يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) باستخدام ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) كمسبار صبغة مضان باستخدام نهج فحص عالي الإنتاجية. يصف البروتوكول طرق التقييم الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) في خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية الثلاثة المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم الفحص عالي الإنتاجية لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) دورا رئيسيا في تنظيم التمثيل الغذائي الخلوي في العمليات الفسيولوجية والمرضية. يلعب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الفسيولوجية دورا مركزيا في التعديل المكاني والزماني للوظائف الخلوية الطبيعية مثل الانتشار والإشارات وموت الخلايا المبرمج والشيخوخة. في المقابل ، فإن الإفراط في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المزمن مسؤول عن مجموعة واسعة من الأمراض ، مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكري وغيرها. وبالتالي فإن قياس مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية بطريقة دقيقة وقابلة للتكرار أمر ضروري لفهم الوظائف الخلوية الطبيعية. تعد الطرق القائمة على التصوير الفلوري لتوصيف أنواع أنواع أنواع ROS داخل الخلايا نهجا شائعا. تستخدم العديد من بروتوكولات ROS التصويرية في الأدبيات صبغة 2'-7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). ومع ذلك ، فإن هذه الصبغة تعاني من قيود كبيرة في استخدامها وتفسيرها. يوضح البروتوكول الحالي استخدام مسبار الفلورسنت ثنائي هيدروإيثيديوم (DHE) كطريقة بديلة لتحديد إجمالي إنتاج ROS في بيئة عالية الإنتاجية. تم استخدام منصة التصوير عالية الإنتاجية ، CX7 Cellomics ، لقياس وقياس إنتاج ROS. أجريت هذه الدراسة في ثلاثة خطوط خلايا سرطانية كبدية - HepG2 و JHH4 و HUH-7. يوفر هذا البروتوكول وصفا متعمقا للإجراءات المختلفة التي ينطوي عليها تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا ، بما في ذلك - تحضير محلول DHE ، وحضانة الخلايا بمحلول DHE ، وقياس شدة DHE اللازمة لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يوضح هذا البروتوكول أن صبغة الفلورسنت DHE هي خيار قوي وقابل للتكرار لتوصيف إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بطريقة عالية الإنتاجية. من المرجح أن تكون الأساليب عالية الإنتاجية لقياس إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية مفيدة في مجموعة متنوعة من الدراسات ، مثل علم السموم وفحص الأدوية وبيولوجيا السرطان.
المقدمة
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي مجموعة من الجذور الكيميائية التي تحدث بشكل طبيعي ، شديدة التفاعل ، وغير مستقرة زمنيا والتي تشكلت كجزء من التمثيل الغذائي الخلوي الطبيعي في الخلايا. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية دورا رئيسيا وأساسيا في تعديل العمليات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الطبيعية التي تحدث في الخلايا 1,2. المصدر الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا هو من مسار سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) كجزء من دورة الطاقة الحيوية العادية. تشمل المصادر الإضافية المهمة لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التفاعلات الأنزيمية مثل أوكسيديز NADPH الخلوي في الخلايا. يحدث استقلاب جزيئات الطعام (مثل الجلو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ثقافة الخلية
- قم بزرع خلايا الاختبار (خلايا سرطان الخلايا الكبدية HepG2 و HUH7 و JHH4) في صفيحة 96 بئرا بكثافة بذر تبلغ 10000 خلية / بئر في حجم بذر نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر.
- قبل زراعة خلايا HepG2 ، قم بتغطية 96 بئرا بالكولاجين من النوع الرابع (50 ميكروغرام / مل) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب تصلب الكولاجين ، ضع محلول المخزون في الثلج وبعد ذلك ، ابدأ عملية التخفيف إلى التركيز المطلوب.
- بعد فترة حضانة 2 ساعة ، استنشق الكولاجين الزائد واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
- قم بزراعة الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco طوال الليل عند 37 درجة مئويةوتركيز CO 2 بن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عبارة عن صبغة مضان فائقة الاستجابة للأكسيد توفر معلومات محددة فيما يتعلق بحالات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. دتنبعث صبغة ال HEE جوهريا من مضان أزرق في السيتوبلازم. ومع ذلك ، عند التفاعل مع جذور الأكسيد الفائق ، يتم تحويله إلى 2-هيدروكسي إيثيديوم ، والذي ينبعث منه مضان في الأطوال الموجية الحمراء (>550 نانومتر) (الشكل 1). دتنتقل صبغة ال EHE بسهولة إلى الخلايا والنواة. يمكن تصور التألق المنبعث باستخدام إعداد مجهر مضان متوفر بشكل شائع في العديد من المختبرات........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، تم إنشاء بروتوكول لتقييم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) التي يحركها الأكسيد الفائق باستخدام صبغة مضان ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) على نظام فحص عالي المحتوى. تستخدم غالبية البروتوكولات الحالية المتاحة في الأدبيات DCFH-DA كمسبار تصوير مضان لتحديد أنواع ROS. ومع ذلك ، فقد أظهرت دراسات متعددة أن DCFH-DA ليس مسبارا مثاليا لقياس أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا. تشمل الأسباب المختلفة المفترضة لعدم ملاءمة DCFH-DA كمسبار - (i) لا يظهر DCFH-DA تفاعلا مباشرا مع H2O2 ، مما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم RK و RRG بمنحة من مركز UNM للمعادن في علم الأحياء والطب (CMBM) من خلال منحة NIH NIGMS P20 GM130422. تم دعم RRG بجائزة تجريبية من منحة NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. تم توفير الدعم الأساسي للتصوير لأداة CX7 Cellomics من خلال نوى مركز AIM بتمويل من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121176. نود أن نشكر الدكتورة شارينا ديساي والدكتور لي تشن على مساعدتهما القيمة في القضايا الفنية المتعلقة باستخدام منصة التصوير CX7 Cellomics.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
أنابيب
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الطرد المركزي 1.5 مل | VWR | 20170-038 | |
| 96- لوحة البئر | كورنينج كوستار | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| كولاجين | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (ثنائي هيدرو إيثيديوم) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | سيجما | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | الإصدار 6.0 | |
| HepG2 خط خلية | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| خط خلية HUH7 | ATCC | ||
| بيروكسيد الهيدروجين ؛ | سيجما | 88597 | |
| خط خلية JHH4 | ATCC | ||
| Menadione | سيجما | M5625 |
المراجع
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642(2021).
- Magnani, F., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
