لدراسة سلوكيات الطيران في سياق مخيف ، نقدم بروتوكول تكييف الخوف المعدل. يضمن هذا البروتوكول أن الفئران تظهر باستمرار سلوكيات الطيران أثناء عرض الإشارات في تكييف الخوف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تعديل تكييف الخوف للحث على سلوكيات الطيران في الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
المظهر المناسب للسلوك الدفاعي في موقف التهديد أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. تشير النظرية السائدة إلى أن السلوك الدفاعي النشط ، مثل القفز أو الاندفاع السريع ، يتم التعبير عنه في ظل تهديد وشيك أو تهديد فعلي ، في حين يتم التعبير عن السلوك الدفاعي السلبي ، مثل التجميد ، عندما يتم التنبؤ بالتهديد ، ولكن التهديد الوشيك منخفض نسبيا. في تكييف الخوف الكلاسيكي ، يظهر الأشخاص عادة التجميد كاستجابة دفاعية مشروطة ، مع القليل من التعبير عن السلوك الدفاعي النشط في معظم الحالات. هنا ، نقدم إجراء تكييف الخوف المعدل للفئران لمراقبة الانتقال من التجمد إلى الطيران والعكس صحيح ، بما في ذلك خمسة أزواج متكررة من المحفزات المكيفة (CS ؛ نغمة مستمرة ، 8 كيلو هرتز ، 95 ديسيبل SPL (مستويات ضغط الصوت)) ومحفزات غير مشروطة (الولايات المتحدة ؛ صدمة القدم ، 0.9 مللي أمبير ، 1.0 ثانية) على مدار يومين. يتطلب إجراء تكييف الخوف المعدل هذا عددا كبيرا نسبيا من جلسات التكييف وأيام التكييف ولكنه لا يتطلب صدمة قدم عالية الكثافة للتعبير المتواضع عن سلوك الطيران. يعد استخدام نفس السياق للتكييف وعروض CS البارزة أمرا ضروريا لاستنباط سلوكيات الطيران. يعد إجراء تكييف الخوف المعدل هذا طريقة موثوقة لمراقبة السلوكيات الدفاعية النشطة في الفئران ، مما يوفر فرصة لتوضيح الآليات والخصائص الدقيقة لمثل هذه السلوكيات في سياق مخيف.
المقدمة
الاختيار المناسب للسلوكيات الدفاعية في ظل ظروف مهددة أمر بالغ الأهمية لبقاء جميع. تتحول السلوكيات الدفاعية تدريجيا من واحد إلى آخر بناء على قرب التهديد ، مثل الانتقال بين سلوكيات التجميد والطيران1،2،3. غالبا ما يتم ملاحظة عدم تنظيم هذه السلوكيات في الاضطرابات العقلية المختلفة4. اضطراب ما بعد الصدمة (PTSD) هو أحد هذه الاضطرابات التي تتميز بسلوكيات دفاعية مبالغ فيها ، مثل استجابات الذعر للمنبهات غير المهددة4.
يشيع استخدام تكييف الخوف الكلاسيكي في القوارض كنموذج لاضطراب ما بعد الصدمة5،6،7 ، لكن القوارض لا تعبر عن سلوكيات الطيران (الشبيهة بالذعر) في هذا النموذج8. وبالتالي ، فإن نموذج تكييف الخوف الكلاسيكي ، الذي يشار إليه غالبا باسم "نموذج اضطراب ما بعد الصدمة للقوارض" ، يفتقر إلى صلاحية الوجه لاضطراب ما بعد الصدمة لدى البشر ، لا سيما في التقاط أعراض الطيران أو الذعر ، والتي لم تتم دراستها جيدا.
في الآونة الأخيرة ، أثبتت العديد من بروتوكولات تكييف الخوف المعدلة بنجاح أن الأشخاص القوارض يظهرون سلوك طيران أثناء هذه الإجراءات. على سبيل المثال ، سمحت الارتباطات المتكررة لمحفز مشروط (CS) ومحفز غير مشروط (الولايات المتحدة) سبع مرات في اليوم لإناث الفئران بإظهار سلوكيات جريئة مشابهة لسلوكيات الطيران9. في تكييفات الخوف لمدة يومين باستخدام محفزات المركبات التسلسلية (SCS ؛ تتكون من نغمة متبوعة بالضوضاء) ، بدأت الفئران في إظهار سلوكيات الطيران أثناء جزء الضوضاء من عروض SCS10،11،12. ويرد الوصف التفصيلي لطريقة SCS في تقرير البروتوكول13. كما عمل تكييف الخوف لمدة ثلاثة أيام مع SCS للفئران للحث على سلوكيات الطيران14. ومع ذلك ، فإن هذه البروتوكولات الجديدة لها بعض القيود. على سبيل المثال ، لا يسمح استخدام عرض الإشارات التسلسلية باستبعاد تأثير تقدير القرب على السلوك الدفاعي. في حالة ارتباط CS-US سبع مرات في الفئران ، لوحظت غالبية استجابات الطيران في الإناث بدلا من الذكور.
في ضوء هذه الاعتبارات ، نقدم بروتوكول تكييف الخوف المعدل للفئران للتحقيق في سلوكيات الطيران في سياق مخيف. تظهر الفئران الذكور باستمرار سلوك الطيران أثناء تكييف الخوف المعدل. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام النغمة البارزة ك CS بدلا من SCS. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم ما لا يقل عن خمسة أزواج من CS-US في يوم واحد لمدة يومين على الأقل ، إلى جانب تقوية الخوف من خلال السياق المشروط. يوفر البروتوكول خيارا آخر للتحقيق في سلوكيات الطيران ، مكملا للبروتوكولات السابقة ، اعتمادا على الغرض من البحث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للجمعية الفسيولوجية اليابانية وحصل على موافقة من لجنة رعاية بجامعة كانازاوا الطبية (2021-32). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإرشادات ARRIVE. تم استخدام ذكور الفئران البالغة C57BL / 6J (3-6 أشهر) للدراسة ، وتم التأكيد سابقا على أن هذه الفئران أظهرت سلوكيات الطيران الموصوفة في هذه المخطوطة15.
1. إعداد
- فئران منزلية جماعية (3-4 لكل قفص ؛ يتم الحفاظ عليها عند 23-27 درجة مئوية ؛ تحت دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ؛ توفر الوصول إلى الطعام والماء) حتى بداية التجارب.
- ضع كل فأر بشكل فردي في قفص زجاجي (14 سم × 21 سم × 12 سم) لمدة 3 أيام على الأقل قبل الخضوع لتكييف الخوف المعدل هذا.
2. إعداد الأدوات / المعدات
- صندوق تكييف الخوف (الشكل 1 أ)
- استخدم غرفة تكييف الخوف (25 سم × 25 سم × 25 سم) محاطة بصندوق مخفف للصوت (67 سم × 53 سم × 55 سم) (انظر جدول المواد).
- هناك حاجة إلى سياقين (A و B). بالنسبة للسياق أ ، قم بإنشاء خطوط سوداء وبيضاء على الجدران عن طريق ربط الورق المقوى البلاستيكي الأبيض بأشرطة سوداء (عرض 3 سم ، 4 على لوح). استخدم لوحا بلاستيكيا أبيض ناعما للأرضية.
- امسح الجدران والأرضية باستخدام Heptanol (1٪) قبل كل جلسة.
ملاحظة: لا يتم استخدام نظام تهوية نشط. التنظيف بالكحول في نهاية الجلسة يقلل من رائحة السباعي. - بالنسبة للسياق (ب)، اجعل مظهر الجدران أسود بالكامل عن طريق إزالة اللوحة المستخدمة في السياق (أ). الأرضية عبارة عن أرضية شبكية.
ملاحظة: لا يتم تقديم رائحة محددة بخلاف رائحة الكحول الخفيفة للتنظيف. - قم بإضاءة الصندوق التجريبي باستخدام صمام ثنائي باعث للضوء الأبيض العلوي (LED ، 240 لوكس) (انظر جدول المواد).
- اثاره
- قم بتوصيل جهاز صدم التدافع (انظر جدول المواد) بأرضية شبكية مكونة من قضبان من الفولاذ المقاوم للصدأ. يستخدم هذا لتوفير صدمات القدم. تم تحديد شدة صدمة القدم عند 0.9 مللي أمبير باتباع الطرق الشائعة لتكييف الخوف10،11،12،13.
- مولد الصوت
- ضع مكبر صوت (انظر جدول المواد) على السقف. يتم تضخيم جميع المحفزات الصوتية.
- قم بتعديل ومعايرة السعة الإجمالية لكل محفز رقميا للحصول على مستويات ضغط الصوت (SPL ، إعادة: 20 μ باسكال) في مقدمة السماعة مقاس 5 سم باستخدام ميكروفون مقاس 1/4 بوصة. قدم نغمة مستمرة تنفجر من خلال هذه السماعة.
ملاحظة: تعد معايرة مكبر الصوت أمرا بالغ الأهمية لفحص التأثير الدقيق للتحفيز الصوتي على السلوكيات الدفاعية أثناء تكييف الخوف المعدل هذا.
- محول
- ضع أرضية غرفة الاختبار على محول طاقة (انظر جدول المواد) للكشف عن الاهتزاز. يتم إرسال الإشارة من محول الطاقة إلى بطاقة صوت بتردد أخذ عينات 8 كيلو هرتز لتسجيل الاهتزازات السلوكية.
- كاميرا فيديو
- ضع كاميرا CMOS (انظر جدول المواد) على السقف لتتبع حركات الهدف وتسجيل الصوت في صندوق التكييف.
- نظام التشغيل
- استخدم برنامج الصوت (انظر جدول المواد) لتشغيل النغمات أو صدمات القدم في الأوقات المجدولة.
ملاحظة: أي محفز متاح تجاريا سيعمل لهذا الغرض.
- استخدم برنامج الصوت (انظر جدول المواد) لتشغيل النغمات أو صدمات القدم في الأوقات المجدولة.
3. التجربة السلوكية
- خطط لأربعة أيام من إجراءات تكييف الخوف: التعود (يوم واحد ، 5 تجارب) ، التكييف (يومان ، 5 تجارب لكل منهما) ، وجلسات الاختبار / الانقراض (يوم واحد أو 5 أو 15 تجربة). تراوحت الفواصل الزمنية بين 60-75 ثانية (الشكل 1 ب).
ملاحظة: يفضل تضمين عشرة أشخاص أو أكثر في مجموعة للحصول على ميول سلوكية موثوقة. مطلوب مجموعتان أو ثلاث مجموعات حسب الغرض من الدراسة.- أثناء جلسة التكييف ، قدم التحفيز غير المشروط (الولايات المتحدة) (1 ثانية ، 0.9 مللي أمبير) مباشرة بعد انتهاء التحفيز المشروط (CS) (انفجار نغمة مستمر ، 8 كيلو هرتز ، 20 ثانية ، 95 ديسيبل SPL) كما هو موضح في الشكل 1B. قدم خمسة أزواج من CS-US في يوم التكييف.
- بعد انتهاء صدمة القدم 5 ، اترك الموضوع في السياق لمدة 1 دقيقة قبل إعادته إلى قفص المنزل. امسح الغرفة بنسبة 70٪ كحول للتنظيف بعد كل اختبار سلوكي.
ملاحظة: يمكن تعديل CS وكثافة الولايات المتحدة اعتمادا على الغرض من الدراسة. أظهرت التقارير السابقة أن كثافة CS الأقوى تؤدي إلى سلوكيات دفاعية أكثر نشاطا من السلوكيات الأكثر ليونة15. يمكن أيضا تمديد أيام التكييف.
- حث سلوكيات الطيران أثناء عروض CS باتباع الجدول الزمني المذكور أدناه.
ملاحظة: يتم استخدام CS (95 ديسيبل SPL) والولايات المتحدة (0.9 مللي أمبير) في هذه التجربة.- في اليوم 1 ، قم بتعريض الأشخاص ل 5 تجارب CS وحدها في السياق A.
- في اليومين 2 و 3 ، يخضع الأشخاص الذين لديهم 5 تجارب ارتباط CS-US في السياق B.
- في اليوم 4 ، قم بتعريض الأشخاص ل 5 تجارب CS وحدها لجلسة الاستدعاء في السياق B. في حالة اختبار انقراض الذاكرة ، قم بتعريض الأشخاص ل 15 تجربة CS وحدها.
ملاحظة: لاختبار استقرار الذاكرة ، سيساعد تمديد جلسات الانقراض لمدة 2-3 أيام. أيضا ، يمكن أن يوفر اختبار الذاكرة بعد أسبوع واحد بدلا من اليوم 4 تأكيدا إضافيا لاستقرار الذاكرة.
4. تحليل السلوكيات الدفاعية
ملاحظة: يتم تحليل الحركة والنسبة المئوية للتجمد وعدد القفزات أثناء عروض CS. التفاصيل موصوفة أدناه. إذا كان ذلك ممكنا ، فإن التحليل بطريقة مزدوجة التعمية سيكون أفضل.
- مزامنة توقيت الأحداث في الفيديو وتوقيتات المحفزات (CS والولايات المتحدة) باستخدام بداية النغمة المسجلة في الفيديو.
- استخدم رمزا مخصصا لحساب كل من الحركات المتوسطة والكلية للفئران بناء على الاختلاف في مركز كتلة صورة ظلية الموضوع عبر الإطارات.
ملاحظة: يتم استخدام وحدة عشوائية لهذا القياس لأن سرعة الحركة تعتمد على معدل أخذ العينات للفيلم. - لقياس النسبة المئوية للتجميد ، استخدم إشارة محول الطاقة في الوقت المناسب.
- إشارات محول الطاقة قبل المعالجة باستخدام مرشح تمرير النطاق 20-500 هرتز.
- احسب جذر متوسط السعة التربيعية لإشارة محول الطاقة في الوقت المناسب لكل حاوية 50 مللي ثانية.
- حدد عتبة لسعة الإشارة لاكتشاف فترة الجمود. مدة الجمود هي فترة الإشارة أقل من العتبة لأكثر من 1 ثانية.
