مقالة منهجية

سير عمل للتقييم الكمي للميكروبيومات البكتيرية الداخلية والنباتية لحاء Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

⸱

يونيو 27, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول سير عمل موثوقا وفعالا من جمع العينات إلى تحليل البيانات لتحديد ملامح الميكروبيوم البكتيري الباطن والمشاشي الموجود في لحاء Populus trichocarpa.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قد تمتلك الكائنات الحية الدقيقة التي تستعمر أسطح النباتات والأنسجة الداخلية وظائف مفيدة في تعزيز نمو النبات وصحته. ومع ذلك ، لا تزال المعلومات المتعلقة بالميكروبيوم لأنسجة اللحاء للنباتات الخشبية محدودة ، خاصة فيما يتعلق بالميكروبات البكتيرية الداخلية والمشاشية لحاء Populus. للتغلب على هذا القيد ، أنشأنا سير عمل لتحديد تكوين وتنوع الجراثيم البكتيرية endophytic و epiphytic التي تستعمر لحاء Populus trichocarpa. باختصار ، بشرة جذع P. trichocarpa تم مسحها مرارا وتكرارا بكرة قطنية مغموسة في 0.1٪ Tween 20 للحصول على عينات بكتيرية نباتية. تم تعقيم البشرة المجردة ثم تجميدها وسحقها بشكل متكرر باستخدام النيتروجين السائل ومضرب الخرزة ، على التوالي ، لجمع عينات بكتيرية endophytic. تم استخراج الحمض النووي الجيني من المجتمعات البكتيرية النباتية الملتصقة بالقطن واللحاء المسحوق ل P. trichocarpa ، وخضع لتضخيم تفاعل ploymerase المتسلسل (PCR) مع بادئات تستهدف مناطق V5-V7 و V4 شديدة التغير من جين 16S rRNA البكتيري. تم خلط ثلاث نسخ مكررة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم الحصول عليها من كل عينة من النباتات الداخلية أو النبتة في تركيزات متساوية لبناء مكتبة amplicon ، والتي تم تسلسلها بعد ذلك. تم تحليل التسلسلات التي تم الحصول عليها عن طريق الربط التسلسلي ، وتصفية الجودة ، وإزالة الوهم ، والتعليقات التوضيحية التصنيفية. باختصار ، أنشأنا سير عمل موثوقا وفعالا من جمع العينات إلى تحليل البيانات لتحديد الميكروبيوم البكتيري الداخلي والمشاشية لحاء P. trichocarpa من خلال التنميط الجيني 16S rRNA. جنبا إلى جنب مع طرق استكشاف لحاء استعمار الكائنات الحية الدقيقة التي تم إنشاؤها في الدراسة السابقة ، قد تكون منهجيتنا بمثابة مخطط لتصميم بروتوكولات للتحقيق في ميكروبيوم اللحاء لأنواع النباتات الخشبية الأخرى ، وخاصة أشجار الغابات ذات الأهمية الاقتصادية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللحاء هو الطبقة الخارجية من سيقان النباتات الخشبية ، في إشارة إلى جميع الأنسجة خارج الكامبيوم الوعائي ، بما في ذلك اللحاء ومحيطالجلد 1،2. أظهرت الأبحاث المكثفة أن اللحاء يلعب أدوارا محورية في نقل الماء والكربوهيدرات ، وحماية الأشجار من الحريق والأضرار الميكانيكية3 ، والتكيف مع الضغوط اللاأحيائية4والحيوية5. والأهم من ذلك ، باعتباره واجهة بين الشجرة والهواء المحيط ، يعمل اللحاء أيضا كموطن فريد للكائنات الحية الدقيقة6. والجدير بالذكر أنه تم تأكيد أن الميكروبات المرتبطة باللحاء تمتلك وظائف تعزيز نمو المضيف7 ، ومساعدة الأشجار في اكتساب المغذيات8 ، وتعزيز تخليق الهرمونات النباتية9 ، وحماية المضيفين من عدوى مسببات الأمراضالنباتية 5. ومع ذلك ، فقد تم إيلاء اهتمام أقل بكثير للمجتمعات الميكروبية التي تستعمر اللحاء مقارنة بالميكروبات الميكروبية وجذورالجذور 10،11. توجد معرفة محدودة فيما يتعلق بالسمات البيولوجية لميكروبيوم لحاء الشجر. الهدف من ورقة المنهجية الحالية هو تزويد الباحثين بمجموعة من البروتوكولات لوصف تنوع وتكوين الميكروبيوم البكتيري الداخلي والمشاشية لحاء النبات الخشبي.

على أساس الطرق المنشورة للتحقيق في ميكروبات اللحاء12،13في هذا العمل ، قمنا بتصميم واختبار سير عمل مفصل يعتمد على تحليل تسلسل أمبليكون جين 16S rRNA لاستكشاف الميكروبيوم البكتيري الذي يستقر الأنسجة الداخلية أو أسطح لحاء جذع Populus trichocarpa ، وهو كائن حي نموذجي مهم يستخدم في بيولوجيا النبات الخشبي14. P. trichocarpa له خصائص النمو السريع15 ، والسهولة النسبية للتلاعب التجريبي16 ، والتحول الجيني السهل ، وأيضا ، معروف بتطبيقه الواسع في إنتاج الأخشاب17. على وجه التحديد ، تبدأ الطريقة المطروحة في هذا العمل بوصف مفصل لأخذ عينات من الجراثيم الداخلية والمشاشية لحاء ساق P. trichocarpa. مع إدراج خطوة لتعقيم اللحاء على السطح بالكحول وهيبوكلوريت الصوديوم بعد حصاد الميكروبيوم الذي يستعمر السطح ، أنشأت هذه الدراسة إجراء لجمع الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في البنية الداخلية لللحاء (النباتات الداخلية) وتلك التي تعيش على السطح الخارجي لللحاء (النباتات الهوائية). على حد علمنا ، من بين الدراسات المنشورة على ميكروبيوم لحاء النبات الخشبي ، لم يتم إجراء أي فحوصات على المجتمعات الميكروبية الداخلية والنباتية التي تم جمعها من نفس عينة اللحاء بناء على تمييز واضح بين المنافذ الداخلية والخارجية لللحاء18،19،20. وبالتالي ، فإن الطريقة التي تم تطويرها في هذا البحث ستمكن الباحثين من فحص تنوع وتكوين المجتمعات البكتيرية التي تعيش في اللحاء بطريقة دقيقة وشاملة. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم هذه الدراسة أوصافا مفصلة لإجراءات استخراج الحمض النووي الجيني ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وإعداد مكتبة تسلسل أمبليكون الجين 16S rRNA21 ، وتحليل بيانات التسلسل. على وجه الخصوص ، استخدمت هذه الدراسة زوجا من البادئات التي تستهدف مناطق V5-V7 شديدة التغير من جين 16S rRNA البكتيري لتقليل التضخيم غير المحدد لتسلسلات الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء للنباتات المضيفة22 ، والتي أسفرت عن ملامح غير متحيزة للميكروبيوم المرتبط باللحاء. تم تقييم التنوع α باستخدام مؤشر شانون23 ، وهو مؤشر تنوع شائع يستخدم على نطاق واسع في أبحاث علم البيئة ، وتم حساب التركيب التصنيفي على مستوى الشعبة وتصوره في الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) 24و Rالبرنامج 25. جنبا إلى جنب مع طرق استكشاف الجراثيم التي تستعمر اللحاء التي تم إنشاؤها في الدراسة السابقة 1،6 ، قد تكون منهجيتنا بمثابة مخطط لتصميم بروتوكولات لدراسة ميكروبيوم اللحاء لأنواع النباتات الخشبية الأخرى ، وخاصة أشجار الغابات ذات الأهمية الاقتصادية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جمع العينة

  1. تنمو بعمر 3 أشهر P. شتلات trichocarpa في غرفة النمو (21-25 درجة مئوية ؛ 16 ساعة من الضوء / 8 ساعات دورة مظلمة مع ضوء تكميلي يبلغ حوالي 300 ميكرومتر −2 ثانية −1 من مصباح فلورسنت خطي ثلاثي النطاقات [T5 28 W 6400 K] ؛ و 60-80٪ رطوبة) 26.
  2. قطع شرائح الساق بطول 10 سم من P. trichocarpa من 2-12 سم فوق سطح التربة المعقمة (الشكل 1 أ) باستخدام مقص معقم. ضع شرائح الساق في طبق بتري مربع معقم (13 سم × 13 سم).
    ملاحظة: تم اختيار ست أشجار من نفس الحجم لهذه الدراسة ، تم استخدام ثلاث منها لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مع كل مجموعة أولية.

2. معالجة العينة

  1. امسح بشرة الساق بشكل متكرر على طبق بتري المربع المعقم باستخدام قطعة قطن معقمة مغموسة في 0.1٪ توين 20 لجمع الكائنات الحية الدقيقة المستعمرة على أسطح اللحاء بشكل أكثر كفاءة (الشكل 1ب).
    ملاحظة: تستخدم القطن المعقم شبه الرطب لجمع الكائنات الحية الدقيقة الملتصقة بسطح الساق. لا تستخدم القطن الجاف جدا أو الرطب جدا عند مسح سطح الساق. Tween 20 هو مادة خافضة للتوتر السطحي قادرة على تقليل التوتر السطحي ، وهي خاصية مفيدة للحصول على المزيد من العينات الميكروبية من أسطح النبات27،28.
  2. قم بقص طرف القطن من المسحة باستخدام شفرة معقمة ، وضع كل طرف قطني يحتوي على عينات ميكروبية نباتية في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
  3. بعد مسح سطح الساق ، افتح اللحاء الذي تم أخذ عينات منه من الكائنات الحية الدقيقة باستخدام مشرط معقم ، وقشر اللحاء ، وضعه في طبق بتري مربع.
  4. قطع اللحاء الذي تم تجريده من الجذع في الخطوة 2.3 إلى شرائح بحجم 1 سم تقريبا (الشكل 1ج) بمشرط معقم.
  5. عقم الأجزاء عن طريق نقعها في 70٪ (حجم / حجم) كحول لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، انقع الأجزاء في هيبوكلوريت الصوديوم (2.5٪ محتوى الكلور الفعال) مع 0.1٪ توين 80 لمدة 5 دقائق.
  6. عقم الأجزاء التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.5 لمدة 30 ثانية في 70٪ (حجم / حجم) كحول29. ثم اغسل جميع العينات ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم وضعها على مقعد نظيف لتجفيفها بالهواء.
    ملاحظة: يتم تقليب عينات اللحاء ذهابا وإيابا باستخدام ملاقط معقمة لضمان تعقيم السطح الكافي.
  7. قم بتخزين كل جزء من لحاء الساق المعقم على السطح (عينات داخلية) في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 2 مل عند -80 درجة مئوية.

3. استخراج الحمض النووي الجيني

  1. قم بتنفيذ الخطوات التالية للمعالجة المسبقة للعينات لاستخراج الحمض النووي.
    1. ضع شرائح لحاء الساق المعقمة على السطح التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.7 في أنابيب صلبة معقمة سعة 5 مل وأضف ثلاث حبات فولاذية معقمة (4 مم) في كل أنبوب.
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة على مقعد نظيف لمنع التلوث الميكروبي. لا تحتاج كرات القطن المحضرة في الخطوة 2.2 (عينات نباتية) إلى المعالجة المسبقة وتستخدم مباشرة لاستخراج الحمض النووي الجيني.
    2. قم بتجميد الأنابيب الصلبة التي تحتوي على العينات في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق.
    3. سحق عينات اللحاء لمدة 5 دقائق باستخدام مضرب الخرز. بعد ذلك ، قم بتجميد الأنبوب الصلب مرة أخرى في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة وكرر خطوة ضرب الخرز لمدة 5 دقائق.
  2. استخراج الحمض النووي الجيني.
    ملاحظة: استخدم مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية لعزل الحمض النووي الجيني من عينات النباتات الداخلية والنباتية.
    1. أضف لحاء الساق المسحوق من P. Trichocarpa والمجتمعات البكتيرية النباتية الملتصقة بالقطن (0.25 جم لكل منهما) لكل أنبوب من أنابيب الخرز. ثم أضف 60 ميكرولتر من المحلول C1 الذي توفره مجموعة تجارية واخلطه برفق عن طريق الانعكاس.
    2. بعد ذلك ، قم بتجانس عينات النباتات الداخلية والنباتية باستخدام مضرب الخرز في أربع جولات مدتها دقيقة واحدة. بعد كل تشغيل ، ضع العينات على الجليد لمدة 30 ثانية.
    3. الطرد المركزي الأنابيب عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
    4. استخرج عينات النباتات الداخلية والمشاشية باستخدام مجموعة (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    5. أضف 30 ميكرولتر من المحلول C6 إلى مركز غشاء المرشح الأبيض واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.

4. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. توحيد تركيز الحمض النووي المستخرج.
    1. قياس تركيزات الحمض النووي الجيني المستخرج من عينات نباتية ونباتات داخلية باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
    2. قم بتخفيف كل عينة من الحمض النووي باستخدام ddHمعقم 2O إلى 2 نانوغرام / ميكرولتر للحصول على قالب الحمض النووي لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. تضخيم عينات الحمض النووي هذه.
    1. قم بتضخيم منطقة V5-V7 من جين 16S rRNA البكتيري باستخدام التمهيدي الأمامي 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') والتمهيدي العكسي 1193R (5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3') 10. تضخيم منطقة V4 من جين 16S rRNA البكتيري باستخدام التمهيدي الأمامي 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') والتمهيدي العكسي 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      ملاحظة: يتم استخدام الحمض النووي الجيني المستخرج من كل عينة كقالب لكل تفاعل من تفاعلات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ثلاثية ، ويتم تعيين تفاعل إضافي لا يحتوي على حمض نووي كعنصر تحكم سلبي. لكل عينة ، حجم خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل هو 25 ميكرولتر. بالنسبة لزوج التمهيدي 799F / 1193R ، يحتوي كل تفاعل على 12 ميكرولتر من ماء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، و 1 ميكرولتر من كل من بادئات F / R (10 ميكرومتر) ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من محلول المزيج. بالنسبة لزوج التمهيدي 515F / 806R ، يحتوي كل تفاعل على 12 ميكرولتر من ماء PCR ، و 1 ميكرولتر من كل من بادئات F / R (10 ميكرومتر) ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 10 ميكرولتر من محلول المزيج. يتم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زوج التمهيدي 799F / 1193R مع ظروف الدورة التالية: التمسخ الأولي عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 25 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 53 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع زوج التمهيدي 515F / 806R مع ظروف الدورة التالية: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، والتمديد النهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    2. امزج كل عينة جيدا وجهاز الطرد المركزي للتخلص من الفقاعات.
    3. قم بتضخيم منطقة V5-V7 أو V4 لجينات الرنا الريبية البكتيرية 16S على دورة حرارية.
  3. الكشف عن المنتجات المضخمة.
    1. قم بتحميل 5 ميكرولتر من كل أمبليكون على هلام الاغاروز بنسبة 1٪ وقم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 120 فولت لمدة 30 دقيقة.
    2. اعرض الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من صحة تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الناجح. يجب أن تكون أحجام منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم الحصول عليها من أزواج التمهيدي 799F / 1193R و 515F / 806R حوالي 430 نقطة أساس و 400 نقطة أساس ، على التوالي.

5. إعداد مكتبة تسلسل Amplicon

  1. امزج المنتجات المضخمة وحدد تركيزاتها.
    1. امزج المنتجات الناتجة عن التكرارات الثلاثة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل عينة في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    2. أضف 5 ميكرولتر من منتجات PCR و 195 ميكرولتر من محلول العمل في بئر من صفيحة دقيقة سعة 96 بئرا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجموعة (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الحمض النووي القياسي (كواشف الحمض النووي بتركيزات 0 و 5 و 10 و 20 و 40 و 60 و 80 و 100 نانوغرام / ميكرولتر من المجموعة) و 190 ميكرولتر من محلول العمل في بئر من نفس الصفيحة الدقيقة. بعد هذه الخطوة ، حدد شدة التألق لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والحمض النووي القياسي.
    3. قم بقياس التألق باستخدام قارئ الألواح الدقيقة.
      ملاحظة: يتم ضبط الإثارة / انبعاث الأطوال الموجية القياسية للفلورسين على 480/530 نانومتر لقياس كمية الحمض النووي المزدوج الشريطة في كل عينة.
    4. إنشاء المنحنى القياسي لتركيزات الحمض النووي وشدة التألق باستخدام تركيزات الحمض النووي القياسية لمحاليل الحمض النووي القياسية (0 و 5 و 10 و 20 و 40 و 60 و 80 و 100 نانوغرام / ميكرولتر) وشدة التألق لكل من محلول الحمض النووي القياسي. استبدل قيمة شدة التألق لكل منتج من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في المنحنى القياسي لحساب تركيزات الحمض النووي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  2. بناء مكتبات تسلسل amplicon.
    1. وفقا للتركيزات المكتشفة في الخطوة 5.1.4 ، قم بخلط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتبقية التي تم تضخيمها بواسطة نفس زوج التمهيدي بتركيزات متساوية لبناء مكتبة تسلسل الأمبليكون.
      ملاحظة: لا يتم تضمين جزء من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل عينة تستخدم لقياس تركيز الحمض النووي المزدوج الشريطة عن طريق قياس شدة التألق في مكتبة تسلسل Amplicon ، والتي تم إنشاؤها من منتجات PCR المتبقية من نفس العينة.
  3. إجراء استخراج الجل.
    1. إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز باستخدام جهاز الرحلان الكهربائي. باختصار ، قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1.3٪ (أي 1.3 جم من مسحوق الاغاروز في 100 مل من 1 × TAE عازلة).
      ملاحظة: يتم توخي الحذر للتأكد من أن كمية الآبار في الجل كافية لحمل كل منتج PCR وسلم الحمض النووي ؛ في هذه الدراسة ، يتم تحضير 1.3٪ من هلام الاغاروز عن طريق إذابة 1.3 جم من مسحوق الاغاروز في 100 مل من 1 × محلول TAE.
    2. قم بإزالة الأمشاط بعد تصلب الجل وضع الجل في خزان الرحلان الكهربائي مع 1 × عازلة TAE. بعد ذلك ، أضف وحدة حجم واحدة من 6 × مخزن مؤقت للتحميل البرتقالي إلى 5 وحدات حجم لكل منتج PCR ، مع تحميل 100 ميكرولتر من الأخير في كل بئر. أضف 30 ميكرولتر من سلم الحمض النووي إلى بئر واحد. بعد توصيل الأسلاك الموجبة والسالبة ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 80 فولت لمدة 50 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام استخراج الجل لتنقية مكتبة تسلسل Amplicon التي يمثلها النطاق المكون من 400 نقطة أساس أو 430 نقطة أساس مكبرة بزوج التمهيدي 515F / 806R أو 799F / 1193R ، على التوالي.
    3. استئصال شظايا الحمض النووي من هلام الاغاروز باستخدام مشرط نظيف وحاد.
    4. قم بوزن شريحة الجل وانقلها إلى أنبوب عديم اللون. أضف عازلة لغمر شريحة الجل.
      ملاحظة: الحد الأقصى لكمية الجل لكل عمود دوران هو 400 مجم. تتم إضافة ثلاث وحدات حجم من المخزن المؤقت إلى وحدة حجم واحدة من شريحة هلامية معينة.
    5. قم بإجراء استخراج الجل باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر جدول المواد) باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يتم الحصول على مكتبة amplicon التي تم إنشاؤها من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تستهدف جين 16S rRNA البكتيري المستخدم لتسلسل المجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية باستخدام هذه الطريقة.
  4. تأكد من جودة مكتبة تسلسل Amplicon المنقى.
    1. حدد تركيز الحمض النووي مزدوج الشريطة في مكتبة تسلسل الأمبليكون المنقى الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5.3.5 بواسطة مقياس الفلور باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (الشكل 2).
    2. حدد حجم جزء الحمض النووي المستهدف لمكتبة تسلسل الأمبليكون التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.3.5 باستخدام نظام تحليل مراقبة جودة الحمض النووي مع رقائق ومجموعات تجارية (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: تأكد من أن حجم القطعة ضمن النطاق المتوقع وعدم وجود ثنائيات أولية في مكتبة تسلسل Amplicon.
    3. تحديد التركيز الفعال لمكتبة التسلسل التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.3.5 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) مع مجموعة تجارية (انظر جدول المواد) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    4. قم بتخفيف مكتبة تسلسل amplicon لتلبية تركيز التحميل الموصى به لمنصة التسلسل.

6. معالجة التسلسل والتحليل الإحصائي

  1. بعد تسلسل مكتبة amplicon التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.4.4 باستخدام منصة التسلسل (انظر جدول المواد)31. قم بإنشاء مجلد باسم emp-paired-end-sequences في دليل العمل ، ثم احفظ ملف التسلسل المضغوط بتنسيق fastq في هذا المجلد. ثم افتح Ubuntu وقم بتنشيط بيئة conda و Quantitative Insights in Microbial Ecology 2 (QIIME2) (v2021.2) 32.
  2. اكتب ملف تعيين واحفظه كملف نصي. يظهر محتوى الملف في الجدول 2.
  3. قم بتقسيم بيانات التسلسل التي تم الحصول عليها باستخدام مكتبة تسلسل amplicon وإزالة البادئات من بيانات التسلسل باستخدام ملف التعيين.
    1. استخدم الأمر التالي لتقسيم بيانات التسلسل: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. استخدم الأمر التالي لإزالة الاشعال: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F أو 515F --p-front-r 1193R أو 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. قم بفحص وإزالة أي وهم باستخدام خط أنابيب DADA233. قم بتجميع التسلسلات التي تمت تصفيتها في متغيرات تسلسل amplicon (ASVs) عند تشابه بنسبة 99٪.
    1. استخدم الأمر التالي لفحص وإزالة الوهم وتسلسلات الكتلة في ASVs: الوقت qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 -p-trim-left-r 0 -p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza -o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. قم بعمل تعليقات توضيحية تصنيفية باستخدام قاعدة بيانات SILVA (v138) بناء على التسلسلات المرجعية34.
    1. استخدم الأمر التالي للتعليق على ASVs التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. قم بإنشاء جدول ASV في QIIME2 (الإصدار 2021.2) باستخدام الأوامر التالية:
    تصدير أدوات QIIME --Input-Path table.qza --output-path exported-feature-table
    تصدير أدوات QIIME --Input-Path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, taxonomy --sc-separate taxonomy
    تحويل بيوم -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key taxonomy
    ملاحظة: تنشئ هذه الأوامر جدولا يحتوي على عدد قراءات جميع ASVs لكل عينة.
  7. احسب عدد ASVs وقراءات المجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية التي تم إنشاؤها باستخدام أزواج التمهيدي 799F / 1193R و 515F / 806R ، على التوالي.
    1. احسب العدد الإجمالي ل ASVs التي تحتوي على قراءة ≥ 1 على مستويات الشعبة والفئة والترتيب والأسرة والجنس ، على التوالي ، في كل عينة في جدول ASV التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.6 عن طريق العد.
    2. احسب العدد الإجمالي للقراءات في كل عينة بناء على مجموع عدد قراءات جميع ASVs في جدول ASV الذي تم الحصول عليه في الخطوة 6.6 عن طريق العد.
    3. احسب عدد قراءات النبات في كل عينة باستخدام عدد قراءات ASVs المشروحة على شكل بلاستيدات خضراء أو ميتوكوندريا في جدول ASV الذي تم الحصول عليه في الخطوة 6.6 عن طريق العد.
    4. احسب عدد القراءات البكتيرية في كل عينة باستخدام الصيغة التالية:
      عدد القراءات البكتيرية = عدد القراءات الإجمالية - عدد قراءات النبات.
    5. احسب وتصور متوسط عدد ASVs (على مستويات الشعبة والفئة والترتيب والأسرة والجنس ، على التوالي) أو القراءات (بشكل إجمالي أو للنباتات والبكتيريا ، على التوالي) للمجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية الناتجة عن أزواج التمهيدي 799F / 1193R و 515F / 806R باستخدام برنامج Excel (2019) و Prism (v8.0).
    6. قم بتقييم أهمية الاختلافات بين أعداد ASVs (على مستويات الشعبة والفئة والترتيب والأسرة والجنس ، على التوالي) أو القراءات (بشكل إجمالي أو للنبات والبكتيريا ، على التوالي) التي تم إنشاؤها باستخدام أزواج التمهيدي 799F / 1193R و 515F / 806R باستخدام اختبار الطالب في برنامج Prism (v8.0).
  8. قم بتصفية القراءات المشروحة على شكل بلاستيدات خضراء وميتوكوندريا باستخدام الأمر التالي: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza -p-exclude mitochondria, chloroplastes --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. قم بإنشاء شجرة النشوء والتطور باستخدام الأمر التالي: time qiime fillogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. احسب وتصور تنوعات ألفا التي يمثلها مؤشر شانون للمجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية باستخدام QIIME2 (v2021.2) وحزمة "ggplot2" في R (v4.0.5) 35.
    1. استخدم الأمر التالي لحساب التنوع ألفا: التنوع الزمني qiime core-metrics-phylogenetic -i-phylogeny rooted-tree.qza -i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth أقل قيمة قراءة بين جميع العينات --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. احسب الوفرة النسبية للسكان على مستوى شعبة المجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية. قم بإنشاء ملف بتنسيق qzv يسمى "taxa-bar-plots" باستخدام الأمر التالي ل QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. افتح الملف taxa-bar-plots.qzv عبر الإنترنت على https://view.qiime2.org/. قم بتنزيل الملف الذي تم إنشاؤه حديثا وحفظه من المستوى 2. احسب الوفرة النسبية بالصيغة التالية مع R (الإصدار 4.0.5):
      الوفرة النسبية لكل شعبة بكتيرية (٪) = (عدد قراءات كل شعبة بكتيرية في كل عينة / عدد إجمالي قراءات كل عينة) × 100٪.
      تصور البيانات باستخدام حزم ggplot2 و RColorBrewer وإعادة التشكيل و ggalluvial في R (الإصدار 4.0.5).
  12. قم بتحليل أهمية الفرق بين الوفرة النسبية لكل من الشعب المهيمنة (المعرفة على أنها شعبة تمتلك وفرة نسبية تبلغ > 0.5٪) في المجتمعات البكتيرية الداخلية والنباتية المتسلسلة مع زوج التمهيدي 799F / 1193R باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) مع اختبار Tukey اللاحق عند مستوى دلالة 0.05 في برنامج STAMP36.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي الجيني عالي الجودة للميكروبيوم البكتيري الباطن والنباتي لحاء P. تم الحصول على trichocarpa باستخدام البروتوكول الأمثل (الجدول 1). أسفر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجميع العينات ال 12 عن نطاقات قوية مفردة بالحجم الصحيح (الشكل 3). نجح كلا الزوجين التمهيديين 799F / 1193R و 515F / 806R في تضخيم المنتجات المستهدفة من عينات أنسجة اللحاء الداخلية أو المشبعة عند حوالي 400 و 430 نقطة أساس ، على التوالي. تم بناء مكتبة ampl...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير سير العمل الذي اقترحناه من المنهجية المنشورة لفحص ميكروبات اللحاء7،18 ، ويوفر إرشادات عامة لتحديد وتوصيف الميكروبيوم الداخلي والمشاشية لحاء النباتات الخشبية. تشتمل هذه الطريقة على بروتوكولات لجمع العينات ومعالجتها ، واستخراج الحمض النووي الجيني ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وإعداد مكتبات تسلسل التمبليكون ، وتحليل بيانات التسلسل ، وتعمل كمخطط محتمل لتصميم بروتوكولات لدراسة ميكروبيوم اللحاء لأنواع النباتات الخشبية....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر السيد ديفيد أنتوني أثيرتون على تقديم السرد بالفيديو وأعضاء مختبر B.N. على المشورة القيمة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (رقم المنحة 32071741 [إلى BN]) ، ومشاريع خطة البحث والتطوير الرئيسية في منطقة شينجيانغ الويغورية ذاتية الحكم (رقم المنحة 2022B02014) ، وخطة مقدمة "مواهب تيانشي" (إلى BN) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم المنحة 2021YFD2200203 [إلى GQ]) ، ومشروع الابتكار للمختبر الرئيسي الحكومي لعلم الوراثة والتربية الشجرية (جامعة شمال شرق الغابات) (رقم المنحة 2019A01 [إلى BN]).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المعدات:
مضرب الخرزةDHS Life Science401265
الطرد المركزي لأنابيب 1.5 ملأجهزة
الحرارية لأنابيب PCR قارئ
MicroplateBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & التكنولوجيا المحدودة2010/2020 مقياس الطيف الضوئي الصغير
كيوبيت 3.0 مقياس الفلور invitrogenQ33216مقياس الفلور 
ثلاجة (-80)باناسونيك للرعاية الصحية المحدودة17060107
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096Thermal Cycler
Tanon EPS-600   ؛TanonA-179047-2313For electrophores
, LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625 Library الكشف عن توزيع أجزاء الحمض النووي, تحليل مراقبة جودة الحمض
, النظم الحيوية التطبيقية QuantStudio 12Kالنظم الحيوية التطبيقية4485694مكتبة القياس
الكمي Illumina Novaseq6000Illumina تسلسل المكتبة
:
قفازاتأي
10 & mu ؛ LAxygenTF-300-R-S
طرف حاجز الهباء الجوي 20 & mu; LAxygenTF-20-R-S
طرف حاجز الهباء الجوي 200 & LAxygenTF-200-R-S
حاجز الهباء الجوي Tipr 1000 & mu; LAxygenTF-1000-R-S
أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملAxygenMCT-150-C
Corning 96 جيدا أسود / شفاف مسطح القاعMicroplate Corning3631
عصا قطنيةZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100لاستخراج الحمض النووي
أنبوب الطرد المركزي الخالي من الإنزيم 1.5 ملالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1415-2600
الإيثانولتيانجين يونغدا الكاشف الكيميائي المحدودة64-17-5
أنابيب صلبة (5 مل)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix   ؛الدقيق Quanta Bio2200400
2.0 ملAxygenMCT-200-C-S
PCR مياهQIAGEN 17000-10
QIAquick Gel Extraction Kit   ;QIAGEN28704لاستخراج هلام
مجموعات فحص Quant-iT dsDNA ، Wide RangeInvitrogenQ33130لتحديد تركيز المنتجات المضخمة ومكتبات amplicon المنقاة
طبق بتري مربعChangde Bkman Biotechnology Co. ، Ltd110301014
حبات الصلبShangyu Yixin Ball Industry Co.، Ltd.YXB36985
محلول هيبوكلوريت الصوديومتيانجين بيليان للكيماويات الدقيقة المحدودة   ؛7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
ثنائي البروتوكول DNA High Sens Reagent KitPerkinElmerCLS760672الكشف عن مكتبة الحمض النووي
مجموعة القياس الكمي لمكتبة IlluminaVazyme Biotech Co.، LtdNQ104مكتبة القياس الكمي
الطرد المركزي 75002440 العلمية الحجم النووي مواد طرف حاجز الهباء الجوي NA أنبوب الطرد المركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

16S rRNA DNA PCR

مقالات ذات صلة