يعد استكشاف السلوك الخلوي تحت الضغط الميكانيكي أمرا محوريا للتقدم في الميكانيكا الخلوية وعلم الأحياء الميكانيكي. نقدم تقنية شفط الماصة الدقيقة الفلورية (fMPA) ، وهي طريقة جديدة تجمع بين التحفيز الميكانيكي المتحكم فيه والتحليل الشامل للإشارات داخل الخلايا في الخلايا المفردة. تبحث هذه التقنية في دراسات متعمقة جديدة لعلم الأحياء الميكانيكية للخلايا الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسة شفط ميكروماصة مضان للتحقيق في ميكانوسن خلايا الدم الحمراء
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لطالما كانت فحوصات شفط الماصة الدقيقة حجر الزاوية في التحقيق في ميكانيكا الخلايا الحية ، حيث تقدم رؤى حول الاستجابات الخلوية للإجهاد الميكانيكي. توضح هذه الورقة بالتفصيل تكيفا مبتكرا لمقايسة شفط الماصة الدقيقة المقترنة بالفلورة (fMPA). يقدم اختبار fMPA القدرة على إدارة قوى ميكانيكية دقيقة مع مراقبة عمليات النقل الميكانيكي للخلايا الحية بوساطة القنوات الأيونية في نفس الوقت. يشتمل الإعداد المتطور على ماصة دقيقة من زجاج البورسليكات المصمم بدقة ومتصلة بخزان مياه منظم بدقة ونظام شفط هوائي ، مما يسهل تطبيق الضغط المتحكم فيه بزيادات تصل إلى ± 1 مم زئبق. ومن التحسينات المهمة دمج التصوير الفلوري الوهمي ، مما يسمح بالمراقبة المتزامنة والقياس الكمي للتغيرات المورفولوجية للخلايا وتدفقات الكالسيوم داخل الخلايا أثناء الشفط. يضع اختبار fMPA ، من خلال مزيجه التآزري من التصوير الفلوري epi-fluorescence مع شفط الماصة الدقيقة ، معيارا جديدا لدراسة الاستشعار الميكانيكي للخلايا في البيئات الصعبة ميكانيكيا. هذا النهج متعدد الأوجه قابل للتكيف مع الإعدادات التجريبية المختلفة ، مما يوفر رؤى نقدية حول آليات الاستشعار الميكانيكي أحادية الخلية.
المقدمة
أبرزت الاكتشافات التي تتكشف في عالم السلوكيات الخلوية دور المحفزات الميكانيكية ، مثل التوتر ، وإجهاد قص السوائل ، والضغط ، وصلابة الركيزة ، في إملاء الأنشطة الخلوية الديناميكية مثل الالتصاق والهجرة والتمايز. هذه الجوانب الميكانيكية البيولوجية لها أهمية قصوى في توضيح كيفية تفاعل الخلايا مع بيئاتها الفسيولوجية والاستجابة لها ، مما يؤثر على العمليات البيولوجية المختلفة 1,2.
على مدى العقد الماضي ، برزت مقايسات الشفط القائمة على الماصة الدقيقة كأداة متعددة الاستخدامات في دراسة الاستجابات الخلوية المتنوعة للمنبهات الميكانيكية. تقدم هذه التقنية رؤى قيمة حول الخصائص الميكانيكية الجوهرية للخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة سيدني وقد تمت الموافقة عليها. تم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة لهذه الدراسة.
1. عزل كرات الدم الحمراء البشرية
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة 1.1 من قبل أخصائي فصد مدرب باستخدام بروتوكول تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية.
- اسحب 5 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط باستخدام إبرة فراشة 19 جرام.
- نقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1: 200 إينوكسابارين لمنع التخثر.
- تمييع 5 ميكرولتر من الدم المضاد للتخثر enoxaparin في 1 مل من المخزن المؤقت للكربونات / البيكربونا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإنشاء مقايسات شفط الماصة الدقيقة ، قمنا أولا ببناء غرفة خلية مخصصة تتكون من مربعين معدنيين (نحاس / ألومنيوم) متصلين بمقبض. تم لصق غطاءين زجاجيين من القطع الثالث (40 مم × 7 مم × 0.17 مم) لإنشاء غرفة مليئة ب 200 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعلقة في Tyrode's Buffer. بعد إدخال كرات الدم الحمراء في الغرفة ، تم تثبيت ماصة ميكروسيليكات البورسليكات المصممة خصيصا على حامل ووضعها بعناية داخل الغرفة باستخدام مناور دقيق. في وقت لاحق ، تم تقريب micropipette لالتقاط RBC الهدف.
بالنسبة لشفط الخلايا ، اس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تجسد فحوصات شفط الماصة الدقيقة منهجية محسنة ، حيث تنشر تعديلا كبيرا للضغط ، وتنسيقا مكانيا دقيقا ، وتمييزا زمنيا موثوقا به لاستكشاف التعقيدات العميقة للميكانيكا الحيوية الخلوية. تركز هذه الدراسة بشكل خاص على تطبيق fMPA كأداة حاسمة للكشف عن الاستجابات الدقيقة الحساسة للميكانيكا التي أظهرتها كرات الدم الحمراء في ظل محفزات مختلفة. مكن الاستخدام المتزامن لإشارات برايت فيلد ومضان من استكشاف متعدد الأوجه للظواهر الخلوية ، مما أدى إلى تعزيز مراقبة واكتشاف تدفق الكالسيوم داخل الخلايا في الوقت الفعلي. يوفر هذا النهج نظرة تكاملية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة للإبلاغ عنها فيما يتعلق بهذه الدراسة.
شكر وتقدير
نشكر نور عائشة زين العابدين ولورا مولدوفان على تجنيد متبرعين إضافيين وجمع الدم ودعم الفصد. نشكر توماس أندرسون وأريان ناصر على تنظيم المعدات والكواشف. تم تمويل هذا البحث من قبل مشروع اكتشاف مجلس البحوث الأسترالي (ARC) (DP200101970-L. أ. ج.) ؛ المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا منحة الأفكار (APP2003904-L. أ. ج.) ؛ منحة معدات NHMRC - L.A.J. ؛ برنامج بناء قدرات القلب والأوعية الدموية في نيو ساوث ويلز (منحة الباحث في وقت مبكر من منتصف الحياة المهنية) ؛ منحة الابتكار البحثي NSW CVRN-VCCRI ؛ مكتب المشاركة العالمية والبحثية (جائزة التعاون في شراكة سيدني - غلاسكو - L.A.J.) ؛ LAJ هو زميل قائد المستقبل لمؤسسة القلب الوطنية المستوى 2 (105863) ، وزميل مؤسسة أبح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ومايكرو. مدير | مايكرو مدير | الإصدار 2.0.0 | |
| 1 مل حقنة | Terumo | 210320D | التعاون مع Microfil ؛ |
| 200 وميكرو ؛ L ماصة | Eppendorf | 3123000055 | تحضير خلية العبثة الحمراء |
| 22 × 40 مم غطاء زلات | التريكو ؛ | MS0014 | مجموعة غرفة الخلية |
| 50 مل حقنة | Terumo | 220617E | قم بتوصيل برج المياه |
| كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's & nbsp; تحضير العازلة - 12 ملي مولار NaHCO3< / sub> ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.137 M كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 5.5 ملي مولار D-glucose مكملا ب 1 ملي مولار CaCl 2< / sub>. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| جهاز طرد مركزي 5425 | Eppendorf ؛ | 5405000280 | تحضير خلايا العبسة الحمراء |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | لمنع تخثر الدم الذي تم جمعه. 10,000 U / مل |
| DAQami | الدؤوب | ||
| مصدر الضوء الفلوري | CoolLED | pE-300 | أجهزة الشفط Micropipette |
| الشعرية الزجاجية | Narishige | G-1 | تصنيع |
| للجلوكوز | سيجما-ألدريتش | G8270 | Tryode's & nbsp; - 12 ملي مولار NaHCO3< / sub> ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.137 M كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 5.5 ملي مولار D-glucose مكمل ب 1 ملي مولار CaCl 2< / sub>. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| تحضير المخزن المؤقت Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's - 12 ملي مولار NaHCO3< / sub> ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.137 M كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 5.5 ملي مولار D-glucose مكمل ب 1 ملي مولار CaCl 2< / sub>. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| كاميرا GigE عالية السرعة | Manta | G-040B | نظام أجهزة الشفط Micropipette |
| مشبك الضغط عالي السرعة | أداة علمية | HSPC-2-SB | التعاون مع مضخة الضغط |
| مرحلة رأس المشبك عالي السرعة ؛ | الأداة العلمية | HSPC-2-SB | التعاون مع مضخة الضغط |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | أوليمبوس | Olympus IX83 | Micropipette نظام أجهزة الشفط |
| Microfil | الدقيقة العالمية | MF34G-5 | 34 جم (67 مم) قم بإلغاء فقاعة الهواء في الماصة الدقيقة المقطوعة واختبار فتحة طرف الماصة ؛ |
| مجتذب الماصة الدقيقة | أداة Sutter | P1000 | تصنيع الماصات الدقيقة |
| نظام تنقية المياه Milli Q EQ 7000 Merck | Millipore | ZEQ7000T0C | كربونات / بيكربونات عازلة & Tryode المخزن المؤقت إعداد |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | دقيقة تصنيع |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's تحضير العازلة - 12 ملي مولار NaHCO3 و 10 ملي مولار HEPES و 0.137 M كلوريد الصوديوم و 2.7 ملي كلوريد كلوريد البوتاسيوم و 5.5 ملي مولار D-glucose مكملا ب 1 ملي مولار CaCl 2< / sub>. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| مضخة ضغط ؛ | الأداة العلمية | PV-PUMP | تحفيز الضغط المتحكم فيه أثناء التجربة |
| Prime 95B Camera | القياسات الضوئية | Prime 95B sCMOS | Flourscent التصوير |
| وحدة التحكم عن بعد للعجلة الدوارة | Sensapex | تحكم uM-RM3 | لضبط موضع الماصة الدقيقة |
| صولجان 3.0 عداد الخلايا | Merck Millipore | PHCC340KIT | عداد الخلايا الأوتوماتيكي |
| بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) | Sigma-Aldrich | S5761 | تحضير عازلة كربونات / بيكربونات - 2.65 جم من NaHCO3< / sub> مع 2.1 جم من Na2< / sub>CO3< / sub> في 250 مل من ماء Mili Q - الرقم الهيدروجيني النهائي = 8-9. |
| كربونات الصوديوم (Na 2< / sub>CO3< / sub>) | Sigma-Aldrich | S2127 | تحضير عازلة كربونات / بيكربونات - 2.65 جم من NaHCO3< / sub> مع 2.1 جم من Na2< / sub>CO3< / sub> في 250 مل من ماء Mili Q - الرقم الهيدروجيني النهائي = 8-9. |
| تحضير عازلة كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | سيجما-ألدريتش | S7653 | Tryode's - 12 ملي مولار من كلوريد الصوديوم < الفرعي >3< / فرعي > ، 10 ملي مولار هيبس ، 0.137 م كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 5.5 ملي مولار د-جلوكوز مكمل ب 1 ملي مولار كلور المكالسيوم < الفرعي >2< / فرعي >. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدرات (NaH2< / sub>PO4< / sub> & H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's تحضير العازلة - 12 ملي مولار NaHCO3 ، 10 ملي مولار HEPES ، 0.137 M كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 5.5 ملي مولار د-جلوكوز مكمل ب 1 ملي مولار كالوريد المكالس < > 2 < / فرعي >. الرقم الهيدروجيني النهائي = 7.2 |
| وحدة التحكم بشاشة تعمل باللمس | Sensapex | uM-TSC | لضبط موضع الماصة الدقيقة ؛ |
| X الهدف الجاف | أوليمبوس | Olympus 60x / 0.70 LUCPlanFL | Micropipette |
المراجع
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
