دراسة مقارنة لمصفوفات الغشاء القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية البشرية وتوليد الأعضاء المعوية

Janny Pineiro-Llanes; Lais da Silva; John Huang; Rodrigo Cristofoletti

doi:10.3791/66277

Method Article

دراسة مقارنة لمصفوفات الغشاء القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية البشرية وتوليد الأعضاء المعوية

DOI:

10.3791/66277

⸱

March 15th, 2024

Janny Pineiro-Llanes¹ , Lais da Silva¹ , John Huang² , Rodrigo Cristofoletti¹

¹Center for Pharmacometrics & Systems Pharmacology, Department of Pharmaceutics, University of Florida, ²TheWell Bioscience, Inc

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت المواد العضوية أدوات قيمة لنمذجة الأمراض. توجه المصفوفة خارج الخلية (ECM) مصير الخلية أثناء توليد الأعضاء ، ويمكن أن يؤدي استخدام نظام يشبه الأنسجة الأصلية إلى تحسين دقة النموذج. تقارن هذه الدراسة توليد العضويات المعوية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في ECM المشتقة من والهلاميات المائية الخالية من xeno.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في سلوك الخلية وتطورها. المواد العضوية المتولدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي في دائرة الضوء في العديد من مجالات البحث. ومع ذلك ، فإن عدم وجود إشارات فسيولوجية في مواد زراعة الخلايا الكلاسيكية يعيق تمايز iPSC الفعال. يوفر دمج ECM المتاح تجاريا في زراعة الخلايا الجذعية إشارات فيزيائية وكيميائية مفيدة لصيانة الخلايا. تتكون منتجات الغشاء القاعدي المشتقة تجاريا من من بروتينات ECM وعوامل النمو التي تدعم صيانة الخلايا. نظرا لأن ECM يحمل خصائص خاصة بالأنسجة يمكنها تعديل مصير الخلية ، يتم استخدام المصفوفات الخالية من xeno لتدفق الترجمة إلى الدراسات السريرية. في حين أن المصفوفات المتاحة تجاريا تستخدم على نطاق واسع في hiPSC والعمل العضوي ، لم يتم تقييم معادلة هذه المصفوفات بعد. هنا ، أجريت دراسة مقارنة لصيانة hiPSC وتوليد العضويات المعوية البشرية (hIO) في أربع مصفوفات مختلفة: Matrigel (Matrix 1-AB) ، Geltrex (Matrix 2-AB) ، Cultrex (Matrix 3-AB) ، و VitroGel (Matrix 4-XF). على الرغم من أن المستعمرات تفتقر إلى شكل دائري تماما ، إلا أنه كان هناك حد أدنى من التمايز التلقائي ، حيث كان أكثر من 85٪ من الخلايا تعبر عن علامة الخلايا الجذعية SSEA-4. أدت المصفوفة 4-XF إلى تشكيل كتل مستديرة ثلاثية الأبعاد. أيضا ، أدت زيادة تركيز العوامل التكميلية والنمو في الوسائط المستخدمة لصنع محلول هيدروجيل Matrix 4-XF إلى تحسين تعبير hiPSC ل SSEA-4 بمقدار 1.3 ضعف. أدى تمايز Matrix 2-AB - الحفاظ على hiPSC إلى عدد أقل من الإطلاقات الكروية خلال المرحلة المتوسطة / الخلفية مقارنة بالأغشية القاعدية الأخرى المشتقة من. بالمقارنة مع الآخرين ، تؤدي المصفوفة العضوية الخالية من xeno (Matrix 4-O3) إلى hIO أكبر وأكثر نضجا ، مما يشير إلى أنه يمكن تسخير الخصائص الفيزيائية للهلاميات المائية الخالية من xeno لتحسين توليد المواد العضوية. إجمالا ، تشير النتائج إلى أن الاختلافات في تكوين المصفوفات المختلفة تؤثر على مراحل تمايز IO. تعمل هذه الدراسة على زيادة الوعي حول الاختلافات في المصفوفات المتاحة تجاريا وتوفر دليلا لتحسين المصفوفة أثناء عمل iPSC و IO.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون ديناميكي ومتعدد الوظائف للأنسجة يلعب دورا مركزيا في تنظيم سلوك الخلية وتطورها. كشبكة معقدة ، فإنه يوفر الدعم الهيكلي ، والروابط اللاصقة للخلايا¹ ، وتخزين عوامل النمو والسيتوكينات التي تنظم إشارات الخلية. على سبيل المثال ، أثناء التئام الجروح ، يعمل ECM كسقالة للخلايا المهاجرة وكخزان لعوامل النمو المشاركة في إصلاح الأنسجة². وبالمثل ، يمكن أن يؤدي عدم التنظيم في ECM إلى زيادة في شدة الأمراض المختلفة مثل التليف والسرطان ^3,4. أثناء التطور الجنيني ، يوجه ECM تشكل الأنسجة. على سبيل المثال ، في تطور القلب ، تلعب مكونات ECM دورا في إنشاء البنية والوظيفة الصحيحة لأنسجة القلب⁵. أظهر أكثر من عقد من الأبحاث أن صلابة البيئة المكروية وحدها ^6,7 يمكنها التحكم في مواصفات نسب الخلايا الجذعية. لذلك ، ليس من المستغرب أنه أثناء تمايز الخلايا في المختبر ، يؤثر ECM على مصير الخلايا الجذعية من خلال توفير إشارات للتمايز.

يمكن توليد المواد العضوية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). مطلوب البدء بخط iPSC مميز بشكل صحيح لتوليد المواد العضوية بنجاح. ومع ذلك ، فإن عدم وجود إشارات فسيولوجية في مواد زراعة الخلايا الكلاسيكية يعيق التمايز الفعال iPSC وتوليد المواد العضوية. علاوة على ذلك ، أكدت الأبحاث الحديثة على أهمية تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتفاعلات بين الخلايا و ECM⁸ ، وكذلك الإشارات الميكانيكية والهندسية⁹^،¹⁰^،¹¹ في سياق التوسع العضوي والتمايز¹². سيتضمن تطوير التكنولوجيا العضوية من خلال تحسين قابلية التكاثر دمج إشارات فيزيائية وكيميائية خاصة بالأنسجة.

تهدف الكائنات العضوية إلى تلخيص الأنسجة الأصلية داخل بيئة دقيقة مماثلة من الناحية الفسيولوجية. يعد اختيار نظام ECM الذي يحاكي عن كثب الأنسجة الأصلية ECM أمرا بالغ الأهمية لتحقيق الأهمية الفسيولوجية فيما يتعلق بسلوك الخلية ووظيفتها والاستجابة للمنبهات¹³. يمكن أن يؤثر اختيار مكونات ECM على تمايز الخلايا الجذعية إلى أنواع معينة من الخلايا داخل الجهاز العضوي. يمكن أن توفر بروتينات ECM المختلفة ومجموعاتها إشارات توجه مصير الخلية¹⁴. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات أن استخدام مكونات ECM محددة يمكن أن يعزز تمايز الخلايا الجذعية المعوية إلى أنواع الخلايا المعوية الناضجة ، مما يؤدي إلى عضويات معوية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية¹⁵. في حين أن المواد العضوية هي أداة قيمة أثناء نمذجة المرض واختبار الأدوية ، فإن اختيار نظام ECM مناسب أمر محوري لهذا التطبيق. يمكن لنظام ECM المناسب أن يعزز دقة نمذجة المرض من خلال إنشاء بيئة دقيقة تشبه الأنسجة المصابة¹⁶. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد ECM الخاص بالأنسجة في توليد مواد عضوية تلخص بشكل أفضل الأنماط الظاهرية المرتبطة بالمرض والاستجابات الدوائية¹⁷. يعد تحسين نظام ECM المستخدم في التمايز العضوي أمرا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج التمايز المرجوة.

تستخدم أنظمة الأغشية القاعدية المتاحة تجاريا والمشتقة من مصادر ECM الحيوانية (على سبيل المثال ، Matrigel ، Cultrex) والهيدروجيل الخالي من xeno (على سبيل المثال ، VitroGel) على نطاق واسع في iPSC وأبحاث المواد العضوية. وضعت الشركات التي تقوم بتسويقها والباحثون الذين يستخدمونها العديد من التعليمات لمنتجاتهم وتطبيقاتهم المحددة على مر السنين. العديد من هذه التعليمات بمثابة دليل لتوليد هذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، فقد لوحظ الفوائد والنكسات المرتبطة بخصائصها الجوهرية بشكل فردي من قبل العديد من¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹. ومع ذلك ، لا يوجد سير عمل منهجي لتوجيه اختيار الأنظمة المثلى ل iPSC والعمل العضوي. هنا ، يتم توفير سير عمل لتقييم معادلة أنظمة ECM بشكل منهجي من مصادر مختلفة ل iPSC والعمل العضوي. هذه دراسة مقارنة لصيانة خطين مختلفين من iPSC البشري (hiPSC) وتوليد عضويات معوية بشرية (hIO) في أربع مصفوفات مختلفة: Matrigel (Matrix 1-AB) و Geltrex (Matrix 2-AB) و Cultrex (Matrix 3-AB) و VitroGel (Matrix 4-XF). بالنسبة للثقافة العضوية ، تم استخدام أربعة إصدارات من المصفوفة الخالية من xeno VitroGel التي تم تحسينها مسبقا للثقافة العضوية: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1) ، ORGANOID 2 (Matrix 4-O2) ، ORGANOID 3 (Matrix 4-O3) ، ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). أيضا ، تم استخدام المصفوفات المشتقة من المحسنة للعضويات: Matrigel عالية التركيز (Matrix 1-ABO) و Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). تم استخدام وسائط زراعة الخلايا الجذعية المتاحة تجاريا (mTeSR Plus) ومجموعة التمايز العضوي (مجموعة STEMdiff العضوية المعوية). يجمع هذا البروتوكول بين التعليمات الفردية من الشركات المصنعة للمنتجات والخبرات المعملية لتوجيه القارئ نحو التحسين الناجح ل ECM لعملهم الخاص ب iPSC والعضوية. إجمالا ، يؤكد هذا البروتوكول والنتائج التمثيلية على أهمية اختيار البيئة المكروية المثلى لعمل الخلايا الجذعية والتمايز العضوي.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة hiPSC

تنبيه: تتم جميع الأعمال في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) باتباع تقنيات التعقيم القياسية. يجب اتباع معايير السلامة OSHA للمختبرات ، بما في ذلك الاستخدام السليم لمعدات الحماية الشخصية مثل معاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية.

إعداد حصصا المصفوفات ووسائط زراعة الخلايا
1. بالنسبة للأغشية القاعدية المشتقة من المتاحة تجاريا (BMs; Matrix 1-AB ، Matrix 2-AB ، Matrix 3-AB) ، قم بإعداد حصص أحجام العمل وفقا لتوصية الشركة المصنعة الملخصة في الجدول 1 وتخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. تجنب تشكيل الفقاعات. إذا تم تشكيل بعض الفقاعات ، قبل التخزين ، عينات أجهزة الطرد المركزي عند 4 °C ، عند <200 × g ، لمدة ~ 1-2 دقيقة لإجبار الفقاعة على الظهور على السطح.
  ملاحظة: يساعد عمل الحصص ذات الاستخدام الواحد على تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة التي تعطل بنية ECM. نظرا لأن تركيز BM يختلف باختلاف عدد اللوت ، تأكد من اتباع توصية الشركة المصنعة لإعداد القسامات ذات الاستخدام الواحد وصنع محاليل الطلاء. BMs عالية التركيز لزجة ويصعب ماصة. استخدم الأطراف الباردة المخزنة مسبقا في -20 درجة مئوية.
2. تحضير وسط زراعة الخلايا الجذعية وفقا لتوصية الشركة المصنعة. لتحضير الوسائط الكاملة المحددة المتاحة تجاريا والمستخدمة في هذا البروتوكول ، أضف 100 مل من كوكتيل مكمل 5x إلى 400 مل من الوسط القاعدي. بعد ذلك ، امزج هذه الوسائط جيدا واحصل على القسمة في أحجام 40 مل ، مخزنة عند 20 درجة مئوية. للاستخدام ، قم بإذابة كل حصة من الوسائط الكاملة ، أو استخدم الوسط الكامل المقتبس على الفور ، أو قم بتخزينه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. لا تقم بإعادة تجميده.
3. تحضير حصص من وسط الخلايا الجذعية الكامل الذي يحتوي على 3x تركيز كوكتيل الملحق لتحضير Matrix 4-XE Hydrogel ، أي تمييع ملحق 5x إلى 3x.
طلاء بلاستيك زراعة الأنسجة ب BMs المشتقة من (Matrix 1-3AB)
1. قم بإعداد ما يلي قبل البدء: احتفظ دائما بالمصفوفات في الثلج عند الذوبان والتعامل معها لمنعها من التبلور. استخدم الوسائط الباردة لتحضير المصفوفات المخففة. قم بإعداد ما يكفي من الآبار المكررة لكل حالة لفحص الخلايا قبل البدء وفي كل مرحلة من مراحل عملية تمايز hiPSC وتوليد hIO العضوي.
  ملاحظة: هنا ، تم استخدام 24 لوحة بئر لهذه الدراسة. راجع الجدول 2 لمعرفة أحجام الطلاء الموصى بها لأحجام الألواح الأخرى.
2. لكل نوع من أنواع المصفوفات ، قم بإعداد 25 مل من DMEM / F-12 المتقدم على البارد تحتوي على 15 مللي متر HEPES في أنبوب مخروطي 50 مل. احتفظ بها على الجليد.
3. أضف المصفوفات المذابة إلى DMEM / F-12 المتقدم على البارد واخلطها جيدا. حافظ على برودة الوسائط أثناء عملية الخلط. تحقق بصريا من الخلط المتجانس من خلال التأكد من عدم وجود كتل.
4. استخدم على الفور محاليل المصفوفات المخففة لطلاء كل بئر محدد للاستخدام (250 ميكرولتر / بئر في حالة استخدام 24 لوحة بئر).
5. قم بإمالة أدوات الاستزراع برفق لنشر محلول الطلاء بالتساوي عبر السطح. احتضان في درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
  ملاحظة: إذا لم يتم استخدامها على الفور ، يمكن تخزين اللوحة في 2-8 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع بعد الطلاء ، ولكن يجب أن تكون مختومة بغشاء شفاف لمنع التبخر. عند استخدام الأطباق المخزنة ، دعها تصل إلى درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
6. قم بإزالة المحلول الزائد برفق باستخدام ماصة مصلية أو عن طريق الشفط. تأكد من عدم خدش السطح المطلي.
7. أضف وسط الخلايا الجذعية الكامل الدافئ على الفور (50٪ من الحجم الكلي المطلوب لبئر معين ، على سبيل المثال ، 250 ميكرولتر / بئر في حالة استخدام لوحة 24 بئرا).
طلاء البلاستيك زراعة الأنسجة مع هيدروجيل ماتريكس 4-XE
1. قم بإعداد ما يلي قبل البدء: أخرج هيدروجيل ماتريكس 4-XE من الثلاجة واتركه دافئا إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). قم بإعداد ما يكفي من الآبار المكررة لكل حالة لفحص الخلايا قبل البدء وفي كل مرحلة من مراحل عملية تمايز hiPSC وتوليد hIO العضوي.
  ملاحظة: هنا ، تم استخدام 24 لوحة بئر لهذه الدراسة. راجع الجدول 3 لمعرفة أحجام الطلاء الموصى بها لأحجام الألواح الأخرى.
2. قم بإعداد وسائط زراعة خلايا جذعية كاملة تحتوي على تركيز عامل نمو 3x مقارنة بالصيغة القياسية لزراعة الخلايا الجذعية (3x وسط الخلايا الجذعية).
3. امزج هيدروجيل ماتريكس 4-XE ووسط الخلايا الجذعية 3x بنسبة خلط 2: 1 فولت / فولت وماصة بلطف لأعلى ولأسفل 5x-10x لخلطها جيدا.
4. انقل خليط الهيدروجيل إلى طبق جيد وقم بإمالة أدوات الاستزراع بعناية لنشر الخليط بالتساوي على السطح. استخدم 250 ميكرولتر / بئر في حالة استخدام لوحة 24 بئر. انظر الجدول 3 للاطلاع على المجلدات الموصى بها.
5. انتظر 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل هلام لينة. أثناء عملية تكوين الهيدروجيل ، لا تعطل الهيدروجيل عن طريق إمالة اللوحة أو هزها.
hiPSC خالية من الإنزيم التكتل تمرير والبذر
1. قم بإعداد ما يلي قبل البدء: على الأقل 1 ساعة قبل المرور ، قم بتغطية الأواني البلاستيكية المرغوبة بالمصفوفات. القسمة كافية كاملة الخلايا الجذعية وسائل الإعلام ودافئة إلى درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية). تجنب دورات التسخين المتعددة للوسائط الكاملة.
  ملاحظة: تصف الخطوات أدناه مرور ثقافة متقاربة بالفعل و >90٪ من iPSCs على لوحة من 6 آبار وزرعها في لوحات 24 بئرا للتمييز بين الكائنات العضوية المعوية.
2. شطف الخلايا مع 1 مل من D-PBS (بدون Ca++ و Mg++) ونضح. أضف 1 مل من كاشف اختيار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخالي من الإنزيم ، وقم بتدوير بعناية لينتشر بالتساوي ، واستنشق في غضون دقيقة واحدة. تحتاج المستعمرات فقط إلى التعرض لطبقة رقيقة من السائل.
3. احتضان في 37 درجة مئوية حتى تبدأ المستعمرات تبدو أقل ضغطا ، الأمر الذي سيستغرق ~ 3-8 دقائق.
  ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة الأمثل حسب خط الخلية المستخدم. يجب تحديد وقت الحضانة الأمثل عند تمرير كل خط خلية بكاشف اختيار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخالية من الإنزيم لأول مرة.
4. أضف 1 مل من وسائط الخلايا الجذعية الكاملة. افصل المستعمرات عن طريق النقر بعناية بقوة على جانب اللوحة. تأكد من إمساك اللوحة باليد الأخرى.
5. باستخدام ماصة سعة 1 مل أو أكبر ، انقل تعليق كتل الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. تقييم حجم الكتل باستخدام مجهر برايت فيلد والتأكد من أن حجم كتلة الخلية يتراوح بين 50-200 ميكرومتر ؛ إذا كانت أكبر ، هز الأنبوب المخروطي برفق لتكسيرها.
6. ارسم شبكة x-y في قاع كل بئر من صفيحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا سيتم استخدامها لحساب التكتلات وإضافة 50 ميكرولتر من D-PBS إلى كل بئر. يوصى بحساب متوسط الكتل المحسوبة من 3 آبار.
7. تأكد من توزيع كتل الخلايا بالتساوي عن طريق هز الأنبوب برفق ثم نقل 5 ميكرولتر من تعليق الكتلة إلى كل بئر من آبار اللوحة ذات القاع المسطح المكونة من 96 بئرا.
  ملاحظة: لا يوصى باستخدام عداد خلايا تلقائي لحساب الكتل. يوصى بالعد اليدوي.
8. احسب العدد الإجمالي للكتل في كل بئر يبلغ قطرها 50-200 ميكرومتر. إذا كان قطر معظم كتل الخلايا > 200 ميكرومتر (انظر الشكل 1) ، كرر الخطوات 1.4.5 - 1.4.7.
9. احسب الحجم (بالميكرولتر) للمعلق المتكتل المطلوب لبذر 6000 كتلة على النحو التالي:
  
  ملاحظة: يجب تحسين كثافة البذر المثلى مع كل خط خلية. لتحديد كثافة البذر المثلى ، يوصى بإجراء البذر الأولي في مجموعة من كثافات التكتل (على سبيل المثال ، 4000 و 5000 و 6000 كتلة لكل بئر) والتحقق من 24-48 ساعة بعد البذر إذا تم الوصول إلى التقاء 85٪ -90٪.
10. كمراقبة للجودة ، افصل عينة من الخلايا لفحص قياس التدفق الخلوي لعلامات الخلايا الجذعية. راجع الجدول 4 للحصول على قائمة بالعلامات الشائعة.
11. افصل الحجم المطلوب من تعليق الكتلة iPSC للبذور على الآبار المطلية ب ECM مختلفة إلى أنابيب منفصلة سعة 15 مل.
12. جهاز طرد مركزي الأنبوب الذي يحتوي على محلول التكتل iPSC عند 200 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة الوسائط التي تحتوي على كاشف اختيار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخالية من الإنزيمات. أثناء انتظار الطرد المركزي ، أضف 50٪ من الحجم المطلوب لكل بئر إلى كل بئر إذا لم يتم ذلك بالفعل.
استزراع iPSC في لوحات تحتوي على مصفوفات مشتقة من
1. أعد تعليق كتل iPSCs برفق في الحجم المحسوب بنسبة 50٪ من وسائط الخلايا الجذعية الكاملة للحصول على الكثافة المطلوبة ولوحة خليط الخلية الكلي على آبار مطلية تحتوي على 50٪ من وسائط الخلايا الجذعية الكاملة المحسوبة.
  ملاحظة: قد تكون إضافة مثبط ROCK-1 ضرورية لبعض خطوط الخلايا أو عندما تكون الكتل 50 ميكرومتر أو أصغر. يوصى بإضافة <10 ميكرومتر لتجنب المعدة المبكرة.
2. أضف بعناية وسيطا به خلايا أعلى المصفوفات ، 250 ميكرولتر / بئر في حالة استخدام لوحة 24 بئرا. لمعرفة الحجم الموصى به لوسط الخلية لألواح الآبار ذات الحجم الآخر ، تحقق من الجدول 2.
3. قم بإمالة اللوحة في عدة حركات قصيرة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى جانب لتوزيع كتل الخلية بالتساوي.
  تنبيه: يؤدي التوزيع غير المتكافئ للمجاميع إلى زيادة التمايز التلقائي للiPSCs البشرية. يؤدي الانتشار الدائري لتعليق الكتل إلى تكتل كتل على حدود الآبار وكثافة أقل في المركز.
4. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية وإجراء تغييرات متوسطة باستخدام وسائط الخلايا الجذعية الكاملة يوميا أو كل يومين. عند إجراء تغييرات متوسطة ، قم بتقييم الثقافات بصريا لمراقبة النمو وتحديد ما إذا كانت الخلايا تتطلب وقتا للمرور أو جاهزة للتمايز. لتخطي يومين متتاليين من التغذية ، أضف 2x حجم الوسط المطلوب ليوم واحد.
ثقافة iPSC في لوحات تحتوي على مصفوفة 4-XE
1. أعد تعليق كتل iPSCs برفق في الحجم المحسوب الإجمالي لوسائط الخلايا الجذعية الكاملة 3x للحصول على الكثافة المطلوبة.
2. أضف بعناية وسطا به خلايا أعلى الهيدروجيل 250 ميكرولتر / بئر إذا كنت تستخدم صفيحة 24 بئرا. لمعرفة الحجم الموصى به لوسط الخلية لألواح الآبار ذات الحجم الآخر ، راجع الجدول 3.
  تنبيه: سوف ينتفخ الهيدروجيل ويشغل حجما أكبر من الحجم الطازج. سيتم تضمين مستعمرات iPSC جزئيا في الهيدروجيل الموجود أسفل اللوحة ، لذلك يوصى بتغيير 50٪ -80٪ من الوسط العلوي دون إزعاج الهيدروجيل.
3. حرك اللوحة في عدة حركات سريعة وقصيرة ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع كتل الخلية بالتساوي.
4. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة. قم بتغيير وسط الخلية باستخدام وسائط الخلايا الجذعية الكاملة. إجراء تغييرات متوسطة يوميا أو كل يوم ؛ بالنسبة للأخير ، أضف 2x حجم الوسيط.
5. فحص الثقافات بصريا لتتبع نموها عند وصولها إلى المرحلة المناسبة للتمايز.

figure-protocol-2
الشكل 1: الحجم الأمثل للتكتل. صور لكتل من خط خلية iPSC SCTi003A تصور مثالا على حجم التكتل الأمثل. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تمايز hiPSC وتوليد الأعضاء المعوية

قم بإعداد ما يلي قبل البدء: إعداد حصص وسط التمايز المطلوبة لكل مرحلة. بعد إذابة القسامات ، استخدمها على الفور. لا تعيد التجميد. اتبع الجدول 5 للحصول على دليل عام لكل نوع من أنواع وسائط المرحلة والأحجام اللازمة للوحة 24 بئرا.
ملاحظة: قد يختلف الوقت الأمثل في كل مرحلة تمايز لكل خط خلية. يوصى بالتحقق من تعبير كل علامة خلية مرحلة لتحسين فعالية التمايز. لم يتم تضمين التقييم الدوري للتعبير الجيني على مزارع iPSCS في هذا البحث لأننا استفدنا من الدفعات المؤهلة من البائعين في الممرات المنخفضة ، ولكن يوصى به كخطوة لمراقبة الجودة لخطوط iPSC الجديدة / غير المؤهلة بعد خلال خطوات التمايز اللاحقة.
المرحلة 1: الأديم الباطن النهائي (DE)
1. لتقييم الاستعداد لبدء التمايز ، تحقق من المعايير التالية.
  1. باستخدام المجهر ، قم بتقييم التقاء مستعمرات الخلايا الجذعية ومقدار التمايز التلقائي في الثقافة. لا تعتمد فقط على التقييم المورفولوجي وحده. يجب أن يكون الالتقاء الأمثل بين 85٪ -90٪ (فوق ~ 10⁵ خلايا / سم²) ، ويجب أن يكون الحد الأدنى من التمايز التلقائي الملاحظ <5٪ تمايز.
  2. اجمع الخلايا من بئر قرباني لتوصيف قياس التدفق الخلوي لعلامات hiPSC قبل متابعة الخطوة التالية. تم استخدام استراتيجية بوابات التشتت الأمامية والجانبية لتوصيف قياس التدفق الخلوي التمثيلي. إذا كانت الخلايا تفي بالمعايير المثلى ، فابدأ التمايز. معايير اجتياز الخلية هي تعبير بنسبة >85٪ عن 3 علامات مثالية (الجدول 4) ، خاصة في حالة خطوط iPSC الجديدة / غير المؤهلة بعد في المختبر.
    ملاحظة: تخضع مزارع iPSC المزروعة على مصفوفات مختلفة لنفس العملية الشاملة مع نمو iPSC فقط على Matrix 4-XE ، مما يتطلب تغييرات وسائط أكثر رقة حتى لا تزعج الخلايا شبه المدمجة. من المتوقع موت الخلايا بشكل كبير أثناء تحريض الأديم الباطن النهائي ، حيث تكون الخلايا حساسة بشكل خاص في هذه المرحلة. توخي الحذر أثناء التغييرات المتوسطة ، بهدف تقليل المدة التي تتعرض فيها الخلايا خارج بيئة الحضانة التي تبلغ 37 درجة مئوية قدر الإمكان.
2. ابدأ تمايز مستعمرات الخلايا كما هو موضح أدناه.
  1. اليوم 0: قم بتسخين حصة من DE متوسطة إلى 37 درجة مئوية. لتجنب تغيير طبيعة الوسائط من دورات الاحترار والتبريد، تأكد من تسخين الحجم المطلوب لليوم 0 فقط (0.7 مل/بئر).
  2. استنشاق الوسائط من hiPSCs. أضف بعناية 0.7 مل من DE Medium لكل بئر أسفل جانب البئر. تجنب السحب القاسي الذي يمكن أن يفصل المستعمرات أو يتلفها. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.
  3. اليوم 1: قم بتسخين حصة من وسط DE تحتوي فقط على الحجم المطلوب لليوم 1 (0.5 مل / بئر) إلى 37 درجة مئوية. نضح وسط DE من الخلايا وأضف بعناية 0.5 مل من وسط DE لكل بئر أسفل جانب البئر. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.
  4. اليوم 3: الخلايا جاهزة للفحص لتشكيل الأديم الباطن النهائي. راجع الجدول 4 للاطلاع على العلامات الموصى بها. قبل الشروع في المرحلة التالية ، ضح ببئر لإجراء توصيف قياس التدفق الخلوي لعلامات محددة مرتبطة ب DE. تم استخدام استراتيجية بوابات التشتت الأمامية والجانبية لتوصيف قياس التدفق الخلوي التمثيلي. يوصى بفحص تعبير أكثر من علامة 1 ، خاصة في حالة خطوط iPSC الجديدة / غير المؤهلة بعد في المختبر.
المرحلة 2: ميدجوت / هندجوت (MH)
1. اليوم الثالث: قم بتسخين حجم وسط MH اللازم لليوم 3 فقط (0.5 مل / بئر) إلى 15 - 25 درجة مئوية. نضح وسط DE من الخلايا واستبدله ب 0.5 مل من وسط MH. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ و 95٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.
2. الأيام 4 - 9: قبل التغييرات المتوسطة اليومية ، استخدم المجهر عند تكبير 2x أو 4x لتقييم تكوين الأجسام الكروية عن طريق التحقق من الهياكل ثلاثية الأبعاد المرئية (قد يحدث من اليوم 4) ؛ كرويات حرة الطفو (قد تحدث من اليوم 5).
3. بمجرد أن تبدأ الأجسام الكروية في الانفصال ، استخدم ماصة سعة 1 مل لنقل الوسط برفق من الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل لتقييم عدد الأجسام الكروية المنفصلة عن الخلايا.
  ملاحظة: تجنب أي قوة القص التي قد تفصل هياكل 3D من طبقة واحدة. بمجرد أن تصبح جاهزة ، سوف تنفصل الأجسام الكروية من تلقاء نفسها.
4. إذا تم فصل أقل من 50 كرويا ، فقم بطرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة الوسط القديم ، وأعد تعليق الكرات على 0.5 مل / بئر من الوسط وانقلها إلى البئر المعنية حتى تنضج ما يكفي من الكائنات الكروية.
  ملاحظة: تلعب مدة التعرض لوسط الأمعاء الوسطى / الأمعاء الخلفية دورا حاسما في تحديد الهوية الإقليمية لتطوير عضويات معوية دقيقة ، مثل الاثني عشر (التعرض الأقصر) أو الدقاق (التعرض الأطول). لتحقيق ثقافات أكثر اتساقا بنفس الهوية ، استهدف جمع الأجسام الكروية المعرضة لوسط الأمعاء الوسطى / الأمعاء الخلفية في وقت واحد.
5. كرر الخطوة 2.3.3 حتى يتم فصل ما يكفي من الأجسام الكروية لتضمين وبدء ثقافة الأعضاء المعوية البشرية (hIO).
6. قبل الشروع في المرحلة التالية ، افصل عينة من الأجسام الكروية وقم بإجراء توصيف قياس التدفق الخلوي لعلامات محددة مرتبطة ب Midgut / Hindgut (MH). تم استخدام استراتيجية بوابات التشتت الأمامية والجانبية لتوصيف قياس التدفق الخلوي التمثيلي. راجع الجدول 4 للحصول على قائمة بالعلامات شائعة الاستخدام. يوصى بفحص تعبير أكثر من علامة 1 ، خاصة في حالة خطوط iPSC الجديدة / غير المؤهلة بعد في المختبر.
المرحلة 3: التضمين الكروي
1. قم بإعداد ما يلي قبل البدء في الإجراء.
  1. إذابة حصص ماتريكس 1-ABO وماتريكس 3-ABO على الجليد. ضع في اعتبارك عدد الأجسام الكروية التي تم جمعها لتحديد الكمية الإجمالية للمصفوفة المطلوبة إذا كانت هناك حاجة إلى 30-40 ميكرولتر من المصفوفة لكل قبة.
  2. تحضير 25 مل من البرد Advance DMEM / F-12 تحتوي على 15 مللي متر HEPES. ECMs عالية التركيز لزجة ويصعب ماصة. ضع علبة من أطراف ماصة معقمة سعة 100 ميكرولتر عند -20 درجة مئوية لتحضير أطراف باردة يمكن أن تساعد في العملية. تحضير حصص وسط النمو العضوي المعوي (OGM) ، والذي يتطلب 4 رضعات (0.5 مل / بئر لكل تغذية). انظر الجدول 5 للاطلاع على التحضير.
  3. قم بإذابة حصة من ملحق OGM على الجليد. بعد إذابة القسامات ، استخدمها على الفور. لا تعيد التجميد. قم بتخزين OGM الكامل في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. تحضير OGM يحتوي على 3x من الملحق مقارنة بالصيغة القياسية ل (3x OGM). أخرج Matrix 4-XFO1 Matrix 4-XFO4 من الثلاجة واتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
2. بالنسبة للنظام المشتق من ، قم بتنفيذ الخطوات الموضحة أدناه.
  1. ضع صفيحة زراعة أنسجة معقمة مكونة من 24 بئرا في الحاضنة لتسخينها إلى 37 درجة مئوية أثناء تحضير الكرويات والمصفوفات. دع الكرويات المجمعة تستقر في قاع أنبوب مخروطي سعة 15 مل. نضح بعناية وتجاهل طاف .
    ملاحظة: لإجراء مقارنة أكثر دقة لتأثير المصفوفات ، تأكد من إبقاء الكرويات التي تم جمعها من hiPSC متباينة على كل مصفوفة في أنابيب منفصلة.
  2. أضف 1 مل من DMEM / F-12 مع 15 mM HEPES إلى الأجسام الكروية. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية).
  3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية بعناية. يوصى بالبدء في الإزالة باستخدام ماصة سعة 1 مل والتبديل إلى ماصات 100 ميكرولتر وحتى 10 ميكرولتر لإزالة أكبر قدر ممكن دون إزعاج حبيبات الأجسام الكروية.
    ملاحظة: كلما زاد حجم الوسائط المتبقية، زادت ضعف المصفوفات. يمكن أن تؤدي المصفوفات المخففة إلى مشاكل التبلور أو القباب اللينة. تؤدي القباب الأكثر ليونة إلى زيادة فرص الانهيار بأقل قدر من الاضطرابات.
  4. باستخدام ماصة ذات طرف ماصة بارد 100 ميكرولتر ، أضف 40 ميكرولتر / 50 كروية من المصفوفة الباردة (2-8 درجة مئوية) 1-ABO أو Matrix 3-ABO إلى الأنبوب الخاص بها. قم بتوزيع المواد الكروية برفق في المصفوفة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ~ 5x. لا تفرغ طرف الماصة تماما ، مما قد يؤدي إلى ظهور فقاعات.
  5. أحضر اللوحة من الحاضنة ، وباستخدام طرف ماصة بارد ، انقل الأجسام الكروية المدمجة برفق إلى وسط اللوحة باتباع الخطوات الموضحة في الشكل 2. تجنب توزيع Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO بسرعة كبيرة في طبق الاستزراع ، لأن هذا سيؤدي إلى تسطيح القبة.
  6. انقل الطبق بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة لضمان هلام القبة. كن حذرا بشكل خاص من أي اهتزاز أو حركة قاسية أثناء النقل وفي الحاضنة.
  7. أثناء احتضان القبة للتبلور ، قم بتسخين كمية كافية من OGM المعوي عند 37 درجة مئوية (0.5 مل / بئر) لعدد الآبار التي سيتم استخدامها.
    ملاحظة: قم بتسخين الحجم المطلوب فقط. تجنب دورات الاحترار والتبريد. تأكد من أن الوسائط دافئة قبل إضافتها إلى القبة ؛ يمكن أن تؤدي الوسائط الباردة إلى انهيار القبة.
  8. بعد 30 دقيقة ، أضف بعناية 0.5 مل من OGM المعوي إلى جانب البئر حتى لا تزعج القبة. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO₂ و 95 ٪ الرطوبة. قم بإجراء تغيير كامل المتوسط كل 3 - 4 أيام عن طريق إزالة الوسيط ثم إضافة وسيط جديد.
3. بالنسبة لأنظمة Matrix 4-XF العضوية ، اتبع الخطوات الموضحة.
  ملاحظة: يتضمن نظام Matrix 4-XF العضوي أربعة خيارات مختلفة (O1-O4) ؛ تختلف صياغة كل نوع في الروابط الوظيفية الحيوية والصلابة والقابلية للتحلل. وبالتالي ، يوصى بإجراء تجارب أولية لتحديد النوع الأمثل للتطبيق المحدد. يصف هذا البروتوكول استخدام الخيارات الأربعة لإيجاد تركيبة مثالية للعضويات المعوية المشتقة من hiPSC. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن هناك العديد من بروتوكولات الاستزراع التي يمكن استخدامها (على سبيل المثال ، تغليف 3D ، تغليف القبة) ، يتضمن هذا البروتوكول استخدام طريقة القبة بحيث يمكن المقارنة مباشرة مع الطرق الشائعة المستخدمة عند العمل مع أنظمة الأغشية القاعدية المشتقة من.
  1. أضف 1 مل / بئر من DMEM / F-12 المتقدم البارد الذي يحتوي على 16 mM HEPES إلى الأجسام الكروية المتولدة على نظام Matrix 4-XFO4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية).
    ملاحظة: للعثور على الصيغة المثلى للتطبيق ، تأكد من توزيع المواد الكروية في 4 أنابيب منفصلة قبل الطرد المركزي. يمكن أيضا أن تنضج الكائنات الكروية المتولدة على المصفوفات المشتقة من إلى عضويات معوية باستخدام هذا النظام.
  2. باستخدام ماصة 1 مل ، قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج الكائنات الكروية. أضف 50 ميكرولتر من 3x OGM إلى حبيبات كروية (~ 100 كروية). أضف 100 ميكرولتر من Matrix 4-XFO المحدد إلى التعليق الكروي 50 ميكرولتر واخلطه برفق 5x-10x مرات. حافظ على Matrix 4-XFO إلى 3x OGM عند نسبة خلط 2: 1 فولت / فولت للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1x.
  3. أضف 40 ميكرولتر من خليط هيدروجيل كروي إلى مركز صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. انقل الأطباق بعناية إلى حاضنة 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لا يتطلب Matrix 4-XFO حضانة 37 درجة مئوية للهلام. ومع ذلك ، يوصى بإبقاء الكائنات العضوية معرضة لظروف مماثلة عند مقارنتها بأنظمة Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO التي تتطلب 37 درجة مئوية لتحسين هلام القباب.
  4. بعد 30 دقيقة ، أضف بعناية 0.5 مل من OGM المعوي إلى جانب البئر حتى لا تزعج القبة. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO₂ و 95 ٪ الرطوبة. قم بإجراء تغيير كامل المتوسط كل 3 - 4 أيام عن طريق إزالة الوسيط ثم إضافة وسيط جديد.
hIO المرور والنضج
1. تحضير نفس المواد الكيميائية والمحاليل والكواشف كما هو الحال في الخطوة 2.4.1.
2. أضف 1-2 مل من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل (1 لكل حالة) وقم بالدوران لتغطية الأنبوب.
3. قم بإزالة المحلول المضاد للالتصاق وشطف الأنابيب ب 5 مل من D-PBS (بدون Ca ++ و Mg ++). قم بتغطية جميع الأنابيب المطلية واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة (15 - 25 درجة مئوية) لحين الحاجة.
4. نضح الوسيط من القباب. باستخدام ماصة 1 مل ، أضف 1 مل من DMEM / F-12 البارد إلى القبة مباشرة. الهدف هو فصل القباب عن اللوحة.
5. أضف 1 مل إضافي من DMEM / F-12 البارد إلى البئر وماصة لأعلى ولأسفل لحصاد أي عضويات متبقية. نقل إلى الأنابيب المخروطية المغلفة 15 مل.
  ملاحظة: تحقق من الحصاد الناجح للعضويات عن طريق فحص البئر بصريا تحت المجهر. إذا لوحظت أي عضويات متبقية ، كرر الخطوة 2.5.5.
6. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإجراء سحب لأعلى ولأسفل للتعليق لتفكيك المواد العضوية حتى يتم تحقيق تعليق شظية موحد بالحجم العضوي المطلوب (على سبيل المثال ، 100 - 500 ميكرومتر).
  ملاحظة: استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر للتحقق من توافق المواد العضوية مع الحجم الموصى به. يسهل استخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر عمليات تجزئة إضافية حسب الحاجة ، مما يضمن أن الشظايا يمكن أن تمر بسلاسة عبر طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر.
  تنبيه: تجنب تفتيت الشظايا إلى خلايا مفردة عن طريق السحب القاسي أو المطول.
7. حدد الكثافة العضوية المطلوبة إما عن طريق عد الشظايا أو استخدام نسبة الانقسام. افصل القسمة وقم بإجراء العد باستخدام نفس الإجراء كما في الخطوات 1.4.6-1.4.9 لحساب التكتل.
  ملاحظة: يجب تحسين الكثافة العضوية المثلى لكل سطر ؛ بشكل عام ، يوصى بكثافة 40-80 عضويا معويا لكل قبة.
8. تأكد من وضع الأنبوب على الثلج أثناء عملية عد المواد العضوية. بعد حوالي 5 دقائق ، ستستقر الشظايا العضوية في قاع الأنبوب بسبب الجاذبية.
  ملاحظة: كلما زاد حجم المحلول العضوي ، كلما استغرق الأمر وقتا أطول للاستقرار في القاع.
9. تخلص برفق من أكبر قدر ممكن من المواد الطافية والطبقة الغائمة المتكونة فوق المواد العضوية. في الممرات المبكرة عندما تنضج الكائنات العضوية ، تشمل هذه المرحلة الغائمة مصفوفة وخلايا فردية.
10. أضف 2 مل من DMEM / F-12 البارد عن طريق السحب مباشرة على الحبيبات. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية).
11. بالنسبة للنظام المشتق من، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باتباع نفس الخطوات الموضحة في الخطوات 2-4-2-4-2-9.
12. بالنسبة لنظام Matrix 4-XFO ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باتباع نفس الخطوات الموضحة في الخطوات 2.4.3.2-2.4.3.4.
  ملاحظة: عند العمل مع نظام Matrix 4-XFO ، يوصى باستخدام محلول استرداد عضوي خال من الهيدروجين لإزالة بقايا الهيدروجيل الأمثل. يوصى بحل الاسترداد هذا بشكل خاص عند التبديل من أنظمة الهيدروجيل الحيوانية إلى أنظمة الهيدروجيل الخالية من الأجانب لضمان التخلص من أي مادة أجنبية.

figure-protocol-3
الشكل 2. رسم تخطيطي للتقنية الموصى بها لتشكيل القبة. يصف المخطط العملية خطوة بخطوة الموصى بها لتشكيل قبة ناجحة لجميع الأنظمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. توصيف حجم IO

ملاحظة: تميز حجم المواد العضوية بصور برايت فيلد التي تم التقاطها بمعدل 4x و 10x. تم أتمتة تحليل معالجة الصور باستخدام MATLAB. يتم وصف الخطوات العامة للعملية أدناه ، ويتم تضمين عينة من الكود في الملف التكميلي 1.

حدد الدليل الذي يحتوي على الصور وقم بإدراج جميع ملفات الصور في الدليل. تهيئة الجدول لتخزين النتائج. اقرأ صور برايتفيلد في ملف.
حدد تحويل البكسل إلى ميكرومتر واضبط المقياس. إذا كانت الصورة لا تحتوي على شريط مقياس، فاطلب من المستخدم عامل التحويل من بكسل إلى ميكرومتر.
تحويل الصورة إلى تدرج الرمادي. قم بتطبيق مرشح Gaussian لتقليل التشويش في الصورة. قم بضبط عتبة الصورة المصفاة لفصل الكائنات العضوية عن الخلفية.
املأ الثقوب الصغيرة وقم بإزالة الأشياء الصغيرة لتنظيف الصورة الثنائية. قم بإجراء تحليل المكونات المتصلة لتحديد الكائنات العضوية الفردية وحساب خصائصها مثل المساحة والسنترويد وطول المحور الرئيسي وطول المحور الثانوي.
احسب حجم المحور العضوي بناء على أطوال المحاور الرئيسية والثانوية. اعرض المواد العضوية المجزأة على الصورة الأصلية وقم بتسميتها بحجمها. اطبع الأحجام العضوية وخزن النتائج في ملف .cvs.
ملاحظة: تم تحليل أول صورتين يدويا لتحديد المعلمات المثلى للانحراف المعياري لمرشح Gaussian والمنطقة إلى العتبة. يوفر الرمز الموجود في الملف التكميلي 1 مثالا على الإطار الأساسي لتحليل حجم الأعضاء من صور برايتفيلد. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من التحسين لتناسب المتطلبات المحددة لكل نوع صورة وجودتها. يمكن إجراء نفس العملية باستخدام برنامج مفتوح المصدر مثل FIJI من Image J.
اتبع الخطوات أدناه لاستخدام برنامج فيجي.
1. حدد تحويل البكسل إلى ميكرومتر واضبط المقياس. إذا كانت الصورة لا تحتوي على شريط مقياس، فاطلب من المستخدم عامل تحويل البكسل إلى ميكرومتر بالنقر فوق تحليل > ضبط المقياس.
2. قم بتحويل الصورة إلى تدرج الرمادي بالنقر فوق > الصورة اكتب > 8 بت. قم بتطبيق مرشح Gaussian لتقليل التشويش في الصورة بالنقر فوق > العملية تصفية > دعاية غاوسية > سيغما (نصف القطر) المستخدمة: 2.
3. قم بضبط عتبة الصورة التي تمت تصفيتها لفصل الكائنات العضوية عن الخلفية بالنقر فوق > الصورة > MaxEntropy > تطبيق.
4. املأ الثقوب الصغيرة وقم بإزالة الكائنات الصغيرة لتنظيف الصورة الثنائية بالنقر فوق معالجة > الضوضاء > إزالة القيم المتطرفة > 20 بكسل.
5. قم بإجراء تحليل المكونات المتصلة لتحديد الكائنات العضوية الفردية وحساب خصائصها مثل المساحة والسنترويد وطول المحور الرئيسي وطول المحور الثانوي بالنقر فوق تحليل > تعيين > القياس تأكد من تضمين المساحة والمحيط والقطر > تحليل > تحليل الجسيمات > إظهار المخططات التفصيلية.
التحليل الإحصائي
1. قم بتقييم توزيع البيانات من أجل الحياة الطبيعية من خلال اختبار Saphiro-Wilk باستخدام برنامج JMP (SAS). لفحص الاختلافات الإحصائية بين المجموعات ، قم بإجراء ANOVA ثنائي الاتجاه ، وقم بإجراء اختبار لاحق باستخدام طريقة Wilcoxon غير البارامترية في برنامج JMP (SAS). تم تحديد الدلالة عند مستوى ألفا p ≤ 0.05.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخدام الأغشية القاعدية المتاحة تجاريا ونظام هيدروجيل خال من xeno بنجاح لزراعة خلايا hiPSC وتمييزها إلى hIO. كان الهدف الرئيسي من هذه التجارب هو التقييم المنهجي لتكافؤ المصفوفات من مصادر مختلفة لعمل hiPSC و hIO. ركز القسم الأول من هذا البروتوكول على الحفاظ على ثقافة iPSC الصحية وتوصيفها والتي تنتج جيلا عضويا معويا فعالا. تم وصف عملية طلاء أدوات الاستزراع بمصفوفات مشتقة من ماتريكس 1-AB وماتريكس 2-AB وماتريكس 3-AB ومقارنتها بنظام هيدروجيل خال من xeno Matrix 4-XF.

كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تظهر hiPSCs BXS 0116 (مشتقة من CD34 +) مورفولوجيا مماثلة عند استزراعها على المصفوفات الثلاثة المشتقة من. ومع ذلك ، فإن مقارنة خط الخلية BXS 0116 مع SCTi003-A (مشتق من PBMC) المستزرع على الآبار المطلية بالمصفوفة 1-AB يؤكد أن الاختلافات الجوهرية بين خطوط الخلايا (الموضحة في الجدول 6) يمكن أن تؤدي إلى اختلاف فيما يتعلق بتكاثر الخلايا والتمايز والتشكل. على سبيل المثال ، بينما استغرق الأمر 3 أيام لإنشاء DE لخطوط خلايا SCTi003-A ، استغرق الأمر 5 أيام لخط BXS0116. علاوة على ذلك ، كما هو موضح في الشكل 3B-C ، يؤدي استزراع hiPSCs في أنظمة هيدروجيل Matrix 4-XF إلى تكوين مستعمرات في مستعمرة ثلاثية الأبعاد مدمجة جزئيا تختلف اختلافا جذريا عن التشكل المسطح لثقافة hiPSC على الألواح المطلية ب Matrix 1-AB أو الأنظمة المكافئة. أيضا ، أحد الجوانب الرئيسية التي يجب ملاحظتها من هذه التجارب هو أن إنشاء نظام هيدروجيل خال من xeno باستخدام عوامل نمو 3x يمكن أن يحسن بشكل كبير من صلاحية الخلية والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية. وإجمالا، أدت استزراع hiPSC على المصفوفات المشتقة من ومصفوفة 4-XF الخالية من xeno المصنوعة من تركيز عوامل النمو 3x إلى تعبير مكافئ ل SSEA-4 (علامة الخلايا الجذعية)²²؛ ومع ذلك ، فإن نظام هيدروجيل يعزز تشكيل مستعمرات 3D جزءا لا يتجزأ منها.

يركز القسم الثاني من هذا البروتوكول على تمايز hiPSCs لتوليد hIO. هنا ، تم استخدام مجموعة متاحة تجاريا تم تطويرها بناء على Spence et ^al.23 للتمييز إلى الأديم الباطن المحدد (DE) ، ثم الأمعاء الوسطى / الأمعاء الخلفية (MH) ، وأخيرا جمع كروي لينضج إلى IO (الشكل 4C). للحصول على جيل فعال من IO ، فإن فحص أن ثقافة hiPSC لديها الحد الأدنى من التمايز التلقائي قبل بدء بروتوكول التمايز أمر بالغ الأهمية. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، كلما انخفض التعبير عن علامات الخلايا الجذعية مثل SSEA-4 عند بدء تمايز DE ، كلما كانت العملية أقل كفاءة في كل مرحلة (أي انخفاض التعبير عن علامات MH) والتوليد الضعيف اللاحق ل hIO. سهل استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المدمج على الطاولة الوصول السريع إلى نتائج قياس التدفق الخلوي واتخاذ قرار بشأن جودة التمايز قبل الانتقال إلى المرحلة التالية. كانت الملاحظة الغريبة هي أن Matrix 2-AB التي تم الحفاظ عليها hiPSC أدت إلى عدد أقل من الإطلاقات الكروية خلال مرحلة الأمعاء الوسطى / الأمعاء الخلفية مقارنة بالأنظمة الأخرى المشتقة من. جانب رئيسي آخر يجب ملاحظته هو أنه نظرا لأن مستعمرات hiPSC التي تم الاحتفاظ بها في Matrix 4-XF كان لديها بالفعل بنية ثلاثية الأبعاد في بداية التمايز ، فقد أدت هذه الأنظمة إلى كرويات أكبر.

تم تضمين الكائنات الكروية في Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO و Matrix 4-XFO1- Matrix 4-XFO4 وتم نضجها في hIO باستخدام مجموعة. بعد نضج الأجسام الكروية لمدة 7 أيام ، تم تمريرها ودمجها في أنظمة المصفوفات الخاصة بها. تم تتبع نمو العضو العضوي على كل نظام لمدة 7 أيام من صور برايتفيلد. بينما بدأت الثقافة بعضويات متشابهة الحجم نسبيا ، بعد 5 أيام ، اختلف حجم hIO كدالة للمصفوفة التي تم تضمينها فيها (الشكل 5). من بين أربعة Matrix 4-XFO ، كانت الصيغة التي أسفرت عن عضويات أكبر هي Matrix 4-XFO3. تمت صياغة أنظمة Matrix 4-XFO بروابط وخصائص ميكانيكية مختلفة لتناسب مجموعة متنوعة من التطبيقات²⁴. على وجه التحديد ، فإن صلابة Matrix 4-XFO3²⁵ أقرب إلى صلابة الأمعاء البشرية²⁶ من تركيبات Matrix 4-XFO الأخرى ، والتي تدعم النتائج الحديثة حول دور الخواص الميكانيكية ل ECM في تمدد الأعضاء¹²^،²⁷^،²⁸. تشير نتائجنا التمثيلية إلى أن Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO يسهلان نمو وتوسع الكائنات العضوية المعوية.

figure-results-1
الشكل 3: اختيار نظام المصفوفة لصيانة iPSC. (أ) صور تمثيلية لخطين خلويين نما على طلاء أدوات الاستزراع مع أنظمة المصفوفة الثلاثة المختلفة المشتقة من. (ب) تظهر الصور التمثيلية التي تقارن استخدام Matrix 4-XF مع مكملات عامل النمو 1x مقابل 3x أن زيادة مكملات عامل النمو يحسن صلاحية hiPSC على هيدروجيل Matrix 4-XF. (C) تظهر مقارنة قياس التدفق الخلوي لتعبير SSEA-4 للمصفوفة 1-AB والمصفوفة 3-AB والمصفوفة 4-XF (3X) تعبيرا مكافئا بينما أدت المصفوفة 4-XF (1X) إلى انخفاض التعبير عن SSEA-4. تمثل الأشرطة متوسط ± SD ل n = 5 ؛ تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه ، والاختبار اللاحق باستخدام طريقة Wilcoxon غير البارامترية لاختبار الأهمية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 4: تمايز iPSC إلى الأديم الباطن المحدد (DE) والأمعاء الوسطى / الأمعاء الخلفية (MH). (أ) الصور التمثيلية لتمايز iPSC إلى DE بدءا من مستويات مختلفة من علامة SSEA4 تسلط الضوء على أهمية بدء التمايز مع مجموعة hiPSC مع تعبير عال عن علامات الخلايا الجذعية. تشير الأسهم الحمراء إلى مناطق التمايز التلقائي قبل بدء DE. (ب) مثال على تحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير علامة الخلايا الجذعية SSEA4 قبل بدء التمايز وعلامة DE FOXA2 بعد 3 أيام من تمايز DE لتمايز DE ضعيف (يسار) وتمايز جيد (يمين). يمثل كل رسم بياني تحليل الخلايا المستخرجة من 1 ؛ للتحليل الإحصائي ، يوصى بحساب متوسط النتائج من 3 عمليات قياس خلوي على الأقل. (ج) صور تمثيلية لتمايز iPSC إلى hIO على جميع المصفوفات المدروسة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 5: اختيار نظام المصفوفة للتضمين الكروي ونضج hIO. (أ) صور نموذجية لنضج hIO مضمنة في Matrix 4-XFO 1-4. يبلغ معامل المرونة لأنظمة Matrix 4-XFO حوالي 50-300 باسكال ، مع أعلى معامل لمصفوفة 4-XFO3 > مصفوفة 4-XFO4 > مصفوفة 4-XFO2 > مصفوفة 4-XFO1. تتراوح صلابة Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO من 440-800 باسكال حسب الدفعة. (ب) تم تضمين عينات من صور نضج hIO في Matrix 1-ABO و Matrix 3-ABO و Matrix 4-XFO3 في يوم التضمين (اليوم 0) وبعد أسبوع واحد من الثقافة (اليوم 7). (ج) بيانات تبين مقارنة حجم hIO الناضجة على أنظمة المصفوفات المختلفة. تمثل الأشرطة متوسط ± SD ل n = 7 ؛ تم استخدام ANOVA ثنائي الاتجاه ، والاختبار اللاحق باستخدام طريقة Wilcoxon غير البارامترية لاختبار الأهمية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 6: تؤكد صور التألق المناعي التمثيلي للعضويات المعوية المزروعة في المصفوفات المختلفة وجود الخلايا الطلائية. تم تثبيت الكائنات العضوية المعوية الكاملة المزروعة في المصفوفات المختلفة وتلطيخها بجزيء التصاق الخلايا الظهارية (EpCAM) (أخضر) ومضادة لنوى الخلية DAPI (أزرق). تظهر جميع الكائنات العضوية خلايا إيجابية ل EpCAM ، مما يؤكد عدد الخلايا الظهارية المترجمة على السطح الخارجي للعضويات. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص تحضير القسمة وتخزينها وتخفيفها للمصفوفات المستخدمة في تغطية أدوات الاستزراع المستخدمة في iPSC. * للحصول على عامل تخفيف دقيق ، تحقق من عامل التخفيف الموصى به و / أو تركيزات البروتين في شهادة تحليل كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: جدول مرجعي لحجم محاليل الطلاء لكل مساحة سطح من أدوات الاستزراع و mTeSR Plus Medium. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: جدول مرجعي لحجم محاليل السلائف Matrix 4-XF لكل مساحة سطح من أدوات الاستزراع ووسط الخلايا الجذعية الكامل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: قائمة العلامات الشائعة الموصى بها لتوصيف hiPSC و hIO أثناء العملية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: ملخص الوسائط اللازمة أثناء تمايز hiPSC إلى عضويات معوية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 6: تفاصيل محددة حول خطي hiPSC المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: كود MATLAB العام للتعديل وفقا لنوع الصورة المحدد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد اختيار البيئة المكروية المثلى لعمل الخلايا الجذعية والأعضاء خطوة مبكرة محورية عند استخدام هذه المنصات لمجموعة واسعة من التطبيقات. تظهر نتائجنا التمثيلية أن Matrix 4-XFO3 ، إلى جانب تركيز أعلى من عوامل النمو ، يؤدي إلى عضويات أكبر ، مما يشير إلى أنه يمكن تسخير الخصائص الفيزيائية للهلاميات المائية الخالية من xeno لتحسين توليد المواد العضوية باستخدام هذه الأنظمة. لقد ثبت سابقا أن الخصائص الفريدة للمصفوفة خارج الخلية (ECM) تتشابك ارتباطا وثيقا مع هوية الخلايا داخل العضو¹². نظرا لأن الخلايا تستشعر قوى خارجية عبر الأنتغرينات والمستقبلات الأخرى ، فإن الخصائص الميكانيكية ل ECM تؤثر بعمق على الخلايا الجذعية ، واستجابة لذلك ، يمكن للخلايا الجذعية توليد قوى داخلية¹². تعد التفاعلات بين الخلايا الجذعية وبيئتها الدقيقة أساسية في بدء مسارات إشارات متنوعة¹². بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن ECM يمكن أن يكون بمثابة خزان لتخزين وإطلاق عوامل النمو وجزيئات الإشارات الأخرى التي تؤثر على سلوك الخلية. ومن ثم ، تؤكد نتائجنا التمثيلية وعقود من البحث على أهمية مراعاة الجوانب الكيميائية الحيوية والفيزيائية للبيئة المكروية للخلايا الأصلية وخصائص الأنسجة عند اختيار أنظمة المصفوفة للتحقيقات في المختبر ^29,30.

تم شرح العديد من الخطوات والتوصيات الحاسمة من خلال البروتوكول لإبلاغ المستخدمين بالمشكلات المحتملة وطرق تجنبها. ومع ذلك ، يتم تقديم خطوتين حاسمتين في هذه الأساليب التي تعتبر محورية لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح. أولا ، يعد التحقق من وجود علامات محددة مرتبطة بعدد الخلايا الجذعية أمرا بالغ الأهمية لتحديد نظام الطلاء الأمثل للحفاظ على عدد الخلايا الجذعية جاهزا للتمايز الفعال المتحكم فيه. وبالمثل ، فإن تأكيد التعبير عن العلامات المرتبطة بكل خطوة تمايز أمر ضروري لتحديد وقت الانتقال إلى المرحلة التالية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات عامة فيما يتعلق بالحد الأدنى من الوقت المطلوب في كل مرحلة. ومع ذلك ، فإن الوقت الأمثل في كل مرحلة سيختلف باختلاف خطوط الخلايا والظروف التجريبية (على سبيل المثال ، النمط الجيني ، الصلابة). لذلك ، فإن توصيف علامات متعددة خاصة بالمرحلة هو أفضل نهج لتحسين كفاءة توليد hIO.

كانت الخطوة الحاسمة الثانية هي دمج تركيز أعلى لعوامل النمو عند استخدام نظام Matrix 4-XF الخالي من xeno ، وهو أمر في غاية الأهمية. ومن القيود التي كثيرا ما يسلط الضوء عليها في نظم المواد الأحيائية الخالية من الأجانب الافتقار إلى عوامل النمو³¹. ومع ذلك ، يمكن أن يصبح هذا الضعف قوة: السيطرة الكاملة على عوامل النمو في الأنظمة لتحسين قابلية التكاثر. بينما يصف هذا البروتوكول استخدام مجموعة مكملات الوسائط وعامل النمو المتاحة تجاريا ، يمكن استخدام نفس الأساس المنطقي عند إنشاء الوسائط الكاملة داخليا مع مكونات فردية. وتوجه النسبة المحددة الهيدروجيل/الوسائط إلى أي مدى يجب أن يكون تركيز عوامل النمو أعلى؛ على سبيل المثال ، قد تتطلب نسبة 2: 1 تركيز 3x من عوامل النمو لينتهي الأمر بممثل تركيز للوسائط الكاملة القياسية المستخدمة. يعد التحكم الكامل في عوامل النمو الموجودة في النظام مفيدا للإجابة على الأسئلة الآلية وتجنب المشكلات التنظيمية للعديد من التطبيقات.

تقتصر خطوات معالجة الصور الموضحة في الخطوة 3 على جودة الصور ونوع الصور التي تم التقاطها. قد يتطلب الأمر تحسينا ليناسب المتطلبات المحددة لكل نوع صورة وجودتها. ومع ذلك ، فإن الخطوات الشاملة للعملية وعينة من كود MATLAB للإطار الأساسي لتحليل الحجم العضوي من صور برايتفيلد تساعد في تحديد سير العمل الذي يمكن تحسينه وتوسيعه بشكل أكبر. علاوة على ذلك ، يعد الوصول إلى مجهر برايت فيلد أكثر شيوعا من الأنواع الأخرى من المجاهر. في حين أن عدم الوصول إلى MATLAB والإلمام به قد يحد من استخدام هذا الرمز ، فإن الخطوات العامة للعملية متوافقة مع البرامج مفتوحة المصدر مثل Fiji by Image J. حجم العضوي وحده ليس مقياسا موصى به لتقييم النضج. ويشجع على أن يتبع ذلك بتقييم لعلامات محددة تمثل الجهاز المستهدف؛ يتم تضمين بعض هذه العلامات للأنسجة المعوية في الجدول 4. يوضح الشكل 6 مثالا على تلطيخ التألق المناعي للعضويات الكاملة مع جزيء التصاق الخلايا الطلائية (EpCAM) ، والذي يتم توطينه على السطح الخارجي (القاعدي) للعضويات. بينما تم تصور EpCAM في المواد العضوية المستزرعة في جميع أنظمة ECM ، كانت هناك اختلافات في حجم هذه الكائنات العضوية. وبالتالي ، فإن المعلومات حول حجم العضوية تساعد على تحسين ظروف الاستزراع. علاوة على ذلك ، في دراسات الاستجابة للأدوية ، يعمل حجم العضو كمقياس للاستجابة للمركب المختبر. يمكن أن تعكس التغييرات في الحجم فعالية أو سمية المركبات المختبرة. الأهم من ذلك ، أن توليد دفعات متعددة من المواد العضوية ذات الحجم القياسي يمثل تحديا حاليا في هذا المجال ، ولكنه مقياس مهم لقابلية التكاثر التجريبي بحيث يمكن مقارنة النتائج عبر التجارب أو المختبرات المختلفة. إجمالا ، يعد سير العمل الآلي الذي يسمح باستخراج معلومات مهمة حول المواد العضوية من صور برايتفيلد أداة مفيدة للعديد من الباحثين.

كلا النظامين ، المصفوفات المشتقة من ، والهلاميات المائية الخالية من الأجانب ، لها مزاياها وعيوبها. يمكن أن تنتج المصفوفة 2-AB التي تؤدي إلى إطلاقات كروية أقل خلال مرحلة MH مقارنة بالمصفوفات الأخرى المشتقة من عن الاختلافات من دفعة إلى دفعة ، وهي خاصية معروفة على نطاق واسع للمصفوفات المشتقة من المتاحة تجاريا. ومن المهم ملاحظة أن تركيز نظم إدارة المحتوى في المؤسسة المتاحة تجاريا يتفاوت؛ على سبيل المثال ، تم استخدام عوامل التخفيف في صحائف مواصفات المنتج لإعداد محاليل الطلاء التي قد تؤدي إلى تركيزات مختلفة قليلا في حالة المصفوفات المشتقة من. يمكن أن تؤثر هذه الاختلافات في تركيز البروتين بشكل كبير على التمايز مما يؤدي إلى تباين في كفاءة التمايز عند استخدام نفس المنتج من مجموعات مختلفة. للاختيار بين هذه الأنظمة ، ضع في اعتبارك عوامل مثل الأهداف التجريبية المحددة والاعتبارات الأخلاقية والمتطلبات التنظيمية. على سبيل المثال ، في حالات مقارنة النتائج التجريبية في المختبر مع نموذج الفأر للإجابة على أسئلة بيولوجيا الورم والسرطان ، يمكن أن يكون استخدام المصفوفات المشتقة من فأر Engelbreth-Holm Swarm EHS خيارا رائعا. أيضا ، نظرا لاستخدام منتجات مثل Matrigel منذ عقود ، فهناك العديد من البروتوكولات والبيانات والمراجع. ومع ذلك ، فإن استخدام مصفوفات خالية من xeno محددة جيدا تسمح بتخصيص الخصائص الفيزيائية والكيميائية قد يكون خيارا أكثر ملاءمة عندما يرتبط سؤال البحث بالأمراض أو العلاجات البشرية. أيضا ، تم تصميم معظم أنظمة الهيدروجيل الخالية من xeno لتلبية المعايير التنظيمية ، مما يجعلها خيارا مناسبا للبحث الذي يتطلب الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة (GMP) أو الإرشادات التنظيمية الأخرى.

باختصار ، في حين تم استخدام المصفوفات المشتقة من على نطاق واسع لصيانة iPSC وتوليد المواد العضوية بسبب توافقها الحيوي ، توفر أنظمة الهيدروجيل الخالية من xeno مزايا من حيث قابلية التكرار والفعالية من حيث التكلفة والامتثال التنظيمي والاعتبارات الأخلاقية. يعتمد الاختيار بين الاثنين على الاحتياجات المحددة للبحث أو التطبيق السريري. تكتسب أنظمة الهيدروجيل الخالية من Xeno شعبية كبديل أكثر تنوعا واستدامة يمكن أن يدعم استخدام المواد العضوية والأنظمة الفسيولوجية الدقيقة للقائمة المختصرة قبل السريرية للمرشحين العلاجيين. يمكن لهذا التطبيق أن يحسن بشكل كبير من تطوير الأدوية المبكرة ويساعد في مواجهة تحديات الترجمة السريرية الحالية في صناعة الأدوية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور جون هوانغ هو المؤسس والرئيس التنفيذي لشركة TheWell Bioscience.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون بالتدريب السابق والتوصيات العامة المتعلقة ببدء عمل hiPSC والعمل العضوي من الدكاترة كريستينا باكاك وسيلفيلي سوسكي هاتانو وراسل ديسوزا. يشكرون الدكتورة تشيلسي سيمونز على توجيهاتها في استخدام أنظمة الهيدروجيل لعمل زراعة الخلايا في المختبر . أيضا ، يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة كريستين رودريغيز وتوماس أليسون من STEMCELL Technologies على توجيهاتهم حول ثقافة hiPSC. يشكر المؤلفون أيضا TheWell Bioscience لتغطية تكاليف النشر.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
24-بئر لوحة (ثقافة معالجة ، معقمة)	فالكون	353504
37 درجة ؛ C حمام مائي	VWR
96 بئر صفيحة	فيشر ساينتفيك	FB012931
Advanced DMEM / F12	Life Technologies	12634
مكافحة الالتصاق الشطف Solutio	STEMCELL Technologies	7010
خزانة السلامة البيولوجية (BSC)	Labconco & nbsp ؛	المنطق
برايتفيلد المجهر	صدى Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
الطرد المركزي مع التحكم في درجة الحرارة (4 درجة ؛ قدرات C)	مخروطية 75002441		ThermoScientific
، 15 مل ،	Thermo Fisher Scientific	339650
، 50 مل ، معقمة	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME ، النوع 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME & nbsp ؛	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (بدون Ca ++ و Mg ++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free ، مؤهل hESC لتقليل عامل النمو	Gibco ؛	A14133-02
مكمل GlutaMAX	Thermo Fischer Scientific	35050-061
خلايا الجوافة موسى أو أي معدات أخرى لقياس التدفق الخلوي (اختياري)		HEPES
	Thermo Fischer Scientific	15630-056
حاضنة ثقافة الخلية Heralcell Vios (37 درجة ؛ C ، 5٪ CO_{2< / sub>) Thermo}	Scientific ؛	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks، Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) مصفوفة الغشاء القاعدي LDEV الحرة	Corning	356231
Matrigel Matrix عالي التركيز (HC) ، عامل النمو المخفض (GFR) Corning الخالي من LDEV	؛	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta المعالجة السطحية 24 بئر لوحة	حرارية علمية	144530
PE ماوس مضاد للإنسان CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-Human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-Human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
الماصات المصلية (10 مل)	فيشر ساينتفيك	13-678-11E
الماصات المصلية (5 مل)	فيشر ساينتفيك	13-678-11D
STEMdiff نمو العضوية المعوية المتوسطة	تقنيات الخلايا الجذعية	5145
مجموعة المواد العضوية المعوية STEMdiff	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K

أنابيب أنابيب مخروطية معقمة محلل محلول عازلة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).
Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).
Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).
Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view. Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).
Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. Matrix control of stem cell fate. Cell. 126 (4), 645-647 (2006).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
Tran, O. N., et al. Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).
Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
Gjorevski, N., et al. Tissue geometry drives deterministic organoid patterning. Science. 375 (6576), (2022).
Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. Engineering the extracellular matrix for organoid culture. Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).
Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).
Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing. Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).
Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.cn/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FGeltrex_LDEV_Free_hESC_qualified_PI.pdf (2024).
biotechne R&D Systems. Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor. biotechne R&D Systems. , (2024).
VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: https://www.thewellbio.com/video-protocols (2024).
Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
Henderson, J. K., et al. Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens. Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).
Haruna, N. F., Huang, J. Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture. J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).
Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
Stewart, D. C., et al. Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease. PLoS One. 13, e0200377(2018).
Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125(2020).
Broguiere, N., et al. Growth of epithelial organoids in a defined hydrogel. Adv Mater. 30, 1801621(2018).
Barthes, J., et al. Cell microenvironment engineering and monitoring for tissue engineering and regenerative medicine: The recent advances. BioMed Res Int. 2014, 921905(2014).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

دراسة مقارنة لمصفوفات الغشاء القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية البشرية وتوليد الأعضاء المعوية

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles