مقالة منهجية

عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

DOI:

10.3791/66423

⸱

ديسمبر 29, 2023

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعلات الجزيئات الحيوية ، مثل تفاعلات البروتين والبروتين ، هي الأساس الجزيئي للوظائف البيولوجية. إذا كان من الممكن عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة التي تفتقر على وجه التحديد إلى التفاعل ذي الصلة ، فإنها ستساعد بشكل كبير على فهم وظيفة (وظائف) هذا التفاعل. تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات بين البروتين والبروتين هي واحدة من العمليات الأساسية التي تكمن وراء الظواهر البيولوجية. واحدة من أبسط وأفضل الطرق لفهم دور (أدوار) ووظيفة (وظائف) تفاعل معين بين البروتين والبروتين هي مقارنة النمط الظاهري للنوع البري (مع تفاعل البروتين والبروتين ذي الصلة) وتلك الخاصة بالطفرات التي تفتقر إلى التفاعل ذي الصلة. لذلك ، إذا كان من الممكن عزل هذه الطفرات ، فإنها ستساعد على توضيح العمليات البيولوجية ذات الصلة. يعد إجراء الخميرة ثنائي الهجين (Y2H) نهجا قويا ليس فقط للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين ولكن أيضا لعزل الطفرات الخالية / الضعيفة. في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة باستخدام تقنية Y2H. أولا ، يتم إنشاء مكتبة الطفرات من خلال الجمع بين تفاعل البلمرة المتسلسل وتقنية الاستنساخ غير الملحومة الفعالة ، والتي تستبعد بكفاءة المتجه الفارغ من المكتبة. ثانيا ، يتم فحص طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة بواسطة مقايسة Y2H. بسبب خدعة في ناقل Y2H ، يتم التخلص بكفاءة من الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات في الإطار وهراء ، من عملية الفحص. هذه الاستراتيجية بسيطة ويمكن تطبيقها على أي مجموعة من البروتينات التي يمكن اكتشاف تفاعلها بواسطة النظام الهجين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات بين الجزيئات الحيوية هي الجزء الأساسي من الظواهر البيولوجية. تشكل تفاعلات البروتين والبروتين جزءا مهما من هذه التفاعلات. لذلك ، فإن تحديد شريك (شركاء) التفاعل للبروتين محل الاهتمام أمر بالغ الأهمية لزيادة توضيح وظيفة البروتين / الجين محل الاهتمام. طريقة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) هي تقنية شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي1. في هذا النظام ، يتم دمج اثنين من البروتينات (X و Y) التي سيتم اختبار تفاعلها في مجال ربط الحمض النووي (DB) ومجال تنشيط النسخ (AD) ، على التوالي. يرتبط بروتين الاندماج DB-X بتسلسل التعرف على مجال DB ؛ لذلك ، عندما يتفاعل البروتينان X و Y ، يقترب بروتين الاندماج AD-Y من تسلسل التعرف. وبالتالي ، يتم تنشيط نسخ جين المراسل في اتجاه مجرى تسلسل التعرف. لذلك ، يمكن استخدام وجود أو عدم وجود نشاط جيني مراسل لتحديد وجود أو عدم وجود تفاعل البروتينوالبروتين 1.

بمجرد تحديد شريك تفاعل معين للبروتين محل الاهتمام ، يجب إجراء مزيد من التحليلات لتوضيح الوظيفة البيولوجية للتفاعل. لهذا الغرض ، إذا كان من الممكن عزل طفرات البروتينات التي تضعف أو تزيل التفاعل المحدد بين البروتين والبروتين ، فستكون بمثابة أدوات قوية. يمكن استخدام نظام Y2H مباشرة لعزل هذه الطفرات عن طريق فحص المستنسخة "السلبية التفاعل" ، بدءا من استنساخ "التفاعل الإيجابي" من النوع البري. لتسريع هذه العملية ، تم تطوير أنظمة Y2H (rY2H) "العكسية" 2,3. في أنظمة rY2H ، تحتوي سلالات الخميرة المضيفة على جينات علامة قابلة للاختيار كجينات مراسلة ، مما يعني أن خلايا الخميرة تنمو فقط عندما لا تتفاعل بروتينات AD-Y و DB-X.

