عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

التفاعلات بين الجزيئات الحيوية هي الجزء الأساسي من الظواهر البيولوجية. تشكل تفاعلات البروتين والبروتين جزءا مهما من هذه التفاعلات. لذلك ، فإن تحديد شريك (شركاء) التفاعل للبروتين محل الاهتمام أمر بالغ الأهمية لزيادة توضيح وظيفة البروتين / الجين محل الاهتمام. طريقة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) هي تقنية شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي¹. في هذا النظام ، يتم دمج اثنين من البروتينات (X و Y) التي سيتم اختبار تفاعلها في مجال ربط الحمض النووي (DB) ومجال تنشيط النسخ (AD) ، على التوالي. يرتبط بروتين الاندماج DB-X بتسلسل التعرف على مجال DB ؛ لذلك ، عندما يتفاعل البروتينان X و Y ، يقترب بروتين الاندماج AD-Y من تسلسل التعرف. وبالتالي ، يتم تنشيط نسخ جين المراسل في اتجاه مجرى تسلسل التعرف. لذلك ، يمكن استخدام وجود أو عدم وجود نشاط جيني مراسل لتحديد وجود أو عدم وجود تفاعل البروتين^{والبروتين 1}.

بمجرد تحديد شريك تفاعل معين للبروتين محل الاهتمام ، يجب إجراء مزيد من التحليلات لتوضيح الوظيفة البيولوجية للتفاعل. لهذا الغرض ، إذا كان من الممكن عزل طفرات البروتينات التي تضعف أو تزيل التفاعل المحدد بين البروتين والبروتين ، فستكون بمثابة أدوات قوية. يمكن استخدام نظام Y2H مباشرة لعزل هذه الطفرات عن طريق فحص المستنسخة "السلبية التفاعل" ، بدءا من استنساخ "التفاعل الإيجابي" من النوع البري. لتسريع هذه العملية ، تم تطوير أنظمة Y2H (rY2H) "العكسية" ^2,3. في أنظمة rY2H ، تحتوي سلالات الخميرة المضيفة على جينات علامة قابلة للاختيار كجينات مراسلة ، مما يعني أن خلايا الخميرة تنمو فقط عندما لا تتفاعل بروتينات AD-Y و DB-X.

على الرغم من أن كلا من نظامي Y2H و rY2H يسمحان بعزل الطفرات السلبية التفاعل ، إلا أن عملية عزل الطفرات شاقة لأنه ليس كل المرشحين الذين تم الحصول عليهم عن طريق الفحص يحملون النوع المطلوب من الطفرات (عادة طفرات خاطئة). القضية الأكثر خطورة هي أن جزءا كبيرا من المرشحين لديهم طفرات أو طفرات هراء ، ومن الضروري إجراء النشاف الغربي لاستبعاد المستنسخة غير المرغوب فيها. للتغلب على هذه المشكلة ، تم تطوير ناقلات البلازميد الجديدة⁴. في هذه المتجهات ، يتم وضع KanMX ، وهي علامة مقاومة للأدوية ، خارج الإطار في اتجاه مجرى مجرى مجال DB أو AD. يصبح جين العلامة في الإطار مع مجال DB أو AD فقط عند إدخال الجين محل الاهتمام. عندما يتم إدخال طفرة (طفرات) عشوائية في الجين محل الاهتمام ، يمكن بسهولة القضاء على الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات إطارية أو طفرات هراء ، عن طريق إجراء اختيار مقاومة الأدوية ، ويمكن بسهولة تحديد المرشحين الذين يحملون طفرات خاطئة مرغوبة باستخدام شاشة Y2H⁴. تقدم هذه المقالة بروتوكولا لعزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة لبروتين مهم باستخدام هذه الإستراتيجية.

1. بناء مكتبة المسخ

1. قم بإعداد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (يظهر مثال أدناه). بشكل عام ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من التفاعل ، والذي ينقسم إلى عشرة حصص من 5 ميكرولتر ، وتضخيم جزء الجين المستهدف في جهاز PCR⁴.
   ملاحظة: يجب على المستخدمين اختيار بوليميراز مناسب لإدخال الطفرات بكفاءة. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه قصيرا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز بمعدل خطأ أعلى ، مثل Taq polymerase ، الذي يفتقر إلى نشاط التدقيق اللغوي. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه طويلا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز أعلى دقة لتقليل عدد الطفرات. تحدث الطفرات كل بضع مئات من أزواج القواعد بعد 30 دورة من التضخيم باستخدام Taq polymerase⁴ العادي. في النتائج التمثيلية ، تم استخدام بوليميراز Taq مختلف (انظر جدول المواد) ، والذي يتمتع بدقة أعلى من Taq polymerase العادي ، وكان معدل الطفرة واحدا في 600 زوج من القواعد. يتم توفير مثال على مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاصيل التمهيدي وظروف التفاعل في الملف التكميلي 1.
2. عند اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بدمج جميع حصص التفاعل ، وتأكد من تضخيم شظايا الحمض النووي ذات الأهمية باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وما إلى ذلك ، وتنقية الحمض النووي⁵.
3. قم بتجميع جزء الحمض النووي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.2 باستخدام متجه Y2H المناسب باستخدام استراتيجية استنساخ "سلسة" (الشكل 1).
   ملاحظة: يقلل نظام الاستنساخ السلس ، مثل Gibson Assembly⁶ ، من تلوث مكتبة الطافرة المبنية بواسطة ناقلات فارغة ناتجة عن الربط الذاتي. وترد في الجدول 1 قائمة بمتجهات Y2H. يمكن تحضيرها عن طريق هضم BamHI قبل التجميع. جميع البلازميدات متوفرة من المشروع الوطني للموارد الحيوية - الخميرة (انظر جدول المواد).
4. أدخل خليط التفاعل المتولد في الخطوة 1.3 في الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية المحضرة وفقا لبروتوكول تحويل الإشريكية القولونية عالي الكفاءة (على سبيل المثال ، Inoue et ^al.7). انشر جميع الخلايا المختصة على عدة ألواح LB (1٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 1٪ كلوريد الصوديوم ، و 2٪ أجار) تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (انظر جدول المواد). في هذه المرحلة ، انشر كمية صغيرة (~ 1/100 من إجمالي التفاعل) على نفس لوحة الاختيار لحساب عيار المكتبة. احتضان الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
5. بمجرد ظهور عدد كبير من مستعمرات الإشريكية القولونية ، كشط جميع الخلايا من سطح اللوحة باستخدام حلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها. استعادة الحمض النووي البلازميد من هذه الخلايا باستخدام الطرق الشائعة ، مثل التحلل القلوي⁸. في الوقت نفسه ، احسب عدد المستعمرات التي تظهر بعد نشر حصص صغيرة من خليط التحول على اللوحة. باستخدام هذا الرقم ، قم بتقدير العدد الإجمالي للنسخ المستقلة في المكتبة.
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، التقط بعض المستعمرات المستقلة (4-6) التي تظهر على اللوحة التي انتشرت عليها الحصص الصغيرة لتفاعل التحول ، وقم بزراعتها بشكل منفصل ، وعزل البلازميدات عنها للتأكد من أن جميع المستنسخة تقريبا تحمل شظايا الحمض النووي المطلوبة⁵. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لعزل البلازميدات من الإشريكية القولونية. يمكن حساب عدد المستعمرات التي تظهر على اللوحة بعد نشر القسمات الصغيرة يدويا.
6. قياس تركيز تجمع الحمض النووي للمكتبة. عادة ما تكون بضع مئات من النانوجرامات من الحمض النووي للمكتبة كافية للحصول على عدة آلاف من المحولات في الخطوة التالية.
   ملاحظة: يوصى بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية ترتبط بالحمض النووي لأن قياس A₂₆₀ غالبا ما يكون غير دقيق.

2. تحويل الخميرة مع مكتبة متحولة وطلاء طبق الأصل

1. أدخل المكتبة الطافرة في سلالة الخميرة المضيفة (TAT-7 (L40-ura3) ^9,10 MATa ، leu2-3,112 ، trp1-901 ، his3-Δ200 ، ade2-101 ، gal80Δ ، LYS2: (lexAop) 4-HIS3 ، ura3: (lexAop) _8-lacZ) لمقايسة Y2H باستخدام حوالي 100 نانوغرام من الحمض النووي. قم بتحويل الخلايا المضيفة مسبقا باستخدام بلازميد "الطعم".
   1. بعد إجراء التحويل ، قم بتعليق خلايا الخميرة في ماء معقم ونشر حصص بكميات مختلفة على الألواح المناسبة (عادة ما يكون وسط SC يفتقر إلى الليوسين والتريبتوفان: SC-LW [0.67٪ قاعدة نيتروجين الخميرة ، 2٪ جلوكوز ، 1.546 جم / لتر SC مزيج مزدوج التسرب -Leu -Trp ، و 2٪ أجار ، انظر جدول المواد]). احتضان هذه الأطباق طوال الليل على حرارة 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: البروتوكول القياسي ، مثل طريقة أسيتات الليثيوم - PEG¹¹ مع ~ 5 × 10⁶ خلايا تنمو لوغاريتميا ، كافية لتحويل الخميرة. يمكن أيضا استخدام طريقة أخرى ذات كفاءة تحويل عالية ، مثل التثقيب الكهربائي.
2. في اليوم التالي ، عندما تظهر مستعمرات صغيرة ، حدد اللوحات التي تحتوي على عدد مناسب من الخلايا (500-2000) وقم بعمل نسخ متماثلة منها على النحو التالي.
3. ضع ورقتين من ورق الترشيح على كتلة طبق الأصل لعمل عدة نسخ متماثلة (الوسيط هو SC-LW و SC-LW المحتويان على كاناميسين) (انظر جدول المواد). احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.
   ملاحظة: تركيز الكانامايسين (G418) هو 600 ميكروغرام / مل. لا تستخدم المخمل لطلاء النسخ المتماثلة لأن دقة المستعمرات ستفقد.
4. بمجرد نمو المستعمرات ، قارن بين الأطباق واختر المرشحين. قم بإجراء اختبار ألوان Y2H (انظر الخطوة 3) إذا تم استخدام lacZ كمراسل.
   ملاحظة: بالنسبة لمراسل Y2H ، عادة ما يكون lacZ أفضل في اكتشاف تفاعل ضعيف من HIS3.

3. مقايسة اللون Y2H

1. ضع ورقة من ورق الترشيح مقطوعة مسبقا إلى الحجم المناسب على اللوحة المتماثلة المعدة باستخدام الخطوة 2. احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين ورق الترشيح واللوحة.
   ملاحظة: استخدم ورق الترشيح رقم 4A أو ورق الترشيح من الدرجة 50 (انظر جدول المواد). يمكن استخدام أي SC-LW أو SC-LW تحتوي على ألواح كاناميسين ، والتي يتم تصنيعها عن طريق الطلاء المتماثل ، لفحص اللون.
2. عندما يتم ترطيب ورق الترشيح الموجود على اللوحة تماما (عندما يتغير لون ورق الترشيح تماما) ، ضع عدة أوراق من المنشفة الورقية في الأعلى واجعلها تتلامس مع ورق الترشيح لإزالة الرطوبة الزائدة. قم بإزالة المنشفة الورقية عندما تمتص الماء ويتغير لونها. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.
3. التقط حواف ورق الترشيح بملاقط ، وقشره من اللوحة بسرعة ، واغمره في النيتروجين السائل ، وقم بتجميده. في حالة عدم توفر النيتروجين السائل ، ضع ورق الترشيح على صينية بلاستيكية بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى وضعه على الفور في الفريزر (-20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية) ليتجمد تماما.
4. قم بإزالة ورق الترشيح المجمد وضعه ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على منشفة ورقية جافة لإذابة. بعد الذوبان مباشرة ، ضع ورق الترشيح ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على ورق ترشيح آخر تم وضعه على صينية بلاستيكية أو حاوية قابلة للغلق ومنقوع بمخزن Z (60 mM_{Na 2}HPO₄ ، 40 mM NaH₂PO₄ ، 10 mM KCl ، و 1 mM MgSO₄ ، pH 7.0) يحتوي على X-gal (5-برومو-5-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactoside) و 2-ميركابتوإيثانول⁹ (انظر جدول المواد). احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين أوراق الترشيح العلوية والسفلية.
5. قم بتغطية الدرج البلاستيكي الذي يحتوي على ورق الترشيح وضعه في حاوية محكمة الإغلاق أو كيس بلاستيكي. أغلق الحاوية محكمة الإغلاق أو الكيس البلاستيكي واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى يظهر اللون الأزرق.
6. عندما يظهر لون أزرق ، ضع ورق الترشيح مع وضع جانب المستعمرة لأعلى على حوالي 500 ميكرولتر من محلول التوقف (1 M Na₂CO₃) موضوعا على صينية بلاستيكية نظيفة. توقف عن نقع المحلول بسرعة ؛ لذلك ، قم بإزالة الفلتر على الفور ، وضعه على منشفة ورقية جديدة بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، واتركه حتى يجف.
7. بعد استبدال المنشفة الورقية وجفاف الفلتر بدرجة كافية، استخدم ماسحا ضوئيا أو جهازا آخر لالتقاط البيانات.

4. استعادة وتأكيد المستنسخة المرشحة

1. حدد النسخ المستنسخة البيضاء و Kan^R المرشحة من اللوحة الأصلية للنسخة المتماثلة (أو اللوحة المنسوخة غير المستخدمة لمقايسة اللون). الأمثلة موضحة في الشكل 1C. تأكد من أن المستنسخة المرشحة بيضاء و Kan^R عن طريق إعادة تخطيطها كرقعة صغيرة على وسط SC-LW يحتوي على كاناميسين واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. اصنع مجموعتين على الأقل أو قم بعمل نسخ متماثلة في اليوم التالي.
   ملاحظة: يجب اختيار المستعمرات البيضاء لأن المستعمرات الزرقاء الباهتة قد تحتفظ بالتفاعل.
2. بمجرد إعادة نمو المستنسخة المرشحة جيدا ، كرر مقايسة اللون مع إنشاء لوحة واحدة على الأقل في الخطوة 4.1 كما هو موضح في الخطوة 3 وتأكد من أنها تظل بيضاء ولا تتحول إلى اللون الأزرق (الشكل 2 أ).
   ملاحظة: عند إعادة خطوط المرشحين ، لا تحمل كميات كبيرة من الخلايا. الكثير من الخلايا تجعل من المستحيل التمييز بين استنساخ Kan^R و Kan^S .
3. خذ المستنسخة التي لا تزال بيضاء و Kan^R المتولدة في الخطوة 4.2 من بقايا اللوحة وقم بزراعتها بشكل مستقل في 1 مل من وسط الاختيار (SC-L أو SC-W ، اعتمادا على المتجه المستخدم في بناء المكتبة) طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
4. نقل الثقافة إلى microtube وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (~ 15000 × غرام ، لمدة 10-30 ثانية في درجة حرارة الغرفة). عزل الحمض النووي كله من بيليه الخلية على النحو التالي.
5. قم بتعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من محلول التحلل (2٪ Triton X-100 ، 1٪ SDS ، 100 mM NaCl ، 10 mM Tris-Cl (8.0) ، و 1 mM EDTA) تحتوي على 1 ميكرولتر لكل من 2-mercaptoethanol و 20 mg / mL Zymolyase 100T (انظر جدول المواد) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم جدران الخلايا. في هذا الوقت ، تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب كل 5-10 دقائق.
6. عندما يصبح تعليق الخلية معتما أو شفافا ، أضف حجما متساويا من خليط من كحول الفينول والكلوروفورم والأيزوميل (25:24:1) واخلطه جيدا عن طريق الدوامة بسرعة معتدلة لمدة 10-20 ثانية.
7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) واستعادة المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي في أنبوب دقيق جديد. أضف 0.8 حجم الأيزوبروبانول واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب.
8. اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق ثم استخدم جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 4-5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) لترسيب الحمض النووي.
9. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الراسب بحوالي 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. إزالة الإيثانول تماما وتجفيف راسب لفترة وجيزة.
10. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-Cl (8.0) و 1 mM EDTA) إلى الراسب ، واخلطه لفترة وجيزة ، واترك الأنبوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإذابة الراسب.
    ملاحظة: إذا كان المستخدمون في عجلة من أمرهم ، فاحتفظ بالأنابيب عند 37-50 درجة مئوية. يذوب راسب الحمض النووي (DNA) في غضون ساعات قليلة.
11. بمجرد إذابة الحبيبات تماما ، قم بتحويل الإشريكية القولونية بكمية صغيرة من محلول الحمض النووي هذا.
    ملاحظة: حوالي 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي كافية إذا تم استخدام الإشريكية القولونية ذات كفاءة التحويل العالية.
12. عندما تظهر مستعمرات الإشريكية القولونية ، اختر العديد من المستعمرات المستقلة ، واستزرعها ، واستعد البلازميدات بالطرق القياسية ، مثل التحلل القلوي.
13. أدخل الحمض النووي البلازميد الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.12 في الخلايا المضيفة Y2H التي تؤوي بلازميد الطعم. عندما تظهر المحولات ، تحقق منها من خلال فحص اللون (يجب أن تظهر بيضاء) والنشاف الغربي⁴ (يجب أن تعبر عن بروتين بالحجم المطلوب).
    ملاحظة: طريقة ما بعد القلوية¹² هي طريقة سهلة وسريعة لتحضير مستخلص خلية كاملة من الخميرة.
14. إذا تم استيفاء المعيارين المذكورين أعلاه ، فحدد موقع طفرة المستنسخة عن طريق تسلسل النوكليوتيدات⁴.

في الآونة الأخيرة ، وجد أن النصف الطرفي C من بروتين Pol2 (Pol2-C) يتفاعل مع Mcm10. كلا البروتينين ضروريان لبدء تكرار الحمض النووي ، وبالتالي لنمو الخلايا في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae13،14،15. للمساعدة في فهم الأهمية البيولوجية لهذا التفاعل ، تم عزل طفرات Pol2-C التي ليس لها تفاعل / متناقص مع Mcm10 باستخدام الطريقة الموضحة هنا.

تم إنشاء مكتبة طفرات باتباع الطريقة الموضحة في الخطوة 1. تم تضخيم شظايا الحمض النووي Pol2-C باستخدام بوليميراز GoTaq واستنساخها في ناقل Gal4AD (pST2525) باستخدام إنزيم In-Fusion. قدر عدد المستنسخة المستقلة في المكتبة ب 5000.

كما هو موضح في الخطوة 2 ، تم إدخال الحمض النووي لبلازميد المكتبة في سلالة مضيف Y2H TAT-7 ، والتي تم تحويلها مسبقا باستخدام بلازميد LexA-Mcm10. ونشرت الخلايا على صفيحة SC-LW واستنسخت إلى صفيحتي SC-LW وSC-LW + G418 في اليوم التالي. خضعت النسخ المتماثلة لمقايسة اللون كما هو موضح في الخطوة 3. تظهر بعض نتائج فحص اللون في الشكل 1C.

تم عزل سبعة وأربعين مستعمرة بيضاء اللون ومقاومة G418 كأول المرشحين من حوالي 8500 محول. تم اختبارها مرة أخرى باستخدام فحص اللون ، وتم تأكيد أن 25 من أصل 47 نسخة بيضاء (الشكل 2 أ). تم الاحتفاظ بهذه المستنسخة ال 25 كمرشحين. تم استرداد الحمض النووي البلازميد المرشح من كل من المرشحين ال 25 كما هو موضح في الخطوة 4. تم إعادة إدخالها في الخلايا المضيفة لخميرة Y2H التي تؤوي LexA-Mcm10 واختبارها باستخدام فحص اللون ، وتم اختيار 16 نسخة تفتقر إلى اللون. لمزيد من التأكيد على أن هذه كانت طفرات خاطئة Pol2-C ، تم تأكيد التعبير عن بروتين Pol2-C من خلال النشاف الغربي. أظهر اثنا عشر مرشحا نطاقا في موضع كان تقريبا نفس موضع التحكم الإيجابي (بروتين الاندماج Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX ، محسوب m.w.: 158.8 كيلو دالتون) (الشكل 2B). أظهر فحص اللون أن هذه المستنسخة ال 12 لم تتفاعل مع Mcm10 (الشكل 2C). بعد تحديد تسلسل النوكليوتيدات لهذه المستنسخة ، تم التأكد من أن جميعها لديها طفرة (طفرات) خاطئة. تراوح عدد الطفرات الخاطئة من واحد إلى خمسة (البيانات غير معروضة). في المتوسط ، حدثت طفرة خاطئة واحدة في كل 1000 قاعدة.

الشكل 1: مخططات النهج القائم على Y2H لفحص الطفرات الفارغة / الضعيفة. (أ) نظام Y2H. (ب) استراتيجية لعزل الطفرات الخالية من التفاعل / الضعيفة. 1: يحتوي متجه Y2H الذي تم إنشاؤه حديثا على نسخة من جين KanMX في اتجاه مجرى النهر لعلامة Y2H ومجال DB و AD. الأهم من ذلك ، أن جين KanMX هذا يفتقر إلى كودون البدء وهو خارج الإطار مع علامة Y2H. لذلك ، لا يتوقع التعبير عن جين KanMX من هذا المتجه. عندما يتم إدخال جزء الحمض النووي المضخم PCR في المتجه ، يكون جين KanMX في الإطار مع علامة Y2H ويتم التعبير عنه. وبالتالي ، فإن البلازميدات التي تؤوي النوع البري أو الإدراج الذي يحتوي على طفرة (طفرات) خاطئة يمكن أن تعبر عن جين KanMX ، الذي يمنح مقاومة ل G418. لا يمكن للبلازميدات ذات الطفرة (الطفرات) الهراء أو إزاحة الإطار التعبير عن جين KanMX. 2: يتم إدخال المكتبة الطافرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1 في خلايا الخميرة المضيفة Y2H. عندما تظهر المحولات ، يتم عمل نسخ متماثلة. من خلال مقارنة تعبير جين (جينات) المراسل والمقاومة ل G418 ، يمكن اختيار مرشحي الطفرات الخالية / الضعيفة. (ج) مثال على الفحص. تم إدخال مكتبة البلازميد ، التي كانت تؤوي Gal4-AD وجزء الحمض النووي Pol2-C المتحور PCR ، في سلالة مضيف Y2H TAT-7 ، والتي تم تحويلها مسبقا باستخدام بلازميد LexA-Mcm10. يتم عرض صور للخلايا قبل (يسار) وبعد (وسط) مقايسة اللون والخلايا المزروعة على لوحة SC-LW + G418 (يمين). يشار إلى أمثلة المرشحين للطفرات الفارغة / الضعيفة والمرشحين الزائفين برؤوس الأسهم البيضاء والسوداء ، على التوالي. د: تتابع الحمض النووي (DNA) حول موقع استنساخ متجهات Y2H ومتجهات AD (أعلى) وDB (أسفل). يظهر التسلسل من آخر عشرة أحماض أمينية (aa) من علامة Y2H (أحمر) إلى الجزء المقابل للعشرة الأولى aa من KanMX (أخضر). كما يتم عرض مواقع التعرف على SmaI و BamHI. تظهر مواضع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الأسفل عند استخدام موقع BamHI كموقع استنساخ. تنطبق نفس البادئات على استنساخ الجين محل الاهتمام في البلازميدات الأخرى (pST2303 / 2523). تم تعديل هذا الرقم من Tanaka et al.4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: مثال على عملية فحص الطفرات الفارغة / الضعيفة. (أ) نمت المستعمرات ال 47 المعزولة كمستنسخات مرشحة ، كما هو موضح في الشكل 1 ج ، مرة أخرى على وسط SC-LW يحتوي على G418 وخضعت لمقايسة اللون. +: التحكم الإيجابي (Wt Pol2-C) ، -: التحكم السلبي (المتجه). تم استزراع المستنسخة المرشحة المرقمة من 1 إلى 25 لاستعادة البلازميدات. (ب) تم استعادة البلازميدات من كل نسخة مرشحة في (A) ، وإدخالها في الخلايا المضيفة Y2H ، وإخضاعها مرة أخرى لمقايسة اللون. ستة عشر منهم كانوا من البيض (تفتقر إلى اللون). تم تحضير مستخلصات الخلايا الكاملة منها ، وتم إجراء النشاف الغربي بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لحمض الهيالورونيكا. الرقم الموجود على اللوحة يتوافق مع الرقم الموجود في (A). تم إجراء تحليلات للعديد من مستنسخات البلازميد المستقلة المستردة من كل مرشح باستثناء # 6. ج: نتائج مقايسة الألوان للمستنسخات ال 12 النهائية. تتوافق الأرقام مع تلك الموجودة في (أ). # 16 ، الذي احتفظ بالتفاعل مع Mcm10 ، تم استخدامه كعنصر تحكم إيجابي في فحص اللون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: قائمة متجهات Y2H التي تحتوي على KanMX خارج الإطار مع علامة Y2H.

الملف التكميلي 1: مثال على مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاصيل التمهيدي وظروف التفاعل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.