يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الحقن داخل الفخذ للخلايا الجذعية والمكونة للدم البشرية والخلايا السلفية في الفئران المصابة بنقص المناعة

2.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66315

⸱

ديسمبر 8, 2023

 ,  , 
1Wellcome and Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute, Department of Haematology, University of Cambridge

في هذه المقالة

ملخص

تسمح الحقن داخل الفخذ بنقش عدد صغير من الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) ، عن طريق وضع الخلايا مباشرة في تجويف نخاع العظم. نصف هنا بروتوكولا تجريبيا للحقن داخل الفخذ ل HSPCs البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

الملخص

يتم تعريف الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من خلال قدرتها مدى الحياة على إنتاج جميع أنواع خلايا الدم. يتم اختبار ذلك عمليا عن طريق زرع مجموعات الخلايا التي تحتوي على الخلايا المنسقة في الفئران المتزاصلة أو التي تعاني من نقص المناعة. ثم يتم قياس حجم الكسب غير المشروع وتكوينه متعدد السلالات بمرور الوقت ، عادة عن طريق قياس التدفق الخلوي. بشكل كلاسيكي ، يتم حقن مجموعة تحتوي على HSCs في الدورة الدموية للحيوان ، وبعد ذلك تكون HSCs موطنا لنخاع العظام ، حيث تستقر وتبدأ في إنتاج الدم. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الخلايا الجذعية الجذعية و / أو الخلايا السلفية (HSPCs) مباشرة في تجويف نخاع العظم.

تصف هذه الورقة بروتوكولا للحقن داخل الفخذ من HSPCs البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. باختصار ، يتم تخدير الفئران المكيفة مسبقا ، ويتم حفر ثقب صغير من خلال الركبة في عظم الفخذ باستخدام إبرة. باستخدام إبرة أنسولين أصغر ، يتم حقن الخلايا مباشرة في نفس القناة التي تم إنشاؤها بواسطة الإبرة الأولى. يمكن تطبيق طريقة الزرع هذه في تصميمات تجريبية متنوعة ، باستخدام خلايا الفأر أو الإنسان كخلايا مانحة. لقد تم استخدامه على نطاق واسع في زراعة الأعضاء ، لأنه في هذا السياق ، يعتقد أنه يوفر تحققا محسنا على الحقن في الوريد ، وبالتالي تحسين القوة الإحصائية وتقليل عدد الفئران التي سيتم استخدامها.

المقدمة

يحتوي الدم على واحد من أعلى معدلات التجدد في جسم الإنسان ، حيث ينتج 1 × 1012 خلية يوميا في نخاع العظام البشريالبالغ 1. تضمن الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) إنتاج الدم على مدى العمر الافتراضي من خلال عملية تكون الدم ويتم تحديدها من خلال قدرتها على إنتاج جميع أنواع خلايا الدم (تعدد الإمكانات) مع الحفاظ على نفسها (التجديد الذاتي). تاريخيا ، اعتمد المعيار الذهبي لاختبار وظيفة HSC دائما على الزرع ، واختبار قدرة المتبرعين على إعادة تكوين جميع سلالات الدم للفأر على المدى الطويل (يعرف عادة بأنه 20 أسبوعا على الأقل)2. أثبتت مجموعة كبيرة من الأعمال الوظيفية التي امتدت لعدة عقود أن حجرة HSC غير متجانسة في كل من إنتاج النسب وإعادة التشكيل على المدى الطويل. توسعت مجموعة الأدوات لدراسة تكون الدم بشكل كبير على مر السنين ، مع العديد من التقنيات الجديدة ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية أحادية الخلية في المختبر ، ونهج omics أحادية الخلية ، وتتبع النسب3. لقد أظهر الأخير بشكل قاطع أن مساهمات HSC والأسلاف متعددة القدرات تختلف اختلافا كبيرا في تكون الدم الأصلي وتحت الضغط الذي تفرضه عملية الزرع. كل هذه التقنيات تكمل فحوصات الزرع ، والتي تظل مهمة لتقييم قدرة إعادة التوطين على المدى الطويل ل HSCs. في سياق دراسة تكون الدم البشري ، يوفر زرع الأعضاء الطريقة الوحيدة لتقييم التجديد الذاتي تجريبيا في بيئة الكائن الحي بأكمله.

يتم إجراء عملية زرع الخلايا الجذعية السرطانية بشكل شائع باستخدام الحقن الوريدي للخلايا في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. ومع ذلك ، فإن الخلايا المنسقة الجذعية نادرة4 والوصول إلى العينات البشرية التي تحتوي على الخلايا الجذعية السرطانية محدود. في عام 2003 ، قامت مجموعة جون ديك بتكييف بروتوكول لشفط نخاع العظم وحقن الفئران غير البدينة السكرية / نقص المناعة المركب الشديد (NOD-SCID) مع خلايا دم الحبل السري Lin−CD34 + (CB)5. على حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن مقارنة رسمية بين الحقن الوريدي والحقن داخل الفخذ في نتائج الزرع طويلة الأمد والمتسلسلة. ومع ذلك ، بالمقارنة مباشرة مع الحقن في الوريد ، توفر الحقن داخل الفخذ أحجام أكبر للكسب غير المشروع بنفس عدد الخلايا المزروعة6 ، على الأقل على المدى القصير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اكتشاف النقش بعدد أقل من الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) المزروعة. يعتقد أن هذا يرجع إلى أن التوصيل داخل الفخذ يتجاوز الحاجة إلى HSCs إلى موطن نخاع العظام ، والذي يحد في سياق الطعم الغريب بسبب نقص التفاعل عبر الأنواع لعدد من المستقبلات والسيتوكينات. من خلال استخدام الحقن داخل الفخذ ، كان Notta وزملاؤه أول من زرع HSCs بشريةواحدة 7 ، على الرغم من الحاجة إلى أخذ اعتبارات إضافية ، كما هو موضح في أساليبهم. التسليم داخل الفخذ من HSPCs له أيضا قيود. الحقن نفسه يعطل ويدمر جزءا من نخاع العظام ، وبالتالي لا يشار إليه لدراسات الحديث المتبادل بين الخلايا الجذعية العليا والبيئة الدقيقة لنخاع العظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحد الأقصى لعدد الخلايا محدود بحجم تجويف العظام وقد يكون ذلك قليلا جدا بالنسبة لبعض التطبيقات. كما هو الحال مع كل تقنية ، يجب تقييم تطبيقها في تجربة معينة بناء على الفوائد / العيوب والسؤال المطروح. في سياق زرع الأعضاء ، إذا كان الهدف من التجربة هو اختبار نقش عدد قليل من HSPCs البشرية دون تقييم للبيئة المكروية ، فعادة ما يفضل التوصيل داخل الفخذ على الحقن في الوريد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تلتزم جميع الأبحاث على المعروضة هنا بلوائح تعديل قانون (الإجراءات العلمية) لعام 1986 لعام 2012 وتم إجراؤها بعد المراجعة الأخلاقية والموافقة من قبل هيئة رعاية والمراجعة الأخلاقية بجامعة كامبريدج (AWERB). إيماءة أنثى. تم استخدام الفئران Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) ، التي تتراوح أعمارها بين 12 و 16 أسبوعا (~ 21-30 جم) ، تم تربيتها في المنزل والحفاظ عليها في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض ، للحقن داخل الفخذ. تم جمع عينات CB غير المحددة من المتبرعين الأصحاء بعد موافقة مستنيرة من قبل بنك كامبريدج الحيوي للدم والخلايا الجذعية (CBSB) وفقا للإجراءات المنظمة المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحث المحلية في كامبريدجشاير (18 / EE / 0199).

1. تحضير الماوس

  1. قبل التشعيع ، قم بشق آذان الفئران للتعرف عليها ووزنها لوزن خط الأساس.
  2. قبل أربع وعشرين ساعة من زرع الخلايا ، قم بتشعيع الفئران تحت المميتة بإشعاع 2.4 Gy.

2. تحضير الخلايا

ملاحظة: بالنسبة لهذه الحقن ، يمكن استخدام الخلايا من عينات طازجة أو مجمدة. يمكن فرز مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يمكن زراعة الخلايا في الظروف المرغوبة قبل الزرع. بالنسبة للتجارب الموضحة ، نستخدم خلايا CB CD34 + المجمدة.

  1. قم بإذابة الخلايا في أنبوب سعة 50 مل عن طريق الإضافة المتنقية ل 10 أضعاف حجم الخلية من IMDM الدافئ مسبقا + 50٪ مصل بقري الجنين (FBS) + 0.1 مجم / مل DNase أثناء تحريك الأنبوب يدويا. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. أعد تعليق الخلايا في 20-40 ميكرولتر (من الناحية المثالية 25 ميكرولتر) من PBS + البنسلين الستربتومايسين (10 وحدة / مل أو 0.1٪) لكل فأر. إذا أمكن ، اسمح لخلايا إضافية بحجم ميت عند أخذ الخلايا في المحقنة للحقن. قم بتخزين الخلايا على الثلج حتى الحقن. الحد الأقصى لعدد الخلايا لكل حقنة هو 4 ملايين خلية.

3. التحضير للحقن داخل الفخذ في منشأة

  1. قم بإعداد الإبر الثلاث التالية المطلوبة لهذا الإجراء:
    1. تحضير حقنة 3 مل بإبرة 27 جم 1/2 بوصة.
    2. قم بإعداد حقنة أنسولين 0.5 مل بإبرة 29 جم × 12.7 مم تحتوي على معلق الخلية.
    3. تحضير حقنة أنسولين سعة 1 مل بإبرة 29 جم × 0.5 بوصة مع 0.1 مجم / كجم بوبرينورفين (100 ميكرولتر).
  2. تخدير الفئران في صندوق مخدر (من خلال استنشاق الأيزوفلوران 2٪ (حجم / حجم) والأكسجين 2 لتر / دقيقة). انقل الماوس إلى مخروط الأنف وتأكد من استعداده للإجراء عن طريق قرصة إصبع القدم. ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في غطاء السلامة الحيوية من المستوى 2 للاحتواء ويتم استخدام ظروف معقمة.

4. الحقن داخل الفخذ

  1. ضع الماوس على ظهره وثني ساقه الخلفية. قم بتأمين الساق الخلفية باستخدام اليد غير المهيمنة عن طريق وضع الإبهام على القدم والإصبع الأوسط على الورك والسبابة على السطح الخارجي لعظم الفخذ.
  2. احلق الشعر أو نتفه برفق من حول الرضفة واستخدم مسحة كحولية لمسح المنطقة.
  3. استخدم حقنة 3 مل بإبرة 27 جم 1/2 بوصة واستهدف الزاوية الداخلية العلوية للرضفة لحفر ثقب برفق عبر الجلد باتجاه عظم الفخذ. على الرغم من أنه يمكن تدوير الإبرة ذهابا وإيابا في البداية ، إلا أنه استخدم حركة في اتجاه عقارب الساعة مرة واحدة فقط في العظم ، حتى تصبح الإبرة بأكملها في العظم.
    ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو إنشاء قناة لتوصيل الخلية. (اختياري) للتحقق مما إذا كانت الإبرة في العظم بشكل صحيح ، حرر الساق وقم بتدوير المحقنة من جانب إلى آخر ؛ إذا كان بشكل صحيح في العظم ، فيجب أن تتحرك الساق بأكملها مع الدوران. أعد تثبيت الساق باستخدام اليد غير المهيمنة عن طريق وضع الإبهام على القدم والإصبع الأوسط على الورك والسبابة على السطح الخارجي لعظم الفخذ قبل المتابعة. إذا تم إدخالها بشكل غير صحيح ، فمن المحتمل أن تكون الإبرة في العضلة أو الوتر ، ولن تدور الساق مع المحقنة ، وقد تشعر بالإبرة تحت الجلد.
  4. قم بإزالة الإبرة باستخدام دوران عكس اتجاه عقارب الساعة حتى تصل إلى منتصف الطريق. في هذه المرحلة ، استخدم مسحة كحولية للمسح حول الإبرة (قد تكون هناك قطرة دم صغيرة) ثم استمر في تدوير الإبرة عكس اتجاه عقارب الساعة وإزالة الإبرة.
  5. أدخل حقنة الأنسولين سعة 0.5 مل التي تحتوي على الخلايا في عمود الفخذ عبر نفس القناة. بمجرد دخول الإبرة ، قم بتدوين الشعور بخدش يشير إلى الموقع الصحيح. في هذه المرحلة ، حرر قبضة الساق ، لكن احرص على عدم إزالة الإبرة من الساق. ثم ، برفق ، قم بحقن 25 ميكرولتر من تعليق الخلية في عظم الفخذ وإزالة الإبرة.
    ملاحظة: يشبه "الخدش" الموصوف ضرب سطح خشن وإذا شعرت الإبرة بأنها دخلت بسلاسة دون أي شعور خشن ، فهي ليست في المكان الصحيح. يفهم معظم المستخدمين هذا بوضوح بمجرد نجاحهم في ممارستهم.

5. رعاية ما بعد الحقن

  1. حقن الفأر تحت الجلد بالبوبرينورفين (0.1 مجم / كجم ، 100 ميكرولتر) قبل إعادته إلى قفصه ومراقبة التعافي من التخدير.
    ملاحظة: لا يجب ترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ولا يتم إعادته إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما. من غير المرجح أن تظهر الفئران أي آثار ضارة على الحقن داخل الفخذ. ومع ذلك ، قد يؤدي الحقن داخل الفخذ إلى انخفاض النشاط والألم في المنطقة التي خضعت للعمل.
  2. تقييم تورم العرقوب والألم والحركة بعد العملية.
    ملاحظة: يجب أن تستعيد الفئران حركة الأطراف الطبيعية في غضون 24 ساعة من الحقن.

6. تحليل البيانات

  1. قتل الفئران عن طريق خلع عنق الرحم أو أي طريقة معتمدة بعد الحقن في أي وقت ، على سبيل المثال ، 24-48 ساعة لتجارب التوجيه ، 4-12 أسبوعا لنشاط HSC قصير المدى ، >18 أسبوعا للنقش طويل المدى. إذا تم التخطيط لتحليل الدم المحيطي (PB) ، فقم بنزيف الفئران قبل التضحية بأي طريقة مصرح بها ، مما ينتج عنه 50-100 ميكرولتر من الدم (لا يزيد عن 10٪ من الحجم الإجمالي). قم بإزالة عظام الساق الخلفية والطحال وفقا لبروتوكولات التشريح القياسية.
  2. لنخاع العظام:
    1. حافظ على عظم الفخذ المحقون (IF) والعظام غير المحقونة (الساق الخلفية وعظم الفخذ غير المحقون ، والتي تسمى BM) منفصلة. اغسل العظام باستخدام 1 مل من IMDM + 5٪ FBS وإبرة 36 جم × 3/4 بوصة وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
    2. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS ثم انقل 50 ميكرولتر إلى بئر من 96 صفيحة مستديرة القاع للتلطيخ.
    3. قم بتجميد أي نخاع عظمي متبقي وقم بتخزينه في النيتروجين السائل لمزيد من التجارب خارج الجسم الحي أو الثانوية في الجسم الحي .
  3. بالنسبة إلى PB:
    1. اغسل أنبوب التجميع ب 100 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS ، وانقل الدم إلى أنبوب FACS سعة 5 مل ، وقم بتكوين الحجم إلى 2.5 مل باستخدام PBS + 3٪ FBS.
    2. ضع الماصة بعناية 1 مل من Pancoll في الجزء السفلي من أنابيب FACS وجهاز الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة عند 500 × جم مع إيقاف تشغيل الفرامل.
    3. اجمع طبقة الطبقة المصفرة ، وانقلها إلى أنابيب سعة 1.5 مل ، وقم بتعبئة ما يصل إلى 1.5 مل باستخدام PBS + 3٪ FBS. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم.
    4. أعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS وانقلها إلى بئر من 96 صفيحة مستديرة القاع للتلطيخ.
  4. للطحال:
    1. ضع الطحال في مصفاة خلوية موضوعة على أنبوب سعة 50 مل واسحقه بالمكبس من حقنة سعة 3 مل.
    2. مليلتر واحد في كل مرة ، أضف 5 مل من IMDM + 5٪ FBS لغسل الخلايا. خذ 50 ميكرولتر إلى بئر من 96 صفيحة مستديرة القاع للتلطيخ.
  5. تحضير ماستر الأجسام المضادة. فيما يلي مثال ل 10 عينات:
    1. Aliquot 550 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS (50 ميكرولتر / عينة + 10٪ إضافية) في أنبوب 1.5 أو 2 مل.
    2. أضف الأجسام المضادة الفردية بحيث يكون تركيزها النهائي 2x بناء على معايرة المعايرة (على سبيل المثال ، بالنسبة للجسم المضاد المعايرة 1: 100 ، أضف 11 ميكرولتر).
      ملاحظة: اختر لوحة أجسام مضادة تقيم التمايز المحتمل عبر جميع سلالات الدم ذات الأهمية ، على سبيل المثال ، CD19 / FITC و GlyA / PE و CD45 / PECy5 و CD14 / PECy7 و CD33 / APC و CD19 / Alexa 700 و CD45 / BV510 و CD3 / APCCy7.
  6. تلطيخ: أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الرئيسية إلى كل بئر من الألواح ذات القاع المستدير المكون من 96 التي تحتوي على العينات المراد تلطيخها. وصمة عار لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وأضف 100 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS لغسل الخلايا ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم. قم بإزالة المادة الطافية.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS + 3٪ FBS وقم بتمرير كل عينة عبر أنبوب FACS بغطاء مصفاة خلية. إلى عينات نخاع العظام والطحال ، أضف 200 ميكرولتر أخرى من PBS + 3٪ FBS.
  8. ضوابط قياس التدفق الخلوي: قم بعمل عناصر تحكم أحادية البقعة باستخدام حبات التعويض عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PBS ، وقطرة واحدة من الخرز الموجب ، وقطرة واحدة من الخرز السالبة ، و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى أنبوب FACS. اتركيه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم أضيفي 300 ميكرولتر من PBS. خذ 50 ميكرولتر من خلايا نخاع العظم غير الملوثة المكونة من 400 ميكرولتر مع PBS + 3٪ FBS كعنصر تحكم غير ملوث.
  9. تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    1. قم بتشغيل أدوات التحكم أحادية البقعة وغير ملوثة للتعويض كما هو موصى به لمقياس الخلوي المستخدم. قم بإعداد البوابات كما في الشكل 3 أ.
    2. بالنسبة إلى PB ، قم بتشغيل جميع الخلايا وبالنسبة لنخاع العظام والطحال ، قم بتشغيل ما لا يقل عن 50,000 حدث لكل عينة اعتمادا على مستويات النقش البشري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن تقييم نقش الخلايا المحقونة داخل الفخذ في أي وقت من 24 ساعة فصاعدا اعتمادا على التصميم التجريبي. في نقطة النهاية ، يمكن جمع IF ، BM ، PB ، والطحال. يمكن معالجتها ، وتقييم مستوى النقش عن طريق قياس التدفق الخلوي. لاستدعاء النقش البشري بقوة حتى عند المستويات المنخفضة ، قمنا بتلطيخ جسمين مضادين متميزين ضد CD45 البشري (استنساخ HI30 واستنساخ 2D1). تم اعتبار الخلايا الإيجابية لكلا الأجسام المضادة (CD45 ++) فقط من أصل بشري. تم تحديد عتبة النقش على النحو التالي: (٪ CD45 ++ + ٪ GlyA +) ≥ 0.01٪ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتبر الحقن داخل الفخذ أداة مفيدة في زراعة الأعضاء عندما يتوفر عدد صغير فقط من HSPCs ، مما يوفر تحسنا مقارنة بالحقن في الوريد. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تتطلب البراعة والتدريب. عند التمرين ، نوصي باستخدام جثث جديدة من نطاق الوزن الصحيح (انظر أدناه) وحقن صبغة ملونة (مثل التريبان الأزرق) بحيث يتضح عند التشريح ما إذا كان الحقن قد دخل في عظم الفخذ واقتصر عليه (لا ينبغي ملاحظة أي صبغة في العضلات). بالنسبة لهذا الإجراء ، هناك خطوتان حاسمتان: تحديد الموضع والشعور بالإدخال الصحيح للإبرة الثانية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بمجموعة الدكتور جون ديك لعملهم السابق على هذه الطريقة ، ومونيكا دويدنز للتدريب. نحن ممتنون للبنك الحيوي للدم والخلايا الجذعية في كامبريدج (CBSB) ، وتحديدا الدكتورة جوانا باكستر وفريق ممرضات CBSB الذين وافقوا وجمعوا عينات من دم الحبل السري. عينة المتبرعين لدينا. الخدمة الطبية الحيوية بالجامعة ، وتحديدا نيكولاس لوملي والموظفين في مبنى آن ماكلارين لصيانة سلالات الفئران لدينا ودعم تجاربنا في الجسم الحي . شايزمين بشير لتحرير المخطوطة.

يتم تمويل E.L. من قبل زمالة السير هنري ديل التي يتم تمويلها بشكل مشترك من قبل Wellcome Trust والجمعية الملكية (107630 / Z / 15 / A). L.M. مدعوم من Sofinter - برنامج رعاية الموارد البشرية. تم تمويل هذا البحث كليا أو جزئيا من قبل Wellcome Trust (203151 / Z / 16 / Z ، 203151 / A / 16 / Z ، 215116 / Z / 18 / Z) ومجلس البحوث الطبية UKRI (MC_PC_17230). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة للمؤلف تنشأ عن هذا التقديم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 مل حقنة الأنسولين مع 29 جم × 12.7 مم إبرةBD324892
1 مل حقنة الأنسولين مع 29 جم × 0.5 بوصة إبرةBD324827
أنبوب 1.5 ملFisherbrand509-GRD-PFB
3 مل حقنة   ؛HENKE SASS WOLF GMBH4020.000V0
5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير مع غطاء مصفاة الخلية 12 × 75 ممFalcon352235أنبوب FACS
5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير مع غطاء المفاجئ 12 × 75 ممأنبوب Falcon352058FACS
27 G 1/2 "إبرة BD 300635
40 & مصفاة خلية m لأنبوب 50 ملGreiner Bio-one542040
أنبوب 50 ملSarstedt Ltd62.547.254
96 لوحة مستديرة القاع جيدا   ؛Falcon351177
مسحة الكحولVITREX MEDICAL A / S
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer مقياس التدفق الخلويBD
BuphrenorphineAnimalcareXVD190
CD14 / PECy7 (استنساخ M5E2)biolegend301814يستخدم في 1 في 1000
CD19 / Alexa 700 (استنساخ HIB19)biolegend302226يستخدم في 1 في 300
CD19 / FITC (استنساخ HIB19)biolegend302206يستخدم في 1 في 200
CD3 / APCCy7   ؛ ( استنساخ HIT3a)biolegend300318يستخدم في 1 في 100
CD33 / APC (استنساخ P67.6) ديناربحريني 345800يستخدم في 1 في 200
CD45 / BV510 (استنساخ HI30)biolegend304036يستخدم في 1 في 500
CD45 / PECy5 (استنساخ 2D1)biolegend368526يستخدم في 1 في 300
CompBeads Anti-Mouse Ig ، & kappa ؛ / مجموعة جزيئات تعويض التحكم السلبيBD552843
Dnase 1ورثينجتون الكيمياء الحيويةLS002139
مصل الأبقار الجنينية (FBS)PAN-BiotechP40-37500
جليكوفورين أ (GlyA) / PE (استنساخ GA-R2) BD340947يستخدم في 1 في 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)PAN-BiotechP04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100٪ وزن / ث بخار الاستنشاق ، سائل)Zoetis115095
Microvette  300 ليثيوم هيبارين LH ، 300 وميكرو ؛ LSarstedt Ltd20.1309أنبوب جمع الدم الماوس
NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) الفئران نهر تشارلز  
Pancoll الإنسان ، الكثافة: 1.077 جم / ملPAN-BiotechP04-60500
البنسلين الستربتومايسين   ؛جيبكو15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)14190169جيبكو
520213

المراجع

  1. Dancey, J. T., Deubelbeiss, K. A., Harker, L. A., Finch, C. A. Neutrophil kinetics in man. J Clin Invest. 58 (3), 705-715 (1976).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  4. Cosgrove, J., Hustin, L. S. P., de Boer, R. J., Perié, L. Hematopoiesis in numbers. Trends Immunol. 42 (12), 1100-1112 (2021).
  5. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9 (7), 959-963 (2003).
  6. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  7. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  8. Belluschi, S., et al. Myelo-lymphoid lineage restriction occurs in the human haematopoietic stem cell compartment before lymphoid-primed multipotent progenitors. Nat Commun. 9 (1), 4100(2018).
  9. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  10. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγ(null) humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  11. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nat Biotechnol. 32 (4), 364-372 (2014).
  12. McIntosh, B. E., et al. Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ−/− KitW41/W41 (NBSGW) Mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells. Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).
  13. Notta, F., Doulatov, S., Dick, J. E. Engraftment of human hematopoietic stem cells is more efficient in female NOD/SCID/IL-2Rgc-null recipients. Blood. 115 (18), 3704-3707 (2010).
  14. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Sci Rep. 6, 23886(2016).
  15. Mende, N., et al. Unique molecular and functional features of extramedullary hematopoietic stem and progenitor cell reservoirs in humans. Blood. 139 (23), 3387-3401 (2022).
  16. Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
  17. Eppert, K., et al. Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia. Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).
  18. Sanchez, P. V., et al. A robust xenotransplantation model for acute myeloid leukemia. Leukemia. 23 (11), 2109-2117 (2009).
  19. Li, J., Chen, H., Zhao, S., Wen, D., Bi, L. Patient-derived intrafemoral orthotopic xenografts of peripheral blood or bone marrow from acute myeloid and acute lymphoblastic leukemia patients: clinical characterization, methodology, and validation. Clin Exp Med. 23 (4), 1293-1306 (2023).
  20. Dobson, S. M., et al. Relapse-fated latent diagnosis subclones in acute B lineage leukemia are drug tolerant and possess distinct metabolic programs. Cancer Discov. 10 (4), 568-587 (2020).
  21. Marktel, S., et al. Intrabone hematopoietic stem cell gene therapy for adult and pediatric patients affected by transfusion-dependent ß-thalassemia. Nat Med. 25 (2), 234-241 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية المكونة للدمزراعة الأعضاء بين الأنواعتطعيم نخاع العظمقياس التدفق الخلويخلايا CD34 في دم الحبل السريعلم الأوميكس للخلية الواحدةزراعة الخلايا الجذعية
الحقن داخل الفخذ للخلايا الجذعية والمكونة للدم البشرية والخلايا السلفية في الفئران المصابة بنقص المناعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.