مقالة منهجية

مراقبة تذبذبات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل التلألؤ البيولوجي في المواد العضوية

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66381

⸱

فبراير 16, 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, University of Cincinnati College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.

الملخص

تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية ، وهي عمليات بيولوجية تحدث خلال فترة 24 ساعة تقريبا وتنظم ذخيرة متنوعة من العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من دورات النوم والاستيقاظ إلى التمثيل الغذائي. تعمل آلية الساعة هذه على تقييد الكائن الحي بناء على التغيرات البيئية وتنسق التنظيم الزمني للأحداث الجزيئية والفسيولوجية. في السابق ، ثبت أن إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة يتم الحفاظ عليها حتى على مستوى الخلية الواحدة باستخدام خطوط الخلايا مثل الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت مفيدة في الكشف عن آليات إيقاعات الساعة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه عبارة عن ثقافات متجانسة تفتقر إلى تعدد الخلايا والاتصالات القوية بين الخلايا. في العقد الماضي ، تم إجراء عمل مكثف على تطوير وتوصيف وتطبيق المواد العضوية 3D ، والتي هي في أنظمة متعددة الخلايا في المختبر تشبه الهياكل والوظائف المورفولوجية في الجسم الحي . تصف هذه الورقة بروتوكولا للكشف عن إيقاعات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل مضيئة بيولوجيا في الأمعاء المعوية البشرية ، مما يتيح التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر.

المقدمة

الساعة البيولوجية
جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الثدييات ، لها علاقة معقدة وديناميكية مع بيئتها. في إطار هذه العلاقة ، يعد التكيف مع التغيرات البيئية أمرا بالغ الأهمية لبقاء الكائنات الحية. تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية تمكنها من التكيف وتحسين وظائفها مع الدورات النهارية التي تبلغ حوالي 24 ساعة. الساعة البيولوجية هي شبكة هرمية من الساعات المركزية والمحيطية التي تعمل بالتعاون للحفاظ على التوازن الفسيولوجي والحفاظ على تزامن الكائنات الحية مع التغيرات اليومية 1,2. في الثدييات ، تتلقى الساعة المركزية أو الرئيسية الموجودة في النواة فوق التصالبية (SCN) إشارات خارجية ، مثل الضوء ، وتنقل المعلومات إلى الساعات الطرفية عبر تفاعل متقدم لمسارات الإشارات العصبية والخلطية3. بالإضافة إلى الساعة المركزية ، تمتلك الأنسجة المحيطية آلية الساعة البيولوجية المستقلة للخلايا الخاصة بها ، والتي يتم الحفاظ عليها بواسطة حلقة التغذية المرتدة السلبية النسخية (TTFL) التي تنظم الجينات التي يتم التحكم فيها على مدار الساعة الخاصة بالأنسجة (CCGs)4,5. تنتج هذه الآلية الجزيئية ما يقرب من 24 ساعة من الإيقاع في الأحداث الخلوية والفسيولوجية ، مثل التعبيرات الجينية ومسارات الإشارات والاستجابات المناعية والهضم. الساعة البيولوجية موجودة في جميع خلايا الثدييات تقريبا ، وقد ثبت أن ما يصل إلى 50٪ من أنماط التعبير عن الجينات تظهر إيقاع الساعة البيولوجية6. بالنظر إلى وفرة CCGs ، قد يؤدي تعطيل آلية الساعة هذه إلى مشاكل فسيولوجية حرجة. ومن ثم ، فإن التحقيقات في إيقاعات الساعة البيولوجية ضرورية لتوضيح الآليات البيولوجية الأساسية وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

نظام مراسل لوسيفيراز
في الدراسات اليومية ، تعد المراقبة في الوقت الفعلي أمرا بالغ الأهمية لفهم أفضل للسلوكيات والاستجابات الخلوية لأنها تسمح بتتبع التغيرات الزمنية في التعبير الجيني و / أو مستويات البروتين ، مما يوفر نظرة ثاقبة للآليات الجزيئية التي تنظمها الساعة البيولوجية. علاوة على ذلك ، تمكن المراقبة في الوقت الفعلي الباحثين من دراسة آثار التغيرات البيئية على الآليات الجزيئية 7,8. هناك العديد من التقنيات لدراسات المراقبة في الوقت الفعلي ، بما في ذلك مقايسة التلألؤ الحيوي ، والتي تستخدم على نطاق واسع لتتبع التعبير الجيني أو مستويات البروتين بمرور الوقت. مقايسة التلألؤ الحيوي هي طريقة للكشف عن العمليات البيولوجية باستخدام إنتاج الضوء كقراءة. في هذا الفحص ، يتم نقل الإنزيم المؤكسد الذي ينتج التلألؤ الحيوي (على سبيل المثال ، luciferase) إما بشكل عابر أو ثابت إلى الخلايا ذات الأهمية ، ويتم قياس قراءات التلألؤ الحيوي في وجود ركيزة (على سبيل المثال ، لوسيفيرين) بمرور الوقت. على سبيل المثال ، ينتج إنزيم لوسيفيراز تلألؤا حيويا عن طريق أكسدة لوسيفيرين الركيزة في وجود ATP9. نظرا لعمر النصف القصير ، 3-4 ساعات10 ، يعد اليراع لوسيفيراز أداة قوية للدراسات اليومية من حيث توفير مراقبة ديناميكية في الوقت الفعلي مع الحد الأدنى من ضوضاء الخلفية11،12،13. لإدخال الحمض النووي مع مروج موسوم ب luciferase أو إطار قراءة مفتوح (ORF) ، يعد نظام توصيل الجينات الفيروسية العدسية طريقة موثوقة توفر فعالية نقل عالية ، وتكامل مستقر ، ومناعة منخفضة. يوفر النقل المستقر لمراسل التوهج الحيوي تعبيرا قويا في الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة ، مما يولد بيانات متسقة للدراسات اليومية14.

عضوي كنموذج
كانت خطوط الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية الخالدة مفيدة في الدراسات البيولوجية التي تتراوح من الكشف عن الآليات الجزيئية الأساسية لإيقاعات الساعة البيولوجية إلى فحص الأدوية. على الرغم من راحة استخدام خطوط الخلايا المتجانسة ، إلا أنها تفتقر إلى الهياكل متعددة الخلايا والتفاعلات بين الخلايا. في المقابل ، فإن الكائنات العضوية هي في المختبر 3D هياكل "شبيهة بالأعضاء" متعددة الخلايا تحاكي بنية العضو في طبق من خلال إظهار التشابه مع بنية الأنسجة في الجسم الحي والخلايا المتعددة ، بما في ذلك أنواع الخلايا الجذعية والسلفية والمتمايزة15,16. إن امتلاك ميزات التنظيم الذاتي وتعدد الخلايا والوظائف يجعل الكائنات العضوية نموذجا رائعا في المختبر يمثل العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تحدث في الأنسجة الحقيقية17. يمكن اشتقاق أنواع مختلفة من الكائنات العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات عن طريق التمايز الموجه أو الخلايا الجذعية البالغة التي يتم حصادها من أعضاء مختلفة ، بما في ذلك الأمعاء الدقيقة والدماغ والكبد والرئة والكلى 18,19. نظرا لأن الهياكل العضوية تمتلك بنية ووظيفة حقيقية تشبه الأنسجة مع تعدد الخلايا والتفاعل الديناميكي من خلية إلى خلية ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا المتجانسة لفهم الأحداث الخلوية التي تحدث في الأنسجة الحية. كما يمكن التلاعب بالمواد العضوية بسهولة ويمكن زراعتها في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، مما يجعلها مفيدة للدراسات اليومية20.

الغرض الرئيسي من هذا العمل هو تقديم طريقة مراقبة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة التلألؤ الحيوي المصممة خصيصا لدراسة إيقاعات الساعة البيولوجية في عضويات 3D متعددة الخلايا. تم إجراء المراقبة في الوقت الفعلي للأحداث الخلوية باستخدام تقنية فحص التلألؤ الحيوي على نطاق واسع لمزارع الخلايا التي تفتقر إلى التعقيد متعدد الخلايا والاتصالات بين الخلايا الموجودة في الأنسجة الحقيقية. تقدم المواد العضوية 3D فرصا فريدة للتحقيق في وظائف إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يبحث في إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية مع تكوين الخلايا المتغيرة أو الكائنات العضوية المشتقة من الأنسجة المريضة للمرضى. يتيح هذا البروتوكول استخدام مقايسة التلألؤ الحيوي للتحقيق في جوانب مختلفة من إيقاعات الساعة البيولوجية في نموذج أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية في المختبر ، وهو المواد العضوية ، مما سيساعدنا على فهم أدوار إيقاعات الساعة البيولوجية في الأعضاء المحيطية بشكل أفضل.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم الأنسجة البشرية لتوليد HIEs من قبل IRB في CCHMC (IRB # 2014-0427). انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

ملاحظة: لتوضيح الإجراء الموضح في هذا البروتوكول ، استخدمنا Bmal1-luc الأمعاء المعوية البشرية (HIEs). خضعت هذه المعوية لعملية نقل عدسية مستقرة22 مع بلازميد مراسل pABpuro-BluF ، والذي يحتوي على مروج Bmal1 المنصهر مع luciferase ، مما يدل على نشاط مروج Bmal1 21.

1. نقل الفيروسات النسرية

  1. إجراء نقل الفيروسالعدسي 22 تحت ظروف غنية بالخلايا الجذعية ل HIEs. على وجه التحديد ، تأكد من تكوين كرويات في HIEs في غضون 3-4 أيام بعد المرور في وسائط نمو الأمعاء ، مما يخلق ظروفا غنية بالخلايا الجذعية.
  2. بعد نقل الفينجين22 ، قم بإجراء اختيار المضادات الحيوية باستخدام 2 ميكروغرام / مل بوروميسين ، واستعد HIEs المقاومة للبوروميسين ، ومررها بكثافة عالية نسبيا (أي بئر واحد في بئرين) لمدة 2-3x. إذا كان معدل نمو HIEs بطيئا ، أضف مثبطات 10 μM ROCK (Y-27632) ومثبطات 10 μM GSK-3 (CHIR-99021) إلى وسط نمو الأعضاء المعوية.

2. إعداد المواد العضوية لمقايسة التلألؤ الحيوي

  1. يوم 1: قم بتمرير HIEs إلى أطباق مستديرة مقاس 35 مم.
    1. باختصار ، لتوسيع HIEs ، امزج HIEs مع مصفوفة ثقافة ثلاثية الأبعاد مخفضة عامل النمو (GFR) وقم بزرعها على 24 لوحة بئر مع ثلاث قطرات من 10 ميكرولتر من مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد لكل بئر. أضف 350 ميكرولتر من وسط نمو HIE وقم بتغييره كل يوم.
      ملاحظة: كثافة HIE في مصفوفة ثقافة 3D أمر بالغ الأهمية لنمو المعوية. تقريبا ، يجب أن يتجاوز عدد الكرويات أكثر من 50 في كل قطرة. إذا كان الرقم منخفضا ، فإن معدل نمو HIE يتأثر سلبا.
    2. عندما تنمو HIEs بشكل كاف (حوالي 7 أيام بعد المرور) ، قم بجمع HIEs من أربعة آبار في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل.
    3. اغسل HIEs باستخدام PBS البارد باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × جم) لمدة 40 ثانية تدور بسرعة لإزالة الحطام ومصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد المفرطة بواسطة الماصة.
    4. أضف 0.5 مل من برنامج تلفزيوني بارد إلى الحبيبات وقم بتطبيق الاضطراب الجسدي عن طريق حقن ما يصل إلى 10 مرات باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل لفصل HIEs.
    5. قم بتدوير HIEs المنفصلة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة كما في الخطوة 2.1.3 وقم بإزالة المادة الطافية برفق بواسطة ماصة. بعد ذلك ، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع حبيبات HIE على الثلج ليبرد لمدة 3 دقائق تقريبا.
    6. أضف مصفوفة ثقافة GFR 3D إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وامزجها مع حبيبات HIE.
      ملاحظة: احسب مقدار مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد بناء على عدد الأطباق المستديرة مقاس 35 مم التي سيتم استخدامها للتجربة. نحن عموما البذور 30 ميكرولتر من قطرات مصفوفة الثقافة 3D لكل طبق مستدير.
    7. قم بزرع خليط HIEs ومصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد في وسط الطبق المستدير مقاس 35 مم واحتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لترسيخ مصفوفة الثقافة ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: يجب تحديد كثافة HIEs البذر تجريبيا. بناء على شدة التلألؤ الحيوي ، يمكن للمرء تحديد عدد HIEs خلال هذه العملية.
    8. أضف 2 مل من وسط النمو العضوي المعوي المسخن مسبقا إلى كل طبق واحتضان الأطباق في حاضنة CO2 حتى الخطوة التالية.
  2. اليوم 3: بدء التمايز
    1. لبدء تمايز HIEs ، قم بإزالة وسط النمو وإضافة 2 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على وصفات وسائط تمايز HIE23.
  3. اليوم 4: لا توجد عملية إضافية مطلوبة.
  4. اليوم 5: استبدل وسط المعوي ب 2 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا.
  5. اليوم 6: مزامنة الساعة وتسجيل التلألؤ الحيوي
    1. لمزامنة الساعة الجزيئية للمعوية ، أضف 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر ديكساميثازون (Dex) لجعل التركيز النهائي 100 نانومتر في كل طبق ثم احتضان الأطباق في حاضنة CO2 (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 1 ساعة24.
    2. أثناء إعادة ضبط Dex ، قم بإعداد مقياس الإنارة المحتضن. تحقق من ثاني أكسيد الكربون2 ودرجة حرارة مقياس الإنارة الحاضن واضبطها على 5٪ و 37 درجة مئوية على التوالي.
      ملاحظة: يقترح مسح الجزء الداخلي من مقياس الإنارة الحاضن بنسبة 70٪ كحول قبل وبعد كل استخدام للآلة لإبقائها معقمة.
    3. بعد تزامن الساعة ، قم بتجديد المعوية ب 3 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا الذي يحتوي على 200 ميكرومتر D-luciferin.
      ملاحظة: نظرا لأن لوسيفيرين حساس للضوء ، يجب لف الوسط المحتوي على لوسيفيرين بورق القصدير وتسخينه مسبقا في حمام حراري بدرجة حرارة 37 درجة مئوية قبل وضعه على الطبق.
    4. ضع الأطباق في طاولة أطباق مكونة من 8 آبار لمقياس الإنارة المحتضن وقم بتغطية طاولة أطباق العينة بغطاءها. ضع غرفتي ترطيب بمنديل مبلل أو إسفنجة أعلى طاولة أطباق العينة. هذه عملية لمرة واحدة.
      ملاحظة: بعد بدء التجربة ، يجب إبقاء غطاء مقياس الإنارة الحاضن مغلقا حتى يتم إنهاء التجربة. تأكد من تبليل المناديل / الإسفنج بما فيه الكفاية.
    5. أغلق غطاء الجهاز وابدأ البرنامج لقياس التلألؤ الحيوي لعدد الأيام والدقة المطلوبة.
      1. في البرنامج ، حدد إعدادات الحالة بالنقر فوق علامة التبويب الحالة واضبط الإعدادات على هذه اللوحة: عدد الأطباق ووقت القياس ومعالجة الخلفية ونوع الفلتر.
        ملاحظة: لهذا العرض التوضيحي ، اخترنا جميع الأطباق من A إلى H ؛ وقت القياس الافتراضي ، والذي يحدده البرنامج بناء على عدد الأطباق ؛ وقت الانتظار لمعالجة الخلفية ، ونوع المرشح F0. نظرا لوجود ثلاثة خيارات للمرشح ، يمكن قياس ثلاثة ألوان مضيئة في وقت واحد.
      2. بعد إدخال جميع الإعدادات المناسبة بناء على التجربة ، احفظ الإعدادات بالنقر فوق موافق.
      3. لبدء تشغيل التجربة، انقر على علامة التبويب تشغيل | الزر "ابدأ " (رمز المثلث الأخضر). لاحظ البيانات على أنها خام أو تمت تصفيتها من الضوضاء أو تم إلغاء اتجاهها عن طريق إجراء التحديدات المناسبة أعلى شاشة البرنامج أثناء إجراء التجارب. انقر فوق علامات التبويب الخام أو Noise Filtered أو Detrended لمراقبة البيانات المحددة.
      4. مراقبة الإشارات لمدة تصل إلى 5 أيام.
        ملاحظة: بعد 5 أيام من المراقبة في مقياس الإنارة الحاضن ، قد تبدأ الأمعاء في الموت بسبب نضوب الوسائط. لمنع أي اضطراب يومي محتمل أثناء التجربة ، لا نقوم بإجراء تغيير في الوسائط طوال مدة التجربة.
      5. في نهاية التجربة ، أوقف التشغيل بالنقر فوق الزر إيقاف (رمز المربع الأزرق) ، وانتقل إلى علامة التبويب ملف ، وانقر فوق حفظ باسم. حفظ البيانات بتنسيق Kronos ؛ قم بتصدير البيانات إلى جدول بيانات في قسم الملف بالنقر فوق الخيار ملف ثم تحديد تصدير بتنسيق Excel ضمن ملف لمزيد من التحليل.

النتائج

تم إجراء تسجيل التلألؤ البيولوجي لتقييم إيقاع الساعة البيولوجية للمعوية المعوية البشرية (HIEs) في ظل حالتين متميزتين: الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية باستخدام وسط نمو عضوي معوي (الشكل 3) مقابل الظروف المحفزة للتمايز ، والتي تم تحقيقها عن طريق استبدال وسط نمو الأعضاء المعوية بوسط تمايز. في يوم التجربة ، قمنا بمزامنة الساعات اليومية عن طريق إجراء علاج لمدة 1 ساعة مع 100 نانومتر ديكساميثازون. بعد ذلك ، استبدلنا الوسط إما ب 3 مل من وسط نمو عضوي معوي أو وسط تمايز مكمل ب 200 ميكرومتر D-Luciferin وبدأنا في مراقبة نشاط التلألؤ الحيوي. بعد فترة تسجيل من 4-5 أيام ، أجرينا تحليل تحويل فورييه السريع (FFT) لتحديد فترة إيقاعات الساعة البيولوجية المرصودة. يوضح الشكل 3 الديناميات الزمنية لنشاط مروج Bmal1 في الظروف المذكورة أعلاه. في ظل ظروف التمايز ، أظهر التلألؤ الحيوي Bmal1-luc تذبذبات يومية قوية بمتوسط دورية يبلغ 22.92 ساعة. في المقابل ، أظهرت HIEs إيقاعات يومية مضطربة في الظروف الغنية بالخلايا الجذعية (الشكل 3). تظهر هذه البيانات أن HIEs في الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية لا تظهر تذبذبات يومية قوية. بمعنى آخر ، سيحتاج المرء إلى تقييم تأثير ظروف النمو فيما يتعلق بإيقاعات الساعة البيولوجية قبل التحقيق في الوظائف المعتمدة على الساعة البيولوجية في الكائنات العضوية.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للبروتوكول. يتم تمرير HIEs إلى أطباق 35 مم في اليوم 1 ويتم استزراعها ب 2 مل من وسط النمو حتى اليوم 3. في اليوم الثالث بعد المرور ، يتم استبدال الوسط ب 2 مل من وسط التمايز المسخن مسبقا لبدء تمايز المعوية. يتكرر التغيير المتوسط مع 2 مل من الوسط المسخن مسبقا في اليوم 5 لمنع نضوب التغذية. في اليوم 6 ، يتم التعامل مع المعوية مع 100 نانومتر ديكساميثازون لمدة 1 ساعة لمزامنة الساعة البيولوجية. بعد ساعة ، يتم استبدال الوسائط ب 3 مل من 200 ميكرومتر من الوسط المحتوي على D-luciferin ، ويتم تثبيت الأطباق في مقياس الإنارة المحتضن. بعد تسجيل تعبير التلألؤ الحيوي لمدة 4-5 أيام ، يتم إنهاء التجربة ، ويتم تصدير البيانات التي تم إنشاؤها كجداول بيانات لمزيد من التحليل. اختصار: HIE = الأمعاء المعوية البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صورة تمثيلية ل HIEs تحت متوسط النمو. تم التقاط الصورة بواسطة مجهر واسع المجال بهدف 25x. شريط المقياس = 1 مم. اختصار: HIE = الأمعاء المعوية البشرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تسجيلات التلألؤ الحيوي من HIEs من ظروف التمايز والخلايا الجذعية. (أ) بيانات تسجيل التلألؤ الحيوي الخام و (ب) غير المتجهة لبيانات Bmal1-luc HIEs تحت ظروف الخلايا الجذعية المخصبة (الحمراء) والتمايز (الأسود). (ج) فترة تذبذبات Bmal1-luc في HIEs في ظل ظروف التمايز. يتم حساب الفترة باستخدام تحليل FFT ؛ n = 3 ل Bmal1-luc HIEs تحت ظروف الخلايا الجذعية المخصبة و n = 4 ل Bmal1-luc HIEs تحت حالة التمايز. تشير أشرطة الخطأ إلى SD. الاختصارات: HIE = الأمعاء المعوية البشرية. FFT = تحويل فورييه السريع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التمايز وسائل الإعلام وصفات
اسم الكاشفشركةرقم الكتالوجالتركيز النهائيالتعليقات
DMEM/F12 المتقدمتقنيات الحياة12634-028أضف كمكون أخير. إذا قمت بإعداد وسائط سعة 50 مل ، بعد إضافة جميع المكونات الأخرى ، املأ الباقي حتى 50 مل باستخدام Advanced DMEM / F12 في النهاية.
أ 83-01سيغما ألدريتشSML0788500 نيوتن متر
ملحق B-27 (50x)جيبكو17504-0441x
جاسترين الأول الإنسانسيغما ألدريتشجي 902010 نانومتر
جلوتا ماكسجيبكو350500611x
هيبسجيبكو1563008010 مللي متر
ملحق N-2 (100x)جيبكو17502-0481x
إن-أسيتيل-إل-سيستينسيغما ألدريتشأ 91651 مللي متر
NOGGIN وسط مكيف5%صنع في المختبر
البنسلين والستربتومايسينجيبكو15140122100 وحدة / مل
الفئران المؤتلف EGFبيبروتك315-0950 نانوغرام / مل
R-SPONDIN وسط مكيف10%صنع في المختبر

الجدول 1: تكوين وسائط تمايز HIE23.

المناقشة

يوفر اختبار التلألؤ الحيوي العديد من المزايا للتحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ، الأمر الذي يتطلب جمع البيانات من تجارب الدورة الزمنية طويلة الأجل. أولا ، يمكن الباحثين من مراقبة التعبير الجيني أو البروتين محل الاهتمام أثناء تحرك الخلايا وتكاثرها. دون إجراء تعديلات غير ضرورية أو تعطيل وظائف الخلايا ، يمكن تسجيل الأحداث الخلوية المهتمة أو التعبير الجيني باستخدام قراءات التلألؤ الحيوي ، والتي توفر بيانات موثوقة في الوقت الفعلي. الأهم من ذلك ، أن مقايسة التلألؤ الحيوي تولد الحد الأدنى من ضوضاء الخلفية مقارنة بمقايسات التألق لأنه يتم إجراؤها في الظلام المستمر25. علاوة على ذلك ، يفضل اختبار التلألؤ الحيوي للمراقبة طويلة المدى لأن الإثارة المستمرة لمقايسة التألق على مدى عدة أيام قد تسبب سمية ضوئية عالية وتبييضا ضوئيا. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود إثارة ضوئية ، يوفر اختبار التلألؤ الحيوي إشارة باهتة من البروتينات الفلورية26. إن عمر النصف القصير للوسيفيراز يجعله مفضلا للدراسات اليومية ، ويمكن تقصيره أيضا عن طريق إضافة تسلسلات إضافية مزعزعة للاستقرار12.

على الرغم من تقديم العديد من المزايا لمراقبة الخلايا الحية ، إلا أن فحوصات التلألؤ الحيوي لها بعض القيود. على الرغم من أن مقايسة التلألؤ الحيوي توفر قراءة قوية للتعبير الجيني الزمني أو مراقبة البروتين من مجموعة من الخلايا ، إلا أن دقتها المكانية محدودة ، مما يجعلها أقل جدوى للتجارب التي تجمع بيانات توطين البروتين من الخلايا المفردة. بالنظر إلى مزاياه وعيوبه ، فإن مقايسة التلألؤ الحيوي تتفوق على الطرق الأخرى ، خاصة بالنسبة للدراسات اليومية. إنه يوفر سمية أقل وحساسية عالية ، مما يجعله مثاليا للمراقبة طويلة المدى.

يجب مراعاة العديد من العوامل الحاسمة خلال مرحلة الإعداد التجريبي. في المقام الأول ، يعد تنفيذ استراتيجية اختيار مناسبة لنقل الفيروسات العدسية أمرا بالغ الأهمية. في حالتنا ، أجرينا 2 ميكروغرام / مل اختيار بوروميسين لمدة أسبوعين. قد يؤدي التنفيذ غير الكافي للاختيار إلى عدم كفاية أعداد المعوية التي تؤوي بلازميد المراسل ، مما يؤدي إلى مستويات تعبير لوسيفيراز غير متسقة. كثافة البذر المثلى مهمة بنفس القدر ؛ قد تؤدي الكثافة المفرطة إلى استنفاد المغذيات قبل الأوان أثناء التجربة نظرا لعدم وجود بديل متوسط بعد بدء تسجيل التلألؤ الحيوي. على العكس من ذلك ، قد تؤدي الكثافة المنخفضة ل HIEs إلى انخفاض ناتج التلألؤ البيولوجي ، وبالتالي التأثير على متانة القراءة. يعد ضمان بيئة مناسبة للمعوية أثناء المراقبة أمرا أساسيا لموثوقية النتائج التجريبية. يعد الحفاظ على الظروف المثلى بما في ذلك CO2 ودرجة الحرارة ومستويات الرطوبة أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على HIEs ، مما يعزز متانة العمليات الخلوية داخل المعوية. يمكن أن تؤثر الانحرافات عن درجة الحرارة المثلى ومستويات CO2 على التمثيل الغذائي الخلوي ومسارات الإشارات ، مما قد يؤثر على إيقاعات الساعة البيولوجية. مستويات الرطوبة الكافية لها نفس القدر من الأهمية ، حيث تمنع الجفاف وتحافظ على السلامة الهيكلية للأمعاء. وبالتالي ، فإن الاهتمام الدقيق بالظروف البيئية أمر بالغ الأهمية لدقة النموذج التجريبي والدراسات اليومية التي تنطوي على المعوية.

تعد مزامنة الساعة ضرورية للدراسات اليومية لأنها تعمل على محاذاة الساعة البيولوجية الداخلية للخلايا الفردية ، مما يضمن أنها في حالة موحدة ومنسقة. هذا التزامن ضروري للمراقبة والتحليل الدقيق لإيقاع الساعة البيولوجية على مستوى الثقافة بأكملها. في هذا البروتوكول ، أجرينا مزامنة الساعة مع 100 نانومتر ديكساميثازون (Dex). قد تكون هناك بعض المخاوف بشأن تأثير Dex على بنية الخلية أو وظيفتها. تشير الأبحاث السابقة إلى أن الكورتيكوستيرويدات تعزز وظيفة الحاجز الظهاري في المعوية27. ومع ذلك ، من المهم تسليط الضوء على أن هذا النمط الظاهري لوحظ بعد معالجة المعوية مع 10 ميكرومتر بريدنيزولون لمدة 12 ساعة. نتوقع أن العلاج القصير لمدة 1 ساعة من ديكساميثازون لن يؤدي إلى تغييرات كبيرة فيما يتعلق ببنية ووظيفة الخلايا داخل المعوية.

إن مراقبة نشاط التلألؤ الحيوي للثقافة العضوية بدلا من ثقافة الخلية الواحدة المتماثلة تمتلك نقاط قوة فريدة. أولا ، تتفاعل أنواع الخلايا المتعددة مع بعضها البعض في ثقافة عضوية كما هو الحال في الأنسجة الحية ، في حين أن ثقافة خلية 2D النموذجية تراقب التعبير الجيني المهتم في نوع من البيئة المعزولة التي تتكون من نوع خلية واحدة. توفر الثقافة العضوية نتائج أكثر واقعية مع تفاعلات متعددة الخلايا ومسارات الإشارات. يعد التفاعل بين الخلايا أمرا بالغ الأهمية ، خاصة بالنسبة للتمايز ودراسات المسار بين الخلايا ، والتي تتطلب زراعة خلايا غير متجانسة28. تشير نتائجنا إلى أن HIEs في الحالة المتمايزة تظهر تذبذبات يومية قوية ولكنها تعطل إيقاعات الساعة البيولوجية في الحالة الغنية بالخلايا الجذعية. تشير هذه البيانات إلى إمكانية إعادة تشكيل آلية الساعة البيولوجية من الخلايا الجذعية البالغة إلى الخلايا المتمايزة. باختصار ، تتيح الكائنات العضوية ذات المراسل الحيوي اليومي التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في نظام متعدد الخلايا في المختبر يكشف عن وظائف إيقاعات الساعة البيولوجية بطريقة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم الحصول على الأمعاء المعوية البشرية من مختبر الدكتور مايكل هيلمراث في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC). تم دعم هذا العمل من قبل R01 DK11005 (CIH) والتمويل التجريبي لمركز السرطان بجامعة سينسيناتي. نحن ممتنون لدعم التصوير من جامعة سينسيناتي لايف ميكروسكوب كور (NIH S10OD030402).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
35 × 10 أطباق زراعة أنسجة الصقرفيشر سينتيفيك08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM / F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV محاقن الأنسولينفيشر Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021كايمان كيميكال13122GSK-3 مثبط
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD4902-500MG
D-Luciferin (ملح البوتاسيوم)كايمان كيميكال14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibcoعامل
المخفض (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
النمو العضوي المعوي (الإنسان)تقنيات الخلايا الجذعية06010من الوسط القاعدي البشري IntestiCult OGM ، 50 مل والمكملات العضوية ، 50 مل. امزج كلاهما بنسبة 1: 1 لاستخدامه كمتوسط نمو عضوي معوي
Kronos Dio LuminometerATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومكورنينج21-040-CV
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122
الفئران المؤتلف EGFPeproTech315-09
Y-27632R & D Systems1254/10مثبط ROCK
النمو 35050061 وسط تتكون Machine

المراجع

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982(2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806(2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416(2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288(2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973(2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338(2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531(2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136(2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001(2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مراقبة تذبذبات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل التلألؤ البيولوجي في المواد العضوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.