Method Article

تحسين تصور النقل المحوري للبضائع الداخلية بواسطة الفحص المجهري الفلوري في التهاب Caenorhabditis elegans الحي

DOI:

10.3791/66236

⸱

February 16th, 2024

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف الورقة تحسين معلمات اكتساب الفحص المجهري الفلوري لتصور النقل المحوري للشحنات الموسومة الداخلية بدقة خلية عصبية واحدة في الديدان الخيطية الحية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد النقل المحوري شرطا أساسيا لتوصيل البروتينات المحورية من موقع تخليقها في جسم الخلية العصبية إلى وجهتها في المحور العصبي. وبالتالي ، فإن فقدان النقل المحوري يضعف نمو الخلايا العصبية ووظيفتها. ومن ثم، فإن دراسة النقل المحوري تحسن فهمنا لبيولوجيا الخلايا العصبية. مع التحسينات الأخيرة في تحرير جينوم CRISPR Cas9 ، أصبح وضع العلامات الداخلية للشحنات المحورية متاحا ، مما يتيح تجاوز التصور القائم على التعبير خارج الرحم للنقل. ومع ذلك ، غالبا ما يأتي وضع العلامات الداخلية على حساب كثافة الإشارة المنخفضة ويستلزم استراتيجيات التحسين للحصول على بيانات قوية. هنا ، نصف بروتوكولا لتحسين تصور النقل المحوري من خلال مناقشة معلمات الاستحواذ ونهج التبييض لتحسين إشارة البضائع الموسومة الداخلية على خلفية السيتوبلازم المنتشرة. نحن نطبق بروتوكولنا لتحسين تصور سلائف الحويصلة المشبكية (SVPs) الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) RAB-3 لتسليط الضوء على كيف يمكن لمعلمات الاكتساب الدقيقة أن تحسن تحليل البضائع المحورية الموسومة داخليا في Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد الخلايا العصبية طوال الحياة على النقل المحوري لتوصيل البروتينات والليبيدات والجزيئات الأخرى من جسم الخلية إلى وجهتها النهائية في المحور. وبالتالي ، يرتبط ضعف النقل المحوري بفقدان الوظيفة العصبية وغالبا ما يشارك في أمراض الاضطرابات التنكسية العصبية 1,2. ومن ثم ، فإن فهم الآليات التي يقوم عليها النقل المحوري له أهمية كبيرة.

كشفت عدة عقود من الأبحاث حول النقل المحوري عن العديد من الأفكار المهمة حول الآلية الجزيئية التي تتوسط هذا النقل وتكوينها وكذلك الآليات التنظيمية. يحدث النقل المحوري بعيد المدى على الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة، والذي يتكون من بوليمرات الأنابيب الدقيقة المتداخلة جزئيا والتي عادة ما تكون موجهة مع نهايتها الموجبة في المحاورالعصبية 3. وبالتالي ، يتم التوسط في النقل المتقدم بواسطة البروتينات الحركية التي تمشي إلى الطرف الزائد من الأنابيب الدقيقة ، كينيسين ، في حين يعتمد النقل الرجعي على محرك الدينين الموجه ناقص النهاية. على الرغم من الكشف عن العديد من جوانب النقل ، إلا أنه بالنسبة للعديد من البروتينات المحورية لا يزال غير واضح ، وكيف يتم تحميلها في آلية النقل ، وكيف يتم تنظيم حزم النقل الفردية ، وكيف يتم تنظيم هذا النقل3.

تمت دراسة النقل المحوري في البداية في تجارب وضع العلامات الراديوية ، حيث تم حقن الأحماض الأمينية ذات العلامات الإشعاعية في المقصورة الجسدية ، حيث تم دمجها في البروتينات الداخلية الوليدة ويمكن تتبعها بمرور الوقت في المقصورة المحورية بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي4. على الرغم من أن تجارب وضع العلامات الإشعاعية سمحت بدراسة النقل المحوري للبروتينات الداخلية في الجسم الحي ، إلا أنها لا تسمح بالمتابعة المباشرة لسلوك البضائع الفردية للحصول على رؤى ميكانيكية4. تم التغلب على هذا القيد باستخدام المجهر الفلوري. ومع ذلك ، غالبا ما لا يتم تصور النقل المحوري على البروتينات الداخلية ولكن بدلا من ذلك عن طريق التعبير عن نسخة فلورية موسومة. خاصة بالنسبة للبروتينات منخفضة التعبير ، يوفر التعبير المفرط شدة إشارة أعلى تجعل التصور ، ويفضل أن يكون ذلك بدقة خلية عصبية واحدة ، ممكنا. علاوة على ذلك ، فإن التعبير خارج الرحم للبروتين الموسوم بالفلورسنت يتحايل على الحاجة والتحديات التي تواجه تحرير الجينوم. على العكس من ذلك ، فقد قيل إن سلوك البضائع المعبر عنها خارجيا قد يختلف عن سلوك البضائع الداخلية5.

