طريقة فلورسنت خالية من الخلايا قابلة للقياس الكمي وغير مكلفة لتأكيد قدرة المركبات الجديدة على تخمير الحديد

ملخص

وصفنا مقايسة الفلورسنت التي يمكن أن تؤكد بسرعة وبتكلفة زهيدة قدرة المركبات الجديدة على تخليب الحديد. يقيس الفحص قدرة المركبات على التفوق على نشاط ربط الحديد لمسبار الفلورسنت المخلب الضعيف للحديد Calcein ، مما يؤدي إلى زيادة قابلة للقياس الكمي في التألق عند حدوث الاستخلاب.

الملخص

تتطلب الخلايا السرطانية كميات كبيرة من الحديد للحفاظ على انتشارها. يعتبر استقلاب الحديد سمة مميزة للسرطان ، مما يجعل الحديد هدفا صالحا للنهج المضادة للسرطان. يتطلب تطوير مركبات جديدة وتحديد الخيوط لمزيد من التعديل إجراء فحوصات إثبات الآلية. وهناك العديد من المقايسات لتقييم الأثر على الانتشار؛ ومع ذلك ، فإن القدرة على تخليب الحديد هي مقياس مهم وأحيانا يتم تجاهله في نقطة النهاية بسبب ارتفاع تكاليف المعدات والتحدي المتمثل في تحديد قوة الاستخلاب بسرعة وبشكل متكرر. هنا ، نصف طريقة فلورية خالية من الخلايا قابلة للقياس الكمي وغير مكلفة لتأكيد قدرة المركبات الجديدة على تخليب الحديد. يعتمد فحصنا على صبغة الفلورسنت غير المكلفة المتاحة تجاريا Calcein ، والتي يمكن قياس مضانها على معظم قارئات ألواح المعايرة الدقيقة الفلورية. Calcein هو مخلب حديدي ضعيف ، ويتم إخماد مضانه عندما يربط Fe^{2 +/3+} ؛ يتم استعادة التألق عندما يتفوق مخلب جديد على Calcein في Fe^{2 +/3+}. تسمح إزالة التبريد الفلوري والزيادة الناتجة في التألق بتحديد قدرة الاستخلاب لمخلب مفترض جديد. لذلك ، نحن نقدم مقايسة غير مكلفة وعالية الإنتاجية تسمح بالفحص السريع لمركبات المخلب المرشحة الجديدة.

المقدمة

يشار الآن إلى التغيرات الظاهرية للخلايا التي تتعلق بتطور السرطان من خلال مجموعة مشتركة من القدرات البيولوجية المتغيرة على أنها السمات المميزة للسرطان. من بينها التغييرات الناتجة عن إعادة برمجة استقلاب الطاقة ، والتي تنتشر على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا السرطانية¹. تتضمن إعادة البرمجة الأيضية هذه زيادة متطلبات الحديد لدعم الانتشار السريع ونمو الورم². يؤدي هذا التعطش للحديد إلى استقلاب الحديد غير المنظم ، والذي يعتبر في حد ذاته سمة مميزة للسرطان ^3,4 ، مع حدوث خلل في جميع المراحل⁵. تشمل السمات المميزة للورم الخبيث ، التي اقترحها ويلش وهيرست مؤخرا ، دورا للحديد⁶ لأن الحديد يمكن أن يحفز الإجهاد التأكسدي ، وهذا بدوره يمكن أن يتوسط في التغييرات في الجينوم والإبيجينوم والبروتين ، مما يعزز إمكانية ورم خبيث⁷. تم إثبات وجود صلة بين مستويات الحديد وزيادة حدوث السرطان من خلال الدراسات الوبائية⁸.

نظرا لأن الخلايا السرطانية تتطلب كميات كبيرة من الحديد ، فهي عرضة لنقص الحديد ، وبالتالي استخلاب الحديد. لقد نشرنا مؤخرا مقالة مراجعة تسلط الضوء على إمكانية استخلاب الحديد في عكس العديد من السمات المميزة للسرطان من خلال NDRG1 الذي يعطل مسارات الإشارات السرطانية⁹. ومع ذلك ، فإن استخدام استخلاب الحديد كعلاج مستقل للسرطان لم يسفر عن نتائج إيجابية في التجارب السريرية بسبب سميتها ، وعمر النصف القصير ، والتمثيل الغذائي السريع ، وآليات المقاومة الناشئة. ومع ذلك ، فقد أظهرت مخلبات الحديد واعدة في التحقيقات في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتطوير مخلبات الحديد الفعالة لعلاج السرطان. استخلاب الحديد المحدد هو استراتيجية تم التحقق من صحتها في اكتشاف الأدوية المضادة للسرطان ، ولكن تم الإبلاغ عن عدد قليل فقط من الفئات حتى الآن¹⁰.

يتطلب تحديد وتوصيف مخلبات الحديد الجديدة القدرة على قياس تأثيرها على العديد من نقاط النهاية. يتم قياس العديد من هذه (مثل الانتشار ، موت الخلايا المبرمج ، تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية) بشكل روتيني وقد تم تحديدها ومراجعتها في الأدبيات كطرق لتقييم السمات المميزة للسرطان¹¹. عند تقييم مخلب الحديد الجديد ، تقوم العديد من المجموعات بشكل روتيني بفحص التأثير على الأنشطة المضادة للتكاثر والاختزال وكذلك التأثيرات على تدفق الحديد أو تدفقه. في تقنيات التنبؤ بالسيليكو ¹² زيادة المجموعة المتزايدة من مخلبات الحديد التي يمكن فحصها.

يتطلب إنشاء Sمن مخلبات الحديد القدرة على قياس تأثيرها على مستويات الحديد كوسيلة لإثبات إثبات المبدأ بشكل فعال. حاليا ، الطريقة الأكثر شيوعا للقيام بذلك هي قياس التدفق^{الخلوي 13} وهو مكلف ويستغرق وقتا طويلا ولا يمكن قياسه كميا. غالبا ما يعتمد اختيار الفحص على توفر المعدات التجريبية والسرعة وتكلفة الفحص. لذلك ، يمكن أن تكون القدرة على تخليب الحديد مقياسا لنقطة النهاية يتم التغاضي عنه بسبب ارتفاع تكاليف المعدات والتحدي المتمثل في تحديد قوة الاستخلاب بسرعة وبشكل متكرر. هنا ، نصف طريقة فلورسنت خالية من الخلايا قابلة للقياس الكمي وغير مكلفة لتأكيد قدرة المركبات الجديدة على تخليب الحديد.

البروتوكول

1. إعداد حل الأسهم

1. عند تحضير حلول مخزون Calcein ، امنع تدهور الصورة عن طريق إبقاء المحاليل في الظلام. قم بإعداد محلول 1 مللي متر من الكالسيين في برنامج تلفزيوني من Dulbecco ، بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم¹⁴. للحصول على 5 مل من محلول 1 مللي مول Calcein ، أضف 3.1 مجم من الكالسيين (622.5 جم / م) إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني Dulbecco. باستخدام جورب 1 مليمتر من الكالسيين ، قم بإعداد حصص 1 مل من محاليل المخزون الثانوية في أنبوب الميكروفوج كما هو مفصل في الجدول 1.
2. تحضير مخزون سداسي هيدرات كبريتات الأمونيوم الحديديك عن طريق إذابة 19 ملغ من سداسي هيدرات FAS (392.1 جم / م) في 5 مل من برنامج PBS الخاص ب Dulbecco للحصول على محلول كبريتات الأمونيوم الحديديك (FAS) 10 mM. إعداد المخزونات الثانوية من FAS عن طريق التخفيف. لتحضير مخزون 2 مللي متر FAS (fA) ، قم بتخفيف 200 ميكرولتر من مخزون FAS 10 mM مع PBS مع 800 ميكرولتر من PBS من Dulbecco. لإعداد مخزون من 100 ميكرومتر FAS (fB) تمييع 50 ميكرولتر من الأسهم fA مع 950 ميكرولتر من PBS Dulbecco.
3. لتحضير 10 ملليمتر من مخزون ديفيريبرون، قم بإذابة 2.8 مجم (139.15 جم/م) في 2 مل من برنامج دولبيكو الإذاعي. قم بإعداد مخزون ثانوي من مخلب الحديد 2 مللي متر عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من مخزون 10 مللي متر مع 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني من Dulbecco.
   ملاحظة: في هذا الفحص ، يجب إذابة مخلب الحديد المفضل في برنامج تلفزيوني من Dulbecco بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم. كنموذج عملي ، استخدمنا مخلب الحديد Deferiprone.

2. التحقق من صحة الفحص عن طريق تحديد النطاق الخطي لمضان الكالسيين

1. قم بإعداد مجموعة من مخزونات الكالسيين من 1 mM إلى 1 μM كما هو موضح في جدول محلول المخزون (انظر الجدول 1). حافظ على حلول المخزون في الظلام لمنع التدهور الكيميائي الضوئي.
2. ماصة 90 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى الآبار من A إلى H و 1 إلى 12 من لوحة بئر 96 باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة أو ماصة يدوية متعددة القنوات.
3. أضف 10 ميكرولتر من مخزون 1 mM Calcein إلى العمود 12 ، الصفوف من A إلى H ، من لوحة البئر 96 باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة.
4. أضف 10 ميكرولتر من مخزون الكالسيين 800 ميكرومتر المعد مسبقا (الجدول 1) إلى صفيحة بئر 96 في العمود 11 ، الصفوف من A إلى H ، باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة.
5. كرر إجراء الإضافة مع المخزونات من الجدول 1 بحيث يحتوي العمود 10 على 10 ميكرولتر من مخزون 400 ميكرومتر ، ويحتوي العمود 9 على 10 ميكرولتر من مخزون 200 ميكرومتر وما إلى ذلك. استمر في هذا الإجراء التدريجي عبر الأعمدة حتى يحتوي العمود 2 على 10 ميكرولتر من مخزون 1 ميكرومتر.
   ملاحظة: التركيز النهائي للكالسيين في كل بئر أقل بمقدار 10 أضعاف من محاليل المخزون بسبب التخفيف 1:10.
6. أضف 10 ميكرولتر من PBS إلى العمود 1 ، الصف A إلى E.
7. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة واضبط المحلل على قارئ الصفائح الدقيقة على إثارة 490 نانومتر واكتشاف 530 نانومتر (أو مجموعة مرشح مناسبة لمضان الكالسيان).

3. التحقق من صحة الفحص عن طريقالتبريد الأيوني Fe²⁺ لتقليل مضان الكالسيين

1. قم بإعداد مخزون Calcein (cB) بمقدار 10 ميكرومتر ومخزون FAS (fA) يبلغ 2 مللي متر (انظر جدول المواد). احتفظ بمخزون Calcein في الظلام لمنع التحلل الضوئي.
2. باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة أو ماصة يدوية متعددة القنوات ، أضف 50 ميكرولتر من PBS إلى الأعمدة من 2 إلى 10 ، الصفوف من A إلى E. لا تقم بإضافة PBS إلى العمود 11.
3. أضف 100 ميكرولتر من مخزون FAS (fA) البالغ 2 مللي متر إلى صفيحة بئر 96 في العمود 11 (الصفوف من A إلى E) باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة.
4. باستخدام ماصة يدوية متعددة القنوات ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من fA من العمود 11 وماصة في PBS الموجود بالفعل في العمود 10 ، واخلطها جيدا عن طريق الماصة.
5. استمر في إجراء التخفيف المزدوج التدريجي هذا عبر الأعمدة 9-2 ، الصفوف من A إلى E من لوحة البئر 96 ، واخلطها عن طريق الماصة.
6. قم بإزالة 50 ميكرولتر من المحلول عن طريق السحب من العمود 2 وتخلص من المحلول للنفايات.
7. أضف 40 ميكرولتر من PBS إلى جميع الآبار مع وجود محلول فيها ، الأعمدة 2-12 ، الصفوف من A إلى E.
8. أضف 90 ميكرولتر من PBS إلى عمود الآبار 1 ، الصفوف من A-E. تعمل هذه الآبار كتحكم إيجابي في 1 ميكرومتر Calcein و 0 μM FAS.
9. أضف 10 ميكرولتر من مخزون الكالسيين 10 ميكرومتر (cB) إلى كل بئر بمحلول فيه (الأعمدة من 1 إلى 12 ، الصفوف من A إلى E). ينتج عن هذا تركيز أعلى قدره 1000 ميكرومتر FAS في العمود 11 ، مع انخفاض تركيز FAS إلى النصف للأعمدة 10 و 9 و 8 عبر العمود 2. يحتوي كل بئر من الآبار الناتجة من الأعمدة على 1 ميكرومتر Calcein وتخفيف FAS.
10. أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى الصف F من الأعمدة من 1 إلى 5 لعنصر تحكم PBS وحده. أضف 100 ميكرولتر من 2 mM من FAS إلى الصف F من الأعمدة من 6 إلى 10 للتحكم في FAS وحده. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام.
11. قم بالتحليل على قارئ صفيحة مجهرية مضبوط على إثارة 490 نانومتر واكتشاف 530 نانومتر (أو مجموعة مرشح مناسبة لمضان الكالسيين).

4. مقايسة لتحديد قدرة مخلبات الحديد على التفوق على المخلب الضعيف Calcein لأيونات Fe²⁺

1. قم بإعداد مخزون Calcein (cB) من 10 μM ، ومخزون FAS (fB) من 100 μM ومخزون مخلب الحديد من 2 mM كما هو موضح في الجدول 1. احتفظ بمخزون Calcein في الظلام لمنع التحلل الضوئي.
2. باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة أو ماصة يدوية متعددة القنوات ، أضف 50 ميكرولتر من PBS إلى الأعمدة من 2 إلى 10 ، الصفوف من A إلى E ، من لوحة بئر 96. لا تقم بإضافة PBS إلى العمود 11.
3. أضف 100 ميكرولتر من مخزون 2 مللي متر (fA) من مخلبات الحديد ، إلى صفيحة بئر 96 في العمود 11 ، الصفوف من A إلى E باستخدام ماصة يدوية أحادية القناة.
4. باستخدام ماصة يدوية متعددة القنوات ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من fA من العمود 11 وماصة في PBS في العمود 10 ، الصفوف من A إلى E ، واخلطها جيدا عن طريق الماصة.
5. استمر في إجراء التخفيف المزدوج التدريجي هذا عبر الأعمدة المتبقية 9-2 ، الصفوف من A إلى E من اللوحة ، وامزج كل بئر عن طريق الماصة. قم بإزالة 50 ميكرولتر من العمود 2 وتجاهلها. وهذا يضمن تخفيفا مزدوجا قدره 2 مللي متر من مخلب الحديد (Deferiprone) عبر 96 عمودا من صفيحة البئر من 11 إلى 2 ، الصفوف من A إلى E.
6. ماصة 30 ميكرولتر من PBS في جميع الآبار مع محلول فيها (على سبيل المثال ، الأعمدة 2-11 الصفوف من A إلى E).
7. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 10 ميكرولتر من مخزون FAS 100 ميكرومتر (fB) في الأعمدة 2-12 ، الصفوف من A إلى E. ينتج عن هذا تركيز 1 ميكرومتر كالسيين و 10 ميكرومتر FAS في كل بئر ، وتخفيف مزدوج للمخلبات ، مع تركيز كل عمود إلى النصف عبر اللوحة ، الأعمدة 11-2 ، مع أعلى تركيز لمخلب الحديد عند 1000 ميكرومتر في العمود 11 من الآبار من A إلى E.
8. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 10 ميكرولتر من مخزون Calcein 10 μM (cB) في الأعمدة 2-12 ، الصفوف من A إلى E.
9. ماصة 80 ميكرولتر من PBS و 10 ميكرولتر من مخزون Calcein (cB) و 10 ميكرولتر من مخزون FAS (fB) إلى العمود 1 ، الصفوف A-E باستخدام ماصة. امزج العينات عن طريق الماصة. يوفر هذا التحكم في 1 ميكرومتر Calcein مع 10 ميكرومتر FAS ولا يوجد مخلب.
10. ماصة 100 ميكرولتر من PBS في أعمدة الصف F من 1 إلى 5. هذا يوفر التحكم السلبي في PBS.
11. أضف 100 ميكرولتر من 2 mM من مخلب الحديد (Deferiprone) إلى الصف F ، الأعمدة من 6 إلى 10. هذا يوفر التحكم في المخلب وحده.
12. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام. قم بالتحليل على قارئ صفيحة مجهرية متعدد الوسائط مضبوط على الإثارة عند 490 نانومتر والكشف عند 530 نانومتر (أو مجموعة مرشح مناسبة لمضان الكالسيان).

5. تحليل البيانات

1. تحليل للتحقق من صحة الفحص عن طريق تحديد النطاق الخطي لمضان الكالسيين.
   1. احسب متوسط وحدات التألق النسبية (RFU) للصفوف A-H لكل تركيز من الكالسيين في أعمدة صفيحة البئر 96 من الخطوة 1 وارسم مقابل التركيز. ارسم الرسم البياني الخطي لتركيز Calcein على المحور x مقابل متوسط RFU على المحور y واستخدم الانحدار الخطي لتوفير خط أفضل ملاءمة.
   2. تحديد الدلالة الإحصائية من خلال مقارنة تركيزات الكالسيين في كل عمود (2-11) بالتحكم في PBS في صفوف العمود 1 من A إلى E. قم بإجراء تحليل التباين (ANOVA) وتطبيق التحليل اللاحق باستخدام الفرق الأقل أهمية (LSD) مع عتبة p <0.001 لتحديد الدلالة الإحصائية ، (يشار إليها ب ** في الشكل 1).
2. تحليل للتحقق من صحة الفحص بواسطة التبريد الأيوني Fe²⁺ لتقليل مضان الكالسيين.
   1. احسب متوسط وحدات التألق النسبية (RFU) للصفوف من A إلى E لكل تركيز من FAS في الأعمدة 2-11. مخطط متوسط RFU لكل تركيز FAS على المحور ص. على تركيزات مخطط المحور السيني ل FAS باستخدام مقياس Log2 حيث يقوم بتوزيع البيانات بشكل أفضل. ارسم خطا مناسبا باستخدام الانحدار الخطي.
   2. حدد الدلالة الإحصائية من خلال مقارنة كل عمود يعني متوسط RFU للتحكم في PBS ، 1 μM Calcein ، 0 μM FAS (العمود 1 الصف A إلى E). قم بإجراء تحليل ANOVA مع تحليل LSD اللاحق مع عتبة p <0.001 لتحديد الدلالة الإحصائية.
3. تحليل للفحص: تحديد قدرة مخلبات الحديد على التفوق على المخلب الضعيف Calcein لأيونات Fe²⁺ .
   1. احسب متوسط وحدات التألق النسبية (RFU) للصفوف من A إلى E لكل تركيز من المخلب في الأعمدة 2-11. مخطط متوسط RFU لكل تركيز مخلب على المحور ص. على المحور السيني ، يتم رسم تركيزات المخلب باستخدام مقياس Log2 لأنه يوزع البيانات بشكل أفضل.
   2. تحديد الدلالة الإحصائية من خلال مقارنة كل عمود يعني متوسط RFU للتحكم في PBS 1 μM Calcein و 10 μM FAS (العمود 1 الصف A إلى E). قم بإجراء تحليل ANOVA مع تحليل LSD اللاحق مع عتبة p <0.001 لتحديد الدلالة الإحصائية.

النتائج

بالنسبة للطريقة الموضحة في الخطوة 2 ، حددت هذه التجربة الأولى (الشكل 1) النطاق الخطي لقارئ لوحة مضان المعايرة الدقيقة عند اكتشاف انبعاثات الفلورسنت Calcein. تظهر نتائجنا التمثيلية نطاقا خطيا واسعا من مضان الكالسيين من 0-100 ميكرومتر. يوضح تحليل ANOVA مع LSD اللاحق أن هناك فروقا ذات دلالة إحصائية في متوسط RFU لجميع تركيزات الكالسيين عند مقارنتها بعنصر تحكم قدره 0 ميكرومتر من الكالسين. في تجارب أخرى ، تم استخدام 1 ميكرومتر Calcein (الخطوتان 3 و 4) لأنه ينتج اختلافات ذات دلالة إحصائية عن عنصر التحكم 0 μM ويقع ضمن النطاق الذي يتم تطبيقه بشكل شائع على الخلايا في شكل Calcein AM في قياس التدفق الخلوي¹³.

بالنسبة للطريقة الموضحة في الخطوة 3 ، نوضح أنه عند إضافة الحديد على شكل Fe²⁺ في نطاق من 0-1000 ميكرومتر (مثل FAS) إلى 1 ميكرومتر Calcein ، تؤدي أيونات Fe²⁺ إلى انخفاض خطي في مضان الكالسيين (RFU). هذا يسمح بمراقبة التبريد القائم على Fe²⁺ لمضان الكالسيين. الكالسيين كمخلب حديد ضعيف يربط الحديد وهذا يقلل من إنتاج الفلورسنت. في الشكل 2 ، أظهرت تركيزات 8.9 ميكرومتر FAS وما فوق انخفاضا كبيرا ، p<0.001 ، في مضان الكالسيين عند مقارنته ب 1 ميكرومتر Calcein وحده. يتوافق استخدام 8.9 ميكرومتر من FAS مع انخفاض بنسبة 33٪ في مضان الكالسيين (متوسط RFU). لمزيد من التجارب (الخطوة 4) تم استخدام 10 ميكرومتر FAS لأنها تقع ضمن نطاق التبريد الفلوري للكالسيين.

بالنسبة للطريقة الموضحة في الخطوة 4 ، يمكن ملاحظة تفوق Calcein لأيونات Fe²⁺ بواسطة مخلب حديدي في الشكل 3. الحديد في شكل Fe²⁺ يقلل مضان الكالسيين من التحكم 1 ميكرومتر ويزيد مخلب الحديد من هذا التألق حتى الذروة ، مما يؤدي إلى إطلاق تبريد الحديد للكالسيين وزيادة التألق (يعني RFU). أدى Deferiprone (المستخدم كنموذج) بتركيزات تتراوح بين 0.97-512 ميكرومتر إلى زيادات ذات دلالة إحصائية في التألق كما لوحظ مع تحليل ANOVA و LSD اللاحق (p<0.001). كان أكبر تغيير في الطي هو تغيير 3 أضعاف في متوسط RFU عند 62.5 ميكرومتر من المخلب عند مقارنته بالتحكم في 1 ميكرومتر كالسيين AM و 10 ميكرومتر FAS. فوق 512 ميكرومتر من الديفيريبرون لم يكن هناك فرق ذو دلالة إحصائية بين المخلب والتحكم في 1 ميكرومتر من الكالسيين و 10 ميكرومتر من FAS.

الشكل 1: تركيزات الكالسيين والتألق (RFU) المحددة باستخدام قارئ لوحة المعايرة الدقيقة الفلورية. يتم عرض تركيزات الكالسيين من 0-100 ميكرومتر المحتضنة لمدة 30 دقيقة والتألق (RFU) المحدد هنا. تظهر البيانات متوسط 8 مكررات لكل تجربة وثلاث تجارب مستقلة ، وتظهر أشرطة الخطأ فاصل ثقة بنسبة 95٪ في المتوسط. يشار إلى الدلالة الإحصائية ب ** حيث p<0.001 كما هو محدد باستخدام تحليل ANOVA و LSD اللاحق (محسوب باستخدام منشور لوحة الرسم البياني). تتم مقارنة متوسط Calcein RFU لكل تركيز مع التحكم في PBS و 0 μM Calcein. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تؤدي زيادة تركيز FAS إلى انخفاض خطي في مضان الكالسيين. تم زيادة تركيز FAS من 0-1000 ميكرومتر مما أدى إلى انخفاض خطي في مضان الكالسيين 1 ميكرومتر بعد 30 دقيقة حضانة في PBS البيانات المعروضة هي متوسط 5 مكررات لكل تجربة وثلاث تجارب مستقلة ، تظهر أشرطة الخطأ فاصل ثقة بنسبة 95٪ في المتوسط. يشار إلى الدلالة الإحصائية ب ** حيث p<0.001 كما هو محدد باستخدام تحليل ANOVA و LSD اللاحق (محسوب باستخدام منشور لوحة الرسم البياني). تتم مقارنة متوسط Calcein RFU لكل تركيز من FAS و 1 μM من Calcein مع التحكم في 1 μM Calcein 0 μM من FAS في PBS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: زيادة تركيزات الديفيريبرون. تم زيادة تركيز ديفيريبرون من 0-1000 ميكرومتر مع حضانة 1 ميكرومتر كالسيين ، 10 ميكرومتر FAS في PBS. تم قياس التألق على قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الوسائط. البيانات المعروضة هي متوسط 5 مكررات لكل تجربة وثلاث تجارب مستقلة ، تظهر أشرطة الخطأ فاصل ثقة بنسبة 95٪ في المتوسط. يشار إلى الدلالة الإحصائية ب ** حيث p<0.001 كما هو محدد باستخدام تحليل ANOVA و LSD اللاحق (محسوب باستخدام منشور لوحة الرسم البياني). متوسط RFU حيث مقارنة ب 1 ميكرومتر كالسيين في PBS مع 10 ميكرومتر FAS و 0 ميكرومتر من Deferiprone. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التركيز (ميكرومتر)	الحجم من (1 mM الأسهم)	حجم برنامج تلفزيوني	الحجم الكلي
800	800 ميكرولتر	200 ميكرولتر	1 مل
400	400 ميكرولتر	600 ميكرولتر	1 مل
200	200 ميكرولتر	800 ميكرولتر	1 مل
100	100 ميكرولتر	900 ميكرولتر	1 مل
50	50 ميكرولتر	950 ميكرولتر	1 مل
25	25 ميكرولتر	975 ميكرولتر	1 مل
10	10 ميكرولتر	990 ميكرولتر	1 مل
6	6 ميكرولتر	994 ميكرولتر	1 مل
2	2 ميكرولتر	998 ميكرولتر	1 مل
1	1 ميكرولتر	999 ميكرولتر	1 مل

الجدول 1: إعداد مخزون الكالسيين الثانوي.

المناقشة

إن الاعتماد المفرط للسرطانات على الحديد لتغذية عملية التمثيل الغذائي يجعل استخلاب الحديد إضافة محتملة للأنظمة العلاجية⁴. ومع ذلك ، هناك قدرة محدودة على فحص مخلبات الأيونات المعدنية الجديدة بسرعة لقدرتها على ربط أيونات الحديد. من المعروف أن مسبار الفلورسنت Calcein الشائع الاستخدام والمتاح على نطاق واسع يعمل كمخلب حديدي ضعيف وملزم بواسطة أيونات الحديد يروي مضان Calcein. يمكن بعد ذلك استعادة التألق من خلال التنافس على الارتباط بالحديد باستخدام مخلب حديدي أقوى. إن الحد من التألق الذي لوحظ عندما يربط الكالسيين الحديد واستعادة التألق عندما يتفوق عليه مخلب أقوى يوفر طريقة سريعة وبسيطة لفحص المركبات الجديدة ذات إمكانات مخلب الحديد. في حين أن التقنيات القائمة على الكالسيين¹³ تستخدم بالفعل لتصور قدرة المخلبات على ربط الحديد في الخلايا ، فإن هذه التقنيات تتطلب جهاز قياس التدفق الخلوي المكلف ، وهي شبه كمية فقط ، وتتطلب تدريبا مكثفا للموظفين واستخدام شكل الخلية الأكثر تكلفة من Calcein ، Calcien-AM. علاوة على ذلك ، فإن هذه التقنية غير قابلة للتكرار ولا تسهل بسهولة تحديد أهمية البيانات عن طريق التحليل الإحصائي. لذلك ، أنشأنا طريقة بسيطة غير مكلفة في المختبر والتي يمكن أن تكون بمثابة شاشة مرور أولى لمركبات جديدة من قدرات مخلب الحديد. يلغي هذا الفحص الخالي من الخلايا متطلبات طرق زراعة الخلايا المكلفة كشاشة عالية الإنتاجية للتمرير الأول لقدرة استخلاب الحديد.

هناك اهتمام متزايد بفحص أو تطوير مخلبات الحديد الجديدة التي يمكن استخدامها لاستهداف السرطانات بسبب اعتمادها على الحديد لدفع تكيفاتها الأيضية². في هذه الورقة ، نصف تقنية في المختبر يمكن استخدامها لتأكيد قدرة المركبات الجديدة على تخليب الحديد عن طريق التفوق على المخلب الضعيف Calcein. وهذا يسمح بفحص بسيط وكمي وغير مكلف للمركبات الجديدة لقدرتها على استخلاب الحديد.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في إنشاء النطاق الخطي لقارئ لوحة المعايرة الدقيقة الفلورية (الشكل 1). يحتوي Calcein على أطياف واسعة من الإثارة والانبعاث الفلوري تتمحور حول ذروة الإثارة البالغة 501 نانومتر وذروة الانبعاث عند 521 نانومتر. ومع ذلك ، قد يعتمد النطاق الخطي للكالسيين على المرشحات المستخدمة لإثارة واكتشاف انبعاثات مضان الكالسيين ، كما أن النطاق الخطي للمضاعف الضوئي المستخدم في الكشف سيحدد جزئيا النطاق الخطي. لذلك ، من المهم أولا تحديد نطاق التركيزات التي يكون فيها مضان الكالسيين خطيا لضمان عمل الفحص ضمن النطاق الخطي للكالسيين على قارئ لوحة الفلورسنت. بالنظر إلى أننا لاحظنا خطية بين 0 و 100 mM Calcein ، فهذا يدل على أن Calcein له نطاق خطي واسع. علاوة على ذلك ، عادة ما تحتوي قارئات ألواح المعايرة الدقيقة الفلورية على مجموعات مرشحات يمكنها قياس مضان الكالسيين لأنه يحتوي على أطياف مماثلة لبعض الفلوروفورات الباعثة للضوء الأخضر الأكثر استخداما. لذلك ، ينطبق هذا الفحص على نطاق واسع على مجموعة كبيرة من المستخدمين.

يفضل استخدام FAS كمانح لأيون الحديد لأنه يوفر أيونات Fe²⁺ وهو أيون الحديد الرئيسي في تجمع الحديد في الخلايا. ومع ذلك ، تم تحقيق نتائج مماثلة لتلك الموضحة هنا (الشكل 2) مع كلوريد الأمونيوم الحديديك (FAC) الذي يوفر Fe³⁺ (البيانات غير معروضة). لذلك ، فإن الفحص متوافق مع كل من حالات الأكسدة والاختزال لأيونات الحديد التي توسع قابلية التطبيق على المخلبات مع تفضيل أي من حالات الأكسدة والاختزال هذه.

في هذه الدراسة ، نقدم بيانات عن مخلب الحديد Deferiprone ، ومع ذلك ، قمنا أيضا بتقييم قدرة مخلبات الحديد الأخرى بما في ذلك Mimosine على التفوق على Calcein في ربط أيون الحديد باستخدام هذا الفحص (البيانات غير معروضة). أحد قيود الفحص هو أنه فوق 512 مللي متر من المخلب deferiprone لم تكن هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في التألق بالمقارنة مع عنصر تحكم 1 ميكرومتر كالسيين و 10 ميكرومتر من FAS. من غير الواضح لماذا لا تؤدي التركيزات العالية من المخلب إلى زيادة الفلورسنت على الرغم من ملاحظة ذلك مع المخلبات الأخرى (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، يجب أن يعمل المركب العلاجي الرئيسي <100 ميكرومتر بحيث يعمل الفحص في نطاقات التركيزات المطلوبة لفعالية مركب الرصاص.

وبالتالي ، يسمح هذا الفحص بفحص أي مخلب حديدي محتمل بسرعة للتأكد من قدرته على تخليب الحديد كدليل على الآلية. هذه خطوة أولى مهمة قبل فحص المخلبات الجديدة في فحوصات مكلفة وشاقة تعتمد على الخلايا أو في الجسم الحي . يتمثل أحد قيود هذا الفحص في أنه يتم إجراؤه باستخدام مذيب مائي وبالتالي يتطلب أن يكون المخلب قابلا للذوبان في المخازن المائية. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن أعلى تركيز مستخدم في هذه الدراسة كان 10 mM Deferiprone وهو مخلب حديدي صغير محب للدهون¹⁵ ، فلا يزال من الممكن اختبار المخلبات ذات الذوبان المائي المحدود.

في الختام ، قد يكون الفحص الموصوف هنا ذا قيمة في فحص مخلبات الحديد الجديدة التي تعد محورا مستمرا لتطوير علاج السرطان.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حديد الأمونيوم (II) كبريتات سداسي هيدرات	سيجما ألدريتش	215406	حكمة أخرى تعرف باسم FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco & prime; s فوسفات مخزن محلول ملحي	Sigma-Aldrich	D5652	المغنيسيوم والحرة من الكالسيوم
Greiner CELLSTAR 96 ألواح بئر	Sigma-Aldrich	M0812	أي لوحة بئر 96 شفافة بصريا ستعمل