطبيق تقنية الحقن المجهري مع المنوية الطبيعية للفئران عن إخصاب مرتفع (86.76٪) ومعدلات خليتين (88.48٪). بعد ET ، بلغ معدل ولادة الفئران ذات النسل حوالي 42.50٪ ، مما يشير إلى متانة المنصة التقنية. كانت النتيجة الأكثر شهرة لهذه الدراسة هي التذبذب المرتبط بالعمر في مستويات استقلاب الجلوكوز في نسل الحقن المجهري ، والذي يمكن أن يعزى إلى تطبيق تقنية الحقنالمجهري 6.
تشكل التقلبات الملحوظة في مستويات استقلاب الجلوكوز اكتشافا رائعا في هذه الدراسة. تشير هذه النتيجة إلى الآثار المحتملة طويلة المدى لتقنية الحقن المجهري على صحة النسل ، وتحديدا فيما يتعلق باستقلاب الجلوكوز7. لتوضيح الأسباب الكامنة وراء هذه الظاهرة ، أجرينا فحصا شاملا للخطوات الفنية المحورية التي يشملها إجراء الحقن المجهري. وجدنا أن التحكم في درجة حرارة الحقن المجهري (19 درجة مئوية) ، ومدة القطع بالموجات فوق الصوتية (في غضون 5 ثوان) ، وحجم سائل النقل (<0.5 سم) كانت مهمة للحفاظ على بقاء الجنين المرتفع ومعدلات الزرع. ظهر التحكم في تأثير السحب لماصة النقل كخطوة حاسمة لنقل الأجنة بدقة. عند تحضير ماصة النقل ، يعد ضمان التوحيد في قطر الأنبوب أمرا أساسيا للتخفيف من تأثير السحب والتحكم بشكل أفضل في حركة السائل داخل الأنبوب. هذا الإجراء مفيد في تعزيز معدل نجاح ودقة نقل الأجنة. علاوة على ذلك ، ساعد تجنب الزراعة الممتدة في المختبر والاكتظاظ أثناء نقل الأجنة أيضا على تحسين الكفاءة التنموية. باستخدام البروتوكولات المحسنة ، حققنا معدل إخصاب قدره 86.76٪ ومعدل ولادة 42.50٪ بعد ET ، مما يشير إلى أن إجراء الحقن المجهري نفسه لم يضعف بطبيعته الجدوى. لذلك ، كانت التقلبات في استقلاب الجلوكوز مرتبطة بشكل أكثر منطقية بالتغيرات الطفيفة داخل الخلايا التي تسببها عملية العلاج المضاد للفيروسات القهقرية بدلا من تلف الجنين العلني.
في حين ينظر إلى العلاج المضاد للفيروسات القهقرية على نطاق واسع على أنه آمن ، تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه حتى النسل المضاد للفيروسات القهقرية الذي يبدو طبيعيا قد يظهر مخاطر صحية مختلفة في وقت لاحق من الحياة بسبب الخصائص التناسلية غير الطبيعية والفترات الحرجة للتدخل أثناء نمو الأمشاج والأجنة5،8،9،10،11،12،13. توفر النتائج التي توصلنا إليها رؤى جديدة حول التأثيرات الأيضية المحتملة للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية وتسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من الدراسات حول التأثيرات طويلة المدى للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية على صحة النسل14.
من الضروري الاعتراف بأن هذه الدراسة استخدمت نموذج الفئران. وبالتالي ، قد لا تكون النتائج قابلة للتحويل مباشرة إلى البشر. ومع ذلك ، نظرا لأوجه التشابه البيولوجية الكبيرة بين الفئران والبشر ، تحتفظ هذه النتائج بأهمية مرجعية كبيرة15. علاوة على ذلك ، من المهم الاعتراف بأن المرضى الذين يخضعون للحقن المجهري في الممارسة السريرية غالبا ما يعانون من تشوهات في المنوية. على العكس من ذلك ، استخدمت هذه الدراسة الفئران الطبيعية لإجراءات الحقن المجهري ، وبالتالي تفتقر إلى البيانات عن نسل الحقن المجهري من الفئران المصابة بتشوهات المنوية. ومع ذلك ، فمن المعقول توقع أن تشوهات المنوية سيكون لها تأثير أكثر عمقا على الآثار طويلة المدى لتقنية الحقن المجهري. ومن ثم ، فإن نتائج هذه الدراسة تحافظ على ميزة مرجعية ملحوظة.
قيد آخر لدراستنا هو التناقض المنهجي بين نموذج الفئران والممارسات السريرية البشرية في تثبيت المنوية. في التطبيق السريري للحقن المجهري ، من الشائع شل حركة المنوية البشرية عن طريق تعطيل الذيل جسديا باستخدام ماصة دقيقة. ومع ذلك ، في تجاربنا على نموذج الفئران ، استخدمنا قص الذيل بالموجات فوق الصوتية لتحضير المنوية ، وهي طريقة تستخدم بشكل روتيني في التلاعب بجنين الفئران. نحن نقر بأن هذا النهج قد يؤدي عن غير قصد إلى حدوث تباين وتحيز محتمل في النموذج ، لا سيما بالنظر إلى الضرر المحتمل لسلامة المنوية ووظيفتها التي قد تسببها الموجات فوق الصوتية. قد يحد هذا الاختلاف المنهجي من قابلية الترجمة المباشرة للنتائج التي توصلنا إليها. في عملنا المستقبلي ، نخطط لاستكشاف استخدام الماصات الدقيقة لتعطيل ذيول المنوية للفأر. يهدف هذا التعديل إلى تقليل أي آثار غير مقصودة على المنوية وتكرار الظروف والنتائج التي لوحظت في إجراءات الحقن المجهري البشري بشكل أفضل. نحن ملتزمون بالتحسين المستمر لممارساتنا البحثية لتعزيز الأهمية السريرية لنتائجنا.
بناء على المنصة التكنولوجية المذكورة أعلاه ، في البحث المستقبلي ، سنحقق بشكل أكبر في تأثير تقنية الحقن المجهري على جوانب أخرى من صحة النسل ، مثل صحة القلب والأوعية الدموية وجهاز المناعة. علاوة على ذلك، فإن دراسات المتابعة طويلة الأجل ضرورية أيضا لفهم الآثار طويلة المدى للحقن المجهري بشكل شامل.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال خطة المشروع الرئيسية لصندوق التنمية الخاصة لمنطقة عرض الابتكار الوطنية المستقلة في شنغهاي تشانغجيانغ (ZJ2022-ZD-006) ، ومشروع التمويل المستهدف للجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (22DX1900400) ، وبرنامج الشباب التابع للجنة الصحة ببلدية شنغهاي (20204Y0276). المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070849).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.25٪ أفيرتين (2،2،2-ثلاثي بروموإيثانول) | نانجينغ أيبي | M2960 | للتخدير |
| أطباق بتري البكتريولوجية 35 × 10 مم مع غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ، | بكتريولوجية BD | 353001 | |
| 50 × 9 مم نمط مع غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ، | الحيوية BD 351006 | ||
| ESCO | الفئة  | عمليات BSC المعقمة ، وصنع أطباق الاستزراع ، ونقل الكواشف ، وما إلى ذلك. | |
| حاضنة CO2 | Thermo | 8000DH | مجهر تشريح ثقافة الأجنة |
| أوليمبوس | SZX16 | يستخدم في نقل أجنة الفأر | |
| Fluorinert Fc-770 | SIGMA | F3556 | Fluorinert FC-770 عبارة عن سائل مفلور بالكامل مستقر حراريا مع قوة عازلة عالية ومقاومة ، ويستخدم كجهاز قياس السكر المحمول |
| باليد Roche | AccuChek performa | Blood قياس الجلوكوز | |
| HTF | Merck | MR-070-D | يتوفر سائل البوق البشري EmbryoMax (HTF) (1x) ، السائل المصمم للاستخدام مع Mouse IVF بتنسيق 50 مل وقد تم تحسينه والتحقق من صحته لزراعة الأجنة. |
| حاقن دقيق هيدروليكي | Eppendorf | CellTram 4r Oil ، 5196000030 | لحقن المنوية |
| المجهر المقلوب | Nikon | TI2-U | مضيف مراقبة التلاعب الدقيق |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x) ، مسحوق ، بدون فينول أحمر ، 5 × 10 مل |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 متوسط (1x) ، سائل ، مع معالج دقيق أحمر الفينول |
| NARISHIGE | NTX-N4 | ذراع التلاعب | |
| الزيوت المعدنية | SIGMA | M8410 | مناسبة للاستخدام كطبقة غطاء للتحكم في التبخر والتلوث المتبادل في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة. |
| قاطع إبرة | نانجينغ أيبي | سوتر MF-800 | استخدم لتصنيع إبر التلاعب الدقيق |
| مجتذب إبرة | نانجينغ أيبي | سوتر موديل p-100 | استخدم لصنع إبر التلاعب الدقيق |
| Piezo Drill Trip Mouce ICSI | Eppendorf | 5195000.087 | تطبيق إبرة حقن الحقن المجهري. |
| معالج دقيق كهرضغطية (قاطع الغشاء) | Eppendorf | Eppendorf PiezoXpert | استخدام النبضات الدقيقة لكسر المنطقة الشفافة وأوليما البويضة |
| حاقن دقيق هوائي | Eppendorf | CellTram 4r Air ، 5196000013 | لتثبيت البويضة |
| موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية الجاهزة للاستخدام (Hcg) كاشف | التعقيم Nanjing Aibei | M2520 | ، الحقن داخل الصفاق. 50 وحدة دولية / مل |
| مصل الفرس الحامل جاهز للاستخدام (PMSG) | التعقيم Nanjing Aibei | M2620 | ، الحقن داخل الصفاق. 50 وحدة دولية / مل |
| مجهر مجسم | أوليمبوس | SZX7 | استرجاع البويضات ومراقبة تطور الجنين |
المراجع
- Palermo, G., Joris, H., Devroey, P., Van Steirteghem, A. C. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet. 340 (8810), 17-18 (1992).
- Flurkey, K. M., Currer, J., Harrison, D. E. Vol. III Mouse models in aging research. Ch. 20. The mouse in biomedical research (second edition). Fox, J. G., et al. , Academic Press. Burlington. 637-672 (2007).
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (art). J Dev Orig Health Dis. 8 (4), 388-402 (2017).
- Heber, M. F., Ptak, G. E. The effects of assisted reproduction technologies on metabolic health and diseasedagger. Biol Reprod. 104 (4), 734-744 (2021).
- Ma, R. C. W., Ng, N. Y. H., Cheung, L. P. Assisted reproduction technology and long-term cardiometabolic health in the offspring. PLoS Med. 18 (9), e1003724(2021).
- De Waal, E., et al. The cumulative effect of assisted reproduction procedures on placental development and epigenetic perturbations in a mouse model. Hum Mol Genet. 24 (24), 6975-6985 (2015).
- Carlin, J., George, R., Reyes, T. M. Methyl donor supplementation blocks the adverse effects of maternal high fat diet on offspring physiology. PLoS One. 8 (5), e63549(2013).
- Hiraoka, K., et al. Piezo-icsi for human oocytes. J Vis Exp. (170), e60224(2021).
- Sullivan-Pyke, C. S., Senapati, S., Mainigi, M. A., Barnhart, K. T. In vitro fertilization and adverse obstetric and perinatal outcomes. Semin Perinatol. 41 (6), 345-353 (2017).
- Luke, B., et al. The risk of birth defects with conception by art. Hum Reprod. 36 (1), 116-129 (2021).
- Norrman, E., et al. Cardiovascular disease, obesity, and type 2 diabetes in children born after assisted reproductive technology: A population-based cohort study. PLoS Med. 18 (9), e1003723(2021).
- Goldsmith, S., Mcintyre, S., Badawi, N., Hansen, M. Cerebral palsy after assisted reproductive technology: A cohort study. Dev Med Child Neurol. 60 (1), 73-80 (2018).
- Hansen, M., et al. Intellectual disability in children conceived using assisted reproductive technology. Pediatrics. 142 (6), e20181269(2018).
- Chang, R. C., Wang, H., Bedi, Y., Golding, M. C. Preconception paternal alcohol exposure exerts sex-specific effects on offspring growth and long-term metabolic programming. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 9(2019).
- Grasemann, C., et al. Parental diabetes: The akita mouse as a model of the effects of maternal and paternal hyperglycemia in wildtype offspring. PLoS One. 7 (11), e50210(2012).
إعادة الطباعة والأذونات