على الرغم من أن كلا من نظامي Y2H و rY2H يسمحان بعزل الطفرات السلبية التفاعل ، إلا أن عملية عزل الطفرات شاقة لأنه ليس كل المرشحين الذين تم الحصول عليهم عن طريق الفحص يحملون النوع المطلوب من الطفرات (عادة طفرات خاطئة). القضية الأكثر خطورة هي أن جزءا كبيرا من المرشحين لديهم طفرات أو طفرات هراء ، ومن الضروري إجراء النشاف الغربي لاستبعاد المستنسخة غير المرغوب فيها. للتغلب على هذه المشكلة ، تم تطوير ناقلات البلازميد الجديدة4. في هذه المتجهات ، يتم وضع KanMX ، وهي علامة مقاومة للأدوية ، خارج الإطار في اتجاه مجرى مجرى مجال DB أو AD. يصبح جين العلامة في الإطار مع مجال DB أو AD فقط عند إدخال الجين محل الاهتمام. عندما يتم إدخال طفرة (طفرات) عشوائية في الجين محل الاهتمام ، يمكن بسهولة القضاء على الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات إطارية أو طفرات هراء ، عن طريق إجراء اختيار مقاومة الأدوية ، ويمكن بسهولة تحديد المرشحين الذين يحملون طفرات خاطئة مرغوبة باستخدام شاشة Y2H4. تقدم هذه المقالة بروتوكولا لعزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة لبروتين مهم باستخدام هذه الإستراتيجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء مكتبة المسخ

  1. قم بإعداد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (يظهر مثال أدناه). بشكل عام ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من التفاعل ، والذي ينقسم إلى عشرة حصص من 5 ميكرولتر ، وتضخيم جزء الجين المستهدف في جهاز PCR4.
    ملاحظة: يجب على المستخدمين اختيار بوليميراز مناسب لإدخال الطفرات بكفاءة. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه قصيرا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز بمعدل خطأ أعلى ، مثل Taq polymerase ، الذي يفتقر إلى نشاط التدقيق اللغوي. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه طويلا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز أعلى دقة لتقليل عدد الطفرات. تحدث الطفرات كل بضع مئات من أزواج القواعد بعد 30 دورة من التضخيم باستخدام Taq polymerase4 العادي. في النتائج التمثيلية ، تم استخدام بوليميراز Taq مختلف (انظر جدول المواد) ، والذي يتمتع بدقة أعلى من Taq polymerase العادي ، وكان معدل الطفرة واحدا في 600 زوج من القواعد. يتم توفير مثال على مخاليط تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاصيل التمهيدي وظروف التفاعل في الملف التكميلي 1.
  2. عند اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بدمج جميع حصص التفاعل ، وتأكد من تضخيم شظايا الحمض النووي ذات الأهمية باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وما إلى ذلك ، وتنقية الحمض النووي5.
  3. قم بتجميع جزء الحمض النووي الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.2 باستخدام متجه Y2H المناسب باستخدام استراتيجية استنساخ "سلسة" (الشكل 1).
    ملاحظة: يقلل نظام الاستنساخ السلس ، مثل Gibson Assembly6 ، من تلوث مكتبة الطافرة المبنية بواسطة ناقلات فارغة ناتجة عن الربط الذاتي. وترد في الجدول 1 قائمة بمتجهات Y2H. يمكن تحضيرها عن طريق هضم BamHI قبل التجميع. جميع البلازميدات متوفرة من المشروع الوطني للموارد الحيوية - الخميرة (انظر جدول المواد).
  4. أدخل خليط التفاعل المتولد في الخطوة 1.3 في الخلايا المختصة بالإشريكية القولونية المحضرة وفقا لبروتوكول تحويل الإشريكية القولونية عالي الكفاءة (على سبيل المثال ، Inoue et al.7). انشر جميع الخلايا المختصة على عدة ألواح LB (1٪ تريبتون ، 0.5٪ مستخلص خميرة ، 1٪ كلوريد الصوديوم ، و 2٪ أجار) تحتوي على مضادات حيوية مناسبة (انظر جدول المواد). في هذه المرحلة ، انشر كمية صغيرة (~ 1/100 من إجمالي التفاعل) على نفس لوحة الاختيار لحساب عيار المكتبة. احتضان الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. بمجرد ظهور عدد كبير من مستعمرات الإشريكية القولونية ، كشط جميع الخلايا من سطح اللوحة باستخدام حلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها. استعادة الحمض النووي البلازميد من هذه الخلايا باستخدام الطرق الشائعة ، مثل التحلل القلوي8. في الوقت نفسه ، احسب عدد المستعمرات التي تظهر بعد نشر حصص صغيرة من خليط التحول على اللوحة. باستخدام هذا الرقم ، قم بتقدير العدد الإجمالي للنسخ المستقلة في المكتبة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، التقط بعض المستعمرات المستقلة (4-6) التي تظهر على اللوحة التي انتشرت عليها الحصص الصغيرة لتفاعل التحول ، وقم بزراعتها بشكل منفصل ، وعزل البلازميدات عنها للتأكد من أن جميع المستنسخة تقريبا تحمل شظايا الحمض النووي المطلوبة5. تتوفر العديد من المجموعات التجارية لعزل البلازميدات من الإشريكية القولونية. يمكن حساب عدد المستعمرات التي تظهر على اللوحة بعد نشر القسمات الصغيرة يدويا.
  6. قياس تركيز تجمع الحمض النووي للمكتبة. عادة ما تكون بضع مئات من النانوجرامات من الحمض النووي للمكتبة كافية للحصول على عدة آلاف من المحولات في الخطوة التالية.
    ملاحظة: يوصى بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية ترتبط بالحمض النووي لأن قياس A260 غالبا ما يكون غير دقيق.