جعلت التحسينات الأخيرة في تحرير الجينوم استراتيجيات وضع العلامات الداخلية أسهل في الوصول إليها. ومن ثم ، أصبحت شدة الإشارة المنخفضة هي القيد الرئيسي لدراسة النقل المحوري للشحنة عن طريق التعبير خارج الرحم بدلا من وضع العلامات الداخلية. يمكن للاعتبارات الدقيقة في استراتيجية وضع العلامات الداخلية المقترنة بتحسين ظروف الاستحواذ التغلب على هذا التحدي.

توفر الديدان الخيطية نموذجا بحثيا ممتازا لدراسة النقل المحوري في الجسم الحي نظرا لشفافيتها وسهولة التلاعب الجيني. في هذا البروتوكول ، نصف استراتيجية بحث لتصور النقل المحوري للبروتينات الداخلية بدقة خلية عصبية واحدة في Caenorhabditis elegans الحية.نحن نتصور النقل المحوري لسلائف الحويصلة المشبكية باستخدام سلالة تم إنشاؤها بواسطة مختبر Jorgensen6 ، حيث يتم تمييز الحويصلة المرتبطة ب RAB GTPase ، RAB3 ، داخليا مع GFP ، في الخلايا العصبية الحركية DA9. من خلال السؤال عن كيفية قيام التعديلات الصغيرة في معلمات الاستحواذ المختلفة والتبييض الضوئي بتحسين تصور أحداث النقل الفردية ، يوفر البروتوكول أفكارا حول كيفية تحسين ظروف التصوير.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على بروتوكول مفصل حول كيفية الحفاظ على الديدان الخيطية وإعدادها لتصوير الخلايا الحية ، راجع عمل S.Niwa 7.

1. توليد سلالة الدودة

بالإضافة إلى توليد سلالات الديدان الخيطية ، يحتوي مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC)8 على مجموعة متزايدة من سلالات الديدان الخيطية مع بروتينات موسومة داخليا يمكن الحصول عليها مباشرة من صفحة الويب الخاصة بهم.

  1. اختيار استراتيجية وضع العلامات الفلورية
    1. استخدم سلالة الديدان الخيطية MTS1161 ، التي تحتوي على أليل rab-3 (ox699)6 ، لتصور GFP الداخلي المسمى RAB-3 في الخلايا العصبية الحركية DA9 (سيتم ترسيب السلالة في CGC). لتصور البروتينات المحورية الأخرى ، قم بتوليد سلالة من الديدان الخيطية مع بروتين موسوم داخلي المنشأ باستخدام بروتوكول تحرير CRISPR Cas9 من Mello Lab9.
      ملاحظة: يستخدم MTS1161 نهج إعادة التركيب للخلية على وجه التحديد تسمية RAB-3 داخليا مع علامة GFP6. يعتمد النهج البديل الشائع على إعادة تكوين بروتين فلوري مقسم ، والذي يوصى به للبروتينات منخفضة التعبير بشكل خاص لأنه يعزز عدد النسخ الفلورية لكل بروتين داخلي المنشأ باستخدام نسخ فلورية مقسمة متعددة10. يمكن تقدير رقم النسخة في البداية بناء على مجموعات بيانات النسخ من صفحة ويب CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. اختيار الخلايا العصبية لتصور النقل المحوري
    1. في MTS1161 الإجهاد ، تصور RAB-3 في الخلايا العصبية الحركية DA9 (انظر الشكل 1). بالنسبة للشحنات المحورية الأخرى ، وخاصة البروتينات منخفضة التعبير ، حدد الخلية العصبية التي تكون فيها مستويات التعبير عن البروتين الذي تم تحليله أعلى باستخدام صفحة ويب CenGen.
      ملاحظة: يوفر مشروع CenGen (cengen.org) موردا رائعا عبر الإنترنت لتقدير مستويات التعبير عن بروتين مهم في العديد من الخلايا العصبية للديدان الخيطية بناء على مجموعة بيانات نسخية كبيرة تغطي جميع الخلايا العصبية البالغ عددها 302 في الجهاز العصبي C. elegans 12,13.

2. التعامل مع الدودة والتحضير للتصوير

  1. الحفاظ على الديدان الخيطية على العشب من البكتيريا (سلالة: OP50) المصنفة على لوحات متوسطة نمو الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية ونمت إلى سن 1 يوم في مرحلة البلوغ للتصوير.
    ملاحظة: يعد قياس النقل المحوري في مرحلة عمرية محددة أمرا مهما حيث تنخفض معدلات النقل مع الشيخوخة باستمرار عبر الشحنات المحورية المختلفة وفئات الخلايا العصبية والكائنات الحية14،15،16،17،18-الديدان الخيطية في مرحلة اليرقات L4 أو يوم واحد في مرحلة البلوغ تم استخدامها في معظم الأوراق وبالتالي تقدم أكبر مجموعات البيانات للمقارنة.
  2. تحضير الديدان الخيطية لتصوير الخلايا الحية: قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة باستخدام مجهر ستيريو لتصور الديدان والتعامل معها.
    1. انقل الديدان الخيطية إلى قطرة 0.5 مللي متر ليفاميزول باستخدام معول سلك بلاتيني واحتضن الديدان الخيطية لمدة 20 دقيقة في القطرة.
    2. قم بتركيب 10-20 نيماتودا بعناية من قطرة ليفاميزول في قطرة 12 ميكرولتر من وسط M9 على رقعة أغاروز 10٪ (مذابة في وسط M9) على شريحة زجاجية باستخدام عود شعر. للحصول على إجراء مفصل حول كيفية صنع رقعة أغاروز بنسبة 10٪ ، راجع بروتوكول S.Niwa7.
      ملاحظة: يكفي تركيب عدد قليل من الديدان الخيطية حيث سيتم تصوير عدد قليل فقط من لكل شريحة قبل أن تبدأ في المعاناة من نقص الأكسجة.
    3. ضع زلة غطاء أعلى القطرة (22 مم × 22 مم أو 18 مم × 18 مم). لتصوير النقل في محور DA9 ، ضع المحور العصبي بالقرب من زلة الغطاء. للقيام بذلك ، قم بتدوير انزلاق الغطاء بمقدار 45 درجة بعد وضعه فوق رقعة أجار ، لدحرجة على ظهرها.
    4. أغلق المسافة بين انزلاق الغطاء والشريحة الزجاجية بهلام لزج مثل الفازلين. سيمنع ذلك رقعة الأغاروز من الجفاف ، مما قد يتسبب في انجراف الديدان الخيطية خارج مجال التصوير.
      ملاحظة: من الضروري معاملة بلطف قدر الإمكان. تركيزات عالية جدا من ليفاميزول أو الأضرار المادية للدودة يمكن أن تضعف النقل المحوري. تشنجات خفيفة من الذيل أثناء جلسة التصوير هي علامة جيدة على أن لا يزال في حالة صحية. تظل بصحة جيدة ويمكن أن تتعافى من رقعة الأغاروز بعد جلسة التصوير.

3. المجهر الخلوي الحي

ملاحظة: يمكن أن تختلف قيم معلمات الاستحواذ الدقيقة بين المجاهر. ومع ذلك ، يجب أن تكون الاتجاهات لكل معلمة اكتساب مستقلة عن المجهر المستخدم. تم استخدام مجهر متحد البؤر ذو قرص دوار مجهز بخط ليزر منفصل للتبييض في هذا البروتوكول (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المجهر). تم إثارة التألق الأخضر بواسطة ليزر 488 نانومتر وتم ترشيح الانبعاثات بواسطة مرشح انبعاث ET525 / 36. تم إجراء التبييض باستخدام خط ليزر 488 نانومتر.

  1. تأكد من ضبط درجة حرارة الغرفة ، أو في حالة توفر مرحلة يتم التحكم في درجة حرارتها ، على درجة حرارة ثابتة. بالنسبة للديدان الخيطية ، اضبط درجة الحرارة على 20 درجة مئوية.
  2. قم بتركيب الشريحة واستخدم عدسة موضوعية مع تكبير 4x-20x لتحديد موقع الديدان الخيطية على الشريحة وحفظ المواضع. قم بالتبديل إلى عدسة تكبير 63x للحصول على الصور.
  3. التقط صورة واحدة للتحقق من معلمات الاستحواذ الأولية. تتبع شدة الإشارة في مجال الرؤية باستخدام الرسم البياني لشدة برنامج الاستحواذ. يجب أن تغطي قيم الكثافة الثلث الأدنى من الإشارة القصوى التي يمكن للكاميرا اكتشافها. تجنب تشبع البكسل. تعزيز شدة ليزر الإثارة إذا كانت شدة الإشارة منخفضة جدا.
    ملاحظة: لا تستخدم شدة ليزر عالية الإثارة لأنها تبيض بروتين الفلورسنت أثناء الفاصل الزمني.
  4. قم بتغيير معلمة الاستحواذ والخطوات هنا لتحسين اكتشاف إشارة التألق.
    1. تنفيذ خطوة التبييض: تبييض منطقة المحور العصبي التي سيتم تحليلها باستخدام خط ليزر 488 نانومتر (الطاقة: 15 ميجاوات) لخطوة التبييض. تهدف إلى كفاءة تبييض لا تقل عن 90٪. حدد كفاءة التبييض من خلال مقارنة شدة إشارة المنطقة قبل وبعد خطوة التبييض.
      ملاحظة: يعزز التبييض إشارة الجسيمات المتحركة عن طريق خفض الإشارة المستمدة من الجسيمات الثابتة وكذلك من الإشارة المستمدة من الجزء السيتوبلازمي للبروتين في الخلفية. تحتوي البضائع الغشائية ، مثل RAB-3 على سلائف الحويصلة المشبكية ، على جزء سيتوبلازمي منخفض بحيث تعمل خطوة التبييض على تحسين إشارة حزمة النقل بشكل معتدل على الخلفية السيتوبلازمية (الشكل 2A ، D). ومع ذلك ، فإن التبييض يحسن تتبع أحداث النقل الفردية عبر مسافات أطول ويسمح بتحديد أوقات التوقف المؤقت (الشكل 2 أ).
    2. Binning: استخدم 2 × 2 binning لتحسين كثافة الإشارة لأحداث النقل الفردية. يجمع Binning بين صفائف البكسل في بكسل واحد أكبر. سيؤدي ذلك إلى تقليل الدقة المكانية ولكنه يعزز شدة الإشارة لأحداث النقل الفردية وهو مفيد بشكل خاص للجسيمات الخافتة (الشكل 2B ، D).
    3. وقت التعرض: تعزيز وقت التعرض لتعزيز شدة الإشارة. يؤدي تحسين وقت التعرض إلى تحسين شدة إشارة العينة إلى تكلفة الحصول على دقة زمنية أقل لأحداث النقل. للتجربة هنا ، استخدم دقة زمنية من 300 مللي ثانية إلى 700 مللي ثانية بين نقاط زمنية متتالية (100-500 مللي ثانية وقت التعرض) لمتابعة أحداث النقل الفردية ل RAB-3. (الشكل 2 ج ، د)
  5. تسجيل الفاصل الزمني: خذ الفاصل الزمني لمدة 1-3 دقائق على الأقل اعتمادا على شدة إشارة البروتين بالإضافة إلى تكرار أحداث النقل الفردية. بمجرد تسجيل الفاصل الزمني ، انتقل إلى التالي. يجب عدم تصوير على شريحة لأكثر من 30 دقيقة للتأكد من أن المسجلة في حالة صحية.
    ملاحظة: تشنجات خفيفة من ذيل أثناء التسجيل هي مؤشر على أن لا يزال على قيد الحياة.

