مقالة منهجية

التحقق الأولي من إحداثيات الحقن التجسيمي عن طريق التقسيم بالتبريد

DOI:

10.3791/66262

⸱

يوليو 19, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول استراتيجية عملية للتعجيل بخطوة التحقق من إحداثيات الحقن التجسيمي قبل إجراء تتبع الفيروس باستخدام الأصباغ والأقسام المجمدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل الحقن التجسيمي لمنطقة معينة من الدماغ تقنية تجريبية أساسية في علم الأعصاب الأساسي. عادة ما يبني الباحثون اختيارهم لمعلمات الحقن التجسيمي على أطالس دماغ الفئران أو المواد المنشورة التي تستخدم مجموعات / أعمار مختلفة من الفئران ومعدات تجسيمية مختلفة ، مما يستلزم مزيدا من التحقق من صحة معلمات الإحداثيات المجسمة. تعتمد فعالية تصوير الكالسيوم والتلاعب الكيميائي الوراثي والبصري الوراثي على التعبير الدقيق لجينات المراسل داخل المنطقة محل الاهتمام ، وغالبا ما تتطلب عدة أسابيع من الجهد. وبالتالي ، فهي مهمة تستغرق وقتا طويلا إذا لم يتم التحقق من إحداثيات منطقة الدماغ المستهدفة مسبقا. باستخدام صبغة مناسبة بدلا من الفيروس وتنفيذ التقسيم بالتبريد ، يمكن للباحثين مراقبة موقع الحقن مباشرة بعد إعطاء الصبغة. هذا يسهل التعديلات في الوقت المناسب لتنسيق المعلمات في الحالات التي توجد فيها تناقضات بين موقع الحقن الفعلي والموضع النظري. هذه التعديلات تعزز بشكل كبير دقة التعبير الفيروسي داخل المنطقة المستهدفة في التجارب اللاحقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب جميع أدوات التعديل العصبي الحديثة تقريبا ، بما في ذلك تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي ، والأدوات البصرية الوراثية ، والأدوات الكيميائية الجينية ، استخدام إحداثيات مجسمة لاستهداف منطقة الدماغ محل الاهتمام1،2،3 ، مما يشكل أساس التلاعب العصبي. يتم تعريف الإحداثيات المجسمة لمناطق دماغ الفأر فيما يتعلق ب bregma و lambda ، المعالم العظمية على الجمجمة ، والتي تشكل ما يسمى بنظام الإحداثيات التجسيمية المشتقة من الجمجمة. يمكن أن يكون البريغما أو لامدا بمثابة نقطة الصفر للإحداثيات ثلاثية الأبعاد. المحاور الثلاثة هي الأمامية الخلفية (AP) ، والمتوسطة الجانبية (ML) ، والظهرية البطنية (DV) ، والتي تمثل المحاور y و x و z على الشاشة الرقمية للأدوات المجسمة. بالنسبة لمناطق الدماغ المعروفة ، يمكن الحصول على معلمات الإحداثيات المجسمة لمنطقة معينة من أطالس دماغ الفأر4 (على سبيل المثال ، Paxinos ودماغ فأر فرانكلين في الإحداثيات المجسمة) و / أو الأدبيات المنشورة 5,6. ومع ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقق بسبب الاختلافات في معدات التجسيم وعمر / أعداد الفئران المستخدمة من قبل باحثين مختلفين.

الهيكل هو أساس الوظيفة. تشكل الدوائر العصبية الأساس للعديد من وظائف الدماغ ، مثل الأنشطة المعرفية والعاطفة والذاكرة والوظائف الحسية والحركية1. يعد وضع العلامات على البنية والتلاعب بنشاط الدوائر العصبية أمرا حيويا لفهم وظيفة دائرة عصبية معينة. على مدى العقود الماضية ، تطورت المتتبعات العصبية عبر أجيال عديدة. اعتمدت الأبحاث المبكرة أغلوتينين جنين القمح (WGA) و phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) كمتتبعات تقدمية ، والفلوروغولد (FG) ، الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTB) ، الكاربوسيانين كمتتبعات رجعية. ومع ذلك ، على عكس المتتبعات الفيروسية ، لا يمكن لهذه المقتفيات العصبية التقليدية دمج الجينات الخارجية في المضيف ، ولا تتمتع بانتقائية نوع الخلية. في الوقت الحاضر ، أصبحت الاستراتيجية الفيروسية اقتراحا مهما خلال أبحاث علم الأعصاب الأساسية. لأغراض بحثية مختلفة ، يمكن اختيار أدوات فيروسية مختلفة 7,8. هناك فيروسات غير عبر المشبكي ، وفيروسات عبر متعدد المشابك (رجعية وتقدمية) ، وفيروسات عبر أحادي المشبك (رجعي وأمامي). تحتوي كل فئة على عدة أنواع لها خصائص كل منها.

