عزل خلايا مولر الدبقية الدبقية لشبكية الفأر الأولية

خلايا مولر (MCs) هي الخلايا الدبقية الرئيسية والأكثر وفرة الموجودة في أنسجة الشبكية. هم اللاعبون الرئيسيون في توفير السلامة الهيكلية ووظائف التمثيل الغذائي داخل شبكية العين¹. ينتشر الهيكل الاستراتيجي ل MCs عبر سمك الشبكية بالكامل ، مما يوفر الدعم لشبكية العين. بالإضافة إلى خصائصها الشبيهة بالسقالات ، فإن لها وظائف التمثيل الغذائي للخلايا العصبية في شبكية العين ، وتزودها بركائز الطاقة ، بما في ذلك الجلوكوز واللاكتات. هذه الوظائف حاسمة من أجل الحفاظ على وظيفة عصبية صحية. تم الإبلاغ عن ضعف MCs للمساهمة في أمراض الشبكية المختلفة ، بما في ذلك الضمور البقعي المرتبط بالعمر ، واعتلال الشبكية السكري ، والزرق^2،3. يمكن أن تكون MCs مصادر خلوية داخلية للعلاج التجديدي في شبكية العين¹. كما أنها تشكل جزءا كبيرا من شبكية العين ، وتشير الأدلة القوية إلى أنه في العديد من الأنواع ، يمكن تحفيز هذه الخلايا لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة². فهي تتعاون بشكل مفيد مع الخلايا العصبية ، وتفتح أقدام نهاية خلايا مولر المتفرعة مخروطيا الأوعية الدموية بكثافة وتربط المكونات العصبية لشبكية العين. من أجل الحفاظ على تطور الخلايا العصبية واللدونة العصبية ، تعمل خلايا مولر كركيزة ناعمة للخلايا العصبية ، وتحميها من الصدمات الميكانيكية³. بالإضافة إلى ذلك ، في ظل الظروف المرضية ، قد تتمايز خلايا مولر إلى أسلاف عصبية أو خلايا جذعية تكرر أو تجدد المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية المفقودة^2،3،4. تحتفظ خلايا مولر بخصائص الخلايا الجذعية الشبكية ، بما في ذلك مستويات مختلفة من إمكانات التجديد الذاتي والتمايز ^5,6. تحتوي خلية مولر الدبقية على سلالة شبكية كبيرة تنتج عوامل التغذية العصبية ، وتمتص وتعيد تدوير الناقلات العصبية ، وتخزن الأيونات مكانيا ، وتحافظ على حاجز الدم والشبكية من أجل الحفاظ على شبكية العين في التوازن^7،8،9. هذا يسلط الضوء على إمكانات خلايا مولر كأداة واعدة في العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض المتعلقة بتنكس الشبكية. خلايا مولر هي الخلايا الدبقية الأولية الموزعة في جميع أنحاء شبكية العين ، وتتصل بكل من الخلايا العصبية والأوعية الدموية. إنها تلعب دورا وقائيا حاسما ، حيث توفر الدعم الهيكلي والأيضي الأساسي للحفاظ على صلاحية واستقرار خلايا الشبكية. لسوء الحظ ، تم العثور على عدد قليل جدا من البروتوكولات في الأدبيات الخاصة بعزل خلايا مولر الأولية من شبكية العين^10,11.

نقدم نهجا محسنا لعزل وزراعة خلايا مولر الأولية للفأر بشكل موثوق. تم استخدام هذا البروتوكول في مجموعتنا لعزل خلايا مولر من الفئران من النوع البري C57BL / 6 والفئران المعدلة وراثيا^12,13. يتم استخدام الفئران التي تتراوح أعمارها بين 5 و 11 يوما ، دون تفضيل الجنس ، لهذا البروتوكول. تم تمرير الخلايا حتى 4 مرات. ومع ذلك ، في P4 يتوقفون عن الالتزام بالقارورة ، ويصبح من الصعب تنمية ثقافة صحية. غالبا ما تكون المزرعة ملوثة بالخلايا الظهارية المصطبغة في شبكية العين (RPE) ، لذلك يجب تمرير الخلايا مرة واحدة على الأقل قبل إجراء أي تجارب إضافية على خط الخلية. يسمح المرور بمزيد من العزل عن الملوثات. لذلك ، يوفر البروتوكول المقدم طريقة سريعة وفعالة لعزل خلايا مولر الفأرية ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك كمنصة موثوقة للبحث عن الأهداف العلاجية وتقييم العلاجات المحتملة لأمراض الشبكية¹⁴.

تتوافق جميع التجارب مع مع بيان ARVO لاستخدام في أبحاث العيون والرؤية وتم إجراؤها وفقا لبروتوكول المعتمد من قبل معهد رعاية ولجنة استخدامه (IACUC) وسياسات جامعة أوكلاند (رقم البروتوكول 2022-1160)

1. وسائل الإعلام وإعداد الحلول

1. تحضير محلول عين خلية مولر عن طريق استكمال وسط النسر المعدل Dulbecco (DMEM ، التفاصيل في جدول المواد) مع البنسلين / الستربتومايسين بتخفيف 1: 1000. على سبيل المثال ، بالنسبة إلى 10 مل من DMEM ، أضف 10 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين.
   ملاحظة: هذه وسائط بسيطة خالية من المصل تم إعدادها. أيضا ، قم بتسخين الوسائط الكاملة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل استخدامه لعمل زراعة الخلايا.
2. تحضير وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة عن طريق استكمال DMEM بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS ، معطل بالحرارة) ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. على سبيل المثال (500 مل من وسائط DMEM + 50 مل من FBS + 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين).
3. تحضير محلول Trypsin-EDTA بنسبة 0.05٪ مع كولاجيناز IV بتركيز 200 وحدة / مل (يستخدم Trypsin-EDTA لإذابة الكمية المحسوبة من مسحوق Collagenase IV للوصول إلى التركيز المطلوب).

2. الاستئصال

1. القتل الرحيم للفأر أخلاقيا باستخدام استنشاق CO₂ باتباع إرشادات IACUC.
   1. باختصار ، ضع () في غرفة CO₂ لإدخال 100٪ CO₂ بمعدل ملء 30-70٪ من حجم الغرفة / دقيقة مع CO₂ لتحقيق هدف فقدان الوعي السريع في غضون 2-3 دقائق مع الحد الأدنى من الضيق للفئران.
   2. نظرا لأن الفئران في سن مبكرة (~ 10 أيام) ، فقم بإجراء خلع عنق الرحم كطريقة ثانوية لضمان القتل الرحيم المناسب.
2. بعد تعقيم منطقة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ضع الماوس على وسادة سفلية معقمة.
3. اقتطع العينين عن طريق وضع أذرع الملقط في الجزء الخلفي من العين ، والسحب برفق من المنطقة المدارية ، واستئصال العينين عن طريق الضغط باستخدام ملاقط نمط 5/45 على المنطقة المدارية لإحداث البروبتوس.
   ملاحظة: تعقيم أدوات التشريح ب 70٪ إيثانول متبوعا بمحلول ملحي عازل للفوسفات قبل التشريح.
4. تأكد من أن العصب البصري لا يزال متصلا بالعين عن طريق استئصال العين ببطء. تأكد من سحب العصب البصري (المعروف بصريا على أنه حبل أبيض) خلف العين.
   ملاحظة: لا يلزم إجراء هذه الخطوة تحت المجهر ، ويمكن إجراؤها على مقعد معقم.

3. علاج العيون المنزوعة النواة

1. قم بتغطية أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل بورق الألمنيوم واملأ الأنبوب ب 10 مل من محلول عين خلية مولر.
2. ضع العيون المقطعة في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على محلول عين خلية مولر واسمح لهما بالجلوس طوال الليل ، أو حوالي 18 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد 18 ساعة ، صب محلول العين وشطف العينين لفترة وجيزة مع 2-3 مل من المياه المالحة الدافئة (37 درجة مئوية) الفوسفاتية (PBS).
4. صب برنامج تلفزيوني وحرك العينين إلى طبق بتري 100 مم يحتوي على 10 مل من محلول التربسين. (أعدت في الخطوة 1-3).
   ملاحظة: يستخدم التربسين على العين المنزوعة النواة بالكامل ، ويعمل كعامل انفصامي لتسهيل فصل الخلايا عن طبقات الشبكية أثناء التسلخ. تحتوي شبكية العين المقطعة على العديد من الخلايا ، بما في ذلك خلايا RPE ، وهي لزجة ومن المرجح أن تلوث مزرعة خلايا مولر¹⁴. أظهر الفحص المجهري بوضوح أنه بعد 5 أيام من العزلة (أثناء تغيير الوسائط الأول) ، انفصلت خلايا RPE عن اللوحة وماتت¹³. الوسائط المستخدمة لعزل RPE هي DMEM / F-12 ، بتركيبة مختلفة عن DMEM (المستخدمة في عزل خلايا مولر) ، والتي تحتوي على بيروفات الصوديوم وانخفاض الجلوكوز.
5. ضع الطبق في حاضنة واحتضانه لمدة 1.5 إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
6. بعد الحضانة ، انقل العينين إلى طبق بتري 60 مم يحتوي على ما يقرب من 5 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.

4. تشريح

ملاحظة: يجب تنفيذ هذا الإجراء في البيئة المعقمة لغطاء الثقافة. وبالتالي ، من الضروري تعقيم أسطح غطاء المحرك تماما بنسبة 70٪ كحول ، إلى جانب جميع الأدوات ومجهر التشريح. تجدر الإشارة إلى أنه تم تسجيل الفيديو خارج غطاء المحرك للحصول على رؤية أفضل وأغراض توضيحية أوضح.

1. ضع قطعة صغيرة من الأنسجة المعقمة من فئة المختبر في الطبق للمساعدة في استقرار العينين أثناء التسلخ. ضع العينين تحت مجهر تشريح لبدء التشريح.
   ملاحظة: يسهل استخدام الأنسجة المعملية مناورة العينين في طبق مملوء بالسوائل (وسائط كاملة) ، مما يضمن تشريحا دقيقا.
2. استخدم مقص Vannas وملاقط على غرار M5S لإزالة النسيج الضام وعضلات العين والعصب البصري.
   1. أمسك العين باستخدام ملاقط على غرار M5S وقم بعمل شق في قسم ora serrata بمقص Vannas أو إبرة حقنة.
      ملاحظة: يوجد خط دائري أزرق فاتح بين الجزء الأمامي والخلفي من العين يسمى ora serrata ، والذي يمكن استخدامه كمعلم للتوجيه الدقيق أثناء التسلخ.
   2. أمسك الشق باستخدام ملاقط على غرار M5S واسحب القرنية أو تمزقها من الجزء الخلفي من العين. اسحب زيادات صغيرة لضمان بقاء سلامة الشبكية سليمة.
      ملاحظة: هذه الخطوات هي لإزالة الجزء الأمامي من العين (القرنية والقزحية والعدسة) من الجزء الخلفي من كأس العين (شبكية العين العصبية والمصطبغة).
   3. للحفاظ على سلامة طبقات الشبكية ، اسحب برفق وإزالة ظهارة الشبكية المصطبغة من الشبكية العصبية. يجب أن تكون الشبكية العصبية خالية من أي بقع سوداء لضمان نقاء العزل قدر الإمكان ، حيث أن طبقة RPE عادة ما تكون لزجة ومتصلة بالشبكية العصبية.
   4. قطع شبكية العين العصبية تشريح إلى قطع صغيرة قبل جمعها في لوحة لضمان انتشار متجانس للخلايا على اللوحة.
3. صفيحة شبكية العين العصبية في دورق T25 يحتوي على 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة.
4. أخيرا ، ضع القارورة في حاضنة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.

5. زراعة خلايا مولر الدبقية الأولية

1. لا تحرك القارورة لمدة 3-5 أيام لتعزيز نمو الخلايا.
2. قم بتغيير الوسائط بعد اليوم الخامس وكل يومين بعد ذلك حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 90٪.

6. تمرير خلايا مولر الدبقية الأولية

1. نضح وسائط زراعة خلايا مولر ، متبوعا ب 2 مل من الغسيل في برنامج تلفزيوني ، واستنشاق PBS. أضف 2 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، أو ما يكفي لتغطية اللوحة.
2. احتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. تأكد من فصل الخلايا عن اللوحة تحت المجهر. بعد ذلك ، اجمع معلق الخلية وأضف 4 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة (المحضرة في الخطوة 1.2) إلى أنبوب التجميع.
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 300 × غرام. بعد شفط المادة الطافية، أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط نمو خلايا مولر الأولية الكاملة. نظرا لأن عدد الخلايا يمكن أن يختلف وفقا لعدد العيون التي تم تشريحها ، فمن الأفضل حساب الخلايا قبل البذر والحضانة. كثافة البذر الموصى بها هي 3.0 × 10⁶ خلايا في قارورة T75.
   ملاحظة: يمكن تمرير الخلايا حتى 4-5 مرات. ومع ذلك ، تم العثور على نتائج التجربة الأكثر اتساقا بعد 1-2 مقاطع.

7. التألق المناعي

ملاحظة: استخدم بروتوكول التألق المناعي لتلطيخ خصوصية خلية مولر والتحقق من صحتها. فيما يلي لمحة موجزة عن بروتوكول الفلورسنت المناعي. يتم تنفيذ هذه الخطوة بعد المقطع الأول¹².

1. قم بزرع الخلايا في شريحة غرفة زراعة الخلايا (30000 خلية لكل بئر لشريحة غرفة ذات 8 آبار).
2. استزراع الخلايا المعزولة لمدة 24-48 ساعة في وسط زراعة خلايا مولر الكامل (محضر في الخطوة 1.2) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
3. قم بنضح الوسائط وغسل شريحة الغرفة ب 250-300 ميكرولتر من 1x PBS على كل بئر عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80-90٪.
4. ثبت الشريحة لمدة 10 إلى 15 دقيقة في 250-300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد على كل بئر ، متبوعا بالغسيل باستخدام PBS / TX-100 (5 دقائق لكل منهما / 3x).
5. أضف حاجزا حاجزا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
6. نضح محلول الحجب ، ثم أضف الأجسام المضادة الأولية الخاصة بخلايا مولر لتأكيد نقاء الخلايا المعزولة باستخدام إنزيم الجلوتامين سينثيتاز وفيمنتين^5،12. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية (باستخدام تركيز الأجسام المضادة من 1: 100-1: 200 في حجب المخزن المؤقت في حجم 150-200 ميكرولتر / شريحة). اغسل الشريحة بغسلة PBS / TX-100 (5 و 10 دقائق لكل منهما).
   ملاحظة: تم اختيار هذه الأجسام المضادة لأنها علامات مميزة لتحديد خلايا مولر وضمان نجاح ونقاء مزرعة خلايا مولر.
7. أضف الجسم المضاد الثانوي (بتركيز جسم مضاد يتراوح من 1: 1000 في المخزن المؤقت المانع في 150-200 ميكرولتر / شريحة) واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل باستخدام PBS / Triton X-100 ، ثلاث مرات (5-10 دقائق لكل منهما).
8. ضع قطرة من وسيط تركيب DAPI لتسمية النوى قبل تغطية الشريحة بغطاء سليب. تجنب فقاعات الهواء عند وضع غطاء الغطاء.
9. استخدم مجهر الفلورسنت للتحقق من الشريحة والتقاط الصور (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: توجد الخلايا باستخدام DAPI عند ex / em 359/461 عند تكبير 10x لتحديد موقع الخلايا ؛ يمكن للتكبير العالي التقاط الخلايا. تعتمد الأطوال الموجية الأخرى على اللون المختار. اللون الأخضر (GFP) - ex / em 488/510. اللون الأحمر (Cy3) - ex / em 555/569.

التحقق من خصوصية ونقاء ووظيفة الحاجز لخلايا مولر المعزولة
لتأكيد الصلاحية والتشكل والصفات المميزة لخلايا مولر المعزولة ، تم فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي. تم تسجيل صور P0 و P1 (الشكل 1A). للتحقق من تلوث خلايا مولر المعزولة بخلايا RPE والتأكد من نقائها ، تم إجراء تلطيخ التألق المناعي (IF) باستخدام أجسام مضادة خاصة بعلامة خلايا RPE ، RPE65. تم استخدام الخلايا المصطبغة في شبكية العين البشرية (ARPE -19) كعنصر تحكم إيجابي. تظهر خلايا RPE الملطخة RPE65 (الأحمر والأزرق للتلطيخ النووي) في الشكل 1B (اللوحة السفلية). لم تلطخ الأجسام المضادة المحددة RPE65 خلايا مولر المعزولة (الشكل 1B ، اللوحة العلوية). حقيقة أن RPE65 لطخت خلايا ARPE-19 (حمراء) ولم تلطخ الخلايا المعزولة ، تشير إلى أن الخلايا المعزولة ليست خلايا RPE. إن وجود البيروفات وانخفاض الجلوكوز في الوسائط يخلق ظروفا غير مواتية لنمو خلايا RPE. وبالتالي ، حتى في حالة تلوث خلايا RPE ، فإنها ستنفصل في النهاية عن القارورة.

علاوة على ذلك ، لتأكيد هوية الخلايا المعزولة ، تم استخدام تلطيخ خلايا مولر المناعي لخلايا مولر علامات محددة لتأكيد العزل الناجح لخلايا مولر. تم استخدام بروتين خيوط الهيكل الخلوي الوسيط المسمىvimentin 12,13. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام سينثيتاز الجلوتامين (GS) ، الذي يحفز تفاعل تكثيف الغلوتامات والأمونيا لتشكيل الجلوتامين ، كوظيفة رئيسية لخلايا مولر الدبقية في شبكية العين ،5.

بشكل جماعي ، الخلايا المعزولة ملطخة سلبية ل RPE65 (أحمر ، الشكل 1 ب) ، موجبة للفيمنتين (أخضر ، الشكل 1 ج) و GS (أخضر ، الشكل 1 د). إذا كان التلوين يؤكد العزلة الناجحة (النقاء والنوعية) لخلايا مولر المعزولة. الشكل 1E ، هو عنصر تحكم سلبي للفيمنتين (اللوحة العلوية) و GS (اللوحة السفلية) ، مما يؤكد خصوصية الأجسام المضادة.

الشكل 1: التحقق من عزل خلية مولر (النقاء والنوعية). (أ) صورة مجهرية ضوئية للمقاطع: المقطع صفر (P0) و (P1) مورفولوجيا. (ب) التلوين المناعي RPE65 جنبا إلى جنب مع التلوين النووي DAPI. (ج) تلطيخ فيمنتين المناعي مع تلطيخ DAPI النووي عند التكبير العالي. (د) تلطيخ منااعي GS عند التكبير العالي نفسه. (ه) ضوابط سلبية لتأكيد خصوصية تلطيخ الأجسام المضادة vimentin و GS. شريط المقياس = 300 ميكرومتر ، 300 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 20 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عن صلة بمحتوى هذه المقالة.