4. تحليل بيانات النقل المحوري

ملاحظة: استخدم ImageJ/Fiji19 لخطوات تحليل الصور اللاحقة. فيجي قادرة على قراءة البيانات بواسطة جميع مجموعات برامج الفحص المجهري الشائعة.

  1. جيل كيموغراف
    1. استيراد البيانات: استيراد ملف بيانات الفاصل الزمني إلى فيجي. في حالة عدم تمكنه من استيراد البيانات إلى فيجي ، قم بتصدير تسجيل الوقت كملف tiff من حزمة البرامج وقم بتحميله لاحقا إلى فيجي.
    2. تصحيح الانجراف: تحقق مما إذا كان جزء/المحور العصبي قد تحرك أو انجرف قليلا أثناء التقاط الصورة. صحيح لحركة أو الانجراف عن طريق تشغيل المكون الإضافي StackReg20. عند تشغيل المكون الإضافي ، اختر تحويل الجسم الصلب .
    3. التوليد اليدوي للكيموغراف: يتم توفير إجراء مفصل خطوة بخطوة في الشكل 3. استخدم الفيلم المصحح للانجراف لإنشاء الكيموغراف. استخدم أداة الخط المجزأ واضبط عرض الخط لمطابقة قطر المحور العصبي بالنقر المزدوج بزر الفأرة الأيسر على أيقونة الخط المجزأ لرسم خط على طول قطعة المحور العصبي التي سيتم تحليلها. قم بتشغيل المكون الإضافي ImageJ / Fiji Kymoreslicewide لإنشاء kymograph واستخدام قيمة الكثافة القصوى عبر عرض الخط في إعدادات المعلمات الخاصة به.
      ملاحظة: الحفاظ على الاتساق في اتجاه رسم الخط (على سبيل المثال ، دائما ما يكون محور عصبي قريب إلى بعيد أو عكسي) يبسط تتبع اتجاه الحركة الخلفية في أجهزة القياس بالكيموجراف.
  2. تحليل معلمة النقل
    1. احسب معلمة النقل: رقم الحدث والسرعة وطول التشغيل ومدة التوقف المؤقت من kymograph باتباع الخطوات التالية.
      1. تتبع أحداث النقل في الكيموغراف: استخدم أداة الخط المستقيم لتتبع أحداث النقل الفردية على الكيموغراف. احفظ كل سطر في مدير عائد الاستثمار وتتبع جميع أحداث النقل في الكيموغراف. اختر معلمات القياس التالية في ImageJ/Fiji: المساحة، المستطيل المحيط، متوسط القيمة الرمادية، قطر Feret.
      2. حساب معلمة النقل: الصق جدول النتائج في جدول بيانات واستخدم الأعمدة التالية من أقسام النتائج للحساب:
        طول التشغيل: اضرب العرض (بالبكسل) في دقة الكاميرا (على سبيل المثال ، x μm / pxl) لتحديد طول التشغيل بالميكرومتر.
        السرعة: طول التشغيل / مدة التشغيل. لتحديد مدة حدث الحركة بالثواني ، اضرب الارتفاع (بالبكسل) في وقت الاستحواذ بين النقاط الزمنية المتتالية (على سبيل المثال ، x s / pixel).
        وقت الإيقاف المؤقت: مدة التشغيل بين حركتين متتاليتين تكون السرعة فيهما 0.
        رقم الحدث: يمكن تسوية إجمالي الأحداث إلى الطول الإجمالي للكيموغراف لتحديد رقم الحدث لكل دقيقة ومقطع طول المحور. يمكن تصنيف الأحداث أيضا إلى أحداث نقل تقدمية ورجعية. لتحديد اتجاه كل حدث حركة ، استخدم أداة Feret Angle. في أجهزة القياس الكميغرافي التي تم إنشاؤها في البداية عن طريق رسم الخط المجزأ من القريب إلى البعيد وأحداث النقل الأمامية في الكيموغراف تشير من اليمين إلى اليسار ، ستشير زاوية النمس < 90 درجة إلى درجة متقدمة و >90 درجة إلى حدث رجعي ، وإلا فسيكون العكس.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرة عامة على النظام النموذجي وإجراءات القياس
لتصور النقل المحوري لسلائف الحويصلة المشبكية ، تتبعنا GFP داخليا المسمى RAB-3. هنا نستفيد من GFP :: Flip-on::RAB-3 سلالة6 التي تم إنشاؤها مؤخرا ، حيث يؤدي التعبير عن Flippase recombinase تحت مروج خاص بالخلية (glr-4p) إلى تسمية RAB-3 الداخلية في الخلايا العصبية الحركية DA9. DA9 هي خلية عصبية حركية ثنائية القطب ، يقع جسمها الخلوي في الجزء الخلفي من على الجانب البطني ، بالقرب من فتحة الشرج (الشكل 1 أ). يحتوي على تغصنات قصيرة تمتد إلى الأمام على طول الحبل العصبي البطني ومحور عصبي طويل يمتد إلى الخلف ، ويشكل تماسكا ثم يمتد إلى الأمام على طول الحبل العصبي الظهري ، حيث يشكل نقاط الاشتباك العصبي العابرة التي تعصب العضلات الظهرية والخلايا العصبية VD22،23،24. نحن نتصور النقل المحوري في المنطقة اللاشبكية. يمكن التقاط معظم أحداث النقل بمستوى بؤري واحد (الشكل 1 أ). يتم تنفيذ خطوة تبييض ضوئية أولية لتقليل خلفية الحويصلات الثابتة في هذه المنطقة ، والتي غالبا ما تميل إلى التوقف مؤقتا في هذه المنطقة (الشكل 1 ب). يتم تسجيل مقاطع الفيديو ذات الفاصل الزمني على مدى 3 دقائق ويتم رسم إشارة RAB-3 على طول المنطقة غير المشبكية في مخطط كموموغراف لاستخراج أحداث النقل الفردية (الشكل 1C).

ضبط معلمة الاستحواذ لتحسين تصور النقل المحوري
للتغلب على شدة الإشارة المنخفضة للعديد من البروتينات الموسومة بالفلورسنت داخليا ، يجب تحسين معلمات اكتساب المجهر. من أجل تقدير كمي قوي لأحداث النقل ، يجب أن تكون شدة إشارة أحداث النقل الفردية ساطعة قدر الإمكان على الخلفية السيتوبلازمية أو البضائع الثابتة المتوقفة مؤقتا. غالبا ما تتوقف سلائف الحويصلات المتشابكة في المنطقة اللاشبكية في برك حويصلات مميزة ، مما يتداخل مع اكتشاف الحويصلات الواردة الجديدة ويجعل من الصعب تتبع آثار نقلها7.

يمكن لخطوة تبييض مضان أولية واحدة أن تقلل بشدة من إشارة التألق المستمدة من أحواض الحويصلات لتعزيز اكتشاف حركة الحويصلات الواردة الجديدة (الشكل 2 أ). عززت خطوة التبييض بشكل معتدل إشارة تحريك حويصلات RAB-3 فوق كثافة الخلفية السيتوبلازمية على الأرجح لأن الجزء السيتوبلازمي من RAB-3 منخفض جدا (الشكل 2D).

يوفر استخدام binning طبقة إضافية لتحسين الإشارة على خلفية أحداث النقل الفردية من خلال الجمع بين صفيف من وحدات البكسل في بكسل واحد. سيؤدي تجميع 2 × 2 إلى خفض الدقة المكانية إلى النصف (هنا من 108.33 نانومتر / بكسل إلى 216.7 نانومتر / بكسل) ، والتي لا تزال كافية لتتبع جزيئات النقل RAB-3 الفردية (الشكل 2B) ولكنها تحسن بشدة شدة إشارة الحويصلات الفردية (الشكل 2D). ما لم تكن هناك حاجة إلى دقة مكانية عالية جدا ، يمكن أيضا تطبيق binning لتصور العديد من الشحنات المحورية الأخرى.

بعد ذلك ، سألنا كيف يمكن للتغييرات في وقت التعرض أن تحسن شدة الإشارة لأحداث النقل الفردية. قمنا بشكل خاص بتضمين وقت التعرض في التحليل لإثبات أن وقت التعرض الذي يصل إلى 500 مللي ثانية مع 700 مللي ثانية بين نقاط وقت التصوير اللاحقة لا يزال يوفر دقة زمنية يمكن عندها تتبع سلائف الحويصلة المشبكية (الشكل 2C ، D).

توليد وتحليل أجهزة القياس الكمي مع فيجي
لإنشاء مخطط كيموغراف وتحليل أحداث النقل الفردية باتباع الخطوات الواردة في الشكل 3.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على نظام النموذج لتصور النقل المحوري للفلورسنت الداخلي RAB-3. (أ) اللوحة العلوية: نظرة عامة على الديدان الخيطية مع المحور الخلفي الأمامي والبطني الظهري المشار إليه. تسمى الخلية العصبية الحركية DA9 باللون الأزرق. اللوحة الوسطى: تكبير المنطقة المحاصرة الموضحة في اللوحة العلوية مع تقسيم DA9 المشار إليه. En نقاط الاشتباك العصبي المارة موضحة باللون الأخضر ، * يشير إلى فتحة الشرج. لاحظ أن المحور العصبي يستمر في الحبل العصبي الظهري حتى يمر الفرج. يشير المربع الأحمر إلى منطقة المنطقة اللاشبكية. اللوحة السفلية: صورة مجهرية متحدة البؤر ل GFP داخلي المنشأ المسمى RAB-3 في المحور العصبي القريب في مستوى بؤري واحد. لاحظ أن هناك أحواض حويصلة من RAB-3 توقف لفترة أطول في المنطقة غير المشبكية ، على الرغم من أن معظم مجموعات إشارات RAB-3 في المنطقة المشبكية. المنطقة اللاشبكية محاصرة باللون الأحمر. المقياس: 20 ميكرومتر. (ب) صور تمثيلية لتسجيل الفاصل الزمني لتصور النقل المحوري. لتعزيز إمكانية تتبع جزيئات النقل الفردية على الجسيمات الثابتة ، يتم تبييض المنطقة اللاشبكية ضوئيا في البداية. تظهر الألواح السفلية في المنطقة المربعة باللون الأرجواني مثالا على حدث حركة أمامي (رأس سهم برتقالي) ورجعي (رأس سهم أزرق). تمثل اللوحات من أعلى إلى أسفل نقاطا زمنية متتالية. (ج) تم رسم تسجيل الفاصل الزمني في (B) كمخطط كموموغراف (تمثيل 2D للوقت على الموضع). تمثل الخطوط القطرية أحداث الحركة التي يشير فيها الميل إلى السرعة. تظهر الخطوط العمودية الأحداث الثابتة. المربع الأرجواني هو تكبير للكيموغراف لتسليط الضوء على أحداث النقل التي تظهر أيضا في (B) ويتم تتبع أحداث النقل الأمامية (البرتقالية) والرجعية (الزرقاء). تشير الخطوط الرأسية المتقطعة إلى أحداث الإيقاف المؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحسين خطوات ومعلمات الاستحواذ لتحسين تصور البضائع المحورية الذاتية. تم تصور GFP الداخلي :: RAB-3 في المنطقة غير المشبكية للمحور العصبي DA9 مع التقاط صور لمستوى بؤري واحد على مجهر قرص دوار متحد البؤر. تم الحصول على أجهزة القياس الكميغرافي لتصور أحداث النقل الفردية في الاتجاه الأمامي (من اليمين إلى اليسار) والتراجع (من اليسار إلى اليمين) (A-C). (أ) تظهر أجهزة القياس بالقياس الحجمي أحداث النقل RAB3 بدون (أجهزة القياس بالكيموجراف اليسرى) أو بخطوة تبييض متكاملة. لاحظ أن خطوة التبييض تعمل على تحسين تصور أحداث الإيقاف المؤقت (المشار إليها برؤوس الأسهم الصفراء) بين أحداث النقل المتتالية (رؤوس الأسهم البرتقالية). (ب) يساعد تنفيذ 2 × 2 binning على تحسين شدة الإشارة لأحداث النقل RAB3 الخافتة. تم الحصول على الصور في وقت التعرض 300 مللي ثانية ومع (C) زيادة تدريجية في وقت التعرض (من 100 مللي ثانية في أقصى اليسار إلى 500 مللي ثانية في أقصى اليمين) يساعد على تحسين شدة الإشارة لأحداث النقل الفردية. تم الحصول على الصور في 2 × 2 binning وباستخدام خطوة التبييض الضوئي الأولية. تعرض جميع أجهزة الكيموغراف مدة إجمالية تبلغ 3 دقائق ويتم رسمها بنفس المقياس بحيث يكون للكيموغراف ذات النقاط الزمنية الأقل للاكتساب بسبب الفاصل الزمني الأطول بين نقاط التصوير المتتالية طول إجمالي أقصر للكيموغراف. (د) التحديد الكمي لشدة الإشارة لكل حدث نقل بعد طرح مضان الخلفية من أجهزة القياس البياني في (A-C). لاحظ أنه تم الحصول على binning وخطوة تبييض الصور في وقت التعرض 300 مللي ثانية. مقارنة إحصائية باستخدام n أحداث ل 100 مللي ثانية (nأحداث = 27 في n = 2) ، 200 مللي ثانية (nأحداث = 30 في n = 2) ، 300 مللي ثانية (nأحداث = 88 في n = 6) ، 500 مللي ثانية (nأحداث = 12 في n = 1) ، 300 مللي ثانية بدون (w.o.) binning (nأحداث = 31 في n = 3) ، 300 مللي ثانية مع (w) binning (nأحداث = 88 فيn = 6) و 300 مللي ثانية ، 2 × 2 binning مع التبييض (nالأحداث = 88 في n = 6) وبدون تبييض. تمثل كل نقطة بيانات شدة إشارة حدث نقل RAB-3 فردي بعد طرح الخلفية (سيتوبلازم المحور) في نقطة زمنية واحدة على طول تتبعها الذي تم اختياره عشوائيا. تمت مقارنة وقت التعرض باستخدام اختبار Kruskal-Wallis متبوعا بمقارنة Dunn المتعددة ، وتمت مقارنة binning وتبييض الصور باستخدام اختبار Mann-Whitney الزوجي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: إجراء خطوة بخطوة لإنشاء مخطط كيموغراف وقياس أحداث النقل الفردية. (أ) بعد تحميل تسجيل الفيديو في فيجي، تستخدم أداة الخط المجزأ لتتبع خط على طول القطعة المحورية التي سيتم تحليلها. (ب) يتم إنشاء kymograph (اللوحة اليمنى) باستخدام المكون الإضافي Kymoreslicewide مع المعلمات الموضحة في اللوحة اليسرى. (ج) يتم تتبع أحداث النقل الفردية باستخدام أداة الخط الخطي وتخزينها إلى مدير عائد الاستثمار. تعرض اللوحة اليمنى إعدادات القياس المستخدمة لإنشاء جدول النتائج. (د) تستخدم النتائج في الجدول لحساب معلمة النقل. تشير المربعات إلى المعلمات المهمة الموضحة في قسم الأساليب في البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حدود الطريقة والطرق البديلة
في هذا البروتوكول ، قمنا بتحسين معلمات الاستحواذ لتصور النقل المحوري ل RAB-3 الموسوم داخليا ، والذي يرتبط بسلائف الحويصلة المشبكية. لتصور RAB-3 ، استخدمنا FLIP-on :: GFP ::RAB-3 الذي تم نشره مؤخرا سلالة 6 وعبرنا عن Flippase recombinase تحت مروج خاص بالخلية (glr-4p) 25. تسمح لنا هذه الإستراتيجية بتسمية RAB-3 بفلوروفور GFP واحد. من السهل نسبيا تصور RAB-3 لأنه يتم التعبير عنه بشكل كبير وإثرائه بقوة على سلائف الحويصلة المشبكية بحيث يكون لأحداث النقل الفردية شدة إشارة ساطعة على إشارة منخفضة مستمدة من الخلفية السيتوبلازمية. قد تتطلب البروتينات المحورية الأخرى استراتيجيات تحسين إضافية خارج إعدادات الفحص المجهري لتمكين تصور أحداث النقل. خاصة بالنسبة للبروتينات منخفضة التعبير ، يوفر نظام الانقسام GFP بديلا رائعا. في هذا النظام ، يتم إدخال GFP11 في الموضع الداخلي للبروتين محل الاهتمام ويتم التعبير عن GFP1-10 من مروج خاص بالخلية. ميزة كبيرة لهذا النظام هي صغر حجم قالب إصلاح الحمض النووي (حوالي 70 نيوكليوتيدات) الذي يحتاج إلى إدخاله جينوميا ، مما يجعل إعادة التركيب المتماثل أكثر كفاءة مقارنة بإدخال ORF لعلامة الفلورسنت بأكملها26,27. نظرا لصغر حجمه ، يمكن إدخال شظايا متعددة من GFP11 في البروتين الداخلي ، مما يزيد من عدد فلوروفورات GFP المعاد تشكيلها لكل بروتين وبالتالي يعزز الإشارة الفلورية للبروتين الداخلي وبالتالي لحزمة النقل28.

بالإضافة إلى وضع علامات على البروتين بنهج تقسيم GFP أو GFP ، يمكن استخدام الفلوروفورات المشفرة وراثيا الأخرى التي لها مزايا وعيوب فريدة فيما يتعلق بخصائصها الكيميائية الضوئية ، والتي تمت مقارنتها مؤخرا29. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الفلوروفورات الكيميائية ذات الخصائص الأكثر قابلية للضوء عن طريق وضع علامات داخلية على البروتين محل الاهتمام باستخدام علامة HALO أو SNAP30.

خاصة بالنسبة للبروتينات السيتوبلازمية الوفيرة في جميع أنحاء المحور العصبي بأكمله ، قد يكون من الضروري اتباع نهج الوسم الشرطي. لقد تصورنا مؤخرا مثل هذه الشحنة ، الطيفية الداخلية ، بواسطة المجهر الفلوري باستخدام الملصقات التي يتم التحكم فيها مؤقتا لتصور بروتينات الطيف المركبة الجديدة فقط. لوضع العلامات الشرطية بدقة خلية عصبية واحدة ، قمنا بدمج التعبير المدفوع بالصدمة الحرارية لإعادة التركيب مع نظام GFP المنقسم31.

إذا كان هدف البحث يهدف إلى فهم انتقال العضيات، فإن التعبير عن مجال البروتين المرتبط بالعضية يمكن أن يوفر بديلا للتعبير الخارجي عن البروتين كامل الطول.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يعد التحضير الدقيق لتحسين تصور البروتين بناء على مستويات التعبير المتوقعة وكذلك لاختيار استراتيجية وضع العلامات المثلى أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص للتصور الناجح للبروتينات الموسومة داخلية. يمكن تقدير مستويات التعبير لمعظم البروتين في العديد من الخلايا العصبية بناء على مجموعة بيانات النسخ من Cengen13. يمكن تحسين كثافة الإشارة المنخفضة المتوقعة لأحداث النقل للبروتينات منخفضة التعبير أو السيتوبلازمية عن طريق ربط نسخ متعددة من الفلوروفور. لاحظ ، مع ذلك ، أنه مع أي تجربة وضع العلامات ، يجب توخي الحذر لعدم تعطيل وظيفة البروتين الموسوم. في حالة وجود نمط ظاهري معروف للمتحولة المقابلة ، من المهم التحقق من أن وضع العلامات لا يولد هذا النمط الظاهري. في الحالات التي لا يوجد فيها نمط ظاهري معروف ، هناك حاجة إلى نهج بديلة تختلف على أساس كل حالة على حدة.

خطوة حاسمة في تصوير أحداث النقل المحوري هي الحالة الصحية للحيوان. يجب معاملة بلطف قدر الإمكان لإعداد الصورة وكذلك أثناء التصوير (على سبيل المثال ، استخدام عود شعر بدلا من سلك معدني لنقل المشلولة ، وتقليل وقت الحضانة في عامل الشلل ، وتقليل وقت التصوير لتجنب السمية الضوئية).

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
بينما نعتزم تحسين تصور النقل المحوري للبروتينات الداخلية ، فإن استراتيجيات التحسين لمعلمات الاكتساب تنطبق أيضا على البروتينات المعبر عنها خارج الرحم. خاصة إذا كانت مستويات التعبير الداخلي منخفضة جدا لتصور أحداث النقل ، فإن التعبير خارج الرحم للبروتين يمكن أن يوفر بديلا.

في حالة عدم إمكانية تسجيل أحداث النقل على الرغم من شدة الإشارة القوية للبروتين المسمى داخليا ، فقد تكون في حالة غير صحية. يمكن حل ذلك عن طريق إعداد للفحص المجهري في ظل إجراءات تحضير أكثر رقة (على سبيل المثال ، تقليل وقت الحضانة في عامل الشلل). بدلا من ذلك ، قد تكون أحداث النقل نادرة ، وقد لا يكون تسجيل الفيديو لمدة 3 دقائق كافيا لالتقاط الأحداث. يمكن تحسين التقاط أحداث النقل النادرة من خلال تحسين مدة تسجيل الفيديو ، أو عن طريق زيادة عدد المصورة أو عن طريق تصوير في مرحلة نمو مختلفة قد تكون فيها أحداث النقل أكثر تكرارا.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح منافسة أو مالية يمكن أن تكون قد أثرت على العمل المذكور في هذه الورقة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا مختبرات يوغيف وهامارلوند على المساعدة الفنية والتعليقات والمناقشات. نود أن نشكر بشكل خاص غريس سويم على التوجيه في تصوير الخلايا الحية وجريس وبريان سويم على إنشاء تحليل كيموغراف يدوي في المختبر في البداية. يتم دعم OG من خلال منحة Walter-Benjamin الدراسية الممولة من Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) -Project # 465611822. يتم تمويل SY من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R35-GM131744.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
(22 مم × 22 مم ، No1) ؛ غطاء الختم الذهبي الزجاجThomas Scientific6672A14
LevamisoleChemCruzsc-205730
المجهر: مجهر نيكون Ti2 المقلوب ، Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead ، كاميرا Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS ، نيكون CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA هدف الغمر بالزيت ، ماسح ضوئي للتحفيز الضوئي من نيكون عند 488 نانومتر مع مرشح انبعاث ET525 / 36مجهر
  NIS-elementsNikonSoftware ل Nikon Ti2 & nbsp ؛
شرائح الفحص المجهري العادي المنظفةمسبقا Thermo Scientific420-004T
سلالة الديدان الخيطيةمصدرالمعرف
rab-3 (ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 سيتم إيداعها في CGC (https://cgc.umn.edu/)
زلات غطاء متحد البؤر لقرص الغزل من نيكون AR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).">Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).">Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).">Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).
  4. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).">Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).">Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).
  6. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).">Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).">Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).
  8. https://cgc.umn.edu/ (2023).">Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023).
  9. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).">Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).">He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).">Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).">Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).">Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).">Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).">Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).">Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).">Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).">Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).">Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).">Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).">Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).">White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).">White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).
  25. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).">Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).">Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).">Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).">Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).">Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).">Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).
  31. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).">Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal TransportFluorescence MicroscopyCaenorhabditis ElegansEndogenous CargoSynaptic Vesicle PrecursorsGFP RAB 3Kymograph AnalysisTime Lapse ImagingCRISPR Cas9 LabelingAxon Imaging

Related Articles