2. تحويل الخميرة مع مكتبة متحولة وطلاء طبق الأصل

  1. أدخل المكتبة الطافرة في سلالة الخميرة المضيفة (TAT-7 (L40-ura3) 9,10 MATa ، leu2-3,112 ، trp1-901 ، his3-Δ200 ، ade2-101 ، gal80Δ ، LYS2: (lexAop) 4-HIS3 ، ura3: (lexAop) 8-lacZ) لمقايسة Y2H باستخدام حوالي 100 نانوغرام من الحمض النووي. قم بتحويل الخلايا المضيفة مسبقا باستخدام بلازميد "الطعم".
    1. بعد إجراء التحويل ، قم بتعليق خلايا الخميرة في ماء معقم ونشر حصص بكميات مختلفة على الألواح المناسبة (عادة ما يكون وسط SC يفتقر إلى الليوسين والتريبتوفان: SC-LW [0.67٪ قاعدة نيتروجين الخميرة ، 2٪ جلوكوز ، 1.546 جم / لتر SC مزيج مزدوج التسرب -Leu -Trp ، و 2٪ أجار ، انظر جدول المواد]). احتضان هذه الأطباق طوال الليل على حرارة 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: البروتوكول القياسي ، مثل طريقة أسيتات الليثيوم - PEG11 مع ~ 5 × 106 خلايا تنمو لوغاريتميا ، كافية لتحويل الخميرة. يمكن أيضا استخدام طريقة أخرى ذات كفاءة تحويل عالية ، مثل التثقيب الكهربائي.
  2. في اليوم التالي ، عندما تظهر مستعمرات صغيرة ، حدد اللوحات التي تحتوي على عدد مناسب من الخلايا (500-2000) وقم بعمل نسخ متماثلة منها على النحو التالي.
  3. ضع ورقتين من ورق الترشيح على كتلة طبق الأصل لعمل عدة نسخ متماثلة (الوسيط هو SC-LW و SC-LW المحتويان على كاناميسين) (انظر جدول المواد). احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.
    ملاحظة: تركيز الكانامايسين (G418) هو 600 ميكروغرام / مل. لا تستخدم المخمل لطلاء النسخ المتماثلة لأن دقة المستعمرات ستفقد.
  4. بمجرد نمو المستعمرات ، قارن بين الأطباق واختر المرشحين. قم بإجراء اختبار ألوان Y2H (انظر الخطوة 3) إذا تم استخدام lacZ كمراسل.
    ملاحظة: بالنسبة لمراسل Y2H ، عادة ما يكون lacZ أفضل في اكتشاف تفاعل ضعيف من HIS3.

3. مقايسة اللون Y2H

  1. ضع ورقة من ورق الترشيح مقطوعة مسبقا إلى الحجم المناسب على اللوحة المتماثلة المعدة باستخدام الخطوة 2. احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين ورق الترشيح واللوحة.
    ملاحظة: استخدم ورق الترشيح رقم 4A أو ورق الترشيح من الدرجة 50 (انظر جدول المواد). يمكن استخدام أي SC-LW أو SC-LW تحتوي على ألواح كاناميسين ، والتي يتم تصنيعها عن طريق الطلاء المتماثل ، لفحص اللون.
  2. عندما يتم ترطيب ورق الترشