وصفنا طريقة لدراسة كيفية استجابة الأس الهيدروجيني للإشارات البيئية في جليكوسومات مجرى الدم من المثقبيات الأفريقية. يتضمن هذا النهج مستشعر بروتين وراثي حساس لدرجة الحموضة مع قياس التدفق الخلوي لقياس ديناميكيات الأس الهيدروجيني ، سواء كفحص زمني أو في شكل شاشة عالية الإنتاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية للمثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسية ، كعملية أيضية أساسية ومنظم لتطور الطفيليات. لا يعرف سوى القليل عن الاستجابات الخلوية المتولدة عندما تتغير مستويات الجلوكوز البيئية. في كل من مجرى الدم والطفيليات ذات الشكل الحلقي (مرحلة الحشرات) ، تحتوي الجليكوسومات على معظم تحلل السكر. يتم تحمض هذه العضيات بسرعة استجابة للحرمان من الجلوكوز ، مما يؤدي على الأرجح إلى التنظيم الخيفي للإنزيمات المحللة للسكر مثل هيكسوكيناز. في العمل السابق ، كان توطين المسبار الكيميائي المستخدم لإجراء قياسات الأس الهيدروجيني أمرا صعبا ، مما حد من فائدته في التطبيقات الأخرى.
تصف هذه الورقة تطور واستخدام الطفيليات التي تعبر عن pHluorin2 الموضعي جليكوسومي ، وهو مستشعر حيوي للبروتين يمكن توريثه. pHluorin2 هو متغير pHluorin نسبي يعرض انخفاضا يعتمد على الأس الهيدروجيني (الحمض) في الإثارة عند 395 نانومتر بينما ينتج عنه في نفس الوقت زيادة في الإثارة عند 475 نانومتر. تم إنشاء الطفيليات المعدلة وراثيا عن طريق استنساخ إطار القراءة المفتوح pHluorin2 في ناقل تعبير المثقبيات pLEW100v5 ، مما يتيح التعبير البروتيني المستحث في أي من مرحلتي دورة الحياة. تم استخدام التألق المناعي لتأكيد توطين الجليكوزوم للمستشعر الحيوي pHluorin2 ، ومقارنة توطين المستشعر الحيوي بالبروتين المقيم الجليكوزومي الألدولاز. تمت معايرة استجابة المستشعر عند مستويات مختلفة من الأس الهيدروجيني عن طريق احتضان الخلايا في سلسلة من المخازن المؤقتة التي تراوحت في الأس الهيدروجيني من 4 إلى 8 ، وهو نهج استخدمناه سابقا لمعايرة مستشعر الأس الهيدروجيني القائم على الفلوريسين. ثم قمنا بقياس مضان pHluorin2 عند 405 نانومتر و 488 نانومتر باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد الرقم الهيدروجيني للجليكوزوم. لقد تحققنا من أداء الطفيليات الحية المعدلة وراثيا التي تعبر عن pHluorin2 ، ومراقبة درجة الحموضة بمرور الوقت استجابة للحرمان من الجلوكوز ، وهو محفز معروف لتحمض الجليكوزومات في طفيليات PF. تحتوي هذه الأداة على مجموعة من التطبيقات المحتملة ، بما في ذلك إمكانية استخدامها في فحص الأدوية عالي الإنتاجية. بالإضافة إلى درجة الحموضة الجليكوزومية ، يمكن تكييف المستشعر مع عضيات أخرى أو استخدامه في المثقبيات الأخرى لفهم ديناميكيات الأس الهيدروجيني في إعداد الخلية الحية.
المقدمة
تعتمد الأراستيدات الحركية الطفيلية ، مثل معظم الكائنات الحية ، على الجلوكوز كمكون أساسي في استقلاب الكربون المركزي. تشمل هذه المجموعة الكائنات الحية المهمة طبيا ، مثل المثقبيات الأفريقية ، المثقبية البروسي. المثقبيات الأمريكية ، T. cruzi ؛ والطفيليات من جنس الليشمانيا. استقلاب الجلوكوز أمر بالغ الأهمية لنمو الطفيليات في مراحل دورة الحياة المسببة للأمراض. على سبيل المثال ، عند الحرمان من الجلوكوز ، يموت شكل مجرى الدم (BSF) من المثقبيات الأفريقية بسرعة. والجدير بالذكر أن تحلل السكر يعمل كمصدر وحيد ل ATP خلال هذه المرحلة من العدوى1. تعتمد طفيليات الليشمانيا أيضا على الجلوكوز في المضيف البشري ، مع مرحلة دورة حياة amastigo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتطلب استخدام T. brucei brucei 90-13 BSF trypanosomes ، وهو خط طفيلي أحادي الشكل ، النظر في السلامة لأنها تعتبر كائنات من مجموعة المخاطر 2 التي يجب التعامل معها في مرافق السلامة الأحيائية من المستوى 2.
1. ثقافة المثقبيات ونقلها
- ثقافة T. brucei brucei 90-13 BSF المثقبيات في وسط HMI-9 مكمل ب 10٪ FBS معطل حراريا و 10٪ Nu-Serum عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO210.
ملاحظة: للحفاظ على صحة المزرعة ، حافظ على كثافة الخلايا بين 2 × 104 و 5 × 106 خلايا / مل. - استنساخ pHluorin2-PTS1 إلى pLEW100v5
- توليف إطار القراءة المفتوح pHluorin2 تجاري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توطين pHLuorin2-PTS1 إلى الجليكوسومات في BSF T. brucei
لتقييم التوطين تحت الخلوي لل pHluorin2-PTS1 ، تعرضت الطفيليات لمقايسات التألق المناعي. إشارة من جين التحوير المتزامن مع الأمصال المضادة التي أثيرت ضد بروتين مقيم في الجليكوزوم ، ألدولاز (TbAldolase) (الشكل 2 أ). كان متوسط معامل ارتباط بيرسون للتمركز المشترك بين مضاد TbAldolase و pHluorin2-PTS1 0.895 ، مما يشير إلى أن pHluorin2-PTS1 كان موضعيا بشكل أساسي إلى الجليكوزومات. مع pHluorin2-PTS1 المترجمة إلى الجليكو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن آليات الإدراك والاستجابة البيئية في المثقبيات الأفريقية غير مفهومة بشكل جيد. من المعروف أن التغييرات في توافر المغذيات تؤدي إلى استجابات متنوعة في الطفيلي ، بما في ذلك تحمض الجليكوزومات. لقد وصفنا هنا طريقة لدراسة استجابة الأس الهيدروجيني الجليكوزومي للاضطرابات البيئية في الخلايا الحية باستخدام مستشعر البروتين الوراثي ، pHluorin2 ، وقياس التدفق الخلوي.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في استخدام المستشعر. أولا ، يعد توصيف الطفيليات المنقولة التي تعبر عن جين التحوير أمرا مهما ، حيث يمكن أن يكو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم استنساخ pHluorin2-PTS1 إلى pLEW100v5 بواسطة Twist Bioscience الذي قدم البناء في ناقل استنساخ عالي النسخ. كان pLEW100v5 هدية من الدكتور جورج كروس. يتوفر المصل المضاد الذي أثير ضد T. brucei aldolase من الدكتورة ميريديث تي موريس ، جامعة كليمسون ، عند الطلب. تم دعم العمل من مختبرات JCM و KAC جزئيا بجائزة من المعاهد الوطنية للصحة (R01AI156382). تم دعم SSP بواسطة NIH 3R01AI156382.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 50 مل قوارير زراعة الأنسجة (غير معالجة ، معقمة) | VWR | 10861-572 | |
| 75 سم 2< / sup> قارورة زراعة الأنسجة (غير معالجة ، معقمة) | Corning | 431464U | |
| 80 & micro ؛ L لوحة مسطحة القاع 384 بئر | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT مقياس التدفق | الخلوي invitrogen بواسطة Thermo Fisher Scientific | A24858 | برنامج FlowJo |
| BRANDplates 96-Well ، لوحة مسطحة | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 المكون الإضافي ل ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen بواسطة Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX مقياس التدفق | Beckman-Coulter | ||
| علوم المجهر الإلكتروني 16٪ محلول مائي بارافورمالديهايد ، درجة EM ، 10 مل أمبولة | فيشر Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | البرنامج الإحصائي | ||
| النيجريسين (ملح الصوديوم) | كايمان الكيميائية | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | توقف المنتج | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine ، 0.1٪ (وزن / حجم) في H2< / sub>O | Sigma Life Science | CAS: 25988-63-0 | روبوت السحب لفحص HTS |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | # 40087 | قمنا بتشكيل حامل لوحة أكريليك مخصص بحيث يمكن اكتشاف هذه العلامة التجارية من الألواح واستخدامها في CytKick Max Auto |
| فالينومايسين | كايمان للأنابيب الكيميائية | 10009152 | لفحص HTS |
| ؛ | لمعايرة الأس الهيدروجيني | ||
| لمعايرة الأس الهيدروجيني |
المراجع
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702(2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