تستغرق عملية الإعطاء والتعبير الفيروسي وقتا طويلا وموارد كثيفة الاستخدام ، وغالبا ما تستغرق أسابيع أو حتى أكثر. من بين النواقل الفيروسية المختلفة ، تم تحديد الفيروس المرتبط بالغدي كوسيلة واعدة لتوصيل الجينات ، مما يوفر نافذة واسعة تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع بعد الحقن للإجراء التجريبي 7,8. مع تطور AAV ، يمكن إجراء التحليل بعد 2-3 أسابيع من إعطاء 9,10. تتطلب متتبعات الدوائر العصبية الأخرى ، مثل فيروس داء الكاذب (PRV) وفيروس داء (RV) ، فترة تتبع لا تقل عن 2-7 أيام11،12،13،14،15. وبالتالي ، فإن التحقق الأولي من موقع الحقن قبل مراقبة إشارات التألق يكون فعالا من حيث الوقت والتكلفة.

لتسهيل التحقق البسيط والسريع من الحقن التجسيمية ، في هذه الدراسة ، يتم إعطاء صبغة قبل النواقل الفيروسية ، ويمكن التشريح بالتبريد الباحثين من مراقبة موقع الحقن وتتبعه في غضون 30 دقيقة بعد الحقن.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على وفقا لإرشادات الإبلاغ عن البحوث الحيوانية في التجارب الحية (ARRIVE) ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية واستخدام في مستشفى رينجي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع في الدراسة الحالية. تم الحصول على تجاريا (انظر جدول المواد) وتم وضعها في أقفاص قياسية (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ، الطعام ، والماء حسب الرغبة).

1. اختيار مناطق الدماغ المستهدفة

ملاحظة: هذا إجراء معقم. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية. رش القفازات بالكحول قبل ملامسة الأدوات الجراحية. تجنب لمس طرف الأدوات أو المنطقة الجراحية بالقفازات. تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف قبل بدء الإجراء عن طريق التحقق من فقدان ردود الفعل الصحيحة وعدم الاستجابة للتحفيز الجلدي. قبل الحفر والحقن ، راقب عن كثب معدل التنفس (60-220 نفسا في الدقيقة ، بمتوسط 100-150 نفسا في الدقيقة) وسعة التنفس (يجب أن تكون متسقة وليست ضحلة أو عميقة بشكل مفرط). يجب ملاحظة أي تغييرات كبيرة في معدل التنفس أو السعة.

  1. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول (250 ملغم / كغم) باستخدام إبرة 29 غرام. حلق الشعر على الجمجمة بمجرد اختفاء رد الفعل الصحيح. قم بتأمين الماوس في الإطار التجسيمي (انظر جدول المواد) عن طريق تثبيت القواطع العلوية بمشبك أنف وتثبيت الرأس باستخدام قضيبين للأذن.
  2. تطبيق مرهم العيون لمنع جفاف العين. تطهير فروة الرأس عن طريق مسحها ثلاث مرات مع Anerdian (محلول مطهر ؛ انظر جدول المواد). حقن 0.2 مل من 1٪ ليدوكائين تحت الجلد باستخدام إبرة الأنسولين 29 غرام لتوفير تسكين موضعي.
  3. قم بعمل شق 0.5 سم باستخدام مقص العين لكشف الجمجمة. استخدم قطعة قطن مغموسة بنسبة 3٪ H2O2 لفرك الجمجمة المكشوفة لإزالة السمحاق. اترك الجمجمة حتى تجف.
  4. لصق الحفر على أداة stereotaxic. اضبط مقابض الأذرع المجسمة لوضع طرف الحفر بدقة في bregma بمساعدة المكبر وتسجيل قيمة المحور z باستخدام شاشة LCD الرقمية.
    1. اضبط المقابض وضع طرف الحفر في لامدا وسجل قيمة المحور z. اضبط مشبك الأنف وقضبان الأذن لتقريب قيمتي z ، وكرر الخطوات أعلاه حتى يصبح الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم.
      ملاحظة: تتوافق المحاور x و y و z على شاشة LCD الرقمية مع المحاور المتوسطة (ML) والأمامية الخلفية (AP) والظهرية البطنية (DV) على التوالي. يمكن اعتبار bregma و lambda على نفس المستوى الأفقي بمجرد أن يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم.
  5. ضمان مستوى اليسار واليمين من الدماغ. اضبط قضبان الأذن المرفقة بالإطار التجسيمي بنفس المقياس. خذ النواة الرباعية اللاحقة ، الجزء البطني (LDTgV) ، على سبيل المثال ؛ إحداثياتها المجسمة هي -5.2 ل x ، +0.8 ل y ، -4.0 ل z ، وفقا ل Paxinos و Franklin's Mouse BrainAtlas 16.
    1. اضبط شريط الأذن لعمل المثقاب عند (-5.2 ، +0.8) لقياس قيمة z في الاتجاه الظهري البطني وحرك المثقاب إلى (-5.2 ، -0.8) لقياس قيمة z.
      ملاحظة: يعتبر اليسار-اليمين عند المستوى المتساوي عندما يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.2 مم. يجب إدخال قضبان الأذن في المكان المناسب لأن الصماخ السمعي الخارجي متماثل. إذا كان الفرق بين قيمتي z أكثر من 0.5 مم ، فقد يتم إدخال شريط الأذن في المكان الخطأ.
  6. ضع المثقاب على bregma مرة أخرى واضبط ثلاثة إحداثيات على شاشة LCD الرقمية على الصفر. ضع التمرين فوق منطقة الاهتمام باستخدام الإحداثيات المرجعية. ابدأ التدريبات.
    1. خفض تدريجيا الحفر باستخدام الذراع العمودي حتى يخترق الجمجمة. قم بإزالة الحطام والدم باستخدام مسحات القطن.
      ملاحظة: احرص على عدم إتلاف أنسجة المخ.

2. تحضير محلول الصبغة والحقن المجهري للدماغ

  1. خذ 25 ميكرولتر من مخزن التحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على بروموفينول أزرق (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من ddH2O إلى الأنبوب لتحضير محلول الصبغة.
  2. قم بتغطية نافذة الجمجمة بقطعة قطن مبللة بالمحلول الملحي. تأكد من سالكية الحقن الدقيقة عن طريق شفط وطرد المحلول الملحي بشكل متكرر. قم بتحميل 0.3 ميكرولتر من الصبغة في المحقنة الدقيقة. قم بتوصيل المحقنة والحاقن الدقيق التجسيمي الميكانيكي بالذراع المجسم.
  3. ضع طرف المحقنة في bregma واضبط الإحداثيات على الصفر على شاشة LCD الرقمية. اضبط الإبرة في منطقة الاهتمام وفقا للإحداثيات المرجعية. اضبط سرعة الحقن على 0.1 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحاقن الدقيق الميكانيكي ، مما يوفر 0.3 ميكرولتر من الصبغة الزرقاء في المنطقة المستهدفة. اترك المحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق على الأقل قبل سحب الحاقن ببطء.
    ملاحظة: يمكن استخدام أصباغ ملونة مختلفة في نفس الفئران لتمييز المناطق القريبة. اختبر الأصباغ الأخرى بحثا عن تركيزات مناسبة بناء على خصائصها الفيزيائية. يوصى باستخدام تركيبة البروموفينول الأزرق وشطف المحقنة جيدا قبل الاستخدام وبعده لمنع الانسداد. اضبط أحجام الحقن بناء على انتشار الصبغة.

3. حصاد أنسجة المخ والتشريح بالتبريد

  1. حرر الماوس من الإطار المجسم. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال باستخدام إبرة 29 غرام. تأمين الماوس على لوحة رغوة مع الشريط.
  2. افتح جانبي الصدر للحث على الاختناق السريع. قم بعمل شق 1-2 مم في الزائدة الأذينية اليمنى. أدخل إبرة التسريب في البطين الأيسر. تنقع 20 مل من محلول ملحي مبرد مسبقا و 20 مل من محلول بارافورمالدهايد المثلج 4٪.
  3. قطع رأس الفأر بمقص تشريح الأنسجة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). قم بإزالة الجلد عن طريق إجراء شق على طول خط الوسط من الرقبة إلى الأنف ثم كشف الجمجمة. تخلص من العضلات المتبقية على الجمجمة بالملقط أو المقص.
  4. ضع طرف شفرة واحدة من المقص الناعم بين الثقبة العظمى والدماغ ، مع الحافة الحادة التي تواجه العظم ، في نهاية المنضدة من الخيط السهمي الأوسط. المضي قدما في الانزلاق وقطع الجمجمة على طول خياطة منتصف السهمي. استخدم ملقط لإزالة الجمجمة ، وكشف الدماغ المكشوف.
    ملاحظة: توخي الحذر لتجنب التسبب في أي ضرر للدماغ أثناء العملية. قبل إزالة رقائق العظام ، انزع بعناية أي سحايا قد تكون متصلة بالجمجمة. هذا الاحتياط ضروري لمنع التقطيع غير المقصود لأنسجة المخ أثناء العملية.
  5. قم بتشغيل قوة كريوستات الميكروتوم الدوار (انظر جدول المواد) واضبط درجة حرارة الغرفة على -20 درجة مئوية. صب القليل من مركب OCT لتغطية سطح قرص العينة بالتساوي. ضعه في غرفة التبريد واسمح ل OCT بالتصلب.
  6. قم بتوصيل القرص برأس العينة. اجعل الشفرة أقرب إلى الكتلة وقم بقص كتلة OCT لعمل مستوى مسطح مواز للقرص.
  7. قطع الدماغ في اتجاه إكليلي بعيدا عن موقع الحقن في قالب شريحة الدماغ بواسطة شفرة حلاقة. ضع أنسجة المخ التي تحتوي على موقع الحقن مع الجانب المقطوع لأسفل على المستوى المسطح OCT.
    1. صب OCT على الدماغ ووضع القرص في غرفة التبريد ، مما يسمح لكتلة العينة بالتصلب. صب OCT بشكل متكرر على الدماغ حتى يتم دمج الدماغ بالكامل مع OCT.
      ملاحظة: أضف مركب OCT طبقة تلو الأخرى. بمجرد تجميد الطبقة السابقة من OCT ، صب الطبقة اللاحقة من مركب OCT على الدماغ.
  8. قم بقص كتلة العينة حتى تقترب المنطقة المستهدفة. اصنع عدة أقسام من مستوى موقع الحقن. اجمع شرائح الدماغ الإكليلي في طبق من 6 آبار يحتوي على برنامج تلفزيوني بدرجة حرارة الغرفة باستخدام فرشاة كتابة صغيرة محفوظة عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: اضبط سمك القطع على سمك أكبر لتقليم الكتلة ، ثم اضبط سمك القطع على 40 ميكرومتر عندما تقترب الشفرة من موقع الحقن. إذا تم استخدام متتبعات الدوائر العصبية ، فلن يتم التضحية بالفئران على الفور. ضع الماوس في قفص تعافي معقم بعد العملية الجراحية فوق بطانية تدفئة للتعافي من التخدير. أعد الفئران إلى القفص الأصلي أو قفص جديد بمجرد استيقاظها.

4. التصوير

  1. اغسل OCT بدرجة حرارة الغرفة PBS. استخدم فرشاة لالتقاط أقسام الدماغ ووضعها على شريحة. اترك الأقسام تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
  2. راقب المنطقة المحقونة بصريا أو استخدم المجهر عندما تكون النوى المستهدفة ضئيلة. قارن موقع الصبغة المحقونة بالمنطقة المقابلة في أطلس الدماغ.
    ملاحظة: اضبط قيم المحاور x وy وz وفقا لاتجاه ومسافة انحراف نقطة الحقن. قد يكون من الضروري تكرار كافة الخطوات في هذا البروتوكول عدة مرات لتحديد الإحداثيات بدقة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجحت هذه الدراسة في تحديد موقع الحقن في غضون 30 دقيقة باستخدام الطريقة المثبتة. في البداية ، تم حقن محلول تحميل عينة SDS-PAGE يحتوي على بروموفينول أزرق في LDTgV في الفئران C57 / BL. يوضح الشكل 1 أ تمثيلا تخطيطيا لحقن محلول الصبغة. يوضح الشكل 1 ب توزيع الصبغة الزرقاء في LDTgV.

كما تم حقن البروموفينول الأزرق في القشرة التمهيدية mPFC ، والقشرة تحت الحمراء mPFC ، واللوزة القاعدية (BMA) لتقييم عالمية هذا البروتوكول. كما هو موضح في الشكل 1C-E والشكل 2A ، تم توزيع الصبغة الزرقاء في القشرة التمهيدية mPFC ، والقشرة تحت الحمراء mPFC ، و BMA.

علاوة على ذلك ، تم حقن فيروس مرتبط بالغدي يحمل بروتين mCherry الفلوري في LDTgV (تم التحقق من الإحداثيات باستخدام محلول الصبغة). استغرق التعبير عن الفيروس أربعة أسابيع. يوضح الشكل 2 ب توزيع الخلايا العصبية mCherry + في LDTgV.

figure-results-1
الشكل 1: حقن محلول صبغي. أ: مخطط تخطيطي لحقن محلول الصبغة. ب: توزيع الصبغة الزرقاء في LDTgV. (ج) توزيع الصبغة الزرقاء في القشرة الأولية mPFC. د: توزيع الصبغة الزرقاء في القشرة تحت الحليمية mPFC. ه: توزيع الصبغة الزرقاء في مادة BMA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توزيع الصبغة الزرقاء وتوزيع mCherry ينظر إليه تحت المجهر. (أ) توزيع الصبغة الزرقاء في القشرة التمهيدية mPFC (تكبير 10x ، شريط المقياس = 500 ميكرومتر). (B) صورة تمثيلية لتوزيع mCherry في منطقة LDTgV تم الحصول عليها بواسطة المجهر الفلوري (تكبير 10x ، شريط المقياس = 500 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت هذه المقالة استراتيجية مستقرة للتحقق من دقة حقن الدماغ التجسيمية 5,6 بسرعة أكبر وببساطة قبل تتبع الفيروس ، ولكن الجانب الذي لا يمكن الاستغناء عنه من التعبير الجيني للمراسل في منطقة الدماغ أمر بالغ الأهمية لوضع العلامات على منطقة الدماغ. سمحت الصبغة الزرقاء التي استخدمناها بالتصور الفوري لموقع الحقن.

تساهم العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في تحسين دقة موقع الحقن. أولا ، ضمان مستوى الدماغ من اليسار إلى اليمين في الأداة المجسمة من الخطوة 1.5 ؛ تتطلب هذه الخطوة من المشغلين أن يكونوا على دراية بتشريح الجمجمة ، مما يضمن وضع قضبان الأذن في الموضع الصحيح. تعمل المقاييس الموجودة على قضبان الأذن والإطار التجسيمي أيضا كمرجع. ثانيا ، إيجاد نقطة الصفر بالضبط ، bregma ، في الخطوة 1.6 والخطوة 2.3. في بعض الأحيان ، يرجع التباين الكبير في الإحداثيات الموجودة في الخطوتين 1.6 و 2.3 إلى اختلاف كبير في تحديد موضع نقطة الصفر. هذا يمكن أن يؤدي إلى عدم قدرة إبرة الحاقن الدقيق على اختراق نافذة الجمجمة. في مثل هذه الحالات ، من الضروري إعادة وضع نقطة الصفر وإذا لزم الأمر ، يجب إنشاء نافذة جمجمة جديدة. على الرغم من ذلك ، لا يزال من الضروري إعادة إنشاء نقطة الصفر وإيجاد الإحداثيات من جديد في الخطوة 2.3 ؛ لا يمكن للمرء إدخال المحقنة الدقيقة مباشرة من نافذة الجمجمة التي تم إنشاؤها مسبقا.

بالمقارنة مع قطع دماغ غير مجمد في قالب شريحة دماغ الفأر ، توفر هذه الإستراتيجية نتيجة أكثر دقة لأن كتلة العينة الصلبة تتجنب الشفرة التي تضغط على الدماغ وتتسبب في إزاحة الصبغة من نقاط الحقن. علاوة على ذلك ، فإن أقسام الدماغ المقطوعة بواسطة قالب شريحة الدماغ أكثر سمكا نسبيا وغير مجدية لتوطين النوى الدماغية الصغيرة. ومع ذلك ، بالمقارنة مع عملية التقسيم بالتبريد القياسية لأنسجة المخ11،12،13،14،15 ، قمنا بتقصير مدة المعالجة بمقدار 72 ساعة على الأقل عن طريق تخطي خطوات الجفاف ، مما أدى إلى أن تكون أقسام الدماغ أكثر هشاشة وأكثر صعوبة في التقاطها على شريحة زجاجية ، مما يمثل نقطة ضعف رئيسية في هذا البروتوكول.

أثناء صنع نوافذ الجمجمة لحقن الصبغة ، فإن ربط مثقاب الأسنان بإحكام بالذراع التجسيمي ، بدلا من إمساكه باليد ، يجعل من السهل التحكم في عمق الحفر باستخدام مقبض الضبط الدقيق ، مما يقلل من إمكانية إتلاف أنسجة المخ.

في الختام ، قدمت هذه الدراسة طريقة واعدة للتحقق بشكل مبدئي من الإحداثيات المجسمة الدقيقة قبل تتبع الفيروس ، مما يجعل عملية وضع العلامات على الخلايا العصبية اللاحقة وتتبعها أكثر موثوقية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101249 إلى XY Sun) ، مؤسسة أبحاث ما بعد الدكتوراه في الصين (منحة رقم 2022M722125 إلى XY Sun). برنامج شنغهاي للإبحار (منحة رقم 21YF1425100 إلى SH Chen). المشروع الخاص للبحوث السريرية التابع للجنة الصحة البلدية في شنغهاي (المنحة رقم 202340088 إلى J Zhou). المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82101262 ل X Zhang ، المنحة رقم 82101287 إلى SH Chen).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.0 وميكرو ؛ L ، حقنة الأعصاب ، موديل 7001 KH ، 32 جم ، بوينت ستايل 3هاميلتون65458-01
200 & L ماصة نصائحbiosharpBS-200-T
20 مل حقنةيرجى مجموعة
3٪ حل H2O2شركة Lircon
6 آبار لوحةShengyou Biotech20006
AnerdianLikang لوحة 31001002
عالية التقنية مضادة للفةLeica14047742497
BD الأنسولين حقنةبيكتون وديكنسون وشركاه328421
بيند ملقطمسنن JinzhongJD1050
Cellens برنامج البعدأوليمبوس
مسحة قطنفيشر Scientific23-400-122
Dapi-Fluoromount-GSouthernbiotech0100-20
DrillLongxiang
فرش دقيقةHWAHONG
مقص ناعمJinzhongy00030
الفحص المجهري الفلوريأوليمبوسBX63
تجميد ميكروتومLeicaCM1950
ملقط مرقئ مستقيم مع الأسنانJinzhongJ31010
إبرة التسريب 0.7 مممجموعة تفضل
حقن هيدروكلوريد الليدوكائينشركة الحصاد للأدوية71230803
العدسة المكبرةM & G Chenguang القرطاسية
ذكر C57 / BL الفئرانمعهد شنغهاي لأبحاث تنظيم الأسرة &ndash ؛ مختبر
الفئران شريحة الدماغ الإكليلية العفنRWD علوم الحياة68713
أنبوب الطرد المركزيالدقيق biosharpBS-02-P
شفرات MicrotomeLeica819
مرهم العيونCisen Pharmaceutical CompanyG23HDM9M4S5
paraformaldehydeBiosharpBL539A
المضخات التمعجيةهارفارد جهاز70-4507
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتServicebioG4202
Piette 2-200 & Lthermofisher4642080
SDS-PAGE تحميل عينة تحتوي على بروموفينول الأزرقBeyotimeP0015A
شفرات الحلاقةBFYING91560618
الشرائحCitotest 188105
التجسيمRWD علوم الحياة68807
ملقط تشريح مسننةمستقيمة JinzhongJD1060
حامل حقنةRWD Life Science68206
مقص المناديلJinzhongJ21040
Tissue-Tek O.C.T مركبساكورا4583
ثلاثي بروموإيثانولAibei التكنولوجيا الحيويةM2910
تشريح BKالعلمية جهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175(2018).
  2. Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
  3. Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
  4. Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
  5. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
  6. Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
  7. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
  8. Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77(2023).
  9. Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
  10. Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719(2023).
  11. Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211(2021).
  12. Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
  13. Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
  14. Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
  15. Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506(2023).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , Academic Press. (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cryosectioning ValidationBrain CoordinatesMouse BrainInjection Site VerificationBromophenol Blue DyeStereotaxic FrameCoronal Brain SlicesMicro Syringe InjectionRotary Microtome

مقالات ذات صلة