يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66231

⸱

يناير 26, 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولات تمكن من عزل الخلايا اللحمية من عظم الفئران ونخاع العظام والغدة الصعترية وأنسجة الغدة الصعترية البشرية المتوافقة مع تعدد الخلايا أحادي الخلية.

الملخص

مكن تسلسل الخلية الواحدة من رسم خرائط لمجموعات الخلايا غير المتجانسة في سدى الأعضاء المكونة للدم. توفر هذه المنهجيات عدسة يمكن من خلالها دراسة عدم التجانس الذي لم يتم حله سابقا في حالة مستقرة ، وكذلك التغيرات في تمثيل نوع الخلية الناجم عن الضغوط الخارجية أو أثناء الشيخوخة. هنا ، نقدم بروتوكولات تدريجية لعزل مجموعات الخلايا اللحمية عالية الجودة من الفئران والغدة الصعترية البشرية ، وكذلك عظام الفئران ونخاع العظام. الخلايا المعزولة من خلال هذه البروتوكولات مناسبة لإنشاء مجموعات بيانات متعددة الخلايا أحادية الخلية عالية الجودة. تتم مناقشة تأثيرات هضم العينات ، واستنفاد سلالة المكونة للدم ، وتحليل / فرز FACS ، وكيف تؤثر هذه العوامل على التوافق مع تسلسل الخلية الواحدة هنا. مع أمثلة على ملامح FACS التي تشير إلى تفكك ناجح وغير فعال وإنتاجية الخلايا اللحمية النهائية في تحليل ما بعد التسلسل ، يتم توفير مؤشرات يمكن التعرف عليها للمستخدمين. يعد النظر في المتطلبات المحددة للخلايا اللحمية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار يمكن أن تعزز المعرفة في هذا المجال.

المقدمة

في البالغين الأصحاء ، يحدث إنتاج دي نوفو لخلايا الدم في نخاع العظام والغدة الصعترية. الخلايا اللحمية في هذه المواقع ضرورية للحفاظ على تكون الدم ، لكن السدى يشكل أقل من 1٪ من الأنسجة1،2،3،4. وبالتالي ، فإن الحصول على عزلات نقية من السدى الداعمة لتكوين الدم يشكل تحديا كبيرا ، خاصة بالنسبة للخلايا المتعددة أحادية الخلية التي تتطلب معالجة مناسبة للحصول على عينات عالية الجودة. قد تتداخل مكونات كوكتيلات الهضم المختلفة مع خطوات معينة في تحليل multiomics 5,6. توضح البروتوكولات المعروضة هنا بالتفصيل عزل مجموعة متنوعة من الخلايا اللحمية من نخاع العظم وأنسجة الغدة الصعترية.

تؤدي اضطرابات المكونات اللحمية في كل من نخاع العظم والغدة الصعترية إلى اضطراب عميق في نمو خلايا الدم ويمكن أن تؤدي إلى أورام خبيثة7،8،9. تتلف السدى الداعمة لتكوين الدم بعد التكييف السام للخلايا وزرع نخاع العظم ، مما يؤدي إلى انخفاض إفراز السيتوكينات وعوامل النمو التي تحافظ على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs)2،10،11. علاوة على ذلك ، تؤثر الشيخوخة على نخاع العظام وخلايا انسجة الغدة الصعترية التي من المحتمل أن تساهم في الأنماط الظاهرية المكونة للدم القديمة. الغدة الصعترية هي أول عضو يخضع لانقلاب واسع النطاق مرتبط بالعمر. تبدأ الأنسجة الدهنية والليفية في استبدال السدى الداعمة للخلايا التائية في وقت مبكر من بداية سن البلوغ 12,13. في نخاع العظام ، يزداد محتوى الخلايا الشحمية مع تقدم العمر ويتم إعادة تشكيل منافذ الأوعية الدموية والداخلية بشكل كبير14،15،16.

لتمكين دراسة السدى الداعم لتكوين الدم عبر حالات الإجهاد المتعددة وفي حالة الغدة الصعترية لكل من الأنسجة البشرية والفئران ، قمنا بتحسين بروتوكولات الهضم المنشورة مسبقا1،2،8،17،18. تضمن هذه البروتوكولات عزلا فعالا وقابلا للتكرار للخلايا ، وهي متوافقة مع تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وأنواع أخرى من multiomics.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الأعمال مع الأنسجة البشرية بعد موافقة مجلس المراجعة الداخلية لمستشفى ماساتشوستس العام (IRB). تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بمستشفى ماساتشوستس العام (IACUC). تم استخدام الفئران C57Bl / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع ، وكل من الذكور والإناث ، في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إعداد أنسجة الغدة الصعترية الفئران

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة والحلول التالية.
    1. متوسط 199 (M199) مع 2٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) (انظر جدول المواد).
    2. كوكتيل تفكك الفئران: 0.5 WU / mL Liberase TM و 6.3 U / mL DNase I في M199 + 2٪ FBS (انظر جدول المواد).
    3. M199 مع 2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA).
      ملاحظة: يمكن تحويل الوسيط المحتوي على FBS إلى BSA لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.
  2. إجراء تشريح الغدة الصعترية الفئران
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الاختناق CO2 (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) ووضعه على ظهره. بلل الفراء على الصدر عن طريق رش 70 ٪ من الإيثانول والمضي قدما في فتح تجويف الصدر.
    2. قم بتشريح الغدة الصعترية بعناية عن طريق إجراء شق عرضي أسفل القفص الصدري مباشرة باستخدام مقص جراحي. قطع الأضلاع على كل جانب من الماوس على طول الطريق حتى الترقوة. ثم قطع الحجاب الحاجز بحيث يمكن تحرير جدار الصدر. ارفع الأضلاع بزوج من الملقط لفضح التجويف الصدري.
      1. الغدة الصعترية هي عضو أبيض ، ثنائي التجويف ، يجلس في الجزء العلوي من التجويف ، فوق القلب مباشرة. امسك الغدة الصعترية بالملقط واقطع برفق النسيج الضام الذي يثبت الغدة الصعترية في مكانها. ضع أنسجة الغدة الصعترية المشرحة في بئر صفيحة ذات 6 آبار مع M199 + 2٪ FBS على الجليد.
        ملاحظة: عند العمل مع الفئران المسنة أو المكيفة إشعاعيا أو السلالات الطافرة ذات العيوب الصعترية ، قد تكون الغدة الصعترية صغيرة جدا بحيث يلزم وجود مجهر تشريح لاستئصال العضو بشكل موثوق.
    3. باستخدام مجهر التشريح ، قم بإزالة أي نسيج خارج الغدة الصعترية باستخدام ملقط غير حاد ومقص زنبركي صغير.
  3. إجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة الغدة الصعترية للفئران (30 دقيقة بزيادات قدرها 10 دقائق)
    1. ضع الغدة الصعترية النظيفة في غطاء أنبوب سعة 15 مل وفرم الأنسجة جيدا بمقص جراحي معقم.
      ملاحظة: إن فرم الأنسجة في غطاء الأنبوب الذي سيتم استخدامه لعملية الهضم يقلل من فقدان الأنسجة بسبب النقل من حاوية إلى أخرى. هذا مهم جدا عند العمل مع الفئران المسنة أو المكيفة بالإشعاع أو السلالات الطافرة ذات العيوب الصعترية. يتطلب حجم الغدة الصعترية الصغير في هذه الإعدادات الحاجة إلى تقليل فقد المواد حيثما أمكن ذلك.
    2. أضف 2 مل من كوكتيل تفكك الفئران إلى أنبوب 15 مل ، وأرفق الغطاء الذي يحتوي على قطع الغدة الصعترية ، واقلبه 5 مرات لضمان إعادة تعليق الأنسجة في كوكتيل التفكك.
    3. لمنع التسرب ، لف غطاء الأنبوب في فيلم البارافين. ثم ضع الأنبوب أفقيا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز 250 دورة في الدقيقة. احتضان لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يعتمد نجاح بروتوكول الهضم على الحضانة التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية ومع الإثارة. تم تحسين البروتوكول الموصوف باستخدام حمام مائي يهتز. إذا لم يكن ذلك متاحا ، فقد تعمل الطرق الأخرى التي تمكن التحريض في بيئة ساخنة ، لكننا نوصي بتحسين البروتوكول لهذه الإعدادات أولا.
    4. ضع أنبوب 15 مل في رف واترك قطع الأنسجة تستقر. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وقم بتمريرها فوق مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل بارد مثلج.
    5. كرر الخطوات 2-4 مرتين لما مجموعه 3 جولات من الهضم. يجب أن يكون النسيج منفصلا تماما إلى حد ما بنهاية الحضانة الأخيرة.
    6. أضف 20 مل من M199 + 2٪ FBS إلى تعليق الخلية المجمعة. قم بتدويره لأسفل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    7. قم بإزالة المادة الطافية وأعد التعليق في حجم مناسب من M199 + 2٪ FBS. ثم انتقل إلى عد الخلايا.
      ملاحظة: يعتمد حجم M199 + 2٪ FBS لإعادة التعليق على حالة الغدة الصعترية. بالنسبة للفئران البالغة من العمر 6-10 أسابيع ، نوصي بإعادة تعليق الأنسجة في 3-4 مل من M199 + 2٪ FBS. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب التي تستخدم الأنسجة القديمة أو المكيفة بالإشعاع أو السلالات الطافرة ذات العيوب الصعترية ، سيتطلب حجم الغدة الصعترية الصغير أحجاما أقل تتراوح من 0.1-1 مل.
    8. عد الخلايا عن طريق تخفيف تعليق الخلية 1: 2 في محلول تريبان الأزرق 0.4٪ (وزن / حجم). قم بتحميل الخلايا على مقياس الدم وعد تحت مجهر المجال الساطع. عد الخلايا غير الملوثة لتحديد عدد الخلايا الحية لكل ملليلتر وعدد الخلايا الملطخة باللون الأزرق لتقييم صلاحية العينة.
  4. إجراء فرز الخلايا المنشطة مضان من سدى الغدة الصعترية الفئران
    1. قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إعادة تعليق الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا / مل في M199 + 2٪ FBS مكمل بمثبط RNase واقي 25 وحدة / مل (انظر جدول المواد).
    2. يضاف كتلة Fc الفئران (انظر جدول المواد) بتركيز 2 ميكروغرام / مل ويحتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة التالية: CD45-PE / Cy7 (4 ميكروغرام / مل) ، Ter119-PE (4 ميكروغرام / مل) ، CD31-BUV737 (2 ميكروغرام / مل) ، و EpCam-BV711 (2 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    4. اغسل العينات في M199 + 2٪ BSA وقم بتدويرها لأسفل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا في M199 + 2٪ BSA التي تحتوي على صبغة صلاحية مثل DAPI (0.5 ميكروغرام / مل) أو 7-AAD (1 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد). انتقل إلى عزل FACS لخلايا انسجة الغدة الصعترية باتباع البروتوكولاتالمعمول بها 19.

2. إعداد أنسجة الغدة الصعترية البشرية

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة والحلول التالية.
    1. متوسط 199 (M199) مع 2٪ (v/v) FBS.
    2. M199 مع 1.5٪ (وزن / حجم) BSA.
    3. كوكتيل التفكك البشري: 1 ملغ / مل كولاجيناز IV و 2 ملغ / مل Dispase و 6.3 U / mL DNase I في M199 + 1.5٪ BSA (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تتضمن خطوة الهضم الأخيرة في تحضير أنسجة الغدة الصعترية البشرية التربسين. لذلك من الضروري أن يتم تنفيذ جميع الخطوات حتى تلك النقطة في BSA التي تحتوي على مخزن مؤقت لأن FBS ستمنع نشاط التربسين.
  2. إجراء عزل أنسجة الغدة الصعترية البشرية
    1. ضع الغدة الصعترية البشرية (التي تم جمعها وفقا للطريقةالمنشورة مسبقا 19) في حجم مناسب من M199 + 1.5٪ BSA وقم بتخزينها على الثلج حتى تبدأ المعالجة.
    2. أثناء العمل مع أنسجة الغدة الصعترية البشرية ، تعامل معها كما لو كانت معدية محتملة من خلال القيام بالعمل في غطاء زراعة الأنسجة واستخدام الاحتياطات القياسية وفقا لإرشادات CDC20.
    3. ضع المنديل في طبق بتري 10 سم مع 10 مل من الثلج البارد M199 + 1.5٪ BSA. باستخدام ملقط ومقص معقم ، قم بتنظيف الدهون أو الأنسجة خارج الغدة الصعترية التي تضررت أثناء استخراج العضو بعناية.
    4. باستخدام مقص جراحي وزوج من الملقط ، قم بتقطيع الغدة الصعترية إلى مكعبات 1 سم3 واستخدم مكبس حقنة سعة 10 مل للضغط برفق على القطع. سيؤدي ذلك إلى إطلاق بعض الخلايا الصعترية النامية ، مما يقلل من حجم الأنسجة المراد هضمها.
      ملاحظة: احفظ الجزء المكون للدم الذي تم إطلاقه إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل لاحق لمراحل نمو الخلايا الصعترية. ومع ذلك ، لا تجمع هذا الكسر مع جزء الخلية اللحمية المتولد أثناء الهضم الأنزيمي. وقد لوحظ أن تجميع الجزأين يزيد بشكل كبير من خطر تشكل السدادات في تعليق الخلية ، مما يقلل في النهاية من إنتاجية الخلايا اللحمية. يتم فقدان عدد قليل من الخلايا اللحمية أثناء التكسير اللطيف للأنسجة.
  3. إجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة الغدة الصعترية البشرية (90 دقيقة بزيادات قدرها 30 دقيقة)
    1. انقل حوالي 5 مجم من قطع أنسجة الغدة الصعترية المسحوقة قليلا إلى غطاء أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم قطع الأنسجة بدقة باستخدام مقص جراحي معقم.
    2. ماصة 8 مل من كوكتيل التفكك البشري في أنبوب 50 مل ، قم بتوصيل الغطاء الذي يحتوي على أنسجة الغدة الصعترية البشرية المفرومة ، ثم اقلب الأنبوب برفق 5 مرات لضمان خلط جميع الأنسجة مع كوكتيل الإنزيم.
    3. تأمين غطاء الأنبوب مع فيلم البارافين لمنع التسرب. احتضان الأنبوب أفقيا في حمام مائي (250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    4. ضع أنبوب 50 مل في رف واترك قطع أنسجة الغدة الصعترية البشرية تستقر قبل إزالة المادة الطافية وتمريرها فوق مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد سعة 50 مل يوضع على الثلج.
    5. كرر الخطوات 2.3.2-1.3.4 لما مجموعه جولتين من الهضم مع كوكتيل التفكك البشري.
    6. بعد الانتهاء من الجولة الثانية من الهضم ، أضف 8 مل إضافية من كوكتيل التفكك البشري إلى الأنسجة المتبقية. ثم أيضا ماصة 2 مل من 0.25 ٪ التربسين في أنبوب تفكك الأنسجة. احتضان لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية ، ويهز عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: من الضروري للغاية أن يكون وقت الهضم للأنسجة البشرية 90 دقيقة على الأقل ، لأن أوقات الحضانة الأقصر تؤدي إلى انخفاض كبير في غلة الخلايا اللحمية.
    7. بمجرد الانتهاء من خطوة الحضانة الأخيرة ، قم بتجميع تعليق الخلية وشظايا الأنسجة المتبقية مع المادة الطافية التي تم جمعها في الخطوات السابقة عن طريق تمرير مصفاة خلية 70 ميكرومتر. أضف 3 مل من FBS إلى العينة لكسر تفاعل التربسين ووضعه على الثلج.
    8. تابع عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.3.
  4. إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لسدى الغدة الصعترية البشرية
    1. قم بتدوير تعليق الخلية للغدة الصعترية البشرية وإعادة التعليق بتركيز 5 × 107 خلايا / مل في M199 + 2٪ FBS مكمل بمثبط RNase الواقي 25 وحدة / مل.
    2. احتضان مع كتلة Fc البشرية (5 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد) لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتلطيخ العينة لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام CD45-BV711 (2.5 ميكروغرام / مل) ، CD235a-BV711 (2.5 ميكروغرام / مل) ، Lineage-cocktail-FITC (3.76 ميكروغرام / مل) ، CD66b-FITC (عينة 20 ميكرولتر / 100 ميكرولتر) ، CD8-APC / Cy7 (عينة 5 ميكرولتر / 100 ميكرولتر) ، CD4-BV605 (عينة 5 ميكرولتر / 100 ميكرولتر) ، CD31-PE / Dazzle594 (10 ميكروغرام / مل) ، و EpCam-BV421 (2.5 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
    4. اغسل العينات في M199 + 1.5٪ BSA وقم بتدويرها لأسفل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في M199 + 1.5٪ BSA التي تحتوي على صبغة صلاحية مثل DAPI (0.5 ميكروغرام / مل) أو 7-AAD (1 ميكروغرام / مل). انتقل إلى عزل FACS لخلايا انسجة الغدة الصعترية باتباع البروتوكولاتالمعمول بها 19.

3. إعداد عظم الفئران وأنسجة نخاع العظام

ملاحظة: يتم تحضير كسور العظام ونخاع العظم في تفاعلين منفصلين للهضم للحصول على أقصى نقاء للخلايا اللحمية والتفكك الأمثل للأنسجة. يمكن تجميع العينات بعد خطوات الهضم ليتم فرزها كحجرة انسجة واحدة.

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة والحلول التالية.
    1. M199 مع 2٪ (v / v) FBS.
    2. كوكتيل تفكك الفئران B &M (العظام والنخاع): Stemxyme 2 مجم / مل ، ديسباز 1 مجم / مل و 10 وحدة / مل DNase I (انظر جدول المواد) في M199 + 2٪ FBS.
      ملاحظة: قم بإعداد مزيج تفكك B&M طازجا واحتفظ بالمزيج على الثلج حتى الاستخدام.
    3. M199 مع 0.5٪ (وزن / حجم) BSA.
    4. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 0.5٪ (وزن / حجم) BSA.
    5. M199 مع 2٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) و 2 مللي متر EDTA.
      ملاحظة: يمكن تحويل الوسيط المحتوي على FBS إلى BSA لتحسين جودة الحمض النووي الريبي.
  2. أداء فصل نخاع عظم الفئران
    1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الاختناق CO2 (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). رش مع 70 ٪ من الإيثانول لتبليل الفراء.
    2. قم بإزالة عظم الفخذ والساق والحوض وعظم العضد بعناية من كل جانب وضعها في بئر يحتوي على M199 + 2٪ FBS على الجليد21,22.
    3. قم بإزالة جميع أنسجة العضلات والأربطة والغضاريف باستخدام مناديل الأنسجة لتقليل تلف العظام والحفاظ على طبقة السمحاق . ضعها في بئر جديدة مع M199 + 2٪ FBS على الجليد.
    4. استخدم مشرطا واقطع ألواح نمو العظام الطويلة لإزالة المشاش ووضعه في طبق 10 سم مع M199 + 2٪ FBS على الثلج.
    5. اغسل نخاع العظم من العظام حتى يصبح لونه أبيض باهتا. استخدم إبرة 28 جم ومحقنة 10 مل مملوءة ب 10 مل M199 + 2٪ FBS لطرد النخاع في أنبوب 15 مل على الثلج. ضع العظم المحمر في طبق 10 سم مع المشاش.
      ملاحظة: سيؤدي التنظيف الكامل لنخاع العظم لفصل الأنسجة بالكامل إلى تحضير أفضل للعينة.
  3. إجراء التفكك الأنزيمي لأنسجة نخاع عظم الفئران (إجمالي 30 دقيقة بزيادات قدرها 10 دقائق)
    1. اترك الأنبوب سعة 15 مل واقفا في وضع مستقيم على الجليد حتى يغوص النخاع في قاع الأنبوب. قم بإزالة 10 مل M199 + 2٪ FBS ببطء عن طريق الماصة.
    2. أضف 4 مل من كوكتيل تفكك B&M إلى أنبوب 15 مل وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية (بدون رج) لمدة 10 دقائق.
    3. بعد 5 دقائق ، اقلب الأنبوب ثلاث مرات وضعه مرة أخرى في حمام مائي.
    4. بعد أول 10 دقائق ، تأكد من أن الحبيبات في الأسفل واجمع المادة الطافية أثناء الترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب بارد سعة 50 مل. أضف 2 مل من كوكتيل تفكك B&M الطازج إلى حبيبات BM المتبقية وضعها مرة أخرى في حمام مائي.
    5. افصل أي قطع متبقية من نخاع العظم عن طريق سحب ماصة قوية باستخدام ماصة سعة 1 مل. اجمع كل تعليق الخلية الناتج في نفس الأنبوب كما في الخطوات السابقة. أضف 20 مل من M199 + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA إلى تعليق الخلية المجمعة.
      ملاحظة: في الخطوة 3.3.5 ، يحتوي المخزن المؤقت المضاف بعد العينة النهائية المهضومة على EDTA للمساعدة في تثبيط المزيد من النشاط الأنزيمي.
  4. أداء استنزاف الخلايا المكونة للدم من أنسجة نخاع عظم الفئران.
    1. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إعادة التعليق في 500 ميكرولتر من PBS + 0.5٪ BSA مع الأجسام المضادة للبيوتين (5 ملغ / مل) التي تستهدف CD45 و Ter119 و CD11b و Gr1 و B220 و CD3 (انظر جدول المواد). نقل إلى أنبوب مستدير القاع مع غطاء.
    2. احتضان على شاكر مداري لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    3. دوامة الخرز المغناطيسي جيدا وإضافة 25 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى الأنبوب.
    4. احتضان على شاكر مداري لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    5. ضع الأنبوب في المغناطيس المطابق لمدة 2-3 دقائق واجمع المادة الطافية في أنبوب جديد.
      ملاحظة: يمكن تجميع نخاع العظم أو إبقائه منفصلا عن جزء العظم بعد هذه الخطوة. إذا نجح استنفاد النسب ، يجب أن يكون تعليق الخلية الناتج خاليا من الخلايا الحمراء.
  5. أداء التفكك الأنزيمي لأنسجة عظام الفئران.
    1. قسم العظام إلى قطع أصغر في الطبق الذي يبلغ طوله 10 سم باستخدام الطرف المسطح لأنبوب سعة 50 مل. قم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر لعزل شظايا العظام داخل الفلتر.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الملاط والمدقة لتفتيت العظام. ومع ذلك ، يميل هذا الخيار إلى توليد المزيد من الحطام وتقليل صلاحية الخلايا اللحمية عندما يكون العظم مطحونا بدلا من كسره. لا تزال خلايا السدى مرتبطة بالعظام وفي داخلها ، ويجب التخلص من المادة الطافية التي تحتوي على خلايا مكونة للدم.
    2. استخدم المقص لقطع شظايا العظام في مصفاة الخلية. سيؤدي ذلك إلى زيادة مساحة السطح للحصول على تفكك إنزيمي أكثر كفاءة. اغسل العظم ب 5 مل من M199 + 2٪ FBS.
    3. ضع الجزء العظمي في 5 مل من مزيج تفكك الفئران B &M (انظر جدول المواد) في أنبوب جديد سعة 50 مل.
    4. لمنع التسرب ، لف غطاء الأنبوب في فيلم البارافين. ثم ضع الأنبوب أفقيا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع اهتزاز 120 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    5. بعد الهضم ، أضف 25 مل من M199 + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA وقم بتصفية المادة الطافية التي تحتوي على الخلايا اللحمية من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل بارد.
      ملاحظة: تأكد من أن شظايا العظام الناتجة قد تضاءلت بشكل واضح بسبب عملية الهضم. في الخطوة 3.5.5 ، يحتوي المخزن المؤقت المضاف بعد العينة النهائية المهضومة على EDTA للمساعدة في تثبيط المزيد من النشاط الأنزيمي.
  6. إجراء فرز الخلايا المنشط مضان من عظم الفئران وسدى نخاع العظام.
    1. قم بتدوير الخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. يعاد التعليق في كتلة Fc Blockin بتركيز 10 ميكروغرام / مل في PBS + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتلطيخ الخلايا (ما يصل إلى 10 ملايين خلية / 100 ميكرولتر من إجمالي حجم التلطيخ) بالأجسام المضادة التالية: CD45-PE / Cy7 (1 ميكروغرام / مل) ، Ter119-PE / Cy7 (1 ميكروغرام / مل) ، CD31-BV421 (0.66 ميكروغرام / مل) ، CD140a-APC (2 ميكروغرام / مل) ، Sca1-AF700 (0.66 ميكروغرام / مل) ، CD51-PE (2 ميكروغرام / مل) ، CD105-PE / انبهار (2 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
    4. اترك Calcein-AM ليتوازن مع درجة حرارة الغرفة وأعد تعليقه في 50 ميكرولتر من DMSO. استعد طازجا لكل استخدام. يحفظ في درجة حرارة الغرفة بعد التعليق. قم بتخفيف الكالسيين مسبقا في PBS (0.1 مجم / مل) قبل إضافته إلى العينة (20 ميكروغرام / مل) المعاد تعليقه بالفعل في كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة واحتضانه لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    5. اغسل العينات في PBS + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في PBS + 0.5٪ BSA + 2 mM EDTA. انتقل إلى عزل FACS للخلايا اللحمية العظمية ونخاع العظم باتباع البروتوكولاتالمعمول بها 19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تنتج هذه البروتوكولات أنواعا من الخلايا اللحمية القابلة للتكرار من الغدة الصعترية ونخاع العظم مناسبة لتحليل التدفق الخلوي ، بالإضافة إلى تعدد الخلايا أحادية الخلية ، مثل تسلسل scRNA. يخضع نسيج الغدة الصعترية للفأر لعملية إعادة تشكيل كبيرة استجابة للضغوط ، مثل التكييف السام للخلايا الذي يسبق زرع نخاع العظم أو عملية الشيخوخة الطبيعية. نتيجة لذلك ، يتم تقليل خلوية الغدة الصعترية بشكل كبير في كل من هذه الإعدادات (الشكل 1 أ). في حين أن الغدة الصعترية من فأر من النوع البري يبلغ من العمر 8 أسابيع ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتبر الخلايا اللحمية في الأعضاء المكونة للدم ضرورية لإنتاج الدم الطبيعي ويمكن أن تؤدي اضطرابات السدى المكونة للدم إلى إعاقات شديدة في صيانة المكونة للدم والاستجابة للإجهاد9،23،24. نظرة ثاقبة على الخلايا اللحمية المكونة للدم أمر ضروري لفهم أمراض الدم7،9،10،24 وللقدرة على تطوير علاجات لمكافحتها

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

دي تي إس هو مدير ومساهم في أجيوس ثيرابيوتكس وإيديتاس للأدوية. مؤسس ومدير ومساهم وعضو مجلس استشاري علمي لشركة Magenta Therapeutics و LifeVault Bio ، ومساهم ومؤسس Fate Therapeutics و Garuda Therapeutics ، ومدير ومؤسس ومساهم في Clear Creek Bio ، ومستشار لشركة FOG Pharma و Inzen Therapeutics و VCanBio ، وحاصل على تمويل بحثي برعاية من Sumitomo Dianippon. D.T.S و K.G مخترعان US20220143099A1 براءات الاختراع.

شكر وتقدير

لقد تم دعمنا بمساعدة فنية متخصصة من قبل مرفق قياس التدفق الخلوي HSCI-CRM في مستشفى ماساتشوستس العام ومرفق باور الأساسي في جامعة هارفارد. تم دعم T.K و K. G من قبل مجلس البحوث السويدي و CM من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية. نشكر سيرجي إيساييف و I-Hsiu Lee على المساعدة في تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تربسين-EDTAثيرمو فيشر ساینتفيك25200-072
7AAD (7-أمينواكتينومايسين د)كوكتيل BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage 3-FITCBD Biosciences643510
مصل الأبقار الألبومينMillipore SigmaA9647
C57Bl / 6 فئرانجاكسون664ذكرا أو أنثى ، 8-12 أسابيع كالسين
 فيشر ساينتفيك65-0853-78
كولاجيناز IVMillipore SigmaC5138
مصافي الخلايا المعقمة كورنينج ، أبيض ، حجم الشبكة: 70 & مفيشر Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  2500 U / مل
Easysep ماوس ستربتافيدين RapidSpheres طقم عزلStemCell Technologies19860
مصل الأبقار الجنينيGibcoA31605-01مؤهل طلقة واحدة
بشرية Fc كتلةBD Biosciences564220
Liberase TM & nbsp ؛Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
ماوس مضاد للإنسان CD235a-BV77BD Biosciences740785
ماوس مضاد للإنسان CD31-PE / Dazzle594Biolegend303130
ماوس مضاد للإنسان CD45-BV77Biolegend304050
ماوس مضاد للإنسان CD4-BV605BD Biosciences562658
فأر مضاد للإنسان CD66b-FITCBD Biosciences555724
فأر مضاد للإنسان CD8-APC / Cy7BD Biosciences557760
ماوس مضاد للإنسان EpCam-BV421Biolegend324220
حامي RNase مثبطMillipore Sigma3335402001
الفئران المضادة للفأر CD105-PE / dazzle594Biolegend120424
الفئران المضادة للفئران CD11b-BiotinBiolegend101204
الفئران المضادة للفئران CD140a-APCفيشر Scientific17-1401-81
الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32 (كتلة الماوس BD Fc)BD Biosciences553142
الفئران المضادة للفئران CD31-BUV737BD Biosciences612802
الفئران المضادة للفأر CD31-BV421Biolegend102424
الفئران المضادة للفئران CD3-BiotinBiolegend100244
الفئران المضادة للفأر CD45.2-BiotinBiolegend109804
الفئران المضادة للفأر CD45-PE / Cy7Biolegend103114
الفئران المضادة للفئران CD45-PE / Cy7Biolegend103114
الفئران المضادة للفئران CD45-PE / Cy7Biolegend103114
الفئران المضادة للفئران CD45R / B220-BiotinBiolegend103204
الفئران المضادة للفئران CD51-PEBiolegend104106
الفئران المضادة للفأر EpCam-BV711BD Biosciences563134
الفئران المضادة للفأر Ly-6A / E (Sca-1) -AF700Biolegend108142
الفئران المضادة للفأر Ly-6G / Ly-6C (Gr1) - BiotinBiolegend108404
الفئران المضادة للفأر Ter119-BiotinBiolegend116204
الفئران المضادة للفأر Ter119-PEBiolegend116208
الفئران المضادة للفأر Ter119-PE / Cy7Biolegend116222
Stemxyme ورثينجتون LS004107 الكيمياء الحيوية

المراجع

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تسلسل الحمض النووي للخلية الواحدةتفكيك الغدة الزعتريةعزل نخاع العظمالترشيح بمصفاة الخلاياالفصل بالخرز المغناطيسيتحليل FACSالخلايا السدوية الفأريةتباين المجموعات الخلوية
عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.