هنا ، نصف منصة تسمح بالتصوير غير الجراحي في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر. يمتد سير العمل من توليد كرويات من خلايا الكبد الأولية إلى الزرع في عين الفأر والتصوير في الجسم الحي بدقة خلوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
مقالة منهجية
التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعوق الدراسات الطبية الحيوية للكبد في الثدييات بسبب عدم وجود طرق للتصوير الطولي غير الباضع في الجسم الحي بدقة خلوية. حتى الآن ، يمكن التصوير البصري للكبد في الموقع عن طريق التصوير داخل الجسم ، والذي يوفر تصويرا عالي الدقة على المستوى الخلوي ولكن لا يمكن إجراؤه عدة مرات ، وبالتالي طوليا في نفس. تسمح طرق التصوير غير الباضعة ، مثل التلألؤ البيولوجي ، بجلسات تصوير متكررة على نفس ولكنها لا تحقق دقة الخلية. لمعالجة هذه الفجوة المنهجية ، قمنا بتطوير منصة للتصوير غير الجراحي في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر. في سير العمل الموصوف في هذه الدراسة ، يتم إنشاء كرويات كبد الفأر الأولية في المختبر وزرعها في الغرفة الأمامية لعين الفئران المتلقية ، حيث تنقش على القزحية. تعمل القرنية كنافذة طبيعية للجسم يمكننا من خلالها تصوير الكرات المطعمة بواسطة المجهر التقليدي متحد البؤر. تعيش الأجسام الكروية لعدة أشهر في العين ، يمكن خلالها دراسة الخلايا في سياقات الصحة والمرض ، بالإضافة إلى مراقبتها استجابة للمحفزات المختلفة خلال جلسات التصوير المتكررة باستخدام مجسات الفلورسنت المناسبة. في هذا البروتوكول ، نقدم تفصيلا للخطوات اللازمة لتنفيذ نظام التصوير هذا ونشرح أفضل طريقة لتسخير إمكاناته.
المقدمة
إن مراقبة وظائف الكبد في الثدييات أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب عدم وجود تقنيات تصوير عالية الدقة وغير جراحية في الجسم الحي . يعوق تصور هذا العضو موقعه الذي يتعذر الوصول إليه ، ومن أجل تجميع العمليات الخلوية معا ، تعتمد الدراسات في الجسم الحي على التضحية بالحيوانات في نقاط زمنية مختلفة. للتحايل على هذا الحد من التصوير ، يعتمد الكثير من العمل على النماذج المختبرية ، حيث يتم تصور الأنسجة الدقيقة الشبيهة بالكبد ودراستها في بيئة خاضعة للرقابة.
في السنوات الأخيرة ، ساعد تطوير أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد ، مثل كرويات الكبد ، في أبحاث الكبد المتقدمة. كرويات الكبد هي مجاميع متعددة الخلايا تحاكي البيئة الدقيقة والتفاعلات المعقدة بين الخلايا والخلايا لأنسجة الكبد إلى حد ما1 وتوفر مزايا واضحة على الثقافات أحادية الطبقة التقليدية 2,3. تستخدم كرويات الكبد أيضا كنماذج لأمراض الكبد المختلفة4،5،6 وكانت مفيدة لفهم آليات المرض. ومع ذلك ، فإن القيود الرئيسية لنماذج الكبد الحالية في المختبر هي عدم وجود بيئة فسيولوجية في الجسم الحي ووقت الاستخدام المحدود في الثقافة (حوالي 20 يوما) 3. تم زرع كرويات الكبد سابقا في مواقع مختلفة في الجسم الحي ، مثل تحت كبسولة الكلى7 أو داخل الصفاق8 ، والتي لا يمكن الوصول إليها للتصوير البصري. تصوير الكبد داخل الجسم هو تقنية حديثة تقدم تصويرا في الوقت الفعلي بدقة الخلايا. حاليا ، هذا التصوير الكبدي في الموقع ممكن فقط على العضو الخارجي ، وهو شديد التوغل وغالبا ما يكون المحطة9. على الرغم من أن تركيب نافذة البطن سيسمح بجلسات تصوير الكبد المتكررة ، إلا أنه يستلزم جراحة معقدة ورعاية لاحقة.
لإجراء مراقبة طولية بدقة خلوية ، استكشفنا زرع كرويات الكبد في الغرفة الأمامية للعين (ACE) للفئران ، حيث يتم غرس الأنسجة الشبيهة بالكبد في بيئة فسيولوجية ، متصلة بمحفزات الجسم ، ويمكن الوصول إليها للتصوير البصري. القرنية عبارة عن نسيج شفاف ويعمل كنافذة يمكن من خلالها تصوير الأنسجة الدقيقة المحفورة على القزحية بشكل غير جراحي وطولي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. هنا ، نقدم سير عمل هذه المنصة المطورة حديثا للتصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد10. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لتنفيذه ، مقسم إلى (1) استخراج خلايا كبد الفأر الأولية وتشكيل كرويات الكبد في المختبر ، (2) زرع كرويات الكبد في ACE للفئران المتلقية ، و (3) التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة في الفئران المخدرة. علاوة على ذلك ، سنعرض بعض إمكانيات وتطبيقات منصة التصوير هذه.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت على من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في معهد كارولينسكا.
1. استخراج خلايا كبد الفأر الأولية وتوليد كرويات الكبد في المختبر
- اعداد
- للقنية واستئصال الكبد وعزل خلايا الكبد الأولية ، قم بإعداد المواد المعقمة أو ذات الاستخدام الواحد التالية بالإضافة إلى الماصات المصلية وأنابيب الطرد المركزي (الشكل 1 أ): مضخة تمعجية ، جهاز طرد مركزي دلو متأرجح ، وسادة ماصة ، حصيرة تشريح ، ملقطان منحنيان ، مقص جراحي ، إبرة فراشة واحدة 27 جيجا ، مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، رافع خلية واحد ، طبق بتري 100 مم ، غرفة عد الخلايا ، و 96 بئرا ، صفائح دقيقة على شكل حرف U.
- تحضير المحاليل المستخدمة في تروية الكبد، وعزل خلايا الكبد الأولية، وتوليد كرويات الكبد كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: يجب تحضير محلول الهضم ومحلول التدرج طازجا. - قم بإعداد نظام التروية الذي يتكون من مضخة تمعجية ، والتي توصل المحاليل من حمام مائي 42 درجة مئوية إلى الكبد (الشكل 1 أ). تضمن درجة الحرارة المرتفعة للحمام المائي وصول المخازن المؤقتة إلى الكبد عند درجة الحرارة المثلى البالغة 37 درجة مئوية. قم بتخصيص هذا اعتمادا على طول الأنبوب ودرجة حرارة الغرفة (RT).
- للقنية ، قم بتركيب إبرة فراشة 27 جم في نهاية الأنبوب. حافظ على وسائط الطلاء المستخدمة في خطوات العزل النهائية عند 4 درجات مئوية.
- إجراء
- قم بتسخين المحاليل التالية مسبقا في حمام مائي 42 درجة مئوية في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل: 40 مل من PBS ، و 20 مل من محلول التروية ، و 12 مل من محلول الهضم.
- لتنظيف وتدفئة أنابيب المضخة ، قم بتدوير حوالي 20 مل من PBS المسخن مسبقا.
- قم بتغيير الأنبوب إلى مخزن التروية المؤقت ، وقم بتجهيز الأنبوب وإبرة الفراشة ، واضبط معدل التدفق على 4 مل / دقيقة. تأكد من عدم وجود فقاعات في الأنبوب أثناء تغييرات المخزن المؤقت في جميع أنحاء البروتوكول.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم واستخدام الإبر لتثبيت الأطراف على لوحة التشريح.
- بلل فرو البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتشريحه للوصول إلى الجهاز الهضمي.
- حرك الأمعاء إلى اليمين لفضح الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي (الشكل 1 ب).
- قم بتقليب الوريد الأجوف في منتصف طوله تقريبا باستخدام الإبرة في وضع أفقي ، وتأكد من استقرارها ، وابدأ المضخة.
- عندما يبدأ الكبد في الانتفاخ ، أو تظهر نقاط بيضاء في الفصوص الأقرب ، اقطع الوريد البابي للسماح للدم ومخزن التروية بالتصريف.
- يجب أن يبدأ الكبد في التبييض على الفور. شجع المقاصة باستخدام ملقط منحني لربط الوريد البابي على فترات 5 ثوان.
- كرر الخطوة 1.2.9 حتى يصبح الكبد أصفر اللون ويطهر من الدم (حوالي 15-20 مل من محلول التروية).
- أوقف المضخة التمعجية لتغيير الأنبوب إلى المخزن المؤقت للهضم وأعد تشغيل المضخة. عندما يصل المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد ، قلل معدل التدفق إلى 2.5 مل / دقيقة.
ملاحظة: يسمح الفينول الأحمر في المخزن المؤقت للهضم بتمييز وصوله إلى الكبد ويتيح تعديل معلمات المضخة أثناء العلاج. - لتشجيع المخزن المؤقت على الوصول إلى جميع الفصوص الكبدية وضمان الهضم السليم ، كرر الخطوة 1.2.9 عدة مرات.
- أوقف تدفق المضخة التمعجية عندما ينضب المخزن المؤقت للهضم أو يبدو الكبد مهضوما بدرجة كافية.
ملاحظة: يمكن مراقبة درجة الهضم بصريا عن طريق قرص فصوص الكبد برفق بالملقط والتحقق مما إذا كانت هناك علامات صغيرة تظهر على الأنسجة. سوف يصبح الكبد أيضا واهية. - لاستخراج الكبد ، قم بقطع الأربطة والوصلات الكبدية داخل تجويف البطن ، بهدف إزالته بالكامل ، ووضعه في طبق بتري الذي يحتوي على 10 مل من وسط الطلاء البارد (الجدول 1).
- بعد إزالة المرارة ، قم بعمل قرصات صغيرة على الفصوص باستخدام ملقط ، وتمزيق الكبسولة الكبدية برفق. عن طريق هز الكبد في الطبق ، لاحظ الخلايا تتدفق في الوسط.
- ثبت الكبد بالملقط ، واسحب رافع الخلايا برفق على طول الفصوص لتحرير الخلايا.
ملاحظة: سيؤدي الهضم الصحيح بين الفصوص إلى تعليق الخلايا في الوسائط ، وليس شظايا الأنسجة. - باستخدام ماصة مصلية ، اجمع تعليق الخلية من طبق بتري وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. استخدم وسائط طلاء جديدة لغسل طبق خلايا الكبد المهضومة ونقلها إلى الفلتر.
- أجهزة الطرد المركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وترك حوالي 1 مل لتغطية حبيبات الخلية ، وقم بتدوير الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا ، ثم أضف تدريجيا 10 مل من وسط الطلاء البارد.
- أضف 10 مل من محلول التدرج إلى تعليق الخلية واقلب الأنبوب برفق 10 مرات.
- أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تحتوي الحبيبات على خلايا كبد قابلة للحياة غنية بخلايا الكبد ، بينما تحتوي المادة الطافية على خلايا ميتة وحطام. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، تاركا حوالي 1 مل ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق الدوران اللطيف.
- أضف 20 مل من وسط الطلاء البارد إلى تعليق الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لغسل محلول التدرج.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وترك حوالي 1 مل فوق الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا في 20 مل من وسط الطلاء البارد.
ملاحظة: هنا ، يمكن ضغط حبيبات الخلية ، لذلك إذا لزم الأمر ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 مل لفصل الخلايا برفق. - حدد رقم الخلية وصلاحيتها يدويا باستخدام غرفة عد الخلايا و Trypan Blue.
ملاحظة: سوف تترسب خلايا الكبد بسرعة في الأنبوب. لإعادة تعليقها برفق عكس الأنبوب عدة مرات. - قم بزرع خلايا الكبد في 200 ميكرولتر / بئر من وسط الطلاء عند 1200 خلية / بئر في 96 بئرا من ألواح الالتصاق المنخفضة للغاية.
ملاحظة: الحجم الأمثل للوسائط لكل بئر هو 200 ميكرولتر ؛ ومع ذلك ، فمن الممكن زرع الخلايا في 100 ميكرولتر / بئر. - قم بتدوير الألواح على حرارة 200 × جم لمدة 3 دقائق لجمع الخلايا في وسط الآبار.
- احتضان (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) الخلايا واتركها لتشكيل كرويات لمدة 5 أيام (الشكل 1C) بشكل طبيعي.
- في اليوم 5 ، قم بإزالة نصف الوسائط بعناية في البئر واستبدلها بوسائط صيانة خالية من المصل (الجدول 1). كرر هذه الخطوة كل 48 ساعة حتى اليوم 10 ، عندما تكون كرويات الكبد جاهزة للزرع.
ملاحظة: يظهر تكوين بنية تشبه الكبسولة في كرويات الكبد المستزرعة تجميعا جيدا وقابلية للحياة.
2. زرع كرويات الكبد في الغرفة الأمامية للعين (ACE)
- اعداد
- لزرع كرويات الكبد في ACE ، تأكد من ترتيب الموارد التالية (الشكل 2 أ): مجهر مجسم ، وحدة تخدير إيزوفلوران ، غرفة الحث ، إيزوفلوران ، وسادة تسخين ، لوحة قاعدة معدنية مخصصة ، حامل رأس الماوس وقناع الغاز ، ملقط متصل بالمفصل العالمي الصلب ، حقنة مكبس ملولبة هاملتون 500 ميكرولتر ، سيليكون ، بولي إيثيلين وأنابيب مضخة ، قنية زجاجية حادة حسب الطلب أو قسطرة 24 جرام ، الإيثانول 70٪ ، محلول ملحي معقم ، إبر معقمة 23 جم ، مرهم للعين (بارافين سائل وفازلين بنسبة 1: 1) ، حقنة 1 مل يمكن التخلص منها ، وطبق تعليق خلية 35 مم.
- نظف حقنة هاملتون والأنابيب والقنية عن طريق تمرير 70٪ من الإيثانول والمالحة.
- املأ حقنة هاملتون والأنابيب والقنية الزجاجية بالمحلول الملحي وقم بتثبيت حقنة هاملتون على المقعد في وضع أفقي بشريط (الشكل 2 أ).
- استخدم قنية زجاجية حادة مصنوعة خصيصا.
- استطالة شعرية زجاجية من البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة دقيقة ثنائية المرحلة إلى قطر داخلي يبلغ >300 ميكرومتر للسماح بطموح الأجسام الكروية.
- قم بشطبة الطرف وخففه باستخدام شطبة قطب كهربائي دقيق وفضح طرف القنية للهب لبضع ثوان لتليين الحواف.
ملاحظة: يتكون شطبة القطب الدقيق من حجر صنفرة دوار يتم تشغيله يدويا ؛ لذلك، إعدادات معينة غير قابلة للتطبيق.
- بدلا من ذلك ، قم ببناء قنية باستخدام الجزء البلاستيكي من قسطرة 24 G (الشكل 2B).
- تحضير وحدة إيزوفلوران التخدير وتسخين وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- قم بتغطية أطراف الملقط المتصل بالمفصل العالمي الصلب بقطعة من أنابيب البولي إيثيلين لتشكيل حلقة ، مما يساعد على استقرار العين.
- انقل كرويات الكبد من الصفيحة التي يبلغ قطرها 96 بئرا إلى طبق تعليق خلوي مقاس 35 مم مع وسائط صيانة باستخدام ماصة وطرف 200 ميكرولتر.
- إجراء
- تخدير الفأر في غرفة الحث باستخدام جرعة 2.5٪ إيزوفلوران و 280 مل / دقيقة هواء.
- عندما يكون الفأر فاقدا للوعي ، قم بخفض التخدير إلى 1.8٪ إيزوفلوران و 280 مل / دقيقة هواء ، وقم بتوصيل أنبوب التخدير بحامل الرأس ، وانقل بسرعة إلى وسادة التدفئة ، ووضع الأنف داخل حامل الرأس.
- شل حركة الرأس بالبراغي ، وأخرج العين برفق من التجويف وقم بتثبيتها بالملقط وضع قطرة من المحلول الملحي على كلتا العينين لمنع الجفاف.
- تحت المجسمة ، استخدم حقنة هاملتون للنضح وجمع كرويات الكبد في طرف القنية وتركها لتستريح أفقيا على سطح نظيف.
ملاحظة: تساعد وسائط الشفط مع كرويات الكبد على منعها من الالتصاق بجدران القنية. - ثقب القرنية بعناية باستخدام إبرة 23 G وتجفيف الفكاهة المائية المتسربة بمنديل. إذا لزم الأمر ، لجعل الشق أوسع ، حرك الإبرة بحذر جانبا لتقطيع القرنية.
ملاحظة: يتم استخدام إبرة معقمة تستخدم مرة واحدة لإجراء ثقب القرنية ، لذلك لا يتم تطهير القرنية قبل الشق. - أضف قطرات محلول ملحي إلى العين لتجنب الجفاف.
- خذ القنية التي تحتوي على كرويات الكبد وأمسكها عموديا للسماح للكرويات بالانجذاب نحو طرف القنية.
- أدخل القنية برفق في الحفرة ، ومع توجيه شطبة نحو التلميذ ، استخدم حقنة هاملتون لطرد كرويات الكبد ببطء إلى ACE (الشكل 2C).
ملاحظة: قبل إزالة القنية ، يوصى بالانتظار بضع ثوان حتى يعاد ضبط ضغط السائل داخل وخارج العين وتجنب هروب الكرويات مرة أخرى من العين. - من خارج القرنية ، ضع كرويات الكبد حول التلميذ وبعيدا عن الشق عن طريق حث القرنية برفق بطرف القنية (الشكل 2 ج).
- انتظر ~ 5-10 دقائق حتى تستقر كرويات الكبد على القزحية قبل تحرير العين من الملقط.
- ضع مرهم عين الفازلين على العين التي يتم تشغيلها ، مما يساعد على تليين القرنية وشفائها.
- إذا رغبت في ذلك ، تابع العمل على العين الثانية باتباع نفس الطريقة.
- قبل إيقاظ الفأر، يتم تطبيق مسكن لتجنب الانزعاج بعد الجراحة، على سبيل المثال، 0.1 ملغ/كغ من البوبرينورفين في محلول ملحي معقم، يتم إعطاؤه تحت الجلد.
ملاحظة: تم إعطاء جرعة واحدة فقط من المسكنات للفئران لأنها تعافت بسرعة من هذا الإجراء الصغير ولم تظهر أي علامات للألم أو تغيير السلوك. نظرا لأن هذا الإجراء سريع جدا (يستغرق أقل من 10 دقائق) ولا يسبب سوى إزعاج بسيط ، فإن الفئران لا تحتاج إلى رعاية ما بعد الجراحة ، بخلاف التسكين بعد الجراحة الذي يتم إعطاؤه قبل إيقاظ.
3. التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة في ACE
- اعداد
- قم بإعداد المواد والأدوات التالية للتصوير غير الجراحي في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في ACE (الشكل 3 أ): مجهر متحد البؤر مستقيم ، هدف غمس الماء لمسافات طويلة ، وحدة تخدير إيزوفلوران ، غرفة الحث ، إيزوفلوران ، وسادة تسخين ، لوحة قاعدة معدنية مصنوعة حسب الطلب ، حامل رأس الماوس وقناع الغاز ، ملقط متصل بالمفصل العالمي الصلب ، هلام المسيل للدموع الاصطناعي ، مرهم العين (البارافين السائل والفازلين بنسبة 1: 1).
- تشمل المواد الاختيارية مجسات الفلورسنت القابلة للحقن ، والمحاقن التي تستخدم لمرة واحدة ، وإبر 27 G للحقن في الوريد الذيل.
- إجراء
- تخدير الفأر في غرفة الحث باستخدام جرعة 2.5٪ إيزوفلوران و 280 مل / دقيقة هواء.
- عندما يكون الفأر فاقدا للوعي ، قم بخفض التخدير إلى 1.8٪ إيزوفلوران و 280 مل / دقيقة هواء ، وقم بتوصيل أنبوب التخدير بحامل الرأس ، وانقل بسرعة إلى وسادة التدفئة ، ووضع الأنف داخل حامل الرأس.
- ثبت تثبيت الرأس في حامل الرأس باستخدام البراغي.
- ضع قطرة من الجل المسيل للدموع الاصطناعي على كلتا العينين لمنع الجفاف.
- عند هذه النقطة ، حقن مجسات الفلورسنت عن طريق الوريد من خلال الوريد الذيل والصورة بعد ذلك مباشرة.
- قم بإمالة الرأس ، وأخرج العين برفق من المقبس ، وقم بتثبيته بالملقط وفي موضعه أسفل الهدف.
- ضع كمية وفيرة من الجل المسيل للدموع الاصطناعي لملء الفراغ بين القرنية والهدف والتركيز على كرويات الكبد من خلال العدسة.
ملاحظة: إذا أمكن ، قم بإزالة عدسة أحد المناظير للحصول على رؤية غير مكبرة وتحديد موقع الكرويات على القزحية بسهولة أكبر. - من أجل الحصول على تصوير عالي الدقة على الرغم من حركات التنفس للحيوان ، استخدم أهداف 25x وإعدادات التصوير التالية: تنسيق 512 × 512 بكسل ، وسرعة مسح 600 هرتز ، وسمك Z-stack يبلغ 3 ميكرومتر. انظر إعدادات التصوير التفصيلية في الجدول 2.
ملاحظة: طوال التصوير ، يتم ضبط تركيز التخدير من 1.6-2.2 مل / ساعة إيزوفلوران لتحقيق إيقاع تنفس ضحل ومتحكم فيه وبالتالي تقليل حركة. - في نهاية جلسة التصوير ، عالج العيون المصورة بمرهم عين الفازلين قبل إزالة الأيزوفلوران وإيقاظ.
النتائج
تم عزل خلايا الكبد الأولية ، المخصبة لخلايا الكبد ، من كبد الفأر عن طريق نضح كولاجيناز من خطوتين ، باستخدام مضخة تمعجية لتدوير المخازن المؤقتة الدافئة عبر الكبد مع الاستفادة من الأوعية الدموية للعضو لتوصيل إنزيمات التفكك إلى جميع الخلايا (الشكل 1 أ). لهذا ، تم تقليب الوريد الأجوف السفلي ، وتم قص الوريد البابي للسماح بتدفق المخازن المؤقتة (الشكل 1 ب). أولا ، تم مسح المخزن المؤقت القائم على HBSS عبر الكبد لتطهير الدم. إذا كان القنية ناجحا ولم تكن هناك جلطات دموية ، فإن الكبد يبيض ويصبح لونه أصفر في غضون ثوان قليلة. ثانيا ، تم توزيع محلول هضم يحتوي على مزيج إنزيم Liberase عبر الكبد لفصل الأنسجة إلى معلق أحادي الخلية. تم عد الخلايا يدويا وزرعها في 96 بئرا من ألواح منخفضة الالتصاق للغاية (ULA) ، والتي تمكن من التجميع الذاتي في كرويات في غضون أيام قليلة. في اليوم 5 ، تتشكل الأجسام الكروية ، وتشير الكبسولة الرقيقة المتاخمة للكرويات إلى التجميع الناجح (الشكل 1C). ننتظر حتى اليوم 10 للزرع ، وعند هذه النقطة تكون الأجسام الكروية مضغوطة وقد طورت روابط قوية بين الخلايا الخلوية. حدد عدد الخلايا المصنفة لكل بئر حجم كروية الكبد ، مع أقطار 1000 و 1200 و 1500 خلية / كروية منتجة جيدا تبلغ 238 ميكرومتر ± 10 ميكرومتر و 248 ميكرومتر ± 17 ميكرومتر و 298 ميكرومتر ± 19 ميكرومتر (متوسط ± SD) ، على التوالي (الشكل 1C ، D). بالنسبة للزراعة ، نختار كرويات يبلغ قطرها حوالي 250 ميكرومتر للأسباب التالية: (1) يجب ألا يكون حجم الكرات كبيرا جدا لتجنب نقص الأكسجة والنواة الميتة ، ولكن يجب أن تحتوي على خلايا كافية لدعم اتصالات الخلايا الخلوية والسماح بإعادة تشكيل الكسب غير المشروع في العين ، (2) يسمح وزن الأجسام الكروية بهذا الحجم لها بالانجذاب نحو القزحية وتحسين نقشها ، (3) هذا الحجم مناسب فيما يتعلق بزرع 5-10 كرويات لكل عين فأر.
تتطلب جراحة الزرع حقنة ملولبة يدوية متصلة بقنية زجاجية (الشكل 2 أ). تتكون القنية الزجاجية من شعيرات شعرية زجاجية من البورسليكات معدلة داخليا للحصول على طرف حاد ناعم باستخدام مجتذب ميكروماصة وشطبة. يمكن إنشاء قنية بديلة أبسط باستخدام قسطرة بلاستيكية متاحة تجاريا متصلة بأنبوب المحقنة ومثبتة في طرف ماصة (الشكل 2 ب). تتكون الجراحة من تلقيح كرويات الكبد في الإنزيم المحول للأنجيوتنسين من خلال شق في القرنية (الشكل 2C). تم وضع الأجسام الكروية على حدود التلميذ لجعلها في متناول التصوير بشكل أفضل وتجنب انتقالها إلى زاوية العين. تم استخدام الفئران البيضاء للزرع ، حيث تسمح قزحية العين غير المصطبغة بالتصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة. تم زرع الفئران المتلقية في كلتا العينين باستخدام 7-10 كرويات / عين ، وتم التقاط صور مجسمة في 3 أيام بعد الزرع (بعد تكساس) وكذلك في أسبوع واحد وشهر واحد بعد تكساس لتوثيق شفاء القرنية ونجاح النقش الكروي (الشكل 2 د). من الجدير بالذكر أن التغير في مظهر كرويات الكبد في ACE بين وقت زرعها حديثا ونقشها بالكامل يرجع إلى تسوية الكسب غير المشروع على القزحية ، وكذلك إلى نمو طبقة أحادية من خلايا القزحية فوق الكروية. معدل نجاح التطعيمات الكروية للكبد في الإنزيم المحول للأنجيوتنسين هو 70٪ (ن = 9 عيون في كل من ذكور وإناث الفئران) (الشكل 2E). الأيام الأولى بعد تكساس هي الأكثر أهمية للبقاء على قيد الحياة والنقش ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى فرك المتلقي عينيه وإزاحة الكرويات قبل أن تلتئم القرنية. لا يختلف حجم كرويات الكبد بشكل كبير بعد تكساس وتعزى التغييرات في الشكل إلى إعادة تشكيل الكسب غير المشروع والتطعيم (الشكل 2F). في 1 شهر بعد تكساس ، كانت جميع الكرويات المطعمة الموجودة على القزحية وعائية ومعصبة ، كما هو موضح في تلطيخ التألق المناعي (الشكل 2G).
يتم إجراء التصوير غير الباضع في الجسم الحي على الفئران المتلقية المخدرة باستخدام مجهر متحد البؤر مستقيم وهدف غمس لمسافات طويلة (الشكل 3 أ ، الجدول 2). يمكن تحقيق التصوير الفلوري في ACE من خلال طرق مختلفة ، كما هو موضح في الشكل 3B. يسمح حقن مجسات الفلورسنت في دوران الماوس المتلقي بتصور أنواع وهياكل مختلفة من الخلايا داخل الأجسام الكروية. استخدمنا الليكتين لتمييز الأوعية الدموية (الشكل 3C) ، CMFDA لمراقبة شبكة القنوات الصفراوية (الشكل 3D) و pHrodo-LDL ، والتي أكدت امتصاص LDL النشط في الخلايا الكروية (الشكل 3E). يمكن أيضا استخدام كرويات الكبد الناتجة عن نماذج فأر المراسل. Albumin-Cre: tdسمحت كرويات الطماطم بوضع العلامات وتتبع خلايا الكبد (الشكل 3F) ، وتم استخدام المستشعر الحيوي للكرويات التي تعبر عن المستشعر الحيوي لمؤشر دورة خلية Ubiquitin الفلوري (FUCCI) لتصور ديناميكيات دورة الخلية بدقة خلية واحدة (الشكل 3G). أخيرا ، يمكن تعديل كرويات الكبد وراثيا في المختبر قبل الزرع ، وفي حالة نقل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) -GFP ، لوحظ التعبير في الجسم الحي لأكثر من 6 أشهر (الشكل 3H).
الشكل 1: عزل الخلايا الكبدية الأولية للفأر وتوليد كرويات الكبد. (أ) المواد والمعدات المستخدمة لعزل الخلايا الكبدية الأولية للفئران: 1. مخازن العزل. 2. حمام مائي. 3. مضخة تمعجية. 4. طبق بتري. 5. مصفاة الخلية. 6. وسادة ماصة. 7. حصيرة التشريح. 8. رافع الخلية. 9. إبرة الفراشة 27 جم. 10. أدوات التشريح. (ب) تجويف البطن أثناء الجراحة: يتم تقليب الوريد الأجوف وتعطيره ، ويتم قص الوريد البابي للسماح بتدفق المخازن المؤقتة. (ج) صور برايتفيلد لتكوين كرويات كبدية في المختبر عند 0 (d0) و 5 (d5) و 10 (d10) أيام بعد البذر ، قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. (د) حجم كروية الكبد بتركيزات مختلفة من بذر الخلايا، ن = 21 كروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زرع كرويات الكبد وتطعيمها في الإنزيم المحول للأنجيوتنسين للفئران. (أ) المواد والمعدات المستخدمة في زرع (تكساس) كرويات الكبد في الإنزيم المحول للأنجيوتنسين: 1. كرويات الكبد في طبق الاستزراع. 2. محلول ملحي معقم. 3. مرهم العين. 4. الإبر 23 غرام ؛ 5. قنية. 6. حقنة هاميلتون. 7. أنبوب غاز التخدير. 8. حامل الرأس وقناع الغاز. 9. وسادة التدفئة. 10. لوحة قاعدة معدنية حسب الطلب. 11. ملقط ومفصل عالمي صلب. (ب) إعداد قنية وحقنة هاملتون: 1. قنية زجاجية متصلة بحقنة هاملتون عبر أنبوب بورتكس وإبرة 27 جرام ؛ 2. يتم توصيل القنية الزجاجية بأنابيب Portex عبر أجزاء إضافية من أنابيب السيليكون وأنابيب PharMed ؛ 3. قنية بلاستيكية مجمعة بديلة. 4. الأجزاء التي تشكل القنية البلاستيكية: قسطرة بلاستيكية 24G BD Insyte متصلة عبر أنابيب PharMed ومغلفة في طرف ماصة مقطوع 10 ميكرولتر لتحقيق الاستقرار والقبضة. (ج) رسم توضيحي لخطوات جراحة Tx: 1. يتم جمع الأجسام الكروية في القنية. 2. يتم ثقب القرنية بإبرة. 3. يتم إدخال القنية في الشق ، ويتم إطلاق الأجسام الكروية في ACE. 4. من خارج العين ، يتم وضع الأجسام الكروية بالقرب من التلميذ وبعيدا عن الشق. (د) صور مجسمة لكرويات الكبد (sph) في عين الفأر في يوم الجراحة وفي 3 و 7 و 30 يوما بعد تكساس. تشير الأسهم إلى كرويات قابلة للحياة. (ه) معدل تطعيم الكبد الكروي (حجم 1200 خلية / بئر) بعد Tx ، n = 9 عيون في 6 فئران متلقية. (F) حجم كرويات الكبد في الثقافة ، قبل الزرع (في المختبر ، ن = 20 كروية من إعداد واحد) وفي 1 شهر بعد Tx في ACE (في الجسم الحي ، ن = 16 كروية في 3 فئران متلقية) ، محسوبة بمتوسط الأقطار الرأسية والأفقية. (ز) تلطيخ التألق المناعي لكرويات الكبد المطعمة في 2 أشهر بعد Tx ، مما يدل على الأوعية الدموية (CD31 ، وردي ، خط متقطع يحدد الكتلة الكروية) والتعصيب الودي (هيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، برتقالي) ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تكييف بيانات اللوحة F بإذن من Lazzeri-Barcelo et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصوير غير جراحي داخل العين في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة. (أ) المواد والمعدات المستخدمة في التصوير بالإنزيم المحول للأنجيوتنسين في الجسم الحي : 1. المجهر البؤري للمسح بالليزر المستقيم. 2. مربع مظلم. 3. مرحلة XYZ الآلية. 4. غمس الهدف. 5. حامل الرأس وقناع الغاز. 6. ملقط ومفصل عالمي صلب. 7. وسادة التدفئة. 8. لوحة قاعدة معدنية حسب الطلب. (ب) شكل يوضح الطرق المختلفة المستخدمة في التصوير الحي لقراءات الفلورسنت في كرويات الكبد المطعمة في العين. (سي - ه) صور تمثيلية لكرويات الكبد ACE-أثناء التصوير في الجسم الحي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. يتم استخدام إشارة التشتت العكسي لمراقبة حجم الكرة وهيكلها ؛ (ج) الأوعية الدموية الموسومة بالحقن الوريدي للمحاضر الفلوري ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر ؛ (د) شبكة القنوات الصفراوية الموسومة بحقن CMFDA الفلوري ، شريط المقياس = 50 ميكرومتر ؛ (ه) امتصاص LDL عن طريق حقن مسبار pHrodo-LDL الفلوري ، شريط المقياس = 100 ميكرومتر ؛ (F) خلايا الكبد المعبرة عن الطماطم Td، تشير رؤوس الأسهم إلى النوى، وتشير العلامات النجمية إلى الأوعية الدموية داخل الكرة الأرضية، وشريط المقياس = 50 ميكرومتر؛ (ز) مراقبة ديناميات دورة الخلية في كرويات الكبد المعبرة عن FUCCI ، قضبان المقياس = 50 ميكرومتر (الصورة الرئيسية) و 20 ميكرومتر (التفجير). (H) كرويات الكبد المحولة في المختبر مع AAV8-GFP قبل Tx وتصويرها في العين في 6 أشهر بعد Tx ، شريط المقياس = 50 ميكرومتر. تم تكييف الصورة في اللوحة G بإذن من Lazzeri-Barcelo et al.10. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: المحاليل المستخدمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران. تكوين المحاليل والمخازن المؤقتة اللازمة لعزل خلايا الكبد الفأر. يجب خلط مكونات محلول الهضم ومحلول التدرج طازجة في يوم العزل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2. إعدادات مجهر لايكا SP5 متحدة البؤر تستخدم للتصوير داخل العين في الجسم الحي لكرويات الكبد. تم تكييف الجدول بإذن من Lazzeri et al.10. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول منصة جديدة للتصوير داخل العين في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في ACE. تم استخدام ACE سابقا كموقع زرع للأنسجة الدقيقة الأخرى المشتقة من الأعضاء ، مثل جزر البنكرياس11,12 ، نظرا لبيئتها الدقيقة الفريدة من نوعها ، كونها غنية بالأوعية والأعصاب والأكسجين ، والوصول إلى التصوير من خلال القرنية. بينما يتيح تصوير الكبد داخل الجسم تصور الخلايا والعمليات في الموقع ، فإن المراقبة الطولية غير ممكنة. يستلزم تصوير الكبد من خلال نافذة البطن جراحة معقدة ، كما أن حركة العضو داخل الجسم تجعل تتبع الخلية الواحدة بمرور الوقت أمرا صعبا. ومن ثم ، فإن طريقة التصوير الجديدة هذه تتيح المراقبة الطولية غير الغازية لخلايا الكبد بدقة خلية واحدة.
ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أجزاء. الأول هو عزل خلايا الكبد الأولية عن طريق نضح كولاجيناز من خطوتين ، مقتبس من Charni-Natan et al.13 ، مع اختلاف أننا نقوم بنضح الكبد على الفأر الميت بدلا من الحية المخدرة. هذا الاختلاف يجلب مزايا معينة ، مثل اعتبارات أخلاقية أقل وتجنب بقايا التخدير في الكائن الحي. في هذا العمل ، نقوم بتوليد كرويات الكبد من الجزء المخصب بخلايا الكبد من العزلة ، لكن هذا لا يستبعد إمكانية عزل مجموعات الخلايا غير المتنية الأخرى باستخدام بروتوكولات متخصصة أخرى لصنع كرويات مشتركة ذات تركيبة متنوعة14,15.
يتضمن الجزء الثاني من هذا البروتوكول زرع كرويات الكبد في ACE للفئران المتلقية. هذه عملية جراحية سريعة (أقل من 10 دقائق) وبسيطة يتم إجراؤها على الفئران المخدرة ولا تتطلب أي علاج بعد الجراحة. ثقب القرنية الأختام الذاتية ويشفى على مدى 3-5 أيام. في بعض الأحيان ، أثناء عملية الشفاء ، لوحظ بعض الضباب حول الشق ، ولكن هذا يزول في غضون أيام قليلة. لم نشهد حالات تزامن أمامي في عيون التي يتم تشغيلها. نقوم بإجراء عمليات الزرع في مختبر نظيف ولكن في الهواء الطلق وبدون مشاكل مع الالتهابات في العيون التي يتم تشغيلها. التلقيح وتطعيم الكرويات في العين لا يضر بالرؤية أو يغير سلوك المتلقي. في هذا البروتوكول ، نستخدم تخدير الأيزوفلوران لكل من جراحة الزرع والتصوير في الجسم الحي ، وهو أمر جيد التحمل في الفئران. نظرا لتأثيره المعتمد على الجرعة ، يمكن تعديله بسهولة طوال الإجراءات ويجلب ميزة تقليل أوقات النوم والاستيقاظ. ومع ذلك ، يمكن استخدام التخدير البديل عن طريق الحقن. بعد الزرع ، نسمح عموما بشهر 1 للكرويات للتطعيم الكامل ، وتصبح الأوعية الدموية ، وتعصب ، قبل إجراء التدخلات العلاجية والتصوير في الجسم الحي . لقد أظهرنا أيضا أن الزرع والنقش ممكن باستخدام كرويات الكبد البشري والفئران المتلقية التي تعاني من نقص المناعة10.
الجزء الثالث من هذه الطريقة هو التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة في ACE. يصف هذا البروتوكول إعداد التصوير في الجسم الحي ، والذي يستخدم معدات الفحص المجهري الموجودة عادة في مرافق التصوير البحثية. علاوة على ذلك ، فإن المواد المتخصصة ، مثل حامل رأس الماوس والقنية البلاستيكية ، متاحة الآن تجاريا. باستخدام إعداد التصوير هذا ، يمكننا التقاط المقاطع z والحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية الكروية ، اعتمادا على عمق اختراق الليزر واكتشاف التألق. تعتمد مراقبة الوظيفة الخلوية في كرويات الكبد المطعمة على تصور البروتينات الفلورية التي تقدم تقارير عن أنواع الخلايا والوظائف الخلوية والديناميكيات. وبالتالي ، يمكن استغلال منصة التصوير هذه باستخدام طرق مختلفة ، بمفردها أو مجتمعة: (1) يمكن إعطاء مجسات الفلورسنت عن طريق الوريد ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة لتسمية الخلايا وتتبعها وكذلك الأصباغ الوظيفية ؛ (2) يمكن توليد كرويات الكبد من الخلايا المعزولة من نماذج الفئران المراسلة التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الخاصة بالكبد ، على سبيل المثال ، كرويات الكبد FUCCI التي تقدم تقارير عن ديناميكيات دورة الخلية ؛ (3) يمكن الجمع بين تكوين كرويات الكبد في المختبر مع النقل أو التنبيغ ، لتزويد الكائنات الكروية ببروتينات الفلورسنت وأجهزة الاستشعار الحيوية. على سبيل المثال ، الفيروسات المرتبطة بالغدية. في إعداداتنا التجريبية وباستخدام فوتون واحد للإثارة ، يكون عمق التصوير الممكن تحقيقه حوالي 60-100 ميكرومتر. ومع ذلك ، فإن هذا يعتمد على قوة الليزر وتوافر التصوير متعدد الفوتونات ، وخصائص انبعاث مسبار مضان وحساسية أجهزة الكشف ، وكذلك زاوية العين التي يتم فيها نقش الكرة الكروية. بعد الحصول على التصوير ، يمكن إجراء تحليل الصورة النهائية باستخدام برامج شائعة مثل Image J و Imaris. على سبيل المثال ، في حالة مراسل FUCCI ، يمكن حساب الخلايا النشطة لدورة الخلية باللون الأخضر ومقارنتها بعدد الخلايا الحمراء الكلية لتقييم نشاط دورة الخلية داخل الكروية المطعمة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح منصة التصوير ACE-imaging بتطبيق المواد على العين (في شكل قطرات للعين) أو حقنها مباشرة في ACE لعلاج الكسب غير المشروع ومراقبة تفاعله. بعد الوفاة ، يمكن بسهولة استرداد الكرويات المزروعة عن طريق التشريح المجهري اليدوي ويمكن أن توفر معلومات قيمة عن طريق تقنيات خارج الجسم الحي ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، والتحليل النسخي ، وما إلى ذلك.10.
هذه التقنية لها قيود معينة. الأول هو أنه من تجربتنا ، يجب أن تكون الفئران المتلقية ألبينو ، أي لديها قزحية غير مصطبغة. عند النقش ، تصبح كرويات الكبد مغطاة بطبقة أحادية من خلايا القزحية ، والتي لا تؤثر على صلاحية أو وظيفة الكائنات الكروية ، لكن الصباغ الموجود في خلايا القزحية يمنع التصوير. الاعتبار الثاني هو الاستقرار أثناء التصوير داخل العين في الفئران المخدرة. أثناء جلسات التصوير في الجسم الحي ، يجب مراقبة تركيز التخدير وتنفس عن كثب لتقليل الحركة. ومع ذلك ، باستخدام إعدادات التصوير المشار إليها هنا ، يمكننا تحقيق تصوير عالي الدقة على مستوى الخلية الواحدة.
للتلخيص ، يصف هذا البروتوكول تنفيذ منصة تصوير غير جراحية في الجسم الحي لأنسجة شبيهة بالكبد محفورة في عيون الفئران. نحن نستخدم إجراءات سهلة ومعدات مشتركة ومواد ميسورة التكلفة ، مما يجعلها نهجا يمكن تحقيقه للعديد من المحققين. يجمع هذا النموذج بين مزايا كرويات الكبد 3D في المختبر مع الوسط في الجسم الحي وإمكانية الوصول البصري التي يوفرها ACE لإنشاء منصة قيمة لدراسة فسيولوجيا الكبد وعلم الأمراض في البحوث الأساسية والإعدادات قبل السريرية.
الإفصاحات
P-OB هو المؤسس المشارك والرئيس التنفيذي لشركة Biocrine AB و IBL و BL هم مستشارون لشركة Biocrine AB.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية السويدية للسكري ، وصناديق معهد كارولينسكا ، ومجلس البحوث السويدي ، ومؤسسة نوفو نورديسك ، ومؤسسة فاميلي إيرلينج بيرسون ، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في معهد كارولينسكا ، ومؤسسة فاميلي كنوت وأليس والنبرغ ، ومؤسسة جوناس وكريستينا أف يوشنيك ، والجمعية السويدية لأمراض السكري و ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. تم إنشاء الرسومات الشكلية بواسطة FL-B باستخدام BioRender.com.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 27 G إبرة فراشة | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | تشارلز ريفر | CV17169-AV9 | محتضنة بخلايا كبد معزولة عند 1 & micro ؛ لتر / مل أثناء تكوين الكبد الكروي |
| المطلق و 70٪ الإيثانول | N / A | N / | |
| وسادة ماصة | يحضر | 203903 | |
| الألبومين Cre ؛ RCL-tdTomato (B6. Cg-Speer6-ps1Tg (Alb-cre) 21Mgn / J ; ب 6. Cg-GT (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J) | Jackson | # 003574 و # 007914 | الفئران التي تم الحصول عليها من تربية |
| الفئران البيضاء B6 الداخلية (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) | Jackson | # 000058 | الفئران التي تم الحصول عليها من التكاثر الداخلي |
| B6 ؛ 129P2-GT (ROSA) 26Sor [tm1 (CAG-Venus / GMNN ، -Cherry / CDT1) Jkn] / JknH | INFRAFRONTIER / EMMA | EM: 08395 | الفئران التي تم الحصول عليها من التربية الداخلية |
| BD Insyte IV القسطرة 24 جم × 0.75 في | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate cappilaries الزجاجية القياسية ؛ | أدوات الدقة العالمية | 1B150-4 | |
| رافع الخلايا | Corning | 3008 | |
| مصفاة الخلية ، 70 ومايكرو ؛ m | Falcon | 352350 | |
| متجر أجهزة الألواح المعدنية المصنوعة حسب الطلب | N / A | ||
| ديكساميثازون | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| مجتذب ماصة زجاجية مزدوجة | المرحلة Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| وسادة تسخين كهربائية | متجر لاجهزة الكمبيوتر | N / A | |
| FBS | Gibco | N / A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| الأخضر CMFDA | Abcam | ab145459 | أعيد تشكيله في DMSO ، تدار في 100 & مايكرو ؛ ز / ماوس في PBS 10٪ FBS |
| حقنة هاميلتون | هاميلتون | 81242 | نموذج 1750 طرف لور خيوط الغطاس حقنة ، 500 & مايكرو ؛ L |
| HBSS ؛ خال من الكالسيوم والمغنيسيوم ولا الفينول الأحمر | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x / 0.95 W الموضوعي | Leica | N / A | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| غرفة الحث 0.8 لتر | Univentor | 8329001 | |
| الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS-G) | جيبكو | 41400045 | |
| الأيزوفلوران | باكستر | N / A | |
| ليكتين DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | يدار بمعدل 1 مجم / مل و 100 ميكرو ؛ L / ماوس |
| Liberase TM البحث الصف | سيجما ألدريتش | 5401127001 | |
| شطوف القطب الكهربائي | الصغير العالم الدقة الآلات | الدقة نموذج BV-10 | |
| حامل رأس الماوس وقناع الغاز | Narshige | نموذج SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-shaped-bottom | Microplate Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N / A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x ؛ لا كالسيوم ، لا مغنيسيوم ، لا مغنيسيوم | ، جيبكو | 14190144 | |
| البنسلين - الستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | |
| بيركول | سيجما - ألدريتش | P1644 | |
| مضخة التمعج | Ismatec | موديل ISM795 | |
| PharMed BPT مضخة | أنابيب VWR | VERN070540-07 | القطر الداخلي 0.76 مم ، القطر الخارجي 2.46 مم |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | تدار عند 1 مجم / مل و 100 وميكرو ؛ L / ماوس |
| Portex Fine Bore أنابيب البولي إيثيلين | سميثس الطبية | 800/100/140 | القطر الداخلي 0.4 مم ، القطر الخارجي 0.8 مم |
| حصيرة تشريح السيليكون | متجر الأجهزة | N / A | |
| كلوريد الصوديوم 0.9٪ | براون | N / A | |
| مفصل عالمي | صلب Narshige | نموذج UST-2 | |
| مجهر مجسم | لايكا | موديل M80 | |
| طبق ثقافة معلق 35 مم | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N / A | تدار s.c. عند 0.05 مجم / مل و 2 & micro ؛ L / g ماوس |
| سيليكون شفافة | VWR | 228-1450 | القطر الداخلي 1.5 مم ، القطر الخارجي 3 مم |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 وحدة التخدير ؛ | Univentor | 8323001 | |
| مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المستقيم | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N / A | |
| William's E Medium ؛ بدون جلوتامين ، فينول أحمر | Gibco | 22551089 |
المراجع
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187(2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248(2020).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964(2020).
- Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297(2018).
- Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347(2019).
- Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014(2021).
- Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767(2024).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086(2020).
- Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
- Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
