يستخدم هذا البروتوكول التصوير بالورقة الضوئية للتحقيق في وظيفة انقباض القلب في يرقات الزرد واكتساب نظرة ثاقبة لميكانيكا القلب من خلال تتبع الخلايا والتحليل التفاعلي.
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الزرد هو كائن نموذجي مثير للاهتمام معروف بقدرته الرائعة على تجديد القلب. تعد دراسة القلب المنقبض في الجسم الحي أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة للتغيرات الهيكلية والوظيفية استجابة للإصابات. ومع ذلك ، فإن الحصول على صور عالية الدقة وعالية السرعة رباعية الأبعاد (4D ، 3D المكانية + 1D الزمانية) لقلب الزرد لتقييم بنية القلب وانقباضه لا يزال يمثل تحديا. في هذا السياق ، يتم استخدام مجهر الصفيحة الضوئية الداخلي (LSM) والتحليل الحسابي المخصص للتغلب على هذه القيود التقنية. هذه الاستراتيجية ، التي تنطوي على بناء نظام LSM ، والتزامن بأثر رجعي ، وتتبع الخلية الواحدة ، والتحليل الموجه للمستخدم ، تمكن المرء من التحقيق في البنية الدقيقة ووظيفة الانقباض عبر القلب بأكمله بدقة الخلية الواحدة في يرقات الزرد Tg (myl7: nucGFP) المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، نحن قادرون على دمج الحقن المجهري لمركبات الجزيئات الصغيرة للحث على إصابة القلب بطريقة دقيقة ومضبوطة. بشكل عام ، يسمح هذا الإطار للمرء بتتبع التغيرات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، بالإضافة إلى الميكانيكا الإقليمية على مستوى الخلية الواحدة أثناء تكوين القلب وتجديده.
المقدمة
الزرد (Danio rerio) هو كائن نموذجي يستخدم على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وعلم وظائف الأعضاء والإصلاح بسبب شفافيته البصرية وقابليته للسحب الجيني وقدرته على التجدد1،2،3،4. عند احتشاء عضلة القلب ، بينما تؤثر التغيرات الهيكلية والوظيفية على طرد القلب وديناميكا الدم ، تستمر القيود التقنية في إعاقة القدرة على التحقيق في العملية الديناميكية أثناء تجديد القلب بدقة مكانية زمانية عالية. على سبيل المثال ، طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود من حيث عمق التصوير أو الدقة الزمنية أو السمية الضوئية لالتقاط التغييرات الديناميكية وتقييم وظيفة انقباض القلب خلال دورات القلبالمتعددة 5.
يمثل الفحص المجهري للصفائح الضوئية طريقة تصوير حديثة تعالج هذه المشكلات بنجاح عن طريق مسح الليزر بسرعة عبر بطين القلب والأذين ، وتحقيق صور مفصلة بدقة مكانية زمانية محسنة وتبييض ضوئي ضئيل وتأثيرات سامة ضوئية6،7،8،9،10،11.
يقدم هذا البروتوكول استراتيجية تصوير شاملة تتضمن بناء نظام LSM ، وإعادة بناء صورة 4D ، وتتبع الخلايا ثلاثية الأبعاد ، والتحليل التفاعلي لالتقاط وتحليل ديناميكيات خلايا عضلة القلب عبر القلب بأكمله خلال دورات القلب المتعددة12. يسمح نظام التصوير المخصص والمنهجية الحسابية للمرء بتتبع البنية المجهرية لعضلة القلب ووظيفة الانقباض على مستوى الخلية الواحدة في يرقات الزرد Tg (myl7: nucGFP) المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، تم تسليم مركبات جزيئية صغيرة إلى الأجنة باستخدام الحقن المجهري لتقييم إصابة القلب التي يسببها الدواء والتجديد اللاحق. توفر هذه الاستراتيجية الشاملة نقطة دخول للتحقيق في الخصائص الهيكلية والوظيفية والميكانيكية لعضلة القلب على مستوى الخلية الواحدة أثناء نمو القلب وتجديده.
البروتوكول
تم منح الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة تكساس في دالاس ، بموجب البروتوكول رقم # 20-07. Tg(myl7:nucGFP) تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا12 في هذه الدراسة. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.
1. تربية الزرد والحقن المجهري للأجنة
التوقيت: 2 أيام
- الحفاظ على وتربية الزرد البالغ من خلال إجراءات الرعاية القياسية والتكاثر. وللاطلاع على الأساليب التفصيلية، يرجى الرجوع إلى التقريرالسابق 13.
- إجراء الحقن المجهري باتباع البروتوكولالمعمول به 14. بالنسبة للدراسة الحالية ، تم إجراء الحقن المجهري في مرحلة 1-2 خلية (زيجوت).
ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد هذه المرحلة بدقة من أجل الحقن المجهري الفعال وضمان الاتساق التنموي. خلال مرحلة الخلية الواحدة ، تتشكل قبة صغيرة فوق صفار البيض ، وتستمر هذه المرحلة عادة حوالي 12 دقيقة. عند التقدم إلى مرحلة الخليتين ، تصبح قبتان متجاورتان مرئيتين ، وتستمر هذه المرحلة لمدة 45 دقيقة تقريبا بعد الإخصاب15. يمكن العثور على معلومات أكثر تفصيلا عن بناء النظام في تقارير أو بروتوكولات أخرى12،16،17.
2. تحضير أجنة / يرقات الزرد وتركيبها
التوقيت: 7 أيام
- نقل الأجنة في يوم واحد بعد الإخصاب (dpf) إلى ماء E3 مع 0.2 mM 1-Phenyl-2-thiourea (PTU) (انظر جدول المواد) لمنع تكوين الصباغ.
- استبدل الوسط بمياه E3 العذبة مع PTU كل يوم حتى تصوير LSM.
- صور الأجنة أو اليرقات باستخدام المجهر المجسم لتسجيل تطورها في النقاط الزمنية المطلوبة بين 0 و 7 dpf.
- تحضير أنابيب بروبيلين الإيثيلين المفلورة المجزأة (FEP) بقطر داخلي 2 مم لتضمين يرقات الزرد تحت نظام LSM12.
ملاحظة: يتم استخدام أنبوب FEP لتأمين العينة بمواد مطابقة معامل الانكسار تشبه إلى حد كبير الوسط المحيط ، مثل الماء. - بدءا من 3 dpf ، انقل الأسماك إلى محلول 150 مجم / لتر تريكايين (MS-222) (انظر جدول المواد) لشل حركة الأسماك قبل التصوير.
- تحضير أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 0.8٪ مع 150 مجم / لتر تريكايين واستخدم ماصة نقل لنقل الأسماك المخدرة إلى الأغاروز بمجرد أن يبرد إلى درجة حرارةالغرفة 18.
- استخدم ماصة نقل أخرى لتركيب السمك مع الأغاروز في أنابيب FEP (الشكل 1).
ملاحظة: للتأكد من الحد الأدنى من الإجهاد في الأجنة النامية ، تم إجراء فحوصات قبل وبعد التثبيت لنشاط القلب ، مثل معدل ضربات القلب ، تحت الملاحظة المجهرية. تهدف هذه التقييمات إلى تحديد أي اختلافات كبيرة قبل وبعد تخدير التريكائين. يمكن أيضا إجراء فحص إضافي للجلد والعضلات بحثا عن مخالفات في بنية القلب ، مثل الوذمة ، بعد التثبيت. يلعب تركيز التريكايين أيضا دورا حاسما في تصوير القلب19 ، وبالتالي تم استخدام محلول التريكائين بتركيز 150 مجم / لتر لتصوير الانقباض في يرقات الزرد في هذا المشروع. في حين أن التزامن بأثر رجعي الحالي يسمح لنا بمعالجة ضربات القلب غير المنتظمة20 ، لا يزال هناك حل شامل للتصوير 4D لعدم انتظام ضربات القلب والتصوير طويل المدى في الزرد قيد التطوير.
3. إعداد وتكوين نظام التصوير بورقة الضوء
التوقيت: 3-14 يوم
- قم ببناء نظام LSM داخلي يعتمد على عدسة أسطوانية باستخدام أنظمة ليزر الحالة الصلبة (DPSS) ذات الموجة المستمرة التي يتم ضخها بالصمام الثنائي بأطوال موجية محددة مثل 473 نانومتر و 532 نانومتر كمصادر إضاءة (الشكل 2 أ).
- قم بتخصيص رموز التحكم LabVIEW (انظر جدول المواد) لمزامنة مرحلة العينة الانتقالية وإضاءة ورقة الضوء وتعريض كاميرا sCMOS لالتقاط تسلسلات الصور.
ملاحظة: يمكن العثور على معلومات أكثر تفصيلا عن بناء النظام في التقارير أو البروتوكولات الأخرى12،16،17. نحن نشجع المجموعات البحثية على البحث عن فرص تعاونية مع المختبرات التي تمتلك خبرة راسخة في التصوير البصري أثناء بناء النظام.
4. إعداد تصوير الزرد وجمع البيانات
التوقيت: 1 يوم
- معايرة الدقة المكانية لنظام LSM وتقليل تباين العتامة على أعماق مختلفة عن طريق قياس حبات التألق.
- أولا ، خرز الفلورسنت المخفف (انظر جدول المواد) التي يبلغ قطرها 0.53 ميكرومتر إلى تركيز 1: 1.5 × 105 باستخدام أغاروز منخفض الانصهار بنسبة 0.8٪ ونقل المحلول إلى أنبوب FEP المجزأ.
- ثانيا ، استخدم نظام LSM لتصوير الخرزات وقياس وظيفة انتشار النقطة (PSF) عبر العينة بأكملها ، والتحقق من الدقة المكانية ومحاذاة النظام12.
ملاحظة: في هذا النظام ، يشير تحليل النتائج التمثيلية للعرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) إلى استبانات جانبية ومحورية تبلغ 1.26 ± 0.15 و 2.48 ± 0.15 ميكرومتر (n = 60 حبة) ، على التوالي. يشير هذا إلى دقة مكانية متسقة في جميع أنحاء عمق التصوير.
- قم بتوصيل أنبوب FEP مع يرقة الزرد المركبة بشكل آمن بمرحلة العينة الآلية ذات 6 محاور (x ، y ، z ، الملعب ، الانعراج ، واللفة) ، واغمر الأنابيب في غرفة العينة المملوءة بماء E3. لتجنب تشتت الضوء بواسطة كيس الصفار وتحديد موضع القلب بشكل أفضل ، قم بتدوير يرقة الزرد لالتقاط صورة من الجانب البطني (الشكل 2 ب). في هذه الحالة ، ستشمل معظم الصور الملتقطة كلا من البطين والأذين (الشكل 2C).
ملاحظة: بالنظر إلى أن إجراءات التصوير الحالية تستغرق عادة أقل من ساعة واحدة لكل سمكة وتم إجراؤها في بيئة درجة حرارة الغرفة الخاضعة للرقابة ، فإن التحكم في درجة حرارة الغرفة وتنظيم مستوى الأكسجين يعتبران اختياريين لهذا المشروع. ومع ذلك ، بالنسبة لدراسات التصوير ذات الفاصل الزمني على المدى الطويل ، لا سيما تلك التي تركز على العمليات التنموية ، يقترح المراقبة المستمرة لدرجة الحرارة وتنظيمها عند 27 درجة مئوية داخل غرفة العينة لضمان البيئة الفسيولوجية لسمك الزرد ومنع أي تشوهات تنموية محتملة. - قم بتوصيل مرحلة العينة الآلية بمحطة العمل وقم بتكوين جميع المعلمات الضرورية ، بما في ذلك وضع النقل المطلوب.
- قم بإنشاء اتصال بين كاميرا sCMOS ومحطة العمل. اضبط جميع الإعدادات الأساسية ، مثل وقت التعرض البالغ 5 مللي ثانية ومنطقة الاهتمام المطلوبة.
- قم بتكوين عدد تسلسلات الصور والإطارات داخل برنامج التحكم LabVIEW المخصص.
- قم بتشغيل الليزر وابدأ تصوير LSM للعينة. حافظ على العملية حتى يتم تسجيل جميع تسلسلات الصور بنجاح.
- سجل 300 إطار كتسلسل صور 2D لتغطية 3-5 دورات قلبية لليرقة بمعدل إطارات 200 إطار / ثانية. يلتقط التسجيل انقباض القلب عند المستوى الانتقائي المضاء بواسطة ورقة الضوء.
- حرك اليرقة بحجم خطوة 1 ميكرومتر عبر إضاءة الورقة الضوئية لتقطيع العينة تقريبا.
ملاحظة: يجب تعيين حجم خطوة مرحلة العينة بناء على الدقة المحورية لنظام الورقة الخفيفة ، باتباع نظرية أخذ العينات Nyquist-Shannon12. - كرر الخطوة 7 لتسجيل تسلسل صورة آخر لشريحة العينة الجديدة حتى يتم تغطية القلب بالكامل. بشكل عام ، يضمن تسلسل الصور 100-200 بحجم خطوة 1 ميكرومتر تغطية قلب يرقة الزرد بالكامل (الشكل 2 د).
ملاحظة: يتم التحكم في الخطوة 4.7-4.9 بواسطة برنامج LabVIEW ويتم تنفيذها تلقائيا بواسطة نظام LSM (الشكل 3). نظرا للحجم الكبير لبيانات الصور التي تم إنشاؤها ، يوصى باستخدام اصطلاح تسمية موحد لتسلسلات الصور. على سبيل المثال ، قم بتعيين مجلدات بأسماء مثل "z-1" و "z-2" وما إلى ذلك ، لتصنيف البيانات عبر تسلسلات الصور المختلفة. ضمن كل تسلسل ، يجب تسمية الصور بالتسلسل (على سبيل المثال ، "1" ، "2" ، ...) للإشارة إلى نقاط زمنية مميزة. يبلغ الوقت الإجمالي لتركيب الأسماك ، وضبط زاوية التصوير ، وجمع جميع البيانات ليرقة الزرد حوالي 1 ساعة.
5. إعادة بناء صورة 4D مع حساب متوازي
التوقيت: 1 يوم
ملاحظة: خوارزمية إعادة البناء 4D التي طورتها مجموعتنا وعينة البيانات متاحة للجمهور21. تسمح هذه الطريقة بإعادة بناء صورة القلب 4D من تسلسلات الصور التي تم جمعها في الخطوات السابقة (الجدول 1).
- افتح الملف test_Parallel صباحا في MATLAB (انظر جدول المواد). حدد موقع المجلد حيث يتم تخزين تسلسلات الصور الأولية في المتغير "baseDir".
- قم بتعيين المتغير "numOfSlice" مع إجمالي عدد تسلسلات الصور (عادة 100-150) والمتغير "numOfImage" مع عدد الصور (عادة 300-500) في كل تسلسل.
- افحص تسلسل الصورة الذي يظهر المستوى الأوسط لقلب الزرد (على سبيل المثال ، التسلسل 51من إجمالي 101 تسلسل). تحديد أرقام إطارات الانقباضات الأولى والرابعة في هذا التسلسل وتعيينها للمتغيرات systolicPoint_1st و systolicPoint_4th.
- انقر فوق تشغيل لبدء العملية.
ملاحظة: سيتم أولا تحديد طول الدورة القلبية في كل تسلسل صورة بواسطة برنامج MATLAB من خلال مقارنة التشابه (مجموع الاختلافات التربيعية) بين الصور في نقاط زمنية مختلفة. بعد ذلك ، سيتم تقدير الدورة القلبية باستخدام متوسط أطوال الدورة من جميع تسلسلات الصور. بعد ذلك ، سيتم محاذاة نقاط البداية لتسلسلات الصور في مواقع محورية مختلفة بواسطة البرنامج من خلال مقارنة تكرارية لتشابه الصورة من تسلسل الصورة الأول إلى تسلسل الصورة الأخير. - تحقق من النتائج في مجلد الإخراج. سيقوم البرنامج بحفظ الصور كملفات ".tif" مع طوابع زمنية. كل ملف ".tif" هو صورة قلب 3D في نقطة زمنية محددة. الفاصل الزمني بين صورتين 3D يساوي وقت التعرض الذي تم تعيينه.
ملاحظة: أعد بناء الصور المكتسبة من الخطوات السابقة لتصوير تقلصات القلب 4D (3D المكانية + 1D الزمانية). لتعزيز الكفاءة في التحقيقات عالية الإنتاجية أثناء المزامنة بأثر رجعي ، يتيح هذا النهج عمليات حسابية متزامنة على وحدة معالجة الرسومات من خلال الاستفادة من نوى وحدة المعالجة المركزية المتعددة من خلال صندوق أدوات الحوسبة المتوازية MATLAB وتحويل الصور إلى تنسيق gpuArray .
تجزئة الخلايا 6. 3D وتتبع الخلايا
التوقيت: 1 يوم
- قم بتنزيل حزمة 3DeeCellTracker (انظر جدول المواد) وقم بإعداد بيئة Python22.
- قم بتنزيل برنامج التعليقات التوضيحية ITK-SNAP23 (انظر جدول المواد) واستخدمه لتسمية صورة القلب ثلاثية الأبعاد يدويا في نقطتين زمنيتين محددتين ، واحدة في الانبساط البطيني والأخرى في الانقباض البطيني ، لإنشاء مجموعات بيانات التدريب والتحقق من الصحة.
ملاحظة: قد تكون برامج وضع العلامات الأخرى قابلة للتطبيق أيضا. - في Python ، قم بتشغيل برنامج التدريب 3DeeCellTracker وقم بتهيئة معلمات noise_level (100 في هذه الحالة) و folder_path والنموذج في وظيفة TrainingUNet3D لتعيين نموذج U-Net ثلاثي الأبعاد المحدد مسبقا.
- في MATLAB ، استخدم برنامج imageDimConverter.m لتحويل وإعادة تسمية مجموعة بيانات التدريب والتحقق من الصحة إلى التنسيق المناسب للتحميل.
- في Python، قم بتحميل مجموعات بيانات التدريب والتحقق من الصحة باستخدام الدالتين trainer.load_dataset() و trainer.draw_dataset() .
- في Python ، قم بتشغيل الجزء الأول من برنامج تتبع 3DeeCellTracker وقم بتهيئة المعلمات.
ملاحظة: يتضمن ذلك تحديد معلمات الصورة لتوصيف أبعاد الصورة ، ومعلمات التجزئة لتحديد نموذج التعلم الآلي المطبق لتجزئة الخلايا ، ومعلمات التتبع لتحديد نماذج الشبكة العصبية العميقة المدربة مسبقا المستخدمة لتسجيل الخلايا. لأول مرة ، يوصى باستخدام نموذج U-Net لتجزئة الخلايا و FFN + PR-GLS لتسجيل الخلايا. هناك حاجة لتخزين البيانات والنموذج والنتائج في مجلدات سيتم إنشاؤها تلقائيا في هذه الخطوة. - في MATLAB ، استخدم برنامج imageDimConverter.m لتحويل وإعادة تسمية جميع صور القلب 3D إلى التنسيق المناسب ونقلها إلى مجلد البيانات الذي تم إنشاؤه في الخطوة الأخيرة.
- في Python ، قم بتشغيل الجزء الثاني من برنامج 3DeeCellTracker لبدء التجزئة.
- بمجرد تقسيم أول صورة 3D ، قارن نتيجة التجزئة بالصورة الأولية ، وقم بإجراء تصحيح يدوي إذا تم العثور على أي تجزئة غير صحيحة. انقل التجزئة المصححة إلى المجلد "/ manual_vol1" الذي تم إنشاؤه.
- في Python ، قم بتشغيل الجزء الثالث من برنامج 3DeeCellTracker لتقسيم جميع الصور.
- استخدم Amira (انظر جدول المواد) لإجراء تقييم مرئي لنتائج التتبع من خلال مقارنة مواضع الخلايا المتعقبة بالصور الأولية المقابلة لها. إذا لم تكن نتائج الاختبار مرضية ، فأعد تشغيل الإجراء من الخطوة 6.6 ، واستخدم نموذجا بديلا للتعلم الآلي للتجزئة أو تسجيل الخلية ، ثم أعد بدء عملية التتبع.
ملاحظة: بعد التجزئة، يتم تخزين بيانات تسميات الخلايا كصورة 8 بت (من 0 إلى 255) بشكل افتراضي، مما يعني أنه يتم توفير 256 مقياسا فقط كتسميات لتصنيف الخلايا. هناك حلان لمعالجة هذه المشكلة عند الحاجة إلى فصول إضافية. يتمثل أحد الحلول في تعيين تنسيق بيانات تسميات الخلايا كصورة 16 بت في برنامج التتبع ، مما سيؤدي إلى زيادة هائلة في وقت المعالجة ، أكثر من يومين في الحالة الحالية. الحل الآخر هو استخدام برنامج "separateTrackingResults.py" لمعالجة تسميات الخلايا بعد ذلك ، والتي ستفصل الخلايا بنفس التسميات بناء على موقعها الفعلي وتعيين تسمية مختلفة لكل خلية. تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق في هذه الحالة.
7. تحليل انقباض القلب في وضع الواقع الافتراضي
التوقيت: 1 يوم
- الحصول على نتيجة تتبع الخلية من الخطوات السابقة.
- تحقق من صحة البيانات يدويا وحدد الخلايا ذات كثافة الصورة المتسقة عبر جميع وحدات التخزين (حوالي 500 خلية من أصل 600 خلية تقريبا).
- استخدم البرنامج النصي cellLabelsToObj.ipynb 21 لإنشاء شبكة سطحية لكل خلية فردية من خلال برنامج 3D Slicer24 (انظر جدول المواد) وتعيين رمز لون فريد لكل خلية.
- تصدير كل نموذج 3D ، يتكون من جميع الخلايا في نقطة زمنية واحدة ، كملف .obj واحد يتكون من كائنات فرعية متعددة مصحوبة بملف .mtl لوصف تسمية الخلية.
- قم باستيراد النماذج إلى Unity باستخدام الترخيص التعليمي ، وهو محرك تطوير يستخدم للواقع الممتد.
- قم بتطبيق البرامج النصية المخصصة التي تتكون من وظائف مكتوبة بلغة C # على النماذج وعناصر واجهة المستخدم للسماح بتصور 4D والتحليل التفاعلي. قم بإجراء تفاعل VR باتباع الخطوة 7.7.
- التفاعل مع النماذج في الواقع الافتراضي (VR) باستخدام الوظائف التالية (الشكل 4):
- تحديد الخلية: حدد ما يصل إلى خليتين في وقت واحد واعرض مساراتها وسرعاتها وأحجامها ومساحات سطحها ومسافاتها النسبية.
- اختيار النقطة الزمنية: اختر نقطة زمنية محددة في البيانات لتحليل مخرجات الخلايا المحددة ، مثل t = 0 ms أثناء الانبساط ، أو عند t = 200 مللي ثانية أثناء الانقباض.
- إيقاف مؤقت: قم بتجميد النموذج الديناميكي للتركيز على الخلايا المحددة ومخرجاتها.
- التباين: قم بتعديل التباين بين الخلايا المحددة والخلايا المحيطة في النموذج.
النتائج
يتكون البروتوكول الحالي من ثلاث خطوات رئيسية: إعداد الزرد والحقن المجهري ، والتصوير بالضوء وإعادة بناء الصور 4D ، وتتبع الخلايا وتفاعل الواقع الافتراضي. سمح لأسماك الزرد البالغة بالتزاوج ، وتم جمع البيض المخصب ، وإجراء الحقن المجهري حسب الحاجة للتجارب المقترحة (الشكل 1). توفر هذه الخطوة نقطة دخول لاستكشاف تطبيقات الزرد في التحقيق في تطور القلب وتجديده ، كما أنها تلعب دورا مهما في التصوير والتحليل اللاحقين. تم تصوير القلب المنقبض في مراحل مختلفة (من 3 dpf إلى 7 dpf) باستخدام نظام LSM المصمم خصيصا ومحاذاة تسلسلات الصور على طول المحور z لإعادة بناء نموذج قلب الزرد 4D (الشكل 2 والشكل 3). توفر هذه النماذج أساسا لتوصيف النمط الظاهري العميق وهي محورية في الكشف عن ديناميكيات مورفولوجيا القلب ووظيفته عبر الجداول الزمنية التنموية. تم تتبع الخلايا الفردية في قلب الزرد وتم قياس حركتها وتفاعلها باستخدام منصة الواقع الافتراضي المخصصة. كما تمت مقارنة تغيرات السرعة والمسافة النسبية لخلايا مختارة خلال دورة قلبية واحدة في الأذين والبطين لتقييم الانقباض الإقليمي والتحقيق في الإجهاد المحلي (الشكل 4). تم تحديد السلالة الإقليمية بناء على التباين في الإزاحة بين خليتين متجاورة لعضلة القلب في المنطقة محل الاهتمام. تم تقدير التقصير التجزيئي (FS) والكسر القذفي (EF) باستخدام المنهجيات الموضحة في الأدبيات المنشورة25. معادلات FS و EF هي كما يلي:
حيث Dd و Ds هي أقطار البطين (محور قصير ، يقاس بالمسافات بين خلايا البطين المختلفة) في المراحل الانبساطية النهائية ونهاية الانقباض ، على التوالي ، و Vd و Vs هي أحجام البطين (محسوبة بأقطار المحور الطويل والقصير للبطين) في المراحل الانبساطية النهائية ونهاية الانقباض ، على التوالي.
بشكل جماعي ، تعرض هذه النتائج استراتيجية جديدة تدمج كلا من علم وظائف الأعضاء والهندسة لتسهيل التصوير الحجمي وتفسير البيانات في نماذج الزرد ، مما يبشر بخير كبير للمضي قدما في استكشاف مورفجيني القلب والميكانيكا.
الشكل 1: جمع بيض الزرد وعملية الحقن المجهري. تتضمن العملية تزاوج الزرد البالغ ، وجمع البيض المخصب ، وإجراء الحقن المجهري الاختياري. أثناء الحقن المجهري ، يتم تحميل الماصة الزجاجية المسحوبة مسبقا بالمواد المطلوبة. يتم محاذاة البيض المخصب في صفوف مستقيمة داخل شقوق قالب الأغاروز ووضعها بشكل عمودي على الإبرة. يتم إجراء الحقن المجهري تحت مراقبة مجهرية مستمرة لكل من البيض وطرف الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية تصوير ورقة الضوء وإعادة بناء صورة 4D. (أ) رسم تخطيطي لهيكل نظام تصوير الألواح الضوئية الداخلي. CL: عدسة أسطوانية. EO: هدف الإثارة. افعل: هدف الكشف. TL: عدسة أنبوب. FL: مرشح. كام: كاميرا sCMOS. (ب) رسم تخطيطي لسمكة الزرد المركبة في أنبوب FEP والمضمنة في الأغاروز. (C) تسلسل صور 2D الخام الملتقطة من يرقة الزرد 4 dpf. تشير الساعة الموجودة في الجزء العلوي الأيسر من كل إطار إلى المرحلة القلبية التي تبدأ من نهاية الانقباض. (د) رسم توضيحي للتزامن بأثر رجعي لتسجيل صورة الزرد 4D. يشير تسلسل الصورة إلى تسجيل مستمر على عمق معين على طول المحور z. يتم تمثيل كل إطار في تسلسل الصورة بنقطة حمراء ، ويتم تمييز مرحلتي البداية والنهاية من الانبساط النهائي إلى الانقباض النهائي في المربع الأصفر. (ه) 4D نماذج القلب المعاد بناؤها من تسلسل الصور 2D. Dpf: أيام بعد الإخصاب. هذا الرقم مقتبس من Zhang et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: لوحة تحكم LabVIEW. (أ) تشمل الإعدادات المستخدمة في لوحة التحكم تكوين الليزر والكاميرا ومسار الصورة ونمط المحرك. (ب) مثال على صورة قلب الزرد الخام التي التقطها برنامج LabVIEW. شريط المقياس: 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: يساعد تتبع الخلايا وتفاعل الواقع الافتراضي في الكشف عن انقباض قلب الزرد. (أ) الخلايا المتعقبة لقلب الزرد Tg(myl7:nucGFP) عند 3 dpf. (ب) توفر منصة الواقع الافتراضي للمستخدمين تجربة مشاهدة غامرة وتفاعلية لنموذج قلب الزرد 4D ، مما يسمح للمرء بتصور وظائف القلب بمرور الوقت من خلال التحليل المحدد من قبل المستخدم. (ج) بعد جمع القياسات من منصة الواقع الافتراضي ، تمت مقارنة تغيرات السرعة والمسافة النسبية خلال دورة قلبية واحدة بين خلايا مختارة عند 3 dpf و 7 dpf. يعرض الشكلان الأولان متوسط تغيرات السرعة في خمس خلايا بطينية وخمس خلايا أذينية ، ويوضح الآخران تغيرات المسافة النسبية بين ثلاث مجموعات من الخلايا ، أي خليتان بطينيتان وخلية بطينية وخلية أذينية وخليتان أذينيتان. (د) تقييمات وظائف القلب ل 3 dpf و 7 dpf قلوب الزرد. تم تتبع ما مجموعه 370 خلية في قلوب الزرد عند 3 dpf ، وتم تتبع 580 خلية في 7 dpf. هذا الرقم مقتبس من Zhang et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | استخدام | المعرف | |
| برامج وخوارزميات مخصصة | |||
| بي إس إف.م | لحساب PSF من قياسات FWHM نتائج حبات مضان. | برنامج ماتلاب | |
| 4D الزرد Imaging.vi | للتحكم في الأجهزة ومزامنتها في نظام LSM. | برنامج لاب فيو | |
| test_Parallel صباحا ، إلخ. | لإعادة بناء صور 4D من تسلسلات الصور 2D. | برنامج ماتلاب | |
| imageDimConverter.m | لإخفاء بيانات الصورة إلى تنسيق محدد لتتبع الخلايا. | برنامج ماتلاب | |
| separateTrackingResults.py | لنشر نتائج تعقب خلية العملية لفصل الخلايا بنفس التسميات. | برنامج بايثون | |
| cellTracking_All.py | لتحديد خلايا ذات كثافة صورة متناسقة عبر جميع وحدات التخزين. | برنامج بايثون | |
| cellLabelsToObj.ipynb | لإنشاء شبكة سطحية لكل خلية فردية من خلال تقطيع 3D. | برنامج بايثون | |
| DynamicHeartModel.cs ، إلخ. | لإنشاء بيئة VR والتفاعل مع الكائنات. | برنامج C # | |
| تصميم الأجهزة حسب الطلب | |||
| 3D المطبوعة غرفة عينة | للاستخدام مع أهداف الغمر في الماء. | تصميم سوليدووركس | |
| حامل عينة مطبوع 3D | للتكيف مع مرحلة العينة وعقد العينة. | تصميم سوليدووركس | |
الجدول 1: جدول الموارد المخصصة. يتم تحميل نماذج الرموز والبيانات إلى Zenodo21.
المناقشة
إن دمج نموذج الزرد مع الأساليب الهندسية يحمل إمكانات هائلة لاستكشاف احتشاء عضلة القلب في الجسم الحي ، وعدم انتظام ضربات القلب ، وعيوب القلب الخلقية. من خلال الاستفادة من شفافيتها البصرية وقدرتها على التجدد والتشابهات الجينية والفسيولوجية مع البشر ، أصبحت أجنة الزرد واليرقات تستخدم على نطاق واسع في البحث1،2،4. إن الدقة الزمانية المكانية الفائقة ، والحد الأدنى من الضرر الضوئي ، وقدرات التقسيم البصري لتصوير ورقة الضوء تميزها عن التحقيق 4D في مورفولوجيا القلب ووظيفة انقباض في يرقات الزرد12،26،27،28. يقدم هذا البروتوكول نهجا شاملا يدمج تصوير ورقة الضوء ، والتزامن بأثر رجعي ، وتتبع الخلايا 3D ، ومنصة الواقع الافتراضي التفاعلي (VR) للتقييمات الكمية. يوفر نقطة دخول لالتقاط وإعادة بناء انقباض القلب ، وتتبع وقياس الديناميات الخلوية ، وتقييم التغيرات الهيكلية والوظيفية والميكانيكية أثناء تطور القلب وتجديده. يمكن أيضا تمكين هذه الطريقة من خلال التصوير الفلوري متعدد القنوات لتتبع أنواع الخلايا والسلالات المختلفة للتحقيق في عدم التجانس الخلوي والتفاعل بين الخلايا. في حين أن انقسام نموذج الزرد عن أنظمة الثدييات وقصره كنموذج حاد يستدعي دراسة متأنية ، فإن التقدم في الهندسة الوراثية قد يسمح بتطوير سلالات الزرد المعدلة وراثيا التي تشبه إلى حد كبير حالات الأمراض البشرية ، وبالتالي تعزيز القيمة الانتقالية للنتائج المستمدة من دراسات الزرد29.
يستخدم هذا التزامن بأثر رجعي على أساس افتراض الدورة القلبية الدورية لإعادة بناء صور الورقة الضوئية لقلب الزرد المنقبض. يتيح تنفيذ هذه الطريقة في تصوير الورقة الضوئية للمرء تصور وتحليل القلب المنقبض بأكثر من 200 مجلد في الثانية. لمواجهة التحدي الذي يشكله الحجم الكبير للبيانات في التحليل الحالي ، تم استخدام الحساب المتوازي مع وحدة المعالجة المركزية متعددة النواة ووحدة معالجة الرسومات ، مما أدى إلى تحسن أكثر من عشرة أضعاف في كفاءة إعادة بناء الصورة. أثناء التزامن بأثر رجعي ، كان من المفترض أن تعود خلايا عضلة القلب إلى مواقعها الأساسية مع كل نبضة قلب. في حين أن هذا الافتراض آمن نسبيا نظرا للتباين المنخفض في ضربات القلب التي شوهدت في الزرد26 كما هو موضح في الأشكال 4C ، إلا أنه يظل تبسيطا قد لا يفسر جميع الفروق الدقيقة البيولوجية. يمكن للابتكارات في التصوير ، مثل التألق الانضغاطي والفحص المجهري للمجال الضوئي ، أن تخفف من الآثار الناجمة عن هذا الافتراض عن طريق تقليل تكرار الشرائح.
لتمكين التحليل المتعمق في نموذج القلب 4D المعقد ، تم تطوير إطار حسابي بما في ذلك كل من تجزئة الخلايا المستندة إلى 3DeeCellTracker ومنصة VR للتحقيقات الموجهة للمستخدم. تسمح القدرات الكامنة في هذا الإطار ، بما في ذلك الكفاءة العالية والتلاعب التفاعلي ، بتحديد التغير في السرعة الخلوية ، والتحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية ، وتقييم ميكانيكا عضلة القلب الإقليمية والعالمية مثل تقصير الكسور ، وجزء القذف ، والإجهاد الإقليمي30 (الشكل 4). لوحظ عدم وجود تقييمات مسبقة لوظيفة قلب الزرد عند 7 dpf ضمن الأدبيات الموجودة. ومع ذلك ، عند مقارنتها بالبيانات عند 3 dpf المقدمة من باحثين آخرين ، فإن النتائج الحالية تتفق مع المؤشرات السابقة لانخفاض كل من الكسر القذفي (EF) والتقصير الجزئي (FS) خلال الفترة من 3 dpf إلى 7 dpf25,31. تمتلك هذه الطرق التحليلية إمكانات كبيرة لتوضيح ديناميكيات القلب في نماذج إصابة القلب لسمك الزرد12،25.
نظرا لأن تقنية وبرامج الواقع الافتراضي تحتوي على ميزات فريدة مثل الرؤية المجسمة والتسجيل التلقائي لمواقع الخلايا ، فإن هذه المنصة تسمح بطريقة غامرة ومبسطة لاختيار خلايا معينة وتحليل مسارها طوال دورة القلب. يوفر استخدام الواقع الافتراضي طريقة بديهية لأداء المهام المعقدة مثل تجزئة الخلايا والتعليقات التوضيحية ، بكفاءة ودقة أكبر32،33،34. كما أنه يدعم العديد من المستخدمين لاستخدام أدوات فريدة عند العمل معا على مجموعات بيانات كبيرة ومعقدة34. على الرغم من أن استخدام الواقع الافتراضي لفترات طويلة قد يؤدي إلى آثار جانبية مثل الدوخة ، إلا أنه يمكن التخفيف من ذلك من خلال تحسين التصميمات المريحة وسماعات الرأس غير المربوطة. علاوة على ذلك ، لمعالجة القوة الحسابية الكبيرة المطلوبة لتقديم الهياكل البيولوجية المعقدة في الوقت الفعلي ، فإن تحسين البرامج للمعالجة الفورية والاستفادة من حلول الحوسبة القائمة على السحابة يمكن أن يعزز قدرة النظام على إدارة التصورات المعقدة.
مع استمرار تقدم الأجهزة وقوة الحساب ، يمكن توسيع هذه الاستراتيجية للتحقيق في عدم انتظام ضربات القلب في عضلة القلب على المستويين الخلوي والأنسجة ، مما يؤدي في النهاية إلى الكشف عن الآلية الأساسية لتشكل القلب ودفع تطوير التدخلات العلاجية.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
نعرب عن امتناننا للدكتورة كارولين بيرنز في مستشفى بوسطن للأطفال لمشاركتها بسخاء أسماك الزرد المعدلة وراثيا. نشكر السيدة إليزابيث إيبانيز على مساعدتها في تربية الزرد في UT Dallas. كما نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>RESOURCE | SOURCE / Reference | IDENTIFIER | |
| Animal Models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) سمكة الزرد المعدلة وراثيا | مختبر الحروق في مستشفى بوسطن للأطفال | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| البرمجيات و خوارزميات | |||
| MATLAB | و MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| شركة يونيتي | يونيتي للبرمجيات | 2020.3.2f1 | |
| أميرة | ثيرمو فيشر Scientific | 2021.2 | |
| قطاعة ثلاثية الأبعاد | أندريه فيدوروف وآخرون17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Cylinderdrical Lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X هدف الإضاءة | نيكون | MRH00045 | |
| 20X هدف الكشف | أوليمبوس | 1-U2M585 | |
| sCMOS كاميرا | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| XYZ الآلية | Thorlabs | PT3 / M-Z8 | |
| مرحلة الإمالة ثنائية المحور | Thorlabs | GN2 / M | |
| محرك متدرج دوران | بولولو | 1474 | |
| حبات الفلورسنت | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS ليزر | Laserglow | R531003FX < | |
| قوي > حاقن دقيق ومضخة فراغ < / قوي > | |||
| حاقن دقيق | WPI | PV850 | |
| مضخة فراغ | Welch | 2522B-01 | |
| ماصات زجاجية مسحوبة مسبقا | WPI | TIP10LT | |
| طرف شعري لتحميل هلام | Bio-Rad | 2239912 | |
| > أجهزة الواقع الافتراضي < / قوية > | |||
| VR سماعة | رأس Meta | Quest 2 | |
| 30mg / L حل PTU< / قوي> | |||
| حل عمل PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 | - | ||
| <قوي > 1٪ Agarose < / قوي > | - | ||
| الذوبان | Thermo Fisher | 16520050 | |
| ماء منزوع الأيونات | - | ||
| <قوي > 10 جم / لتر محلول مخزون التريكايين < / قوي> | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| ماء منزوع الأيونات | - | ||
| بيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| < قوي > 150 مجم / لتر محلول عمل Tricaine < / قوي > | |||
| 10 جم / لتر محلول مخزون Tricaine | - | ||
| منزوع الأيونات الماء | - | ||
| <قوي>60X E3 محلول مخزون< / قوي > | |||
| كلوريد الصوديوم | (LARC) ، جامعة تكساس في دالاس | كلوريد | |
| كلوريد | الصوديوم كلوريد الصوديوم ثنائي | ||
| هيدرات | الكالسيوم-CaCL | sub>2 < / sub>x 2H2< / sub>O | |
| كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات-MgSO | sub>4 < / sub>x 7H2< / sub>O | ||
| RO Water | - | ||
| حل عمل <قوي>1X E3< / قوي > | |||
| 60X E3 حل | مختبر الموارد الحيوانية (LARC) ، جامعة تكساس في دالاس | - | |
| RO Water | - | ||
| 1٪ ميثيلين بلو (اختياري) ؛ | - | C16H18ClN3S |
المراجع
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ. Res. 110 (6), 870(2012).
- Ding, Y., Bu, H., Xu, X. Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine. Front. Physiol. 11, 599244(2020).
- Giardoglou, P., Beis, D. On zebrafish disease models and matters of the heart. Biomedicines. 7 (1), 15(2019).
- Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational analysis of cardiac contractile function. Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227(2015).
- Vedula, V., et al. A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling. PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828(2017).
- Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).
- Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).
- Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
- Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J. Biophotonics. 16 (5), e202200278(2023).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7 (2), 026112(2023).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. Eugene. , University of Oregon Press. (2000).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. 25, e1115(2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J. Opt. 20 (5), 053002(2018).
- Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
- Messerschmidt, V., et al. Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart. J Vis Exp. 138, e57763(2018).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Zhang, X., et al. 4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae. Zenodo. , (2023).
- Wen, C., et al. 3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images. Elife. 10, e59187(2021).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Fedorov, A., et al. 3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
- Naderi, A. M., et al. Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos. Comput. Biol. Med. 135, 104565(2021).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3 (16), e121396(2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).
- Coelho-Filho, O. R., et al. Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling. Circulation. 128 (11), 1225(2013).
- Zhang, B., et al. Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning. Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291(2021).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), e97180(2017).
- Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. Virtual reality for interactive medical analysis. Front. Virtual Real. 3, 782854(2022).
- Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).
إعادة الطباعة والأذونات
