يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقنيات الزراعة في المختبر لنمذجة تكوين عضويات الكبد ، وبناء التجمعات ، وتصميم الأنسجة الاصطناعية باستخدام خطوط الخلايا البشرية

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66229

⸱

أبريل 18, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

تحدث العضيات ثورة في نمذجة الأنسجة الشخصية لتطوير الأعضاء واكتشاف الأدوية وأبحاث الأمراض. تتقدم الهندسة العضوية في إنشاء أنسجة اصطناعية معقدة. الهدف هو دمج التشكل وتكنولوجيا التجميع والمصفوفات الحيوية لتطوير هندسة الأنسجة. يساعد هذا البروتوكول في نمذجة تكوين أعضاء الكبد ووضع مبادئ توجيهية لبناء الأنسجة الاصطناعية.

الملخص

وصل مرض الكبد المزمن إلى أبعاد وبائية، حيث أثر على أكثر من 800 مليون شخص على مستوى العالم. العلاج الحالي ، زراعة الكبد تقويم العظام ، له العديد من القيود. ظهرت حلول واعدة في مجال الطب التجديدي للكبد ، حيث يمتلك تكوين أعضاء الكبد إمكانات كبيرة. يتضمن تكوين أعضاء الكبد المبكر ، الذي يحدث بين E8.5 و 11.5 ، تكوين تفاعلات ظهارية متوسطة تؤدي إلى التشكل وتكوين الحبل الكبدي والهجرة الجماعية. ومع ذلك ، هناك نقص في طرق النمذجة المختبرية لهذه العملية. في هذه الدراسة ، يتم تقديم سلسلة مفصلة من الأساليب ، مما يتيح نمذجة المراحل والجوانب المختلفة لتكوين أعضاء الكبد باستخدام خطوط الخلايا البشرية. في سلسلة طرق واحدة ، يتم استخدام تقنية التجميع مع الكرات الكبدية (HEP) واللحمة المتوسطة (MES) ، وتكرار الهياكل المبكرة الموجودة في تكوين أعضاء الكبد ، ونمذجة التشكل المبكر ، وإظهار هجرة الخلايا الخلالية كما هو موضح في الجسم الحي. تساعد أنظمة التجميع المبتكرة هذه في تحديد العوامل التي تؤثر على تكوين التجميع والهجرة. كما تم استخدام أنظمة الزراعة الكروية HEP لنمذجة الهجرة الجماعية والتشكل المتفرع. تلعب الوسائط المكيفة باللحمة المتوسطة (M-CM) دورا مهما في بدء الهجرة المتفرعة المعتمدة على الجرعة. تبين أن جميع الطرق المعروضة قابلة للتكرار بدرجة عالية مع معدل نجاح مرتفع. من خلال ربط هذه الأحداث معا ، سيمكن عملنا من إعادة إنشاء الأحداث المتسلسلة والمورفوجينية لعكس هندسة تكوين الأعضاء في المختبر وفي الجسم الحي.

المقدمة

< p class = "jove_content" > تلعب هجرة خلايا الكبد دورا مهما في تكوين أعضاء الكبد والأمراض والعلاج بالخلايا. أثناء تكوين عضويات الكبد (E8.5-9.0 ، الفأر) ، تبدأ ظهارة ما قبل الكبد في الأمعاء الأمامية البطنية في التعبير عن جينات الكبد بسبب الإشارات الاستقرائية المنبعثة من اللحمة المتوسطة المحيطة والقلب. في E9.0 ، تتكاثف ظهارة المعى الأمامي مع انتقال الخلايا من شكل متوازي المستطيلات إلى مورفولوجيا عمودية كاذبة ، وتشكل رتج الكبد < فئة sup = "xref" >1،< sup class = "xref" >2. في هذه المرحلة الحرجة ، يتكون رتج الكبد من ~ 1,500 خلية فقط. بعد ذلك ، يثخن الأديم الباطن الكبدي المبطن لرتج الكبد ، ويتفكك ، ويشكل حبال من الخلايا الكبدية المهاجرة (HBs). تهاجر هذه HBs مع الخلايا البطانية والخلايا الوسيطة ، وتتفرع إلى الأنسجة الوسيطة المحيطة ، وتبدأ في هجرة الخلايا الجماعية ثلاثية الأبعاد لتشكيل برعم الكبد < فئة sup = "xref" >3،< sup class = "xref">4. في الواقع ، خلال هذه المرحلة ، تخضع الخلايا بشكل جماعي ل (1) الهجرة المشتركة ، أو الحركة مع أنواع الخلايا الأخرى ، (2) التشكل المتفرع أو تشكيل هياكل متفرعة تشبه الأنبوب ، و (3) الهجرة الخلالية ، أو الهجرة فوق الخلايا الأخرى أو بينها. بحلول E11.5 ، تتوقف الهجرة ، وتشكل الكبد البدائي ، ويتوسع 103 أضعاف < فئة sup = "xref" >3. قد تكون هجرة خلايا الكبد مطلوبة أيضا في مراحل لاحقة من تكوين أعضاء الكبد ، حيث أظهر تعبير HBs لجنين الفئران دليلا على جينات عالية التنظيم مرتبطة بهجرة الخلايا الجماعية ثلاثية الأبعاد ، والتشكل ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية< فئة sup = "xref">5. بالإضافة إلى دورها في تكوين أعضاء الكبد المبكر ، ترتبط الهجرة الجماعية ثلاثية الأبعاد ارتباطا وثيقا بالانتشار المحلي والورم الخبيث لسرطان الخلايا الكبدية المتقدم (HCC) ، مما يؤدي في النهاية إلى تفاقم التشخيص وزيادة مقاومة العلاج < فئة الدعم = "xref" >6. تستخدم خلايا الكبد البالغة والجنينية أيضا الهجرة الجماعية عند الانتقال من الطحال إلى داخل الكبد أثناء إعادة توطين الكبد. أظهرت دراسات التصوير في الجسم الحي أن خلايا الكبد المزروعة تدخل الوريد البابي ثم الشعيرات الدموية في غضون ساعات ، وتهاجر عبر الجيوب الأنفية للكبد وعبر أنسجة الكبد< فئة الدعم = "xref">7،< فئة الدعم = "xref">8،< فئة الدعم = "xref">9. أخيرا ، تظهر الدراسات الحديثة أن هجرة HBs تنشأ أثناء تجديد الفئران والكبد البشري ، مع بعض الأدلة على الحركة في الأوراق < sup class = "xref" >10. بشكل عام ، تلعب الهجرة الجماعية للكبد ، القادرة على أنماط متعددة من التشكل ، دورا مهما في تكوين الأعضاء والسرطان وعلاج خلايا الكبد وتجديد الكبد.

استكشفت العديد من الدراسات الجينية المسارات الجزيئية الكامنة وراء الهجرة الجماعية لخلايا الكبد ثلاثية الأبعاد. تكشف هذه الدراسات أن غياب الحبل الكبدي يعيق تكوين الكبد ، مما يؤكد ضرورة تكوين الحبل الكبدي وتفاعلاتها مع الخلايا الداعمة لتكوين الكبد < فئة الدعم = "xref" >1 ، < sup class = "xref" > 11 ، < sup class = "xref" > 12 ، < sup class = "xref" >13. تظهر هذه الدراسات أيضا أن نمو الكبد يبدأ بعوامل مختلفة ، بما في ذلك FGF-2 الذي يفرز من الأديم المتوسط القلبي ، و BMP4 الذي يفرز من اللحمة المتوسطة المحيطة ، و HGF ، وتفاعلات الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب عوامل النسخ المرتبطة بالترحيل ، بما في ذلك HEX و PROX1 و TBX3 ، أدوارا حاسمة < فئة الدعم = "xref" >2،< sup class = "xref" >14. في الختام ، تقدم الدراسات الجينية دليلا على أن إشارات العوامل القابلة للذوبان ، والتي تؤدي إلى التعبير عن عامل النسخ ، تدفع الهجرة والإشارات والتفاعلات الجزيئية بين HBs واللحمة المتوسطة المحيطة بها.

< p class = "jove_content"> بينما تم التحقيق على نطاق واسع في هجرة الخلايا في تكوين أعضاء الكبد المبكر ، غالبا ما تستخدم الدراسات الحالية في المختبر للهجرة الكبدية فحوصات ثنائية الأبعاد باستخدام خلايا HCC عالية الارتحال جنبا إلى جنب مع نماذج الورم في الجسم الحي< فئة sup = "xref">15. قدمت هذه الدراسات نظرة ثاقبة للعديد من العوامل التي تؤثر على الهجرة الكبدية ، بما في ذلك TGFβ-116 ، c-Myc17 ، YAP18 ، goosecoid < sup class = "xref" >19 ، actopaxin < sup class = "xref" >20 ، و miRNAs21 ، < sup class = "xref" >22 ، < sup class = "xref" >23. على الرغم من إحراز تقدم جدير بالملاحظة في فهم الآليات الجزيئية في هجرة الخلايا الكبدية ثلاثية الأبعاد ، إلا أن التفاوتات المميزة بين الهجرة الخلوية ثنائية الأبعاد و 3D تشير إلى أن المقايسات ثنائية الأبعاد لها قيود متأصلة. علاوة على ذلك ، غالبا ما تفتقر هذه النماذج إلى إدراج أنواع الخلايا الوسيطة ، والتي تعتبر ضرورية لكل من الهجرة والنمو. على الرغم من التقدم في تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد لهجرة الكبد تدمج اللحمة المتوسطة الداعمة ، إلا أن هذه النماذج تؤكد في المقام الأول على الهجرة المشتركة بدلا من استكشاف الأنماط المتنوعة للهجرة الجماعية.

< p class = "jove_content">القدرة على توليد الأنسجة من الكرويات من خلال عمليات التجميع الذاتي والمورفوجيني المختلفة تسهل الاستكشاف العلمي للأنسجة الاصطناعية. هذه الأنسجة لها تطبيقات واسعة في تطوير الأدوية وفحصها ، ونمذجة الأمراض ، والعلاج ، وغيرها من التطبيقات الطبية الحيوية والتكنولوجيا الحيوية. يتم توفير التفاصيل المنهجية للعديد من أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد في المختبر المصممة لعرض أنماط مختلفة من الهجرة الجماعية ثلاثية الأبعاد للكبد. تشتمل هذه الأنظمة على (1) مزرعة كروية مشتركة مع كرويات HEP و MES في مصفوفة ، (2) قطرات مصفوفة كروية HEP مستزرعة ب M-CM ، (3) الكرات الكروية المختلطة HEP-MES ، و (4) المصفوفة الكروية HEP المزروعة بكثافة عالية من خلايا MES. تتيح هذه الأنظمة النمذجة القوية للهجرة الجماعية للكبد في بيئة ثلاثية الأبعاد ، وبالتالي تعزيز فهمنا للعمليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تكوين أعضاء الكبد والسرطان والعلاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد. يتم تعريف الاختصارات المستخدمة في هذه المقالة في الملف التكميلي 1.

< p class = "jove_title" >1. تحضير محلول الاغاروز منخفض التناضح الكهربائي (EEO) بنسبة 1٪

  1. تزن 2.5 جم من مسحوق الاغاروز منخفض EEO وانقله إلى دورق
    ملاحظة: تأكد من أن الدورق يبلغ ضعف حجم الحجم المطلوب على الأقل لاستيعاب الفقاعات أثناء تحضير المحلول.
  2. استخدم أسطوانة متدرجة لقياس 250 مل من الماء المقطر واسكبها في الدورق ، بهدف التركيز النهائي (وزن / حجم) 1٪.
  3. قم بتغطية فتحة الدورق بغلاف بلاستيكي ، مع ترك ثقب صغير للتهوية. سخني الدورق في الميكروويف لمدة 30 ثانية.
  4. قم بإزالة الدورق بعناية وقم بتدوير المحتويات. كرر هذه العملية كل 30 ثانية حتى الذوبان الكامل.
    تنبيه: تعامل مع الأواني الزجاجية المطبوخة في الميكروويف بعناية باستخدام القفازات المناسبة. راقب المحلول عن كثب لمنع ارتفاع درجة الحرارة أو الغليان.
  5. بمجرد تحقيق محلول متجانس ، قم بإزالة الدورق من الميكروويف. حرك المحلول برفق قبل نقله إلى زجاجة معقمة مسبقا. قم بتعقيم المحلول وتخزين محلول الاغاروز في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
فئة < p = "jove_title" >2. طلاء لوحة 96 بئر

ملاحظة: يمكن استخدام الصفائح الدقيقة الكروية المتصلة ب 384 جيدا في هذه التجارب والمزيد من التجارب.

  1. قم بفك غطاء الزجاجة الذي يحتوي على محلول الاغاروز المعقم بنسبة 1٪. قم بتسخين المحلول في الميكروويف على فترات 30 ثانية حتى ينتقل إلى المرحلة السائلة ؛ ثم شد الغطاء.
    تنبيه: تعامل مع الأواني الزجاجية المطبوخة في الميكروويف بعناية باستخدام القفازات المناسبة. راقب المحلول عن كثب لمنع ارتفاع درجة الحرارة أو الغليان الزائد.
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي المعقم لزراعة الأنسجة.
  2. انقل 55-65 ميكرولتر من محلول الاغاروز بنسبة 1٪ لكل بئر لتغطية الصفيحة المزروعة بالأنسجة المكونة من 96 بئر وقم بتدوير اللوحة على الفور.
  3. بمجرد نقل محلول الاغاروز بنسبة 1٪ إلى العدد المطلوب من الآبار ، ضع الأطباق في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح للأغاروز بالتصلب. قبل الاستخدام ، أحضر الطبق إلى درجة حرارة الغرفة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 أ).
< p class = "jove_title" >3. تحضير كرويات HEP

  1. قم بزراعة خلايا HepG2-WT في قارورة T-75 باستخدام وسط النمو المكتمل (cDMEM) الذي يتكون من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco ، مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (Pen-Strep). حافظ على زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، وتغيير وسط النمو يوميا.
  2. عند الوصول إلى 80٪ من التقاء ، اشطف الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) وتخلص من الشطف. أضف 5 مل من 0.05٪ من Trypsin-EDTA إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5-10 دقائق.
  3. أضف كميات متساوية من cDMEM واغسل الخلايا من القارورة. بمجرد فصل الخلايا ، انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي الموضحة في هذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT). ومع ذلك ، يمكن إجراء إجراءات الطرد المركزي هذه بدلا من ذلك في درجات حرارة باردة.
  4. أعد تعليق تعليق الخلية في cDMEM جديد وعد الخلايا لتحديد التركيز النهائي في الخلايا / مل (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 ب).
  5. صبغة العلامات على الخلايا
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية.
    1. انقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط نمو خال من المصل لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 106 خلايا / مل. أضف 5 ميكرولتر من محلول وضع العلامات على الخلايا الفلورية لكل مل من تعليق الخلية واحتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند الدوران لمدة 20 دقيقة < br / > ملاحظة: وسط النمو الخالي من المصل هو DMEM ويتم استكماله فقط بنسبة 1٪ من البكتيريا العقدية. اضبط وقت الحضانة للتلوين المنتظم بناء على كثافة تعليق الخلية.
    3. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في cDMEM الطازج. كرر عملية الغسيل هذه مرتين أخريين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 ج).
  6. تشكيل كروي
    1. قم بتعليق الخلايا في cDMEM الطازج لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 5.0 × 104 خلايا / مل بناء على عدد الخلايا. امزج تعليق الخلية جيدا وانقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر إلى لوحة 96 بئر مطلية ب agarose.
      ملاحظة: تم تعيين كثافة تعليق الخلية لتحقيق 5,000 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئرا المطلية بالأغاروز. لاستخدام ألواح 384 بئرا ، يتم تعليق الخلايا بتركيز نهائي يبلغ 2.0 × 105 خلايا / مل ، ويتم نقل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر لتحقيق تركيز 10,000 خلية لكل بئر.
    2. قم بالطرد المركزي للوحة عند 340 × جم لمدة 10 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5-9 أيام (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 د).
      ملاحظة: قم بتغيير وسط النمو كل يومين بعد الطلاء ، وقم بإزالة 50٪ من cDMEM برفق واستبداله. الكرات الكروية HEP مناسبة لنموذج تجميع HEP-MES أو نموذج M-CM.
< p class = "jove_title" >4. تحضير MES الكروية

  1. قم بزراعة خلايا HFF / MRC-5 في قارورة T-175 باستخدام cDMEM الذي يتكون من DMEM ، مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ Pen-Strep. حافظ على زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، وقم بتغيير الوسط كل يومين.
  2. عند الوصول إلى 80٪ من التقاء ، قم بشطف الخلايا باستخدام 1x PBS وتخلص من الشطف. أضف 5 مل من 0.25٪ من Trypsin-EDTA إلى القارورة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5-10 دقائق.
  3. أضف كميات متساوية من cDMEM واغسل الخلايا من القارورة. بمجرد انفصال الخلايا ، انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لمعلق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. أعد تعليق تعليق الخلية في cDMEM جديد وعد الخلايا لتحديد التركيز النهائي في الخلايا / مل (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 ب).
  5. صبغة العلامات على الخلايا
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية.
    1. انقل الكمية المطلوبة من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط نمو خال من المصل لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 106 خلايا / مل. أضف 5 ميكرولتر من محلول وضع العلامات على الخلايا الفلورية لكل مل من تعليق الخلية واحتضان تعليق الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند الدوران لمدة 20 دقيقة < br / > ملاحظة: وسط النمو الخالي من المصل هو DMEM ويتم استكماله فقط بنسبة 1٪ من البكتيريا العقدية. اضبط وقت الحضانة للتلوين المنتظم بناء على كثافة تعليق الخلية.
    3. بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في cDMEM الطازج. كرر عملية الغسيل هذه مرتين أخريين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 ج).
  6. تشكيل كروي
    1. قم بتعليق الخلايا في cDMEM الطازج لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 105 خلايا / مل بناء على عدد الخلايا. امزج تعليق الخلية جيدا وانقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر إلى لوحة 96 بئر مطلية ب agarose.
      ملاحظة: تم تعيين كثافة تعليق الخلية لتحقيق كثافة 10,000 خلية لكل بئر في الصفيحة المكونة من 96 بئرا المطلية بالأغاروز.
    2. قم بالطرد المركزي للوحة عند 340 × جم لمدة 10 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5-9 أيام (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 د).
      ملاحظة: قم بتغيير وسط النمو كل يومين بعد الطلاء ، وقم بإزالة 50٪ من cDMEM برفق واستبداله. الكرويات MES مناسبة لنموذج تجميع HEP-MES.
< p class = "jove_title" >5. تشكيل مجموعة HEP-MES

ملاحظة: ارجع إلى الخطوة 3 والخطوة 4 لتشكيل HEP (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 أ) وفرويات MES (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 ب).

  1. اجمع الكرويات HFF / MRC-5 بشكل فردي باستخدام ماصة من اللوحة المكونة من 96 بئرا. انقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل يحتوي على cDMEM طازج. اترك الكرات الكروية تستقر في الأنبوب لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها برفق باستخدام cDMEM.
    ملاحظة: قم بإجراء عملية الشطف برفق وبعناية.
  2. انقل كرويا واحدا من HFF / MRC-5 برفق باستخدام ماصة إلى بئر يحتوي على كروي HepG2-WT. أضف عامل النمو المثلج البارد المخفض (GFR) Matrigel (MG) أو كولاجين ذيل الفئران (CG) في تخفيف 1: 1 و 1: 5 واحتضانه عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة 3 ساعات (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2C).
    ملاحظة: قم بإذابة الثلج طوال الليل على الثلج في ثلاجة من 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية. تأكد من استخدام الماصات والنصائح والأنابيب المبردة مسبقا عند التعامل مع MG، لأنها تشكل مادة هلامية أعلى من 10 درجات مئوية.
  3. بعد الحضانة ، أضف 75 ميكرولتر من cDMEM الطازج إلى كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة 2-3 أيام.
    ملاحظة: قم بتغيير وسط النمو كل يومين بعد الطلاء ، وقم بإزالة 50٪ من cDMEM برفق واستبداله. ستظل التجميعات تتشكل دون تغييرات في الوسائط لمدة تصل إلى 3-4 أيام. يمكن أن يحدث تكوين مجموعة HEP-MES دون استخدام المصفوفة.
فئة

6. تكوين قطرات كروية HEP

ملاحظة: ارجع إلى الخطوة 3 لتكوين كرويات HEP (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 أ). يمكن استخدام مادتين مختلفتين لتعليق كرويات HEP في القطرات. وترد أدناه الطريقتان.

  1. قطرات GFR MG
    1. اجمع الكرات الكروية HepG2-WT بشكل فردي باستخدام ماصة من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، مما يسمح لها بالاستقرار في جهاز طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل على الجليد.
    2. في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم منفصل سعة 15 مل ، امزج 1 مل من GFR MG المثلج ووسط النمو للتحكم في البرودة المثلجة عند تخفيف 1: 1. استنشق الوسط باستخدام ماصة من أنبوب سعة 15 مل يحتوي على كرويدات HepG2-WT وضعها على الثلج.
      ملاحظة: قم بإذابة الثلج طوال الليل على الثلج في ثلاجة من 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية. تأكد من تبريد الماصات والنصائح والأنابيب مسبقا عند التعامل مع MG، لأنها تشكل مادة هلامية أعلى من 10 درجات مئوية.
    3. أضف حل MG إلى HepG2-WT الكروية ، مما يضمن توزيعا كرويا متساويا داخل حل MG.
    4. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع حجما 15 ميكرولتر من كروي واحد في محلول MG وقم بزرعه ببطء في طبق بتري مقاس 60 مم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 ب).
      ملاحظة: إذا تم زرع أكثر من كروي واحد لكل قطرة ، فقم بإزالته وإعادة البذر بشكل صحيح. يتم إعادة وضع الكرويات إذا لزم الأمر للتأكد من أنها في وسط القطرة. للحصول على البذر الكروي الأمثل، ضع في اعتبارك استخدام سحب العينات العكسي لتقليل تكوين فقاعات الهواء.
  2. ذيل الفئران CG قطرات
    ملاحظة: يجب أن يتم تحضير كل CG على الثلج.
    1. اجمع الكرويات HepG2-WT بشكل فردي باستخدام ماصة من اللوحة المكونة من 96 بئرا ، مما يسمح لها بالاستقرار في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل على الجليد (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3 ب).
    2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، أضف 358.8 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، و 100 ميكرولتر من 10x PBS ، و 12.1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، و 529.1 ميكرولتر من ذيل الفئران CG لحجم إجمالي قدره 1 مل < br / > ملاحظة: يجب دائما إضافة CG ذيل الفئران في النهاية.
    3. أضف حل CG إلى HepG2-WT الكروية ، مما يضمن توزيعا كرويا متساويا داخل حل CG.
    4. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع حجما 15 ميكرولتر من كروي واحد في محلول CG وقم بزرعه ببطء في طبق بتري مقاس 60 مم.
      ملاحظة: إذا تم زرع أكثر من كروي واحد لكل قطرة ، فقم بإزالته وإعادة البذر بشكل صحيح. يتم إعادة وضع الكرات للتأكد من أنها في وسط القطرة. للحصول على البذر الكروي الأمثل، ضع في اعتبارك استخدام سحب العينات العكسي لتقليل تكوين فقاعات الهواء.
  3. احتضان القطرات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 60 دقيقة قبل إضافة وسط النمو.
  4. أضف ببطء 5 مل من وسط النمو المطلوب إلى طبق بتري واحتضنه عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 مع تغيرات وسط النمو كل ثلاثة أيام (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3C).
    ملاحظة: تم استخدام M-CM في مقايسة تكوين قطرات HEP.
< p class = "jove_title" >7. تحضير M-CM

  1. احصد خلايا HFF / MRC-5 وبذرها في قارورة معالجة بزراعة الأنسجة T-75 بكثافة بذر تبلغ 5,000 خلية / سم2 واحتضان القارورة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 72 ساعة في 15 مل من cDMEM.
    ملاحظة: راقب القارورة خلال هذه الفترة لضمان صحة الخلايا المثلى.
  2. بعد الحضانة لمدة 72 ساعة ، اجمع M-CM في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل. جهاز الطرد المركزي M-CM عند 290 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام والتصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر للتعقيم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4 أ).
  3. قم بتخفيف M-CM بوسط نمو كامل بنسبة تخفيف 1: 1 إلى 1: 7 وأضفه إلى التجربة المطلوبة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 4 ب).
    ملاحظة: استخدم M-CM في مقايسة تكوين قطرات HEP.
فئة

8. تكوين كروي مختلط HEP-MES

ملاحظة: راجع الخطوات 3.1-3.5. لتحضير تعليق خلية HepG2-WT والخطوات 4.1 - 4.5 لإعداد تعليق الخلايا HFF / MRC-5.

  1. قم بتعليق خلايا HepG2-WT في cDMEM الطازج لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 105 خلايا / مل لكل معلق خلية.
  2. قم بتعليق خلايا HFF / MRC-5 في cDMEM طازج لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 105 خلايا / مل لكل معلق خلية.
  3. انقل معلقات الخلايا HepG2-WT و HFF / MRC-5 إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل بنسبة 1: 1 للحصول على تركيز نهائي يبلغ 2.0 × 105 خلايا / مل. امزج معلق الخلية جيدا وانقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر إلى لوحة 96 بئر مطلية بالأغروز.
    ملاحظة: تم تعيين كثافة تعليق الخلية للحصول على 20,000 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئرا المطلية بالأغاروز.
  4. قم بالطرد المركزي للوحة عند 340 × جم لمدة 10 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1-2 أيام (<فئة قوية = "xfig" > الشكل 5 ج).
  5. إضافة هيدروجيل الفيبرين
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية يتم إجراؤها في غضون 72 ساعة بعد طلاء الكرويات المختلطة HEP-MES.
    1. في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 مل ، امزج الفيبرينوجين (3.25 مجم / مل) والثرومبين (12.5 وحدة / مل) بنسبة 4: 1 لتكوين الفيبرين ووضع الأنبوب على الجليد.
  6. انقل الفيبرين إلى كل بئر باستخدام كروي مختلط موجود مسبقا عند تخفيف 1: 1 مع cDMEM الحالي في البئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
  7. بعد الحضانة ، أضف 75 ميكرولتر من cDMEM الطازج إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1-2 أيام.
    ملاحظة: قم بتغيير وسط النمو كل يومين بعد الطلاء ، وقم بإزالة 50٪ من cDMEM برفق واستبداله.
< p class = "jove_title" >9. نموذج ترحيل MES عالي الكثافة

ملاحظة: ارجع إلى الخطوة 3 لإعداد HepG2-WT الكروي (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 6 أ) والخطوات 4.1-4.5 لتحضير تعليق الخلية HFF / MRC-5 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 6 ب).

  1. قم بتعليق خلايا HFF / MRC-5 في cDMEM الطازج لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 6.0 × 105 خلايا / مل ووضعها على الجليد.
  2. امزج معلق الخلية HFF / MRC-5 ومعلق MG / CG المثلج بتخفيف 1: 1 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 6C).
    ملاحظة: تم تعيين كثافة تعليق الخلية للحصول على 30,000 خلية لكل بئر في لوحة 96 بئرا المطلية بالأغاروز. قم بإذابة الثلج طوال الليل على الثلج في ثلاجة من 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية. تأكد من تبريد الماصات والنصائح والأنابيب مسبقا عند التعامل مع MG، لأنها تشكل مادة هلامية أعلى من 10 درجات مئوية.
  3. انقل 100 ميكرولتر من محلول HFF/MRC-5 وMG باستخدام ماصة إلى بئر يحتوي على كروي HepG2-WT. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
  4. بعد الحضانة ، أضف 75 ميكرولتر من cDMEM الطازج إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة تصل إلى 12 يوما.
< p class = "jove_title" >10. التحليل الإحصائي

  1. مراجعة وتحليل البيانات التي تم جمعها باستخدام Microsoft Excel أو أي برنامج إحصائي / رسوم بيانية.
    ملاحظة: للتقييم الإحصائي بين مجموعتين ، تم إجراء اختبار t للطالب (النوع الثاني مع ذيولين) ، واعتبرت القيم p التي تساوي أو أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية ويتم تعريفها داخل النص والأشكال / وسائل الإيضاح الشكلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتزايد الاهتمام بالأنسجة الاصطناعية لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية، مثل نمذجة الأمراض، واكتشاف الأدوية، وهندسة الأنسجة (الشكل 7). وفي هذا المجال، يتم تحويل العضوانيات والكريات والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) إلى أنسجة اصطناعية أكثر تعقيداً وأكبر حجماً. ويتضمن هذا التحول تطبيق مبادئ التخلق الشكلي، والاستعانة بأدوات مثل التصنيع الدقيق، ودمج المصفوفات الحيوية، مما يتيح الهندسة الدقيقة للأنسجة الاصطناعية (الشكل 7). تُعرض هنا عد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يشمل البروتوكول الحالي طرقا متعددة لزراعة كل من التجميعات البسيطة والمعقدة ، بالإضافة إلى تقنيات إحداث هجرة الخلايا الجماعية ثلاثية الأبعاد في تكوين أعضاء الكبد المبكر24،25. تسلط البروتوكولات الموضحة الضوء على العديد من الخطوات الحاسمة ، مع كون تكوين الكروية جانبا مركزيا عبر جميع المنهجيات. يتم استخدام الآبار الدقيقة (96 أو 384 بئرا) إما مع صفائح غير ملتصقة أو مطلية بالاغاروز لتحقيق تكوين كروي. تضمن هذه الطريقة إنتاجا وفيرا من الكرويات للتجارب اللاحقة ، مع الأخذ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

NP هي مؤسسة Khufu Therapeutics ، وهي شركة هندسة عضوية تعمل على تطوير علاجات لأمراض الكبد الحادة والمزمنة.

شكر وتقدير

يود المؤلفان أن يعربوا عن خالص امتنانهم لأوجيتشي أوغوكي وأسامة يوسف لمساهماتهم القيمة في البيانات المستخدمة في هذه الورقة. تم دعم NP من قبل صناديق بدء التشغيل UB CBE ، وزمالة مارك دايموند ، و C024316 علوم الخلايا الجذعية بولاية نيويورك ، ومركز UB Stem Cells in Reregenative Medicine (ScIRM) ، ومركز جامعة بوفالو للخلايا والجينات وهندسة الأنسجة (CGTE).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
384 بئر أسود / واضح قاع دائري منخفض للغاية مرفق كروي صفيحة ميكروبليتCorning3830
96-wl لوحة ثقافة الخلية مسطحة ، TC ، STR ، 1 / pk ، 100 / CSمبيعات منتجات المختبر701001 Agarose
Sigma-AldrichA0576Low EEO
Axiovision SoftwareZEISSالإصدار 4
طبق ثقافة الخلية ، 60 مم ، TC ، STRL ، 20 / عبوة، 500 / CSمنتجات المختبر مبيعات705001
قارورة ثقافة الخلية ، 175 سم & sup2 ؛ ، تنفيس ، TC ، STR ، 5 / pk ، 40 / CSمنتجات المختبر مبيعات709003
قارورة ثقافة الخلية ، 75 سم & sup2 ؛ ، تنفيس ، TC ، STR ، 5 / pk ، 100 / CSمبيعات منتجات المختبر708003
أنابيب الطرد المركزي ، 15 مل لتر ، PP ، STR ، غراد ، 50 / bg ، 500 / CSالمختبرL226010
الكولاجين الأول ، ذيل الجرذ ، 100 مجمكورنينج354236
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GlutaMAX ، البيروفاتThermoFisher Scientific10569010
EVOS الفلورسنت ، مجهر تباين الطورEVOSAMEFC4300R1,360 × 1,024
بكسل مصل بقري الجنين ، مؤهل ،المتحدة ThermoFisher Scientific 26140079
الفيبرينوجين من البلازما البشريةسيجما ألدريتشF4883-500 مجم500 مجم
هيب جي 2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r ؛ https://imagej.net/ij/
غشاء أساسي لعامل نمو Matrigel (GFR) ماتريكس ، خال من LDEV ، 10 ملCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT BulletKit لنمو الخلايا الجذعية الوسيطة البشريةLonzaPT-3001
Penicillin-Streptomycin (10,000 وحدة / مل)ThermoFisher Scientific15140122
الثرومبين من البلازما البشريةSigma-AldrichT6884-100UN100 وحدة
التربسين EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25300062
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Cell-LabelingSolution ThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Cell-LabelingThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Cell-Labeling الحلThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio مجهر مضانZEISSSE64 ، 1,344 &مرة; كثافة 1,024 بكسل
منتجات المبيعات كثافة الولايات

المراجع

  1. Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
  2. Gualdi, R., et al. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control. Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).
  3. Ogoke, O., et al. Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis. Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).
  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
  6. Yang, M. H., et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).
  7. Gupta, S., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium. Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).
  8. Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).
  9. Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule. Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).
  10. Matchett, K., et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).
  11. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science. 294 (5542), 559-563 (2001).
  12. Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. Hepatocyte migration during liver development requires prox1. Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).
  13. Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression. Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).
  14. Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).
  15. Ng, L., et al. Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion. Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).
  16. Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).
  17. Zhao, Y., et al. RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell. Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).
  18. Fitamant, J., et al. Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression. Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).
  19. Xue, T. C., et al. Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 9 (10), e109695(2014).
  20. Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).
  21. Chen, J. S., et al. MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells. Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).
  22. Yang, C., et al. MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9. Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).
  23. Zeng, Y. B., et al. MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1. Cancer Cell Int. 16, 63(2016).
  24. Ogoke, O., et al. Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis. bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).
  25. Ogoke, O., et al. Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway. Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).
  26. Kanton, S., Pasca, S. P. Human assembloids. Development. 149 (20), dev201120 (2022).
  27. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقنيات الزراعة في المختبر لنمذجة تكوين عضويات الكبد ، وبناء التجمعات ، وتصميم الأنسجة الاصطناعية باستخدام خطوط الخلايا البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.