- قم بقياس مدة التجميد يدويا من خلال مشاهدة الفيديو.
- اضبط عتبة سعة الإشارة للتجميد من خلال مقارنة النسبة المئوية المقاسة يدويا للتجمد والنسبة المئوية المحسوبة من إشارة محول الطاقة.
- احسب عدد القفزات يدويا من ملفات الفيديو.
ملاحظة: سيكون حساب عدد السهام مفيدا أيضا في تقييم استجابة الرحلة.
5. التحليل الإحصائي
- اضبط الدلالة الإحصائية على p < 0.05.
- لإجراء مقارنات بين مجموعات متعددة وعوامل متعددة ، قم بإجراء ANOVA متعدد الاتجاهات متبوعا باختبارات ما بعد التخصيص. إذا تم اختبار يوم محدد من جدول التكييف ، فقم بإجراء اختبارات مقارنة متعددة أو اختبارات التقليب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم عرض النتائج التي تم الحصول عليها مع تكييف الخوف المعدل في الفئران الذكور (C57BL / 6J ؛ 3-6 أشهر من العمر) ، وفقا للجدول الموضح في الشكل 1C. تم تصميم التجربة للتحقيق في كيفية تأثير السياق المشروط على التعبير عن سلوكيات الطيران. تم تعيين مجموعتين: المجموعة 1 (ن = 10) والمجموعة 2 (ن = 10). تم استخدام CS (95 ديسيبل SPL) والولايات المتحدة (0.9 مللي أمبير) في هذه التجربة.
في اليوم 1 ، خضعت جميع الفئران للتعرض ل 5 تجارب تحفيز مشروطة (CS) وحدها في السياق أ. بعد ذلك ، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد بروتوكول تكييف الخوف المعدل الذي تم تقديمه في هذه المقالة طريقة مستقرة للتحقيق في سلوكيات الطيران في سياق مخيف. من خلال استخدام هذا البروتوكول ، وجدنا أن سلوكيات الطيران للفئران في السياق المخيف يتم تشغيلها بواسطة محفزات بارزة وتعتمد على السياق. لم يتم التحقيق جيدا في خصائص سلوك الطيران ، حيث لم يكن هناك بروتوكول مناسب لمراقبة سلوكيات الطيران. سيكون هذا البروتوكول أحد الطرق المناسبة لدراسة السلوكيات الدفاعية النشطة في سياق مخيف.
في الآونة الأخيرة ، تم إدخال العديد من البروتوكولات بالإضافة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل KAKENHI Grants JP22K15795 (إلى TF) ، JP22K09734 (إلى NK) ، JP21K07489 (إلى RY) ، جامعة كانازاوا الطبية (C2022-3 ، D2021-4 ، إلى R.Y.) ومؤسسة نايتو (إلى T.F.).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مكبر الصوت | Fostex | FT17H | |
| مكبر للصوت | سوني | TA-F500 | |
| CMOS كاميرا | Sanwa Supply Inc. | CMS-V43BK | |
| غرفة تكييف الخوف | Panlab SLU | LE116 | |
| كريات الغذاء | Nosan | Labo MR القياسية | |
| LED | Yamazen | LT-B05N | |
| ميكروفون | ACO | نوع 4156N | |
| صدمة التدافع | Panlab SLU | LE 100-26 | |
| بطاقة الصوت | Behringer | UMC202 | |
| برنامج الصوت | Syntrillium Software | Cool Edit 2000 | |
| محول الطاقة | Panlab SLU | 111 |
المراجع
- Fanselow, M. S., Lester, L. S. Evolution and learning. , Psychology Press. 185-212 (1988).
- Fanselow, M. S. Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear. Psychonomic Bulletin & Review. 1 (4), 429-438 (1994).
- Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits. Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).
- Black, D. W., Grant, J. E. Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders. American Psychiatric Pub. , (2014).
- Bienvenu, T. C., et al. The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research. Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).
- Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd. Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).
- Yehuda, R., Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd. Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).
- Ledoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).
- Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats. Elife. 4, e11352(2015).
- Fadok, J. P., et al. A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses. Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).
- Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli. Elife. 9, e53803(2020).
- Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice. Elife. 11, e75663(2022).
- Borkar, C. D., Fadok, J. P. A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior. Journal of Visualized Experiments. 167, e61536(2021).
- Totty, M. S., et al. Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats. Scientific Reports. 11 (1), 8215(2021).
- Furuyama, T., et al. Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning. Scientific Reports. 13 (1), 10402(2023).
- Cain, C. K. Avoidance problems reconsidered. Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).
- Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm. Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).
- Bouchekioua, Y., et al. Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning. Translational Psychiatry. 12 (1), 58(2022).
- Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice. Bio-Protocol. 12 (23), e4568(2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice
Posted by JoVE Editors on 5/17/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66266
الوسوم
