التكيف في أقصى درجات الحياة: التطور التجريبي مع الأركيون المتطرف Sulfolobus acidocaldarius

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكول تطور تجريبي للتكيف في المحبة للحرارة باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة كحاضنات. يتم توضيح هذه التقنية من خلال توصيف التكيف مع درجة الحرارة في Sulfolobus acidocaldarius ، وهو أثري بدرجة حرارة نمو مثالية تبلغ 75 درجة مئوية.

الملخص

برز الأركيون Sulfolobus acidocaldarius كنظام نموذجي واعد للحرارة. يعد التحقيق في كيفية تكيف المحبة للحرارة مع درجات الحرارة المتغيرة مطلبا رئيسيا ، ليس فقط لفهم العمليات التطورية الأساسية ولكن أيضا لتطوير S. acidocaldarius كهيكل للهندسة الحيوية. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام إجراء التطور التجريبي مع المحبة للحرارة في تكلفة صيانة المعدات واستخدام الطاقة للحاضنات التقليدية للنمو في درجات الحرارة العالية. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي شامل لإجراء التطور التجريبي في S. acidocaldarius ، باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة. يتضمن البروتوكول تقنية استزراع دفعي بأحجام صغيرة نسبيا (1.5 مل) ، مما يتيح تتبع التكيف في سلالات مستقلة متعددة. هذه الطريقة قابلة للتطوير بسهولة من خلال استخدام خلاطات حرارية إضافية. مثل هذا النهج يزيد من إمكانية الوصول إلى S. acidocaldarius كنظام نموذجي عن طريق تقليل كل من الاستثمار الأولي والتكاليف الجارية المرتبطة بالتحقيقات التجريبية. علاوة على ذلك ، يمكن نقل هذه التقنية إلى أنظمة ميكروبية أخرى لاستكشاف التكيف مع الظروف البيئية المتنوعة.

المقدمة

قد تكون الحياة المبكرة على الأرض قد نشأت في بيئات قاسية ، مثل الفتحات الحرارية المائية ، والتي تتميز بدرجات حرارة وحموضة عالية للغاية¹. تستمر الميكروبات في العيش في البيئات القاسية ، بما في ذلك الينابيع الساخنة والصولفاتارا البركانية. إن توصيف الديناميات التطورية التي تحدث في ظل هذه الظروف القاسية قد يلقي الضوء على العمليات الفسيولوجية المتخصصة التي تمكن من البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف. وقد يكون لذلك آثار واسعة النطاق، من فهمنا لأصول التنوع البيولوجي إلى تطوير إنزيمات جديدة ذات درجة حرارة عالية مع تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

لا يزال فهم الديناميات التطورية الميكروبية في البيئات القاسية محدودا على الرغم من أهميته الحاسمة. في المقابل ، تم اكتساب مجموعة كبيرة من المعرفة حول التطور في البيئات متوسطة الحجم من خلال تطبيق تقنية تعرف باسم التطور التجريبي. يتضمن التطور التجريبي مراقبة التغير التطوري في ظل ظروف المختبر^2،3،4،5. وغالبا ما ينطوي ذلك على بيئة تغيير محددة (مثل درجة الحرارة والملوحة وإدخال مادة سامة أو كائن منافس)^7،8،9. عندما يقترن التطور التجريبي بتسلسل الجينوم الكامل ، فقد مكننا من اختبار الجوانب الرئيسية للعمليات التطورية ، بما في ذلك التوازي والتكرار والأساس الجينومي للتكيف. ومع ذلك ، حتى الآن ، تم إجراء الجزء الأكبر من التطور التجريبي باستخدام الميكروبات متوسطة الحجم (بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات^2،3،4،5 ، ولكن باستثناء العتائق إلى حد كبير). ستمكننا طريقة التطور التجريبي المطبقة على الميكروبات المحبة للحرارة من فهم كيفية تطورها بشكل أفضل والمساهمة في فهم أكثر شمولا للتطور. ومن المحتمل أن يكون لهذا آثار واسعة النطاق ، من فك رموز أصول الحياة المحبة للحرارة على الأرض إلى تطبيقات التكنولوجيا الحيوية التي تنطوي على "الإنزيمات المتطرفة" المستخدمة في العمليات الحيوية ذات درجة الحرارة^{العالية 10} والبحوث البيولوجية الفلكية¹¹.

يعتبر الأركيون Sulfolobus acidocaldarius مرشحا مثاليا ككائن نموذجي لتطوير تقنيات التطور التجريبية لمحبي الحرارة. تتكاثر S. acidocaldarius هوائيا ، مع درجة حرارة نمو مثالية عند 75 درجة مئوية (نطاق 55 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية) وحموضة عالية (درجة الحموضة 2-3) ^{4،6،12،13،14}. بشكل ملحوظ ، على الرغم من ظروف نموها القاسية ، تحافظ S. acidocaldarius على الكثافة السكانية ومعدلات الطفرات المماثلة للميسوفيل^{7،15،16،17،18}. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمتلك جينوم صغير نسبيا ومشروح جيدا (سلالة DSM639: 2.2 ميجا بايت ، 36.7٪ GC ، 2347 جينا)¹² ؛ تستفيد S. acidocaldarius أيضا من أدوات هندسة الجينوم القوية ، مما يسمح بإجراء تقييم مباشر للعملية التطورية من خلال الضربات القاضية الجينية المستهدفة¹⁹. ومن الأمثلة البارزة على ذلك توافر سلالات معدلة وراثيا من S. acidocaldarius ، مثل سلالات uracil auxotrophic من MW001¹⁹ و SK-1²⁰ ، والتي يمكن أن تكون بمثابة علامات قابلة للاختيار.

هناك تحديات كبيرة في إجراء التطور التجريبي مع محبة للحرارة مثل S. acidocaldarius. تفرض الحضانة الممتدة في درجات الحرارة العالية المطلوبة لهذه الدراسات تبخرا كبيرا لكل من تقنيات الاستزراع السائل والصلب. يمكن أن يؤدي التشغيل الممتد في درجات حرارة عالية أيضا إلى إتلاف حاضنات الاهتزاز التقليدية التي يشيع استخدامها في التطور التجريبي في الوسائط السائلة. يتطلب استكشاف درجات حرارة متعددة استثمارا ماليا كبيرا للحصول على العديد من الحاضنات وصيانتها. علاوة على ذلك ، فإن ارتفاع استهلاك الطاقة المطلوب يثير مخاوف بيئية ومالية كبيرة.

يقدم هذا العمل طريقة لمواجهة التحديات التي واجهتها في إجراء التطور التجريبي مع محبة للحرارة مثل S. acidocaldarius. بناء على تقنية طورها Baes et al. للتحقيق في استجابة الصدمات الحرارية^14,21 ، تستخدم الطريقة التي تم تطويرها هنا خلاطات حرارية على مقاعد البدلاء من أجل حضانة متسقة وموثوقة في درجات الحرارة العالية. تسمح قابليتها للتوسع بالتقييم المتزامن لمعالجات درجات الحرارة المتعددة ، مع انخفاض تكاليف الحصول على معدات حضانة إضافية. هذا يعزز الكفاءة التجريبية ، مما يتيح التحليل الإحصائي القوي والتحقيق المكثف في العوامل التي تؤثر على الديناميات التطورية في محبة الحرارة²². علاوة على ذلك ، يقلل هذا النهج بشكل كبير من الاستثمار الأولي المالي واستهلاك الطاقة مقارنة بالحاضنات التقليدية ، مما يوفر بديلا أكثر استدامة وصديقة للبيئة.

تضع طريقتنا الأساس للتحقيق التجريبي في الديناميات التطورية في البيئات التي تتميز بدرجات حرارة قصوى ، والتي ربما لعبت دورا رئيسيا خلال المراحل المبكرة من تنويع الحياة على الأرض. تتمتع الكائنات المحبة للحرارة بخصائص فريدة ، لكن ظروف نموها الشديدة ومتطلباتها المتخصصة غالبا ما تحد من إمكانية الوصول إليها كنظام نموذجي. إن التغلب على هذه الحواجز لا يوسع فرص البحث للتحقيق في الديناميات التطورية فحسب ، بل يعزز أيضا الفائدة الأوسع لمحبي الحرارة كأنظمة نموذجية في البحث العلمي.

البروتوكول

1. تحضير وسط نمو S. acidocaldarius (BBM ⁺)

ملاحظة: لزراعة S. acidocaldarius ، يستخدم هذا البروتوكول وسط بروك القاعدي (BBM ⁺) ²³. يتم إعداد ذلك من خلال الجمع أولا بين حلول المخزون غير العضوية الموضحة أدناه لإنشاء ^BBM− ، والتي يمكن إعدادها مسبقا. ثم يتم تحضير BBM⁺ حسب الحاجة عن طريق إضافة حلول المخزون العضوي إلى BBM⁻. يتم عرض وصفات حل الأسهم أيضا في الجدول 1. يجب تحضير جميع حلول الوسائط والمخزون في H₂O المقطر المزدوج (ddH₂O).

1. إعداد حلول المخزون غير العضوي لوسط النمو
   1. إعداد حل مخزون العناصر النزرة.
      1. قم بإعداد محلول مخزون العناصر النزرة بإضافة 9 جم / لتر من رباعي هيدرات الصوديوم (Na₂B₄O₇ · 10H₂O) إلى ddH₂O ، متبوعا بإضافة 1: 1 H₂SO₄ بالتنقيط حتى يذوب.
      2. إدخال 0.44 جم / لتر من سباعي هيدرات كبريتات الزنك بالتتابع (ZnSO₄ · 7H₂O) ، 0.1 جم / لتر من ثنائي هيدرات كلوريد النحاس الثنائي (CuCl₂ · 2H₂O) ، 0.06 جم / لتر من ثنائي هيدرات موليبدات الصوديوم (Na₂MoO₄ · 2H₂O) ، 0.06 جم / لتر من ثنائي هيدرات كبريتات الفاناديوم الرباعي (VOSO_{4.2H 2}O) ، 0.02 جم / لتر من كبريتات الكوبالت الثنائي هيبتاهيدراتي (CoSO₄ · 7H₂O) ، و 3.6 جم / لتر من رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز الثنائي (MnCl₂ · 4H₂O). الأوتوكلاف الحل وتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
   2. تحضير محلول مخزون الحديد (1000x) عن طريق إذابة 20 جم / لتر من سداسي هيدرات كلوريد الحديديك (FeCl₃ · 6H₂O) في ddH₂O. تعقيم المحلول عن طريق التصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
   3. تحضير محلول بروك I (1000x) عن طريق إذابة 70 جم / لتر كلوريد الكالسيوم (CaCl₂ · 2H₂O) في ماء مقطر مزدوج (ddH₂O). الأوتوكلاف ويحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      تنبيه: إذابة CaCl₂ · 2H₂O في الماء هي عملية طاردة للحرارة. نفذ هذه الخطوة بعناية. ارتد قفازات الخطر الحراري المصنفة EN407 للحماية من الإصابة. لا تغلق الوعاء بإحكام ، حيث قد يتراكم الضغط.
   4. تحضير محلول بروك II / III عن طريق الجمع بين 130 جم / لتر من كبريتات الأمونيوم ((NH₄) ₂SO₄) ، 25 جم / لتر من كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتي (MgSO₄ · 7H₂O) ، 28 جم / لتر من فوسفات هيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄) ، و 50 مل من محلول مخزون العناصر النزرة المعد مسبقا. باستخدام 1: 1 H₂SO₄ ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمحلول المخزون إلى 2-3. الأوتوكلاف الحل وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. إعداد حلول المخزون العضوي لمتوسط النمو
   1. قم بإعداد محلول مخزون الجلوكوز D (100x) عن طريق إذابة 300 جم / لتر (30٪ وزن / حجم) من D-glucose في ddH₂O وتعقيم المرشح (من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام مصادر الكربون الأخرى بدلا من D-glucose وفقا للمتطلبات التجريبية (على سبيل المثال ، D-xylose).
   2. تحضير الببتون من محلول مخزون الكازين (100x) عن طريق إذابة الببتون من الكازين عند 100 جم / لتر في ddH₂O. الأوتوكلاف لتعقيم وتخزين محلول المخزون في RT.
   3. تحضير محلول مخزون اليوراسيل (100x) عن طريق إذابة 2 جم / لتر من اليوراسيل في ddH₂O وتعقيم المرشح (من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر) ؛ يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. تحضير متوسط نمو BBM ⁺ عند تركيز عمل 1x
   1. أولا ، قم بإعداد 988 مل من ddH₂O المعقم عن طريق التعقيم.
   2. قم بإعداد 1 لتر ^BBM− بإضافة 1 مل من Brock Stock Solution I ، و 10 مل من Brock Stock Solution II / III ، و 1 مل من محلول مخزون Fe إلى 988 مل من DDH₂O المعقم المعقم سابقا. اضبط درجة الحموضة المتوسطة على نطاق 2-3 مع 1: 1 H₂SO₄.
      ملاحظة: ^BBM− يمكن تصنيعه مسبقا وتخزينه في RT لمدة تصل إلى 1 شهر.
   3. أخيرا ، لإنتاج 1 لتر ^{BBM +} ، اجمع 10 مل لكل من محلول مخزون D-Glucose و Peptone من Casein Stock Solution و Uracil Stock Solution مع 985 مل من ^BBM−. تخلط جيدا واضبط درجة الحموضة المتوسطة إلى 2-3 مع 1: 1 H₂SO₄.
      ملاحظة: يجب أن يكون ^BBM+ طازجا كما هو مطلوب.
4. تحضير BBM ⁺ وسط صلب
   1. إعداد حلول مخزون 1 م من MgCl₂ و CaCl₂ ؛ هذه سوف تساعد في تصلب الوسط الصلب BBM. للحصول على 1 M MgCl₂ ، أضف 9.5 جم إلى 100 مل من ddH₂O. ل 1 M CaCl₂ ، أضف 11 جم إلى 100 مل من ddH₂O. الأوتوكلاف للتعقيم.
      تنبيه: إذابة CaCl₂ · 2H₂O في الماء هي عملية طاردة للحرارة. نفذ هذه الخطوة بعناية. ارتد قفازات الخطر الحراري المصنفة EN407 للحماية من الإصابة. لا تغلق الوعاء بإحكام ، حيث قد يتراكم الضغط.
   2. امزج 3٪ (وزن / حجم) من صمغ جيلان (على سبيل المثال ، 30 جم / لتر) في ddH₂O والأوتوكلاف للتعقيم.
      ملاحظة: يستخدم صمغ جيلان (على سبيل المثال ، Gelrite) هنا كعامل تبلور ، حيث لا يمكن للأجار البكتريولوجي القياسي أن يتجمد عند 75 درجة مئوية.
   3. بشكل منفصل ، قم بإعداد BBM ⁺ للوسط الصلب ، والذي يجب خلطه بنسبة 1: 1 مع صمغ جيلان المعقم المحضر في الخطوة 1.4.1.
      1. أولا ، قم بإعداد 1 لتر ^BBM− كما في الخطوة 1.3.2. اجمع بين 887 مل من BBM⁻ مع 1 مل من محلول مخزون الحديد و 20 مل لكل من محلول مخزون D-Glucose و Peptone من Casein Stock Solution و Uracil Stock Solution.
      2. أضف 40 مل من 1 M MgCl₂ و 12 مل من 1 M CaCl₂. تخلط جيدا واضبط درجة الحموضة المتوسطة إلى 2-3 مع 1: 1 H₂SO₄.
         ملاحظة: أحجام حلول المخزون المضافة هنا أكبر عمدا من تحضير ^BBM+ السائل في الخطوة 1.3. هذا لحساب الخلط بنسبة 1: 1 مع صمغ جيلان المنصهر في الخطوة التالية.
   4. سخن BBM⁺ للوسط الصلب إلى حوالي 75 درجة مئوية واخلطه بنسبة 1: 1 مع صمغ الجيلان المنصهر في ddH₂O. اخلط جيدا واسكبه في بلاستيك مستقر للحرارة (على سبيل المثال ، البولي بروبلين) أو أطباق بتري الزجاجية أو ألواح من ستة آبار لنموS. acidocaldarius. استخدم الآجار على الفور بمجرد مزجه ، حيث سيتماسك بسرعة.
      ملاحظة: بعض أطباق البوليسترين 90 مم بتري المستخدمة عادة في علم الأحياء الدقيقة سوف تتشوه إذا تم تحضينها في درجات حرارة عالية لفترات طويلة.
      تنبيه: اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة عند التعامل مع السوائل الساخنة. ارتد قفازات الخطر الحراري المصنفة EN407 للحماية من الإصابة.

2. إحياء S. acidocaldarius من ثقافة مخزون المجمد

1. إعداد أنابيب النمو ذات التهوية لضمان التهوية الكافية وتوافر الأكسجين.
   1. مقدما ، قم بإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المثقوبة سعة 2 مل لنمو Sulfolobus . قم بتسخين الأسلاك الحادة بعناية (>0.7 مم ، مثل مشبك الورق المستقيم) باستخدام لهب موقد بنسن واخترق غطاء الأنبوب ، مما يؤدي إلى إنشاء ثقب صغير يبلغ حوالي 1 مم.
   2. ضع الأنابيب المثقوبة في وعاء قابل للتعقيم (على سبيل المثال ، صندوق طرف ماصة فارغ) والأوتوكلاف للتعقيم.
      تنبيه: ارتد قفازات الخطر الحراري المصنفة EN407 للحماية من الإصابة الحرارية لليدين من المعدن الساخن. سخني السلك لفترة قصيرة فقط (1-2 ثانية) لمنع ارتفاع درجة الحرارة. يجب استخدام المعادن ذات درجة حرارة الانصهار العالية (الفولاذ) فقط.
2. تلقيح الثقافات بداية من S. acidocaldarius.
   1. املأ أنابيب 2 مل المثقوبة المعقمة ب 1.5 مل من ^{BBM +} المسخن مسبقا (كما هو محضر في القسم 1 ، تم تحضينه مسبقا عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل).
   2. قم بتلقيح الأنابيب المملوءة ب BBM ⁺ بكشط (ما يعادل 50 - 60 مجم) من مخزون الجلسرين (25٪ v / v glycerol ، المخزن عند -80 درجة مئوية). هنا ، يتم استخدام سلالة S. acidocaldarius DSM639. املأ أنبوبا إضافيا ب 1.5 مل من BBM+ كعنصر تحكم سلبي.
3. لمنع أي رذاذ من الهروب من غطاء الأنبوب المثقوب سعة 2 مل وتلويث بيئة النمو (وأي عينات أخرى) ولتقليل تباين تبخر المزرعة داخل الأنابيب ، ضع غشاء نافذا للغاز أعلى الغطاء يمكنه تحمل درجات الحرارة المرتفعة (65-85 درجة مئوية) ومنع الهروب / التسلل الميكروبي.
   ملاحظة: استخدام الأغشية المنفذة للغاز لأنابيب الختم يقلل بشكل كبير من التبخر. خلال فترة 48 ساعة عند 75 درجة مئوية ، تظهر الأنابيب المختومة متوسط خسارة في الحجم بنسبة 8.63٪ (النطاق: 3.29-16.45٪ ، ن = 24 تكرارا تقنيا ، تتكرر مرتين) ، على عكس 25.05٪ (النطاق: 11.92-62.91٪ ، ن = 24 تكرارا تقنيا ، تتكرر مرتين) للأنابيب غير المختومة.
4. احتضان الأنابيب الملقحة في خلاط حراري عند 75 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر عند 400 دورة في الدقيقة (RPM) لمدة 48-72 ساعة أو حتى يتم الوصول إلى_{OD 600nm} من 0.3 - 0.8 كما تم قياسه بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
   ملاحظة: يسمح الغطاء المثقوب للأنابيب سعة 2 مل والاهتزاز بالتهوية المناسبة للنمو الأمثل. يجب أن يكون غطاء الخلاط الحراري في مكانه لضمان الحفاظ على درجة حرارة ثابتة وتقليل التبخر.
5. بعد فترة الحضانة ، امنح الثقافات التي تم إحياؤها مرحلة نمو ثانية (التكييف المسبق).
   1. بيليه أسفل الثقافات عن طريق الغزل الأنابيب في 5000 × ز لمدة 2 دقيقة في RT. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل ^{BBM +} دافئ جديد.
      ملاحظة: تستخدم هذه التجربة سلالة S. acidocaldarius من النوع البري DSM639 ، ولكن يمكن تطبيق طرق النمو والتطور التجريبي هذه على أي سلالة Sulfolobus وربما غيرها من المحبة للحرارة.

3. تحديد الكثافة السكانية ومضاعفة الوقت ومرحلة النمو الأسي ل S. acidocaldarius

1. تحديد الكثافة السكانية والوقت اللازم لمرحلة النمو الأسي لظروف الاختيار المختارة. لكل حالة بيئية يتم اختبارها ، قم بإعداد ثلاث ثقافات بداية باتباع الخطوات 2.1-2.5.
2. تمييع الثقافات الثلاث في BBM ⁺ إلى OD_600nm من 0.01. اصنع 20 مل على الأقل من كل ثقافة. تمثل هذه الثقافات الثلاث تكرارات تقنية.
3. قم بإجراء نسخ متماثل لمنحنيات نمو OD_600nm بمرور الوقت باستخدام أخذ العينات المدمرة.
   1. قم بإعداد 24 أنبوبا مثقوبا سعة 2 مل من الخطوة 2.1 ، وافصلها إلى ثلاث مجموعات من ثمانية ، وقم بتسمية هذه النسخ المتماثلة التقنية 1 و 2 و 3 (على سبيل المثال ، ثمانية أنابيب تحمل علامة النسخ المتماثل 1 وما إلى ذلك).
   2. من كل من الثقافات الثلاث المخففة من الخطوة 3.2 ، ماصة 1.5 مل في سبعة أنابيب معدة. املأ الأنبوب المتبقي ب 1.5 مل من BBM+ كعنصر تحكم سلبي.
4. احتضان جميع الأنابيب ال 24 في خلاط حراري عند 75 درجة مئوية و 400 دورة في الدقيقة. ختم مع غشاء نفاذية الغاز. على فترات منتظمة (مثل 0 ، 4 ، 8 ، 12 ، 24 ، 36 ، 48 ساعة) ، قم بإزالة أنبوب واحد من كل من النسخ المتماثلة الثلاثة وقم بقياس OD_600nm باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، ثم تخلص من الأنبوب. استبدل الغشاء المنفذ للغاز بعد إزالة الأنبوب.
5. في موازاة ذلك ، حدد العلاقة بين OD_600nm والكثافة السكانية. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية (1 × ^10-1 إلى 1 × ^10-6) في وسيط ^BBM+ لمدة ثلاث نقاط زمنية على الأقل (من الناحية المثالية ، البداية والوسط والنهاية). قم بتلقيح 100 ميكرولتر من كل تخفيف على وسط ^BBM+ صلب (محضر كما في الخطوة 1.4).
   ملاحظة: لتحقيق نمو ثابت للمستعمرة وإحصاء دقيق ، من الأفضل وضع الثقافة المخففة على الوسائط الصلبة في مكان ما دون إجراء انتشار ميكانيكي ، مثل استخدام مفرشة على شكل حرف L أو خرز زجاجي. يبدو أن الانتشار الميكانيكي يؤثر سلبا على تكوين المستعمرة.
6. احتضان الألواح في حاضنة ثابتة عند 75 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات (5-7 أيام).
   1. خلال هذه الفترة الزمنية ، حافظ على رطوبة الحاضنة لتجنب التجفيف المفرط للألواح ، وإلا فلن تتشكل المستعمرات.
   2. حقق ذلك عن طريق وضع الألواح في صندوق مغلق من مادة البولي بروبيلين مبطن بقطعة قماش مبللة. اثقب غطاء الصندوق ثلاث مرات على الأقل لتمكين التهوية.
   3. ضع دلاء من الماء في الحاضنة لزيادة الرطوبة. أعد ملء الدلاء يوميا.
7. بمجرد جمع جميع قياسات OD_600nm ، حدد وقت ووقت المضاعفة للوصول إلى مرحلة النمو الأسي عن طريق تركيب منحنى لوجستي للعلاقة بين OD_600nm والوقت ، على سبيل المثال ، باستخدام SummaryGrowth من حزمة growthcurver في R.
8. بمجرد تكوين المستعمرات المرئية على وسائط صلبة ، عد وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) ، بهدف العد من عامل التخفيف ، وإنتاج 50-100 مستعمرة للحصول على أفضل دقة.
9. احسب كثافة الخلية في وسط الاستزراع باستخدام الصيغة: CFU / mL = عدد المستعمرات / (عامل تخفيف × مطلي بالحجم).
10. قم بإجراء الانحدار الخطي لسجل السجل لتحديد العلاقة بين log10 (CFU) و log10 (OD_600nm). وبالتالي ، احسب CFU / mL المتوقع ل OD معين من ميل وتقاطع نموذج الانحدار: CFU المتوقع = 10 ^{[المنحدر × log10 (OD600nm) + الاعتراض].}
11. (اختياري) أيضا ، قم بتنفيذ الخطوات 3.1-3.10 في حاضنة الاهتزاز لتحديد ما إذا كان يتم تحقيق نمو مماثل في الخلاطات الحرارية.

4. بدء الأنساب المستقلة للتطور التجريبي

1. اليوم 1: لإنشاء مستعمرات فردية ، قم أولا بتنفيذ جميع خطوات القسم 2 أعلاه لإنشاء ثقافة البداية.
2. اليوم 3: قم بقياس OD_600nm للثقافة للتأكد من وصولها إلى كثافة كافية في المرحلة الأسية (OD_600nm 0.3-0.8 بواسطة مقياس الطيف الضوئي).
3. قم بإنشاء تخفيفات تسلسلية لثقافة S. acidocaldarius DSM639 من 1 × ^10-1-1 × ^10-6 ونشر 100 ميكرولتر من كل تخفيف 1 × ^10-5 و 1 × ^10-6 في آبار صفيحة 6 آبار تحتوي على وسيط BBM ⁺ صلب (القسم 1 والجدول 1) في العديد من النسخ المتماثلة. احتضان الألواح عند 75 درجة مئوية في حاضنة ثابتة كما في الخطوة 3.5 لمدة 5-7 أيام لظهور مستعمرات مفردة.
4. اليوم 8-10 (5-7 أيام بعد الحضانة):
   1. تحديد عدد الأنساب المتطورة من مستعمرات واحدة. لكل سلالة ، اختر مستعمرة واحدة عشوائيا من الألواح باستخدام حلقة التلقيح. أعد تعليق المستعمرة في أنبوب مثقوب سعة 2 مل يحتوي على 1.5 مل من وسط ^BBM+ المسخن مسبقا. قم بتسمية الأنبوب بشكل مناسب.
   2. كرر العدد المطلوب من الأنساب ؛ هنا ، تم إنشاء سبعة سلالات وتسميتها SA1-7. املأ أنبوبا إضافيا ب 1.5 مل من BBM+ كعنصر تحكم سلبي.
   3. أغلق قمم الأنابيب بغشاء قابل للتنفس واحتضانها في خلاط حراري عند 75 درجة مئوية ، 400 دورة في الدقيقة لمدة 48-72 ساعة ، حتى تصبح الثقافات عكرة (أي ما يعادل_{OD 600nm} 0.3-0.8 بواسطة مقياس الطيف الضوئي).
5. اليوم 10-12 (7-9 أيام بعد التلقيح):
   1. في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء ، قم بتدوير الثقافات النسيلية عند 5000 × جم لمدة 1 دقيقة في RT. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات ب 200 ميكرولتر من السائل ^{BBM +}.
   2. امزج معلقات الخلايا 200 ميكرولتر مع 200 ميكرولتر من 50٪ جلسرين (25٪ فولت / فولت جلسرين) لإنشاء مخزون الجلسرين من السلالات السبعة المستقلة وتخزينها عند -80 درجة مئوية. هذه هي مجموعات الأجداد لتجارب التطور.

5. إجراء تجربة تطور درجة الحرارة

ملاحظة: يرد مخطط مفاهيمي يحدد الجوانب الرئيسية لبروتوكول التجربة في الشكل 1.

1. استخدم مجموعات الأسلاف السبعة التي تم إنشاؤها في القسم 4 لتجربة التطور.
   1. إجراء جميع فحوصات التطور التجريبي في أنابيب معقمة مثقوبة سعة 2 مل مختومة بغشاء نافذ (الموصوف أعلاه ، القسم 2).
   2. جنبا إلى جنب مع هذه المجموعات ، الحفاظ على أنابيب منفصلة مثقوبة 2 مل مع 1.5 مل من BBM ⁺ كضوابط سلبية خالية من الثقافة لرصد التلوث (المتقاطع) وتعيين عتبة ل OD تشير إلى عدم نمو الثقافة.
2. إنشاء معالجات درجة الحرارة: يسمح استخدام الخلاطات الحرارية بإنشاء معالجات متعددة لدرجة الحرارة. هنا ، استخدم معالجات درجة الحرارة التالية: ثابت 75 درجة مئوية ، ثابت 65 درجة مئوية ، وينخفض تدريجيا من 75-65 درجة مئوية عن طريق خفض درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية كل 4 أيام ("معالجة انخفاض درجة الحرارة").
   ملاحظة: يمكن تصميم هذه العلاجات وفقا لمتطلبات تجريبية محددة. مطلوب خلاط حراري منفصل لكل معالجة حرارية.
3. اليوم 1: إحياء مجموعات الأجداد من مخزون الجلسرين (المعد في الخطوة 4.5) باتباع الخطوات الموضحة في القسم 2.
4. يوم 3:
   1. قم بتخفيف هذه الثقافات إلى OD_600nm من 0.01 (يقاس بواسطة مقياس الطيف الضوئي) إلى حجم إجمالي لا يقل عن 6 مل من ^{BBM +} المسخن مسبقا. القسمة 1.5 مل من كل من ثقافات الأجداد السبعة المخففة إلى ثلاثة أنابيب منفصلة مثقوبة 2 مل ، واحد لكل معالجة حرارية محددة في الخطوة 5.2.
      ملاحظة: تضمن خطوة الاقتباس هذه وجود أي اختلاف جيني موجود في كل مجموعة أسلاف في جميع المعالجات الحرارية في بداية تجربة التطور. ستعمل هذه الثقافات كنقل 0 (Tx0) لبدء تجربة تطور درجة الحرارة.
   2. أغلق الأنابيب بغشاء مسامي وضع كل مجموعة من سبعة أسلاف في خلاطات حرارية منفصلة. اضبط كل خلاط حراري على درجة الحرارة المطلوبة و 400 دورة في الدقيقة لبدء تجربة التطور.
5. يوم 5:
   1. بعد 48 ساعة ، قم بإجراء النقل 1 (Tx1) عن طريق تلقيح 1.5 مل من وسط BBM ⁺ الدافئ في أنبوب مثقوب سعة 2 مل مع 15 ميكرولتر من الثقافة من كل من ثقافات Tx0 (تخفيف 1: 100). للسرعة ، نفذ هذه الخطوة باستخدام ماصة متعددة القنوات متغيرة العرض لإكمال عمليات نقل متعددة من تجربة واحدة في انسجام تام ، مما يقلل من الوقت الذي تخرج فيه الثقافات من الخلاط الحراري.
   2. كما كان من قبل ، أغلق الأنابيب قبل إعادتها إلى مواضع عشوائية في الخلاطات الحرارية الخاصة بها. قم بإجراء التوزيع العشوائي يدويا أو من خلال iMetaLab 96 بشكل عشوائي.
6. قم بقياس OD_600nm من Tx0 في مقياس الطيف الضوئي القائم على الألواح (200 ميكرولتر في 96 لوحة بئر ؛ يتم استخدام نفس الحجم من ^{BBM +} كفراغ) لتتبع نمو السلالات المستقلة.
   ملاحظة: يجب قياس OD_600nm بعد إجراء النقل إلى وسط جديد لمنع التلوث. يمكن أيضا قياس الكثافة الضوئية بوسائل أخرى ، مثل مقياس الطيف الضوئي القياسي. يتيح استخدام مقياس الطيف الضوئي القائم على الألواح القياس المتزامن لثقافات متعددة ، مما يبسط العملية.
7. كرر الخطوتين 5.5 و 5.6 في الأيام 7 و 9 و 11 وما إلى ذلك ، المقابلة ل Tx2 و Tx3 و Tx4 وما إلى ذلك. حافظ على درجة الحرارة ثابتة للعلاجات 75 درجة مئوية و 65 درجة مئوية. بالنسبة لمعالجة انخفاض درجة الحرارة ، قم بخفض درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية كل عملية نقل ثانية (على سبيل المثال ، على Tx2 ، Tx4 ، Tx6 ، إلخ).
8. قم بإعداد مخزون الجلسرين (الخطوة 3.2.3) من السكان بعد^{كل نقل 10} (أي Tx10 ، Tx20 ، إلخ) ، مع تسمية الأنبوب بمعرف مجموعة الأجداد (على سبيل المثال ، SA1^{للسكان المستقلين} الأول) ورقم النقل (على سبيل المثال ، Tx10 للنقل العاشر). استخدم مخزون الجلسرين هذا لاحقا لإحياء السكان لدراسة كيفية تغير السكان بمرور الوقت أو لإعادة تشغيل التجربة إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، بسبب التلوث أو الحوادث غير المتوقعة التي تؤدي إلى فقدان الثقافات).
9. دع التجربة تستمر إما لعدد محدد مسبقا من عمليات النقل أو حتى انقضاء عدد محدد مسبقا من الأجيال. في النقل النهائي ، قم بإعداد مخزون الجلسرين لجميع سلالات السلال.
   ملاحظة: هنا ، استمرت التجربة حتى وصلت معالجة انخفاض درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية ، والتي حدثت في Tx22. هذا يتوافق مع ما يقرب من 150 جيلا (محسوبا على أساس عامل التخفيف 100 في 4.6: log₂ (100) = 6.64 أجيال لكل نقل). يمكن تعديل طول تجارب التطور وفقا للمتطلبات التجريبية.

6. مقايسات نمو تجربة ما بعد التطور: سلالات الأجداد مقابل الأنساب المتطورة

ملاحظة: يرد رسم تخطيطي مفاهيمي يحدد بروتوكول فحص النمو / اللياقة في الشكل 2.

1. تحضير أنابيب 2 مل مثقوبة مع 1.5 مل ^{BBM +}. قم بإعداد أنابيب كافية لزراعة جميع سلالات الأسلاف بالإضافة إلى كل سلالة من سلالات الأجداد.
2. إحياء مجموعات الأسلاف ، وكل مجموعة سليلة مخزنة في الخطوة 5.9 بعد النقل النهائي لتجربة التطور باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوات 2.2-2.5 ، ولكن مع الحضانة عند درجة الحرارة التي اختبرها كل مجتمع في آخر عمليتي نقل من تجربة التطور ، أي 75 درجة مئوية للمعالجة الثابتة 75 درجة مئوية ، و 65 درجة مئوية لتجارب 65 درجة مئوية ثابتة وانخفاض درجة الحرارة. لتحقيق كثافات سكانية قابلة للمقارنة ، قم بإجراء حضانة 75 درجة مئوية لمدة 72 ساعة وحضانة 65 درجة مئوية لمدة 120 ساعة.
3. قم بقياس_{OD 600nm} من المزارع المزروعة عبر مقياس الطيف الضوئي القائم على اللوحة.
4. إجراء فحوصات النمو لكل مجموعة من السكان المنحدرين وكل سلالة أسلاف في كلتا درجتي الحرارة (أي 75 درجة مئوية و 65 درجة مئوية) في ثلاث مكررات. تحضير أنابيب طرد مركزي مثقوبة سعة 2 مل مع 1.5 مل من ^{BBM +}. قم بإعداد ستة أنابيب لكل سلالة متطورة وكل سلالة أسلاف. قم بتسمية الأنابيب باسم النسب (SA1-7 أو السلف) ، ودرجة حرارة النمو (75 درجة مئوية أو 65 درجة مئوية) ، ومعرف النسخ المتماثل (1 أو 2 أو 3).
   ملاحظة: في حالة توفر أقل من ستة خلاطات حرارية ، يمكن تكرار اختبار النمو على مدار عدة أيام عبر عدة كتل تجريبية. في هذه الحالة ، من المهم قياس كل سلالة وسلف في كل كتلة تجريبية بحيث يمكن تقدير تأثيرات الكتلة وحسابها إحصائيا.
5. قم بتلقيح الوسط الطازج في الأنابيب الستة المعدة ب 15 ميكرولتر من الثقافة من كل سلالة سليل وسلالة الأجداد.
6. اضبط ثلاثة خلاطات حرارية على 75 درجة مئوية وثلاثة خلاطات حرارية على 65 درجة مئوية ، مع تعيين كل خلاط حراري إلى معرف مكرر. ضع الأنابيب في الخلاط الحراري المقابل لدرجة الحرارة وقم بتكرار المعرف. داخل كل خلاط حراري ، تأكد من وضع الأنساب والأسلاف بشكل عشوائي للتحكم في عدم التجانس.
7. ختم كل مجموعة من 24 أنبوبا بغشاء نافذ. احتضان لمدة 48 ساعة.
8. نقل 200 ميكرولتر من كل ثقافة إلى لوحة 96 بئر. قياس OD_600nm باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   ملاحظة: يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات متغيرة العرض لتسهيل النقل بين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وألواح 96 بئرا.
9. رسم وتحليل البيانات باستخدام البرامج الإحصائية (على سبيل المثال ، R).

7. تسلسل الجينوم الكامل للسلالات المتطورة وتحديد الطفرات

1. إحياء السلالات المنحدرة المخزنة في الخطوة 5.9 في BBM⁺ قبل التسخين عند 75 درجة مئوية من 48-72 ساعة عن طريق تلقيح كشط من الجليد من كل مجموعة مجمدة في BBM ⁺ كما في القسم 2 ، الخطوات 2.2-2.5. تحضير ما بين 1-10 مل من حجم المزرعة للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الجينومي. يعتمد الحجم الدقيق المطلوب على الخيار المختار للتسلسل في الخطوتين 7.2 أو 7.3 (أدناه).
   ملاحظة: من الممارسات الجيدة أيضا تسلسل السلالة المستخدمة لبدء مجموعات الأجداد. هذا لتحديد ما إذا كانت أي طفرات تم اكتشافها في السلالات المنحدرة قد نشأت أثناء تجربة التطور وليس قبل ذلك.
2. (الخيار 1) استخراج الحمض النووي الجينومي وإعداد مكتبات تسلسل Illumina لتسلسل Illumina.
   1. استخراج وتنقية الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي التجارية للبكتيريا.
   2. تأكد من أن الحمض النووي الجينومي المستخرج يلبي متطلبات الكمية والنوعية لمزود التسلسل باستخدام مجموعات تجارية موصى بها من قبل المزود.
   3. قم بإعداد مكتبة الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة تجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. يوصى باستخدام بروتوكول ثنائي النهاية 250 نقطة أساس. قم بتخزين الحمض النووي الجينومي المستخرج عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا لتقديم العينات إلى مزود التسلسل.
3. (الخيار 2) بدلا من ذلك ، أرسل العينات إلى مزود تجاري يقوم باستخراج الحمض النووي ، وفحوصات جودة الحمض النووي الجينومي ، وإعداد مكتبة Illumina ، وتسلسل Illumina كخدمة مشتركة.
4. تحليل الجينومات المتسلسلة لتحديد الطفرات.
   1. استلم ملفات FASTQ ، وإذا لم يتم تنفيذها بالفعل بواسطة موفر التسلسل ، فقم بإجراء قص المحول باستخدام Trimmomatic مع قطع جودة النافذة المنزلقة Q15.
   2. باستخدام ملفات FASTQ المشذبة ، قم بتشغيل خط أنابيب breseq (الإصدار 0.38.1) للكشف عن الطفرات ، ومقارنة قراءات الحمض النووي الجينومي بالتسلسل المرجعي للسلالة المختارة. بالنسبة إلى S. acidocaldarius DSM639 ، هذا هو معرف RefSeq NC_007181.

8. (اختياري) تقييم الخلاط الحراري مقابل استهلاك طاقة الحاضنة

1. لمقارنة استهلاك الطاقة لاستخدام الحاضنة مقابل الخلاط الحراري للنمو ، قم بقياس استهلاك الطاقة لكل جهاز على مدار 24 ساعة باستخدام قابس مراقبة الطاقة.
2. استخدم قابسين لقياس استهلاك الطاقة لكلا الجهازين في نفس الوقت. بدلا من ذلك ، قم بقياس استهلاك الطاقة في أيام متتالية.
3. افصل الحاضنة أو الخلاط الحراري عن المقبس الكهربائي. قم بتوصيل قابس مراقبة الطاقة بالمقبس وقم بتهيئته وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، بما في ذلك تثبيت برنامج المراقبة والتحكم.
4. قم بتوصيل الحاضنة أو الخلاط الحراري بقابس مراقبة الطاقة واتركه يعمل لمدة لا تقل عن 2 ساعة (ولكن من الناحية المثالية لمدة 24 ساعة أو أكثر) لتحقيق تقدير جيد لاستهلاك الطاقة النموذجي. سجل استهلاك الطاقة لكل جهاز.

النتائج

قياسات منحنى النمو
منحنيات النمو ل S. acidocaldarius DSM639 موضحة في الشكل 3A. وجد أن النمو متشابه عند مقارنة الحضانة باستخدام الخلاطات الحرارية مع تلك الموجودة في الحاضنات التقليدية. تم تقدير متوسط معلمات معدل النمو عن طريق تركيب منحنى لوجستي لكل منحنى نمو مكرر وحساب المتوسط والخطأ المعياري. كانت الأوقات حتى منتصف المرحلة الأسية على الخلاط الحراري والحاضنة 27.2 ساعة ± 1.1 ساعة و 31.1 ساعة ± 1.9 ساعة على التوالي. كانت أوقات المضاعفة الأولية المقدرة للخلاط الحراري والحاضنة عند 75 درجة مئوية 4.29 ساعة ± 0.28 ساعة و 4.19 ساعة ± 0.44 ساعة على التوالي ، وهو ما يتوافق مع القيم المنشورة سابقا²⁴. تميزت العلاقة بين log₁₀ (OD_600nm) و log₁₀ (CFU) بشكل جيد بنموذج خطي (R² المعدل = 0.82 ، F (1,22) = 104 ، p < 0.00001 ، المنحدر = 1.73 ± 0.17 ، التقاطع = 9.73 ± 0.14). وبالتالي يتم إعطاء العلاقة بين OD_600nm و CFU بواسطة الصيغة CFU = 10 ^{(1.73 × log10 (OD600nm) + 9.73).} وبالتالي فإن OD_600nm من 0.3 يتوافق مع حوالي 6.7 × 10⁸ CFU / مل (الشكل 3B).

تجربة تطور درجة الحرارة
بدأت ثلاث ظروف درجة حرارة ، ثابتة 75 درجة مئوية ، ثابتة 65 درجة مئوية ، وانخفاض درجة الحرارة (75-65 درجة مئوية ، تتناقص بمقدار 1 درجة مئوية كل عمليتين) ، باستخدام سبع سلالات مستقلة مشتقة من S. acidocaldarius DSM639. تم أخذ قياسات OD_600nm بعد كل عملية نقل على مدار 45 يوما من التجربة (حوالي 150 جيلا عند 75 درجة مئوية) وهي موضحة في الشكل 4. قياسات OD_600nm المأخوذة عبر الأيام صاخبة بطبيعتها ، لأنها قد تكون عرضة لاختلافات طفيفة ، على سبيل المثال ، في فترة النمو ودرجة الحرارة وما إلى ذلك. ومع ذلك ، يمكن أن تظل القياسات المأخوذة عبر الأيام مفيدة لتقييم قابلية السكان للحياة ، وكذلك إعطاء مؤشر على ما إذا كانت اللياقة البدنية تتحسن بمرور الوقت. زادت السلالات من حالة 75 درجة مئوية الثابتة في OD_600nm من النطاق الأولي من 0.125-0.3 إلى نطاق 0.248-0.471 بنهاية التجربة. هذا يشير إلى أن اللياقة البدنية قد تحسنت مع هذا العلاج. في المقابل ، أظهرت السلالات من المعالجة الثابتة 65 درجة مئوية انخفاضا في OD_600nm ، من النطاق الأولي من 0.018-0.087 إلى 0.008-0.04 في النقطة الزمنية النهائية. يشير هذا إلى أن السكان لم يكونوا قادرين على التكيف مع درجة حرارة ثابتة تبلغ 65 درجة مئوية ، على الرغم من حقيقة أن الكائنات الحية القابلة للحياة يمكن استعادتها تظهر أن المجموعات لم يتم غسلها من خلال التخفيفات المتتالية ، مما يشير إلى درجة معينة من التكيف. أخيرا ، زادت التجمعات السكانية في معالجة انخفاض درجة الحرارة من نطاق OD_{الأولي 600nm} من 0.099-0.279 إلى 0.3-0.39 عند Tx6 (المقابلة ل 288 ساعة و 73 درجة مئوية في هذا العلاج) ، يليه انخفاض مطرد إلى نطاق 0.003-0.024 في النقطة الزمنية النهائية.

مقايسات النمو / اللياقة البدنية
تم إجراء فحوصات اللياقة البدنية لكل مجموعة سليلة بعد تجارب التطور. تم فحص OD_600nm بعد نمو 48 ساعة لجميع السلالات السبعة المستقلة ، تليها نماذج خطية مناسبة في R لكل درجة حرارة فحص ، مع "بيئة الاختيار" كتأثير رئيسي و "النسخ المتماثل / الخلاط الحراري" كتأثير كتلة. تم استخدام نمو سلالة الأجداد كمستوى مرجعي لتناقضات العلاج. البيانات موضحة في الشكل 5.

عند فحصها عند 75 درجة مئوية ، كانت هناك زيادات كبيرة في المتوسط في اللياقة البدنية على سلالة الأجداد للسلالات من ثابت 75 درجة مئوية (اختبار t: t₂₁₀ = 3.64 ، p = 0.0003) وثابت 65 درجة مئوية (اختبار t: t₂₁₀ = 2.8 ، p = 0.005) ، ولكن ليس من علاج انخفاض درجة الحرارة (اختبار t: t₂₁₀ = −0.87 ، p= 0.38). عند فحصها عند 65 درجة مئوية ، في المتوسط ، أظهرت السلالات من جميع العلاجات زيادة في اللياقة البدنية (سلالات ثابتة 75 درجة مئوية. اختبار t: t₂₁₀ = 4.68 ، p<0.0001 ، سلالات ثابتة 65 درجة مئوية ؛ اختبار T: t₂₁₀ ، = 4.24 ، p<0.0001 ، سلالات انخفاض درجة الحرارة ؛ اختبار T: t₂₁₀ = 3.15 ، p = 0.002). ومع ذلك ، بالنسبة لدرجات حرارة الفحص ، كانت هناك اختلافات كبيرة بين السلالات في لياقتها (الشكل 5). بعض السلالات لا تختلف اختلافا كبيرا عن سلالة الأجداد أو انخفضت في اللياقة البدنية. كان هذا واضحا بشكل خاص بالنسبة للسلالات من معالجة انخفاض درجة الحرارة.

تجدر الإشارة إلى أن العلاقة بين OD_600nm و CFU / mL ربما تغيرت أثناء تجربة التطور. يمكن تقييم ذلك من خلال تحديد معايير النمو للسلالات المتطورة (باتباع الخطوات 3.1-3.10).

نتائج تسلسل الجينوم الكامل
تم إجراء تحليل الجينوم الكامل باستخدام breseq (الإصدار 0.38.1) ²⁵ على السلالات السبعة من حالة 75 درجة مئوية الثابتة باستخدام الجينوم المرجعي ل S. acidocaldarius DSM639 (انضمام RefSeq NC_007181.1). تم الكشف عن مجموعة متنوعة من الطفرات التي تنطوي على الإدراج والحذف وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNP) عبر جينومات جميع السلالات المنحدرة (الجدول 2). كانت الإدخالات المتعددة والطفرات غير المترادفة في الجينات المشفرة للبروتين ، وكذلك المناطق بين الجينات التي قد تؤثر على التعبير الجيني بسبب تحولات الإطار في مناطق محفز الجينات. كانت بعض الطفرات متسقة عبر سلالات سليلة متعددة في الجينات المشاركة في وظائف مختلفة مثل التخليق الحيوي لجدار الخلية ، والنسخ ، والتمثيل الغذائي ، والنقل الخلوي ، والنشاط التحفيزي (الجدول 2). من بين هذه الطفرات كان هناك حذف كبير ل 54667 زوجا أساسيا في خمسة من أصل سبعة سلالات. تم تأكيد ذلك من خلال مخطط أدلة التغطية المفقودة لكل مجموعة سكانية (يتراوح التردد بين 93.2٪ و 100٪). المنطقة المحذوفة تعادل فقدان 53 جينا ؛ سيتم التحقيق في أدوار هذه الجينات في التكيف في الدراسات المستقبلية. لوحظت بعض الاختلافات بين العزلة المستخدمة ل DSM639 والتسلسل المرجعي المنشور (كما هو موضح في الجدول التكميلي 1).

استهلاك الطاقة لحاضنة الاهتزاز مقابل الخلاط الحراري
تمت مقارنة استهلاك الطاقة لحاضنة الاهتزاز بخلاط حراري باستخدام قابس ذكي لمراقبة الطاقة متاح تجاريا عبر مجموعة من درجات حرارة الحضانة الشائعة ودرجة حرارة 75 درجة مئوية المستخدمة هنا. عند 75 درجة مئوية ، استهلك الخلاط الحراري ما يقرب من 1/40^من طاقة حاضنة الاهتزاز التقليدية (الشكل 6) ، مما يشير إلى الخلاطات الحرارية كوسيلة محتملة لتقليل البصمة الكربونية المرتبطة بالتطور التجريبي.

الشكل 1: مخطط انسيابي يوضح بروتوكول تجربة التطور عبر ثلاث معالجات حرارية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مخطط انسيابي يوضح خطوات بروتوكول فحص النمو / اللياقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحديد معلمات النمو الرئيسية ومقارنة أجهزة الحضانة ل S. acidocaldarius DSM639. تمت زراعة ثلاث مزارع مكررة عند 75 درجة مئوية في 7 أنابيب منفصلة. تم استخدام أخذ العينات المدمرة لقياس (A) OD_600nm (يعني ± الخطأ المعياري n = 3 مكررات تقنية ؛ بعض أشرطة الخطأ أصغر من رموز الرسم) ؛ تمثل المنحنيات نماذج النمو اللوجستي المجهزة و (ب) وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) ؛ تمثل الخطوط نماذج الانحدار الخطي اللوغاريتمي المجهزة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: النتائج التمثيلية للكثافات البصرية (OD_600nm) التي تم الحصول عليها أثناء تجارب التطور. الكثافات البصرية للسلالات المستقلة التي تم قياسها خلال تجارب التطور تحت ثلاث معالجات حرارية (ثابت 65 درجة مئوية ، ثابت 75 درجة مئوية ، انخفاض 75 درجة مئوية -65 درجة مئوية) أجريت على مدى 150 جيلا تقريبا. تصور المنحنيات تنعيم اللوس بمرور الوقت لكل سلالة مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: النتائج التمثيلية لمقايسات النمو. مقايسات النمو للسلالات المستقلة المشتقة من S. acidocaldarius DSM639 بعد تجارب تطور درجة الحرارة (ثابت 65 درجة مئوية ، ثابت 75 درجة مئوية ، انخفاض 75 درجة مئوية -65 درجة مئوية) مقارنة بسلالة السلف. بالنسبة لجميع السلالات ، تم فحص النمو عند 65 درجة مئوية و 75 درجة مئوية. تظهر النقاط الملونة متوسط الخطأ المعياري ± للتكرارات التقنية (كما هو موضح باللون الرمادي ، n = 12 للسلف و n = 3 لكل سلالة متطورة). يشير الشريط الرمادي إلى متوسط الخطأ القياسي ± للياقة الأجداد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: استهلاك الطاقة للحاضنة التقليدية مقابل أجهزة الخلاط الحراري. تم تسجيل استهلاك الطاقة باستخدام قابس ذكي لمراقبة الطاقة متاح تجاريا يزيد عن 2 ساعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: وصفات الوسائط وحلول المخزون اللازمة لزراعة S. acidocaldarius. يجب أن تصنع جميع محاليل الوسائط والمخزون باستخدام H₂O المقطر المزدوج (ddH₂O) ثم تعقيمها إما عن طريق التعقيم أو تعقيم المرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، كما هو موضح. يرجى الرجوع إلى القسم 1 من البروتوكول للحصول على وصف تفصيلي لكيفية إعداد جميع حلول الوسائط والمخزون. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: النتائج التمثيلية لتسلسل الجينوم الكامل للسلالات السلالية . الطفرات الموجودة في سلالات سليل من S. acidocaldarius DSM639 من العلاج المستمر 75 درجة مئوية. تشير الطفرات إلى التغيرات المتعلقة بالسلف المباشر للسلالة ، والتي تمتلك العديد من التغييرات المتعلقة بالتسلسل المرجعي ل S. acidocaldarius DSM639 (RefSeq NC_007181 ؛ تظهر الطفرات في السلف في الجدول التكميلي 1). يشير n إلى عدد السلالات التي تم العثور فيها على طفرة. → الجين على "إطار القراءة الأمامية" ؛ ← الجين على "إطار القراءة العكسية". †هذه التغييرات مرتبطة بإزاحة الإطار (A) 10→11 الموجودة في عزل S. acidocaldarius DSM639 (الجدول التكميلي 1). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 1: الطفرات الموجودة في عزلة S. acidocaldarius DSM639 بالنسبة إلى التسلسل المرجعي (انضمام RefSeq NC_007181.1). → الجين على "إطار القراءة الأمامية" ؛ ← الجين على "إطار القراءة العكسية". ‡SACI_RS04020 مشروح على أنه سودوجين في NC_007181.1 ، لكن طفرة إزاحة الإطار Δ1 bp التي لوحظت هنا تستعيد وظيفتها كما هو الحال مع الطفرة ، فهي تشفر بروتينا بهوية 100٪ لجين rgy العكسي gyrase (انضمام RefSeq WP_176586667.1). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

طور هذا العمل بروتوكول تطور تجريبي لمحبي الحرارة ، مصمم هنا ل Archaion S. acidocaldarius ، ولكنه قابل للتكيف مع الميكروبات الأخرى ذات متطلبات النمو ذات درجات الحرارة العالية. يعتمد هذا البروتوكول على التقنيات المصممة في البداية للبكتيريا متوسطة الحجم ولكن تم تعديلها خصيصا للتغلب على التحديات التقنية المرتبطة بالنمو الهوائي عالي الحرارة^2،4،5،24. سيمكن إنشاء هذه الطريقة من استكشاف ديناميكيات تطورية غير مميزة سابقا تحدث في ظل ظروف درجات الحرارة القصوى ، تشبه الظروف التي يحتمل أن تكون موجودة خلال المراحل المبكرة من تطور الحياة¹.

هناك العديد من الجوانب الحاسمة للبروتوكول التي يجب مراعاتها لتحقيق نتائج موثوقة من تجارب التطور. الأول هو الاستقلال بين الأنساب ، والذي يتحقق عن طريق الخروج إلى مستعمرات واحدة قبل بدء التجربة. هذا أمر ضروري للتأكد من أن أي طفرات شائعة موجودة في سلالات منفصلة لها أصول مستقلة. بدلا من ذلك ، إذا تم تحديد ثقافة سائلة سائبة لبدء الأنساب ، فقد يتم توزيع المتغيرات الجينية الشائعة على كل مجموعة. الاعتبار الرئيسي الثاني هو السيطرة على التلوث ، والذي يتحقق من خلال الحفاظ على السيطرة السلبية الخالية من الثقافة ومراقبة النمو. على عكس التجارب مع المحبة المتوسطة ، من غير المرجح أن تكون تجارب التطور المتطرفة ملوثة من مصادر خارجية ، ولكن قد يستمر حدوث تلوث متبادل بين الأنساب. الحفاظ على التوازن بين التهوية والتبخر هو اعتبار رئيسي آخر. S.acidocaldarius هو هوائي ملزم وبالتالي يتطلب الأكسجين للنمو^10,23. كان ثقب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المصنوعة من مادة البولي بروبيلين يدويا وختمها بغشاء منفذ للغاز^21,25 ، مفتاحا للحفاظ على التهوية دون التبخر المفرط المستحق. يمكن أن يعزى هذا الانخفاض على الأرجح إلى الحفاظ على بيئة موحدة داخل الأنابيب المغلقة (البيانات غير معروضة).

قد يتطلب جانبان من الطريقة التعديل أو استكشاف الأخطاء وإصلاحها وفقا للظروف البيئية المحددة المستخدمة في تجربة التطور: عامل التخفيف والوقت بين عمليات النقل. في هذه الطريقة ، تم إجراء تخفيف 1: 100 في كل عملية نقل ، مما يستلزم مضاعفة في المتوسط_{log 2} (100) = 6.64 للعودة إلى نفس حجم السكان. يوفر هذا توازنا جيدا بين إمكانية التكيف (يتم حساب عامل التخفيف الأمثل بواسطة Wahl and Gerrish²⁶) وقابلية السحب التجريبية. من حيث المبدأ ، فإن عامل التخفيف القوي سيمكن من حدوث المزيد من الأجيال يوميا ، لأنه يتطلب المزيد من المضاعفة للعودة إلى نفس الكثافة السكانية (على سبيل المثال ، 1: 1000 يتطلب log₂ (1000) = 9.97 مضاعفة في المتوسط). ومع ذلك ، إذا تم تحقيق عدد أقل من المضاعفة مما هو مطلوب بين عمليات النقل ، غسل المجموعات تدريجيا من خلال التخفيف ما لم تحدث طفرة مفيدة تقلل من وقت المضاعفة. مع نقل السكان كل 48 ساعة ، يجب أن تكون أوقات المضاعفة أقل من 8 ساعات ، وهو ما يتماشى مع وقت المضاعفة المقدر والقيم المنشورة مسبقا للنمو غير الذاتي في S. acidocaldarius عند 75 درجة مئوية (4-6 ساعات)^23,27. ومع ذلك ، فإن الانخفاض التدريجي في OD_600nm بمرور الوقت لمعالجات 65 درجة مئوية ثابتة وانخفاض درجة الحرارة يشير إلى أن هذا قد لا يكون وقتا طويلا بما يكفي لتحقيق العدد المطلوب من المضاعفة وأن فترة النقل الأطول ستكون مفيدة.

لوحظت العديد من المزايا المهمة لاستخدام الخلاطات الحرارية على حاضنات الاهتزاز التقليدية للتطور التجريبي ، خاصة عند التحقيق في التكيف مع درجة الحرارة. تقدم الخلاطات الحرارية بديلا فعالا من حيث التكلفة لحاضنات الاهتزاز ، مع ميزة إضافية تتمثل في تقليل البصمة المكانية. تتيح هذه الخصائص التقييم الفعال للمعالجات الحرارية المتعددة بالتوازي. تظهر الخلاطات الحرارية أيضا استهلاكا أقل للطاقة من حاضنات الاهتزاز ، لذلك يمكن أن يقلل استخدامها من التأثير البيئي عند تحضين عدد متواضع من الأنابيب (على سبيل المثال ، أقل من 100). يتضح هذا التفاوت في استهلاك الطاقة بشكل خاص في درجات الحرارة ذات الصلة بالحرارة ولكنه ينطبق أيضا عبر مجموعة من نطاقات درجات الحرارة الأكثر اعتدالا (الشكل 6) ، مما يعني أنه يمكن أيضا اعتماد الخلاطات الحرارية لتقليل التأثير البيئي للتطور التجريبي للميزوفيل. تشير هذه السمات مجتمعة إلى أن استخدام الخلاطات الحرارية في التطور التجريبي لديه القدرة على تحسين إمكانية الوصول إلى منهجية البحث هذه ، لا سيما في البيئات المحدودة الموارد ، مثل المختبرات في البلدان النامية وفي التعليم الابتدائي والثانوي.

على الرغم من توفير طريقة للمضي قدما للتطور التجريبي المحب للحرارة ، إلا أن الطريقة الحالية لها بعض القيود المتعلقة بالتطور التجريبي للميزوفيل. أولا ، عدد السلالات المستقلة المكررة التي يمكن إنشاؤها باستخدام الخلاطات الحرارية صغير بالنسبة للطرق عالية الإنتاجية التي تتضمن ألواح العيار الدقيق ، والتي تستخدم على نطاق واسع للميزوفيل⁴. يحول التبخر في درجات الحرارة المرتفعة حاليا دون استخدام ألواح المعايرة الدقيقة خلال النافذة الزمنية المطلوبة للوصول إلى النمو الأسي. ثانيا ، يعد تقدير معلمات منحنى النمو الرئيسية ، مثل معدل النمو ، ومضاعفة الوقت ، ووقت التأخر ، أمرا صعبا لأن مقاييس الطيف الضوئي القائمة على الألواح والتي يمكن أن تعمل في درجات حرارة عالية (>45 درجة مئوية) غير متاحة حاليا للشراء. باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، يتطلب توصيف منحنى النمو في الوقت الحالي أخذ عينات مدمرة كثيفة العمالة وبالتالي يحد من الإنتاجية. وأخيرا، لم يتم بعد تطوير تقنيات عالية الإنتاجية لتقييم اللياقة التنافسية للعزلات المكيفة بشكل كامل لمحبي الحرارة. على وجه الخصوص ، فإن تطوير بروتين فلوري قابل للحرارة يمكن استخدامه للتمييز بين السلالات من شأنه أن يمكن من مقايسات اللياقة البدنية القائمة على قياس التدفق الخلوي^{عالية الإنتاجية 28,29} ؛ التطورات الأخيرة للبروتينات الفلورية القابلة للحرارة ذات الأطياف المختلفة ترفع هذا كتطور مستقبلي محتمل^30،31،32. تعد الزيادات في الإنتاجية خطوة منطقية تالية لمواصلة تطوير تقنيات التطور التجريبية لمحبي الحرارة ، لأنها ستمكن من وصف العمليات التطورية بشكل كامل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 & مرشحات غشاء تعمل بالحقنة	م StarLab	E4780-1226	لتعقيم مكونات وسائط تعقيم الترشيح التي لا يمكن تعقيمها.
1 & مو حلقات التلقيح L	Greiner	731161 أو 731165 أو 731101	لتلقيح الثقافات. يمكن استخدام حلقات أخرى.
1000 مو ؛ أطراف ماصة L	StarLab	S1111-6811	يمكن استخدام أطراف ماصة أخرى.
2 مل أنابيب الطرد المركزي	StarLab	S1620-2700	لزراعة S. acidocaldarius< / em> في الخلاطات الحرارية.
200 مو ؛ أطراف ماصة L	يمكن استخدام		أطراف الماصة الأخرى.
أنابيب البوليسترين سعة 50 مل ذات القاع المخروطي		430828 أو 430829	أنابيب أخرى. تحقق من الأداء عند 75 درجة مئوية ، وقد لا تسمح الأنابيب ذات أغطية مانع التسرب بتهوية كافية ؛ تحقق قبل الاستخدام.
50 مل حقنة	BD plastipak	300865	للاستخدام مع المرشحات التي تعمل بالحقن.
96 لوحة ميكروتيتر بئر (غير معالجة ، قاع مسطح)	Nunc	260860	لقياس OD عند 600 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي.
Pipet-Lite	LA8-300XLS	متعددة القنوات ذات عرض قابل للتعديل	اختيارية، ولكنها توفر الوقت عند النقل بين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة وألواح الآبار البالغ عددها 96 لوحا.
كبريتات الأمونيوم ((NH4)2SO4)	Millipore	168355	لمحلول مخزون بروك I.
الأوتوكلاف	Priorclave	B60-SMART أو SV100-BASE	أجهزة التعقيم الأخرى.
غشاء مانع للتسرب قابل للنفاذية للغاز Breathe-EASY	Sigma-Aldrich	Z763624-100EA	قطع حسب الحجم لاستخدامه في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المثقوبة. في حالة استبدال الميمبربان الأخرى المنفذة للغاز ، تأكد من أن الأداء مناسب عند 75 درجة ؛ C
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2< / sub> & middot ؛ 2H 2 < / sub > )	Sigma-Aldrich	C3306	لحل مخزون بروك I.
CELLSTAR ستة ألواح آبار (معلقة / غير معالجة)	Greiner	M9062	من المحتمل استبدال ألواح الآبار الستة للمصنعين الآخرين. تحقق من الأداء في درجات الحرارة العالية.
كبريتات الكوبالت (II) سباعي الهيدرات (CoSO4< / sub> & middot ؛ 7H2O)	Supelco	1025560100	لحل مخزون العناصر النزرة.
هيدرات كلوريد النحاس (II) (CuCl 2< / sub> & middot ؛ 2H2O)	Sigma-Aldrich	307483	لحل مخزون العناصر النزرة.
D- (+) - الجلوكوز اللامائي (C6< / sub>H12< / sub>O6< / sub>)	الكيميائية العلمية الحرارية	11462858	يمكن أيضا استخدام سكريات البنتوز والسداسية الأخرى (مثل D-xyllose ، D-arabinose). الجلوكوز ليس مصدرا مفضلا للكربون ل S. acidocaldarius< / em> (SV Albers ، اتصال شخصي)
الماء المقطر المزدوج (ddH2< / sub>O)
يستخدم Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101.1000	Gelrite (صمغ الجيلان) بدلا من أجار لصنع وسائط صلبة بسبب نقطة انصهاره العالية.
أطباق بتري زجاجية 100 مم	تستخدم أطباق بتري الزجاجية	BR455742	العلامة التجارية لأن معظم أطباق بتري القياسية من البوليسترين 90 مم تتشوه عند 75 درجة ؛ C (يعتمد على العلامة التجارية). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ستة ألواح آبار لأنها لا تتشوه في درجات الحرارة العالية.
حاضنة	نيو برونزويك	Innnova 42R	يمكن أيضا استخدام حاضنات أخرى. تحقق من درجة حرارة التشغيل للمعدات قبل الشراء / الاستخدام ، حيث أن العديد من الحاضنات غير قادرة على درجات حرارة أعلى من 65 درجة مئوية.
سداسي هيدرات كلوريد الحديد (III) (FeCl 3< / sub> & middot ؛ 6H2< / sub>O)	Supelco	103943	لمحلول مخزون الحديد
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (ملح إبسوم) (MgSO4< / sub>& middot; 7H 2 < / sub >O)	Sigma-Aldrich	230391	لحل مخزون بروك I.
رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز (II) (MnCl2< / sub> & middot ؛ 4H2< / sub>O)	Sigma-Aldrich	SIALM5005-100G	لحل مخزون العناصر النزرة.
مقبس واي فاي ذكي صغير ، مراقبة الطاقة	Tapo	Tapo P110	لمراقبة استهلاك الطاقة
N-Z-Amine A - الكازين المائي الأنزيمي	يستخدم Sigma-Aldrich	C0626-500G	N-Z-AMINE-A كمصدر للأحماض الأمينية.
مشبك الورق (أو غيرها من الأسلاك القوية)	لا شيء		لثقب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل.
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (فوسفات أحادي البوتاسيوم) (KH2< / sub>PO4< / sub>)	Sigma-Aldrich	P0662	لمحلول مخزون بروك الأول.
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	اختياري ، لاستخراج الحمض النووي الجيني في المختبر
ثنائي هيدرات موليبدات الصوديوم (Na 2< / sub >MoO 4< / sub> & middot ؛ 2H 2 < / sub >O)	Sigma-Aldrich	M1651-100G	لحل مخزون العناصر النزرة.
ديكاهيدرات رباعي بورات الصوديوم (بوراكس) (Na2B4O7· 10H2< / sub>O)	Sigma-Aldrich	S9640	لحل مخزون العناصر النزرة.
مقياس الطيف الضوئي	BMG	SPECTROstar OMEGA	لقياس OD عند 600 نانومتر. يمكن استخدام مقاييس الطيف الضوئي الأخرى التي يمكنها قراءة OD عند 600 نانومتر.
حمض الكبريتيك (مخفف بنسبة 1: 1 بالماء) (H2< / sub>SO4< / sub>)	الكيميائية العلمية الحرارية	11337588	تستخدم لضبط درجة الحموضة لمحلول مخزون بروك II / III إلى درجة حموضة نهائية تبلغ 2 &ndash ؛ 3.
خلاط حراري	DLab	HM100-Pro	يمكن أيضا استخدام خلاطات حرارية أخرى ؛ الاعتبار الرئيسي هو القدرة على الحفاظ على 65 & 75 درجة ؛ درجات الحرارة C و 400 دورة في الدقيقة
Uracil (C4< / sub>H4< / sub>N2< / sub>O2< / sub>)	Sigma-Aldrich	U0750	pyrE هو علامة وراثية شائعة تستخدم في S. acidocaldarius< / em>. يجب استكمال سلالات الحذف باليوراسيل للنمو. المكملات ليست مطلوبة بشكل صارم لسلالة DSM639 البرية ، ولكن يتم تضمينها هنا حيث قد تتضمن التجارب المستقبلية سلالات الحذف.
ثنائي هيدرات كبريتات الفاناديل (VOSO4· 2H2O)	Sigma-Aldrich	204862	لحل مخزون العناصر النزرة.
كبريتات الزنك سباعي الهيدرات (ZnSO4< / sub>& middot; 7H2< / sub>O)	Sigma-Aldrich	221376	لحل مخزون العناصر النزرة.