تقدم هذه المقالة تقنية فريدة من نوعها للصدر المغلق لإحداث إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) في الفئران. تسمح الطريقة المقدمة للفئران بالتنفس تلقائيا أثناء تحفيز نقص تروية عضلة القلب عن بعد. يوفر هذا الوصول إلى لدراسة العمليات الديناميكية لنقص التروية وإعادة التروية في الموقع وفي الوقت الفعلي عبر التصوير غير الباضع.
مقالة منهجية
انسداد LAD الذي يتم تشغيله عن بعد باستخدام قسطرة بالون في الفئران التي تتنفس تلقائيا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) هو حالة قلبية وعائية منتشرة وعالية الوفيات. على الرغم من التقدم في استراتيجيات إعادة التوعي ل AMI ، فإنه يؤدي في كثير من الأحيان إلى إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) ، مما يؤدي إلى تضخيم تلف القلب. تعمل نماذج الفئران كأدوات حيوية للتحقيق في كل من الإصابات الحادة وإعادة تشكيل عضلة القلب المزمنة في الجسم الحي. تقدم هذه الدراسة تقنية فريدة من نوعها لإغلاق الصدر لتحفيز IRI عضلة القلب عن بعد في الفئران ، مما يتيح التحقيق في المرحلة المبكرة جدا من الانسداد وإعادة التروية باستخدام التصوير في الجسم الحي مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني. يستخدم البروتوكول طريقة انسداد عن بعد ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في بدء نقص التروية بعد إغلاق الصدر. يقلل من الصدمات الجراحية ، ويتيح التنفس التلقائي ، ويعزز الاتساق التجريبي. ما يميز هذه التقنية هو قدرتها على التصوير غير الباضع في وقت واحد ، بما في ذلك الموجات فوق الصوتية والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، أثناء أحداث الانسداد وإعادة التروية. إنه يوفر فرصة فريدة لتحليل استجابات الأنسجة في الوقت الفعلي تقريبا ، مما يوفر رؤى مهمة للعمليات أثناء نقص التروية وإعادة التروية. تم إجراء اختبارات منهجية مكثفة لهذا النهج المبتكر ، وقياس علامات نخر القلب للاحتشاء ، وتقييم المنطقة المعرضة للخطر باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز بالتباين ، واحتشاء تلطيخ في مرحلة نضج الندبة. من خلال هذه التحقيقات ، تم التركيز على قيمة الأداة المقترحة في تطوير مناهج البحث لإصابة نقص تروية عضلة القلب وتسريع تطوير التدخلات المستهدفة. يتم عرض النتائج الأولية التي توضح جدوى الجمع بين البروتوكول التجريبي المبتكر المقترح وتقنيات التصوير غير الباضعة هنا. تسلط هذه النتائج الأولية الضوء على فائدة استخدام مهد المصمم لهذا الغرض للحث على نقص تروية عضلة القلب عن بعد أثناء إجراء فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الوقت.
المقدمة
يرتبط احتشاء عضلة القلب الحاد (AMI) ، وهو حالة قلبية وعائية عالمية سائدة ، بارتفاع معدلات الوفيات والمراضة1. على الرغم من التطورات التكنولوجية التي مكنت استراتيجيات إعادة التوعي المبكرة والفعالة لمرضى AMI ، لا يزال المرضى يعانون من إصابة نقص تروية عضلة القلب (IRI) بعد هذه التدخلات2. لذلك ، فإن فهم الآليات الأساسية وصياغة النهج للتخفيف من IRI أمر بالغ الأهمية. يمثل IRI حالة فيزيولوجية مرضية معقدة تنطوي على العديد من العمليات البيولوجية المعقدة. وتشمل هذه موت الخلايا المنظم ، واستجابات الإجهاد التأكسدي ، والالتهابات ، والتئام الجروح ، والتليف ، وإعادة تشكيل البطين. كانت النماذج الحيوانية ، مثل الفئران ، ذات أهمية كبيرة لأبحاث IRI ويتم استخدامها على نطاق واسع بسبب فعاليتها من حيث التكلفة ، والتكاثر السريع ، وثروة المعلومات الميكانيكية من النماذج المعدلة وراثيا3.
يقدم هذا البروتوكول تقنية مبتكرة للحث عن بعد IRI في الفئران التي تتنفس تلقائيا بصدر مغلق ، تحاكي عن كثب علم الأمراض البشري. تم تحقيق الانسداد عن بعد من خلال استخدام قسطرة بالون موضوعة على مسافة من عضلة القلب لسد الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD). يوفر هذا النهج وصولا مستمرا إلى القلب النابض في لحظات الانسداد وإعادة التروية بالضبط ، مما يسهل طرق التصوير المتزامن ، بما في ذلك التصوير بالموجات فوق الصوتية أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). يمكن أن توفر هذه الطرق غير الباضعة رؤى مهمة حول استجابات الأنسجة قبل وأثناء وبعد أحداث الانسداد وإعادة التروية.
توجد تقنيات جراحية مختلفة للحث على IRI في نماذج الفئران. تؤدي الصدمة الجراحية الناجمة عن بضع الصدر في نماذج الصدر المفتوح للربط التاجي إلى استجابة مناعية تؤثر على آليات متنوعة مرتبطة بنقص التروية وإعادة التروية. تفعيل الجهاز المناعي الفطري يحمل القدرة على التأثير على مدى احتشاء عضلة القلب4. توفر التقنية المعدلة المقترحة نهجا محتملا لاستكشاف ما قبل وبعد تكييف عضلة القلب وربما تقليل تأثير الاستجابة المناعية الفطرية للصدمة الجراحية في دراسات IRI للفئران عن طريق تقليل الإطار الزمني المفتوح للصدر إلى 5 دقائق كحد أقصى. علاوة على ذلك ، قد تساهم التقنية المطورة حديثا أيضا في تقليل العواقب المؤيدة للالتهابات الناتجة عن إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفسالصناعي 5. ومع ذلك ، فإن الآثار المشتركة لهذه الطريقة الجديدة للصدر المغلق تتطلب مزيدا من التحقيق المتعمق.
تم إجراء التحقق الشامل من التقنية المقترحة من خلال مقارنتها بالطريقة التقليدية ، والتي تتضمن تعريض LAD من خلال تشريح الصدر الجراحي والانسداد الناجم عن الأربطة لمدة 30 دقيقة. تمت مقارنة النتائج من كلتا التقنيتين ، والتي تضمنت قياسات التروبونين التي تعكس حجم احتشاء القلب ، وتقييمات المنطقة المعرضة للخطر باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مع تعزيز تباين الجادولينيوم ، وتلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل رباعي التنسج (TTC) ، وتحديد أحجام الندبات النهائية عبر تلطيخ Sirius Red (SR). توضح النتيجة متانة وفعالية النهج المقترح لدراسة إصابة نقص التروية في نماذج الفئران.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذا البروتوكول الحيواني من قبل ويتوافق مع المبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اللجنة الأخلاقية للتجارب على (ECD) في الجامعة الكاثوليكية في لوفين. تتبع جميع السياسات التي طورتها تنمية الطفولة المبكرة المحلية لوائح الاتحاد الأوروبي المتعلقة برعاية المختبر كما هو معلن في التوجيه 2010/63 / EU. تم إجراء جميع الاختبارات الموضحة أدناه على ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-12 أسبوعا (وزن الجسم = 20-23 جم). تمثل التجارب الحادة التي تم التضحية بها على الفور بعد الجراحة. مثلت تجارب البقاء على قيد الحياة متابعة لمدة أربعة أسابيع ، بما في ذلك قياس التروبونين والتصوير بالرنين المغناطيسي وتلطيخ SR.
1. التخدير والتنبيب الرغامي
- تطبيق دواء ما قبل التخدير باستخدام مزيج من الكيتامين (7.5 ملغ/كغ; نيماتيك 100 ملغم/مل)، زيلازين (1 ملغم/كغ; رومبون، 20 ملغ/مل)، والأسيبرومازين (0.1 ملغ/كغ; بلاسيفيت ، 10 مجم / مل) (KXA) (انظر جدول المواد) مع 0.9٪ محلول ملحي مخفف داخل الصفاق. هذا يسمح بتنبيب أكثر سلاسة وأقل توغلا.
- ضع الفأر في غرفة الحث (انظر جدول المواد) واستحضر التخدير باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين النقي بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى فقدان التصحيح ومنعكس قرصة إصبع القدم.
- نقل إلى وسادة ساخنة (±38 درجة مئوية) ووضعها مستلق مع الرأس نحو الجراح. إصلاح الذيل والكفوف الأمامية مع الشريط على وسادة. تأكد من أن الأطراف الأمامية ليست ممتدة بشكل مفرط ، لأن هذا يمكن أن يضر بالتنفس.
- ضع خيطا حريريا 2-0 (انظر جدول المواد) حول القواطع العلوية وقم بلصق الخيط على حدود الوسادة لسحب الماوس مشدودا. إذا لزم الأمر ، قم بتوصيل حامل إبرة للحفاظ على التوتر على الخيط. الحفاظ على تخدير باستخدام 2٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ مع تدفق 1 لتر / دقيقة باستخدام مخروط الأنف.
- ضع مصدر ضوء منبر القص فقط ، وأزل مخروط الأنف ، وضع إمداد الأيزوفلوران على جهاز التنفس الصناعي. تنبيب الفأر باستخدام ملقط عن طريق رفع اللسان لأعلى وعقد منظار الحنجرة عصامي لرفع الجزء القاعدي من اللسان أكثر وتصور الحبال الصوتية.
- ضع أنبوب القصبة الهوائية المصنوع ذاتيا باستخدام قسطرة 18 جم على إبرة باهتة بين الأحبال الصوتية. حرك القسطرة لأعلى ، واستخرج الإبرة الباهتة ، وقم بتوصيل الأنبوب بجهاز التنفس الصناعي للفأر (انظر جدول المواد).
- استخدم موصلا معدلا على شكل حرف Y (انظر جدول المواد) لتوصيل أنبوب التنبيب بجهاز التنفس الصناعي. يمكن تأكيد الموضع الصحيح لأنبوب القصبة الهوائية من خلال الحكم على توسع الصدر المتماثل.
- اضبط حجم المد والجزر (مل) عند وزن الجسم (BW) (g) x 7 ومعدل التهوية عند 53.5 × (BW (g) -0.26) ضربات في الدقيقة ، واضبطه على وزن جسم ماوس معين إذا لزم الأمر6 (على سبيل المثال ، بالنسبة للفأر 25 جم ، يكون حجم المد والجزر 175 مل بمعدل 140 ضربة في الدقيقة).
- قلل الأيزوفلوران إلى 1٪ في الأكسجين بنسبة 100٪ ، حيث سيبقى مخدرا بسبب التخدير. ومع ذلك ، قم بتقييم عمق التخدير بانتظام عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم. تكييف تركيز إيزوفلوران على أساس عمق التخدير.
- ضع قطرة من مرهم العيون لمنع الجفاف أثناء التخدير.
2. تثبيت أداة IRI
ملاحظة: قم بإزالة كل الشريط ووضع على اللوحة الأساسية لأداة IRI المصممة لهذا الغرض. وترد تفاصيل عن خصائص أداة IRI في الملف التكميلي 1.
- ثبت اللوحة الأساسية لأداة IRI عن بعد المصممة لهذا الغرض في وضع جانبي أمام الجراح. إصلاح الذيل والكفوف باستخدام الشريط. ثبت الرأس باستخدام خياطة الحرير 2-0 حول القواطع العلوية لمنع الحركة العرضية (الشكل 1).
- أدخل المسبار الحراري المستقيمي (انظر جدول المواد) لمراقبة درجة حرارة الجسم واستخدم مصباح تسخين بالأشعة تحت الحمراء فوق للحفاظ على درجة الحرارة حوالي 37 درجة مئوية. انتبه إلى المسافة الكافية بين والمصباح لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
- ضع أقطاب إبرة ECG في جميع الكفوف الأربعة لمراقبة وتسجيل معدل ضربات القلب وشكل موجة ECG. قم بتثبيت مسبار المستقيم وأقطاب تخطيط القلب على المنصة باستخدام شريط لاصق.
- ضع كريم إزالة الشعر على الجانب الأيسر من الصدر لإزالة الشعر وإنشاء مجال جراحي واضح.
ملاحظة: الحد من وقت التطبيق والانتباه إلى الإزالة الكاملة للكريم لمنع الحروق الكيميائية.
3. بضع الصدر
- قم بإجراء التحضير المعقم للجلد باستخدام محلول Betadine ، ثم ضع ثنى جراحيا على الصدر الأيسر لضمان بيئة معقمة. استخدم معدات معقمة لتنفيذ الإجراء. قم بعمل شق جلدي عمودي في الجزء الأوسط من العضلة الصدرية بطول 1 سم تقريبا و 2 مم بعيدا عن الحد القصي الأيسر.
- بصق العضلة الصدرية لفضح الأضلاع تحتها. تجنب الإصابة العرضية للسفينة. في حالة حدوث نزيف ، استخدم أدوات تطبيق القطن لوقف أي نزيف.
- تصور الأضلاع وحدد المساحات الوربية من خلال مراقبة الرئة المتضخمة من خلال جدار الصدر الرقيق شبه الشفاف. افتح تجويف الصدر باستخدام مقص جراحي عن طريق عمل شق 6-8 مم في الفضاء الوربي الثالث. تأكد من أن الشق لا يقل عن 2 مم من الحدود القصية حيث يوجد الشريان الصدري الداخلي.
- أدخل منظارا صغيرا لعين الجرذ (انظر جدول المواد) في الفضاء الوربي. سيعمل هذا كمبعدة ضلع (الشكل 1 أ).
- ارفع التامور برفق باستخدام ملقط منحني واسحبه بعيدا.
- ضع قطعة صغيرة من القطن أعلى الرئة وادفعها برفق إلى أسفل.
4. إعداد LAD
- يظهر LAD باللون الأحمر الفاتح ويمتد من الشريان الأورطي تحت الأذن اليسرى نحو القمة. الوضع المثالي للرباط أقل بحوالي 2 مم من طرف الأذن اليسرى. استخدم الجذع الرئوي كعلامة للمساعدة في تحديد الأذن اليسرى وتحسين تصور LAD باستخدام تدفق الضوء (الشكل 2).
- استخدم إبرة مدببة لتمرير خياطة البولي بروبلين 7-0 حول LAD. لا تضع الإبرة عميقة جدا ، لأنها يمكن أن تدخل البطين الأيسر ، ولا ضحلة جدا ، لأنها يمكن أن تلحق الضرر ب LAD.
- قم بإزالة قطعة القطن الصغيرة وتحقق مما إذا كانت الرئة اليسرى لا تزال جيدة التهوية.
- إزالة ضلع المبتور.
- تأكد من أن طول الخيط لا يقل عن 15 سم على كلا الطرفين. قطع الإبرة.
- ضع قطعة من أنابيب PE-50 مقاس 1 مم فوق قطعة من أنابيب PE-10 مقاس 15 مم (انظر جدول المواد). قم بتوجيه طرفي الخيط من خلال أنبوب PE-10 وقم بتحويل أنبوب PE بنهايته السميكة ضد القلب.
5. إغلاق الصدر ونزع الأنبوب
- ضع بعض هلام حمض الفوسيديك على المساحة الوربية المفتوحة واسمح للهواء المتبقي داخل الصدر بالهروب برفق عن طريق إعاقة تدفق جهاز التنفس الصناعي لفترة وجيزة. يمكن إضافة جل حمض الفوسيديك الإضافي إلى الجزء الخارجي من أنبوب PE لمنع دخول الهواء إلى الصدر.
- أغلق العضلة الصدرية بغرزة 5-0 بولي بروبيلين X أعلى وأسفل مستوى أنبوب PE ، وتأكد من أن الجزء السميك من أنبوب PE تحت مستوى العضلات.
- أغلق الجلد بغرزتين من مادة البولي بروبيلين X 5-0 أعلى واثنين أسفل أنبوب PE (الشكل 1B والشكل 3).
- مع صندوق مغلق ، يمكن للحيوان التنفس تلقائيا مرة أخرى. فطم من جهاز التنفس الصناعي عن طريق تقليل حجم المد والجزر ومعدل التنفس ببطء. عندما يبدأ في التنفس ، افصل أنبوب جهاز التنفس الصناعي تلقائيا بعناية ، ولكن احتفظ به في مكانه حتى يتم ملاحظة نمط تنفس مستقر.
- قم بتوصيل إمداد الأيزوفلوران بمخروط أنف يتم وضعه فوق أنف ويتم تثبيته على لوحة القاعدة.
6. تجميع أداة الأشعة تحت الحمراء عن بعد
- ضع الجزء الجانبي الرأسي في لوحة القاعدة عن طريق إدخاله في الشقوق.
- استخدم خطافا رفيعا لاسترداد طرفي الخياطة واسحبهما عبر الفتحة المركزية في الجزء الجانبي خلف البالون (انظر جدول المواد).
- توجيه أحد الغرز ينتهي فوق وحول البالون. اتبع مع نهاية خياطة أخرى تحت وحول البالون. ضع جل حمض الفوسيديك لتوجيه أكثر سلاسة للخياطة.
- توجيه ينتهي خياطة من خلال الشقوق على الجزء العلوي من الجزء الجانبي. في الجزء البعيد من الخيط ، ضع وزنا قدره 2.1 جم للحفاظ على نهاية كل خياطة في مكانها (الشكل 1 ج والشكل 4).
ملاحظة: تكوين الأوزان المناسبة عرضة للتغيير ويجب اختباره مسبقا. انظر الشكل التكميلي 1 والملف التكميلي 1 للحصول على التفاصيل. يتم توفير تصميم أداة IRI عن بعد في الشكل التكميلي 2.
7. تحريض نقص التروية والتروية
- تحفيز نقص التروية عن طريق نفخ البالون على الفور باستخدام مضخة البالون الوعائية حتى 2 بار. قفل المضخة. تحقق بصريا مما إذا كان البالون منتفخا وأن الأوزان مرفوعة (الشكل 4).
- تأكيد نقص التروية من خلال مراقبة التغيير في تتبع تخطيط القلب.
- اترك البالون منفوخا للوقت المحدد وفقا لبروتوكول الدراسة المحدد (30 دقيقة في التجارب المقدمة).
- أوقف الانسداد ببساطة عن طريق فتح المضخة. أفرغ البالون بعناية. تحقق بصريا مما إذا كان البالون مفرغا من الهواء ويتم خفض الأوزان.
8. تفكيك أداة الأشعة تحت الحمراء عن بعد
- قطع خياطة وأنبوب بين والجزء الجانبي وإزالة بعناية الجزء الجانبي.
- ضع هلام حمض الفوسيديك في موقع إدخال الأنبوب في الصدر. استخدم ملقط منحني لدفع الجلد برفق ضد الأنبوب واستخدم ملقط آخر لاستخراج الأنبوب. قطع أي خياطة المتبقية بالقرب من الجلد.
- ضع خيطا إضافيا من 5-0 بولي بروبيلين لإغلاق موقع خروج الأنبوب وتقليل خطر دخول الهواء إلى الصدر.
9. نهاية التخدير والشفاء
- أوقف إمداد الأيزوفلوران واسمح للحيوان بالاستيقاظ في بيئة صامتة ودافئة وغنية بالأكسجين.
- تأكد من أن الفأر ليس في أي ضائقة تنفسية من خلال مراقبته حتى الشفاء التام. توفير 0.3 مل من محلول ملحي معقم (في درجة حرارة الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق لمنع الجفاف.
- في حالة التسكين بعد الجراحة، يتم تطبيق مسكن أفيوني المفعول (البوبرينورفين، 0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل أن يصبح متنقلا. تحقق من الفئران كل 4-6 ساعات لمدة 24-48 ساعة القادمة عند توفير البوبرينورفين للتأكد من أن الفئران تستجيب لمسكنات الألم ولتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى أدوية إضافية للألم. يجب أن يشمل الدعم الإضافي جل أو هريس غذائي قياسي موصى به للرعاية الداعمة يوضع على أرضية القفص بعد الجراحة.
النتائج
تم التحقق من صحة القدرة على إحداث نقص التروية من خلال أربعة اختبارات: كلوريد ثلاثي فينيل رباعي الأزوليوم (TTC) وتلطيخ سيريوس الأحمر (SR) ، وقياس تروبونين القلب I ، والتصوير بالرنين المغناطيسي لتعزيز الجادولينيوم المتأخر (LGE). تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني غير المعلمية ، مع الأخذ في الاعتبار أحجام العينات المحدودة. تعزى الدلالة الإحصائية إلى p < 0.05.
لم يكن للتجارب الحادة (تلطيخ TTC ، ن = 15) أي عطل فني ، وتم تضمين جميع. تضمنت هذه التجارب الحادة تجارب متابعة فورية (تروبونين القلب I ، LGE MRI ، Sirius red staining ، N = 12) وكان معدل البقاء على قيد الحياة 85٪ و 80٪ لتقنيات الانسداد عن بعد والقياسية ، على التوالي ، خلال فترة 4 أسابيع.
تلطيخ كلوريد ثلاثي فينيل تيترازوليوم
TTC (كلوريد ثلاثي فينيل تيترازوليوم) تلطيخ في نموذج الماوس من إصابة نقص التروية في القلب يقيس مجهريا ظاهرة صلاحية عضلة القلب من خلال إظهار فقدان وظيفة إنزيم ديهيدروجيناز. تساعد طريقة التلوين هذه على التمييز بين مناطق القلب التي لا تزال قابلة للحياة (حية) وتلك التي أصبحت غير قابلة للحياة بسبب نقص التروية. بقع عضلة القلب القابلة للحياة حمراء مع TTC ، في حين أن المنطقة الإقفارية تظل شاحبة أو غير ملوثة لأن إنزيم ديهيدروجيناز لم يعد يعمل. يوفر هذا معلومات مهمة حول مدى تلف الأنسجة في وقت مبكر بعد ظهور نقص التروية. تم إجراء التلوين لمجموعات IRI القياسية (n = 7) و IRI البعيدة (n = 8) مباشرة بعد 30 دقيقة من نقص التروية. يوضح الشكل 5 شرائح ملطخة ممثلة لحيوان واحد، مع عبور شرائح الأنسجة من القاعدة باتجاه القمة. يتم عرض نتائج تلطيخ TTC في الشكل 6 ولا تظهر أي فرق كبير بين تقنيتي IRI. تم إجراء تلطيخ TTC كما هو موضح من قبل Fishbein et al.7.
التصوير بالرنين المغناطيسي لتعزيز الجادولينيوم المتأخر
لقياس مدى نقص تروية المنطقة الإقفارية بشكل غير جراحي ، تم استخدام LGE MRI بعد 24 ساعة من الانسداد لمجموعات IRI القياسية (n = 5) و IRI عن بعد (n = 5). وترد تفاصيل الاقتناء التفصيلية في الملف التكميلي 1. يتم قياس المنطقة المعرضة للخطر على أنها النسبة المئوية لنسيج البطين الأيسر في الشرائح الثلاث الأكثر قمية التي تتجاوز معايير العتبة المفصلة في الملف التكميلي 1. يوضح التمثيل الرسومي في الشكل 7 أنه لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين تقنية الانسداد عن بعد المقترحة حديثا وطريقة "الصدر المفتوح" التقليدية عند تقييم قياسات المنطقة المعرضة للخطر.
سيريوس تلطيخ أحمر
يمثل احتشاء عضلة القلب ، نتيجة لنقص تروية عضلة القلب ، مشكلة خطيرة للأفراد الذين يعانون من نقص التروية لأنه يؤدي إلى تقليل كتلة انقباض القلب ، مما يضعف قدرته على ضخ الدم بكفاءة. يوضح الشكل 8 النتائج باستخدام تلطيخ Sirius Red بعد 4 أسابيع من الانسداد لتأكيد موقع تكوين الندبة بناء على المنطقة المعرضة للخطر التي يصورها التصوير بالرنين المغناطيسي LGE وقياس مدى النسيج الندبي. تم إجراء التلوين لمجموعات IRI القياسية (n = 5) و IRI البعيدة (n = 5). تشير المناطق الحمراء الزاهية إلى النواة الميتة للاحتشاء ، بينما تشير الأجزاء البرتقالية إلى الأنسجة القابلة للحياة. أخيرا ، يوضح الشكل 9 أحجام الندبات النهائية التي تم قياسها باستخدام تلطيخ Sirius Red في كلتا التقنيتين. يتم حساب حجم الندبة على أنها مساحة الاحتشاء الملطخ مقسومة على المساحة الإجمالية للجدار الحر للبطين الأيسر في بلاطة قسم الأنسجة القمية بسمك 2.4 مم. تم إجراء تلطيخ سيريوس الأحمر وفقا ل Rittié8.
تروبونين القلب الأول
بالإضافة إلى تقنيات التصوير والتلوين ، قامت الدراسة أيضا بتقييم تلف القلب باستخدام تروبونين القلب I كعلامة. تم جمع عينات الدم في 24 ساعة بعد الجراحة لمجموعات IRI القياسية (ن = 8) و IRI عن بعد (ن = 8). يعرض الشكل 10 قيمة تروبونين القلب I ، مما يدل على عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند مقارنة تقنية الانسداد عن بعد الجديدة بتقنية IRI القياسية.
كدليل على جدوى المفهوم المقترح ، يتم أيضا تقديم النتائج الأولية لإحداث نقص التروية من مكان بعيد مع التصوير غير الباضع في وقت واحد. تم تحقيق ذلك من خلال استخدام أداة الانسداد عن بعد المصممة خصيصا ، والتي تم وضعها داخل مهد التصوير بالرنين المغناطيسي ووضعها في وسط ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. تظهر النتائج الموضحة في الشكل 11 اختلافات في تباين الصورة (مستويات السطوع) بين المناطق المحتشدة وغير المحتشة. يظهر تتبع ECG ارتفاع ST النموذجي كعلامة تؤكد الانسداد الناجح ل LAD أثناء وضع داخل ماسح MR في الشكل 12B ، بينما يوضح الشكل 12A تتبع ECG قبل الانسداد.
يوفر هذا النهج الشامل فهما مفصلا لتأثيرات تقنية الانسداد عن بعد المقترحة حديثا على نقص التروية والنخر وتلف القلب في النموذج التجريبي مقارنة بطريقة "الصدر المفتوح" التقليدية.
الشكل 1: صور تمثيلية توضح تحضير كما هو موضح في البروتوكول. أ: بضع الصدر مع إدخال ضامد الضلع. (ب) إغلاق الصدر بأنبوب PE-10 يخرج من الصدر ويوجه الخيط حول LAD. (ج) وضع داخل أداة IRI عن بعد المجمعة. لاحظ الأوزان 2.1 جم التي تثبت كل طرف من طرفي الخيط وتستقر بجانب الجزء الجانبي من مهد IRI البعيد. يتم وضع الجزء الجانبي وتثبيته في مكانه بواسطة القواطع الموجودة في لوحة قاعدة الأداة. يتم تفريغ قسطرة البالون الوعائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصور خارج الجسم الحي ل LAD (السهم الأبيض) والأذن اليسرى (السهم الأسود). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: عرض تخطيطي من أعلى إلى أسفل للإعداد التجريبي ، يوضح موضع الأداة المستخدمة للانسداد عن بعد. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم تخطيطي يوضح استخدام الأداة للانسداد عن بعد من منظر جانبي. (أ) من بداية الجراحة ، يتم وضع في الجزء السفلي. بعد إغلاق الصندوق ، يتم تثبيت الجزء الجانبي في مكانه. عند هذه النقطة، لا يزال البالون مفرغا من الهواء، وتستقر الأوزان على الجزء السفلي. (ب) سيؤدي نفخ القسطرة البالونية إلى رفع الأوزان (المميزة بالأسهم) ويسبب انسداد LAD مع نقص التروية اللاحق لعضلة القلب. يظهر الانسداد الناجح في التغييرات في تتبع تخطيط القلب. سيؤدي تفريغ البالون إلى استعادة تدفق الدم عبر LAD. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور تمثيلية لشرائح قلب الفأر الملطخة بكلوريد ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC). تمر الشرائح من القاعدة إلى القمة من اليسار إلى اليمين ، بدءا من الصف العلوي. (أ) المعيار IRI. (ب) المعهد الجمهوري الدولي عن بعد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نتائج تلطيخ TTC. تم إجراء تلطيخ TTC بعد 24 ساعة من الانسداد لقياس حجم الاحتشاء. يتم تقديم نقاط البيانات كوسيلة مع SEM لمجموعات IRI القياسية (n = 7) و IRI البعيدة (n = 8). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: التصوير بالرنين المغناطيسي لتعزيز الجادولينيوم المتأخر. المنطقة المعرضة للخطر عند 24 ساعة بعد الانسداد كما هو محدد على ثلاث شرائح قمية (لا تشمل القمة نفسها) تم الحصول عليها باستخدام LGE MRI. يتم تقديم نقاط البيانات كوسيلة مع SEM لمجموعات IRI القياسية (n = 5) و IRI البعيدة (n = 5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التحقق من صحة جهاز الانسداد عن بعد بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي بعد إجراء نقص التروية / إعادة التروية. مقارنة تمثيلية بين المنطقة المعرضة للخطر كما هو موضح في صور LGE MR في 1 يوم بعد الانسداد والأنسجة الندبية النهائية الملطخة ب Sirius Red في 4 أسابيع بعد الانسداد. (أ-ب) شرائح محور قصيرة من مع انسداد عن بعد ومقاعد البدلاء ، على التوالي. يشير السهم إلى المنطقة المحددة المعرضة للخطر. (ج-د) تؤكد الشرائح النسيجية الملطخة ب Sirius Red من نفس المعنية أن تشكيل الندبة النهائي يطابق المنطقة المعرضة للخطر مع التصوير بالرنين المغناطيسي عند 24 ساعة بعد الانسداد. LV = البطين الأيسر. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: نتائج تلطيخ سيريوس الأحمر. تم إجراء تلطيخ سيريوس الأحمر بعد 4 أسابيع من الانسداد لقياس مدى تكوين الندبة. يتم تقديم نقاط البيانات كوسيلة مع SEM لمجموعات IRI القياسية (n = 5) و IRI البعيدة (n = 5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: القياس الكمي لتركيز تروبونين القلب I في مصل الفأر الذي تم الحصول عليه بعد 24 ساعة من الانسداد. يتم تقديم نقاط بيانات cTnI كوسيلة مع SEM لمجموعات IRI القياسية (n = 8) و IRI البعيدة (n = 8). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: يتم عرض النتائج الأولية التي تم الحصول عليها من خلال استخدام أداة الانسداد عن بعد المقترحة مع اكتساب التصوير بالرنين المغناطيسي في وقت واحد. نفس شريحة منتصف البطين في اتجاه المحور القصير لحيوان واحد قبل ، في وقت ، وبعد فترة وجيزة يتم تقديم الانسداد. على اليسار ، تظهر شريحة الصورة التمثيلية حدود عضلة القلب في بداية التجربة (قبل تشغيل IRI). في المنتصف ، تظهر نفس شريحة المحور القصير بعد 30 دقيقة من نقص التروية المستحث عن بعد. تم استخدام كلوريد المنغنيز (MnCl) كعامل تباين لتسليط الضوء على المنطقة المحتشدة (المميزة باللون الأصفر). تم ضبط السطوع يدويا وتشبعه لتسليط الضوء على مناطق الأنسجة المختلفة. لاحظ فرق السطوع بين الحاجز والجدار الحر الجانبي (المميز باللون الأصفر). على اليمين ، باستخدام نفس إعدادات السطوع كما كان من قبل ، يتم عرض نفس شريحة المحور القصير عند 20 دقيقة بعد الانسداد (مرحلة إعادة التروية). يشير السهم إلى المنطقة ذات السطوع المتزايد مقارنة بوقت الانسداد ، مما ينص على امتصاص عامل التباين في مرحلة التروية وانكماش منطقة نقص الكثافة الأولية كما هو محدد في وقت الانسداد. LV = البطين الأيسر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: تم التقاط تتبع مخطط كهربية القلب باستخدام نظام مراقبة التصوير بالرنين المغناطيسي لتأكيد بداية نقص التروية. (أ) تتبع مخطط كهربية القلب الطبيعي الذي تم التقاطه قبل الانسداد عن بعد. (ب) تتبع مخطط كهربية القلب الذي تم التقاطه بعد نفخ البالون في نفس مباشرة. يشير السهم إلى الارتفاع في مقطع ST ، والذي يعتبر عادة علامة على بداية نقص التروية الناجحة. كما لوحظ زيادة في معدلات القلب والتنفس ، بالإضافة إلى انخفاض في سعة الإشارة. يتم وضع في وسط الماسح الضوئي MR في مراحل الانسداد وإعادة التروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: تكوين الأوزان. رسم جميع الأوزان في دالة إزاحة الدينامومتر باستخدام نظام التحكم عن بعد بالبالون (الأزرق) مقابل. نظام البكرة الأصلي (برتقالي). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تصميم أداة IRI عن بعد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: تفاصيل عن خصائص أداة IRI وتقنيات الحصول على الصور وتحليلها. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
توفر تقنية الانسداد عن بعد الجديدة التي تم تقديمها في هذه الدراسة منصة فريدة لتطوير البحث في مجال نمذجة إصابة نقص التروية عن طريق تجنب الحاجة إلى التلاعب المباشر بالأوعية أثناء الجراحة الأولية والسماح بالتصوير المتزامن متعدد الوسائط لعضلة القلب المعاد تشكيلها في وقت مبكر. يظهر التوصيف الشامل ، بما في ذلك قياسات التروبونين I ، والتصوير بالرنين المغناطيسي على النقيض من LGE ، و TTC ، وتلطيخ SR ، أن التقنية المقترحة تعادل المعيار الذهبي الحالي (أي ربط LAD المفتوح الصدر)9.
وللتقنية المقترحة مزايا متعددة مقارنة بنهج الربط التقليدي "المفتوح". في المقام الأول ، يقلل من وقت الصدر المفتوح أثناء الجراحة إلى 15 دقيقة فقط ، على عكس وقت الانسداد (30-60 دقيقة) بالإضافة إلى وقت الجراحة (15 دقيقة) المطلوب في الطريقة التقليدية. قد تخفف جراحة القلب المفتوح المصغرة هذه من تلف الأنسجة والالتهابات ولكنها ستحتاج إلى مزيد من التحقيق. علاوة على ذلك ، يسمح إغلاق بضع الصدر المبكر بفطام جهاز التنفس الصناعي ، مما يتيح التنفس التلقائي تحت الأيزوفلوران أثناء تجارب نقص التروية. هذا لديه القدرة على تقليل إصابة الرئة التي يسببها جهاز التنفس الصناعي والالتهابات المرتبطة بها ، مع السماح أيضا باستجابة أكثر دقة من الناحية الفسيولوجية لنقص تروية عضلة القلب وإعادة التروية10.
علاوة على ذلك ، توفر تقنية الانسداد عن بعد تحكما معززا في التوقيت الدقيق لتحريض نقص التروية. كدليل على المفهوم ، تم إثبات الجدوى والنتائج الأولية لتحفيز نقص تروية عضلة القلب والسيطرة عليه عن بعد ، بينما تم وضع في وسط ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي. تسمح القدرة على بدء نقص التروية بدقة بعد إغلاق الصدر للباحثين بتحديد وقت التدخلات العلاجية أو التحقيقات الإضافية ومزامنة الإهانة الإقفارية عبر الموضوعات التجريبية. يمكن أن يؤدي هذا التحكم المتزايد إلى تحريض أكثر دقة واتساقا لل IRI ، وهو أمر بالغ الأهمية للدراسات الميكانيكية والعلاجية. ومع ذلك ، فإن الامتداد الهامشي لاستنشاق الأيزوفلوران أثناء إعداد التصوير بالرنين المغناطيسي للقلب قد يشكل قيدا على هذه الدراسة. وعلى وجه التحديد، قد يكون للتعرض لفترات طويلة للإيزوفلوران تأثيرات إضافية وقائية للقلب، كما هو موضح في دراسات الفئران، وسيحتاج إلى مزيد من التحقيق للنموذج11 المقترح.
يعد الاختلاف في مدى الإصابة المستحثة تحديا شائعا في نماذج IRI ، وغالبا ما ينشأ عن الاختلافات في التنفيذ الجراحي أو التشريح المتغير12. الأهم من ذلك ، أن التدريب الكافي للجراح سيؤثر على معدلات الوفيات في هذا النموذج بما يتجاوز المتغيرات الأخرى المعترف بها مثل وضع LAD ، والمدة التجريبية ، وسلالات الفئران ، والخلفيات الجينية13. يمكن أن يؤثر اختيار عوامل التخدير والمسكنات أيضا على النتائج. من خلال التجربة ، يظهر هذا النموذج معدل وفيات إجمالي يقترب من 15٪. يمكن أن يؤدي تنفيذ إدارة صارمة للألم والمراقبة اليقظة للحيوانات إلى تقليل الوفيات بشكل أكبر.
أحد الاتجاهات المقنعة التي أشار إليها هذا العمل هو التطبيق المحتمل لتقنية الانسداد عن بعد في تقييم التدخلات العلاجية في المراحل المبكرة من الانسداد أو إعادة التروية.
في الختام ، تمثل تقنية الانسداد عن بعد تقدما واعدا في نمذجة IRI ، مما قد يؤدي إلى تحسين الدراسات الميكانيكية وتسريع العلاجات المستهدفة. إن قدرتها على الحد من الصدمات الجراحية ، وتعزيز السيطرة على توقيت نقص التروية ، وتحسين الاتساق التجريبي تؤكد أهميتها. من خلال مواصلة استكشاف قدرة التقنية على التكيف ، يمكن للباحثين إطلاق العنان لإمكاناتها الكاملة والمساهمة في فهم أكثر دقة للمراحل المبكرة من تحريض نقص التروية ، وإعادة التروية ، وإصابة نقص التروية المصاحبة. أيضا ، يمكن الآن ملاحظة تأثير استراتيجيات العلاج المختلفة خلال هذه المراحل الأولية.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم إجراء التجارب في منشأة KU Leuven الأساسية "مركز التصوير الجزيئي للحيوانات الصغيرة" (MoSAIC). ويود المؤلفون أن يعربوا عن شكرهم لكاتارزينا بواجيجزيك على المساعدة التقنية. تم دعم البحث بمنح بحثية من KU Leuven (C14/20/095) ومؤسسة الأبحاث - فلاندرز (FWO G0A7722N). يتم دعم M. Algoet من قبل مؤسسة الأبحاث - منحة زمالة فلاندرز (FWO 11A2423N).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-0 خياطة حريرية | منتجات شاربوينت | DC-2515N | |
| 5-0 خياطة البولي بروبلين | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 خياطة البولي بروبلين | Ethicon | 8206H | |
| جهاز نفخ بالون ACCLARENT | Johnson& amp جونسون ميدتك | BID30 | |
| أسيبرومازين | كيلا | ||
| فيتامين بي فيالون 18 جم | دينار | بحريني 381347 | |
| BD فيالون 20 جم | دينار | بحريني 381334 | |
| بيتادين سوليول | بوردو فارما | 25655-41-8 | |
| بوبرينورفين (بوبرينكس عن طريق الحقن) | ريكيت بينكيسر للرعاية الصحية | NDC 12496-0757-1 | |
| الكارب زوم ستايل Knijplood 2.1 جم (أوزان الصيد الرصاصية) | Visdeal.nl | ||
| دومون # 3 ملقط | أدوات العلوم الدقيقة | 11231-30 | |
| دومون # 5 ملقط | أدوات العلوم | الدقيقة 11251-30 | |
| أدوات العلوم الدقيقة 14040-10 | |||
| جل فوسيدين | ليو فارما | ||
| إيزوفلوران | أبوت | NDC 5260-04-05 | |
| KD الماوس / الجرذ العين منظار | العالم أدوات الدقة | 501897 | |
| KD الماوس / الجرذ العين منظار | العالم أدوات الدقة | 501897 | |
| الكيتامين | Dechra | ||
| مصدر الضوء | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| نظام التصوير بالرنين المغناطيسي | Bruker BioSpin ، Ettlingen ، ألمانيا | BioSpec 70/30 | |
| NatriumChloride 0.9٪ | Baxter | ||
| مصباح حراري للأشعة تحت الحمراء | الليلية Zoo Med Laboratories، Inc. | RS-75 | |
| ParaVision البرمجيات | إصدار Bruker BioSpin | 6.0.1 | |
| أنابيب البولي إيثيلين PE-10 | SAI تقنيات التسريب | PE-10 | |
| أنابيب البولي إيثيلين PE-50 | تقنيات التسريب SAI | PE-50 | |
| IRI عن بعد (PMMA) جهاز | محلية الصنع | ||
| Indus | |||
| Segment v4.0 | Medviso ، segment.heiberg.se | R12067 | |
| تسلسل صدى التدرج الذاتي | Bruker BioSpin ، Ettlingen ، ألمانيا | IntraGate ، ParaVision 6.0.1 | |
| حامل إبرة ممدود رفيع | أدوات العلوم الدقيقة | 12005-15 | |
| Sure-Seal Mouse / Rat Induction Chamber | World Precision Instruments | EZ-178 | |
| موصلات الأنابيب ، بولي ، Y الشكل | Westlab | 072025-0001 | |
| قسطرة توسيع Ultraverse 035 PTA: 5 مم × 40 مم ، بالون RBP 17 ATM على قسطرة بطول 130 سم | Bard Peripheral Vascular، Inc. | 00801741092671 | |
| فيت (كريم مزيل الشعر) | Reckitt Benkiser للرعاية الصحية | ||
| ، MiniVent موديل 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & لومب فارما | 685313 | |
| زيلازين | باير |
المراجع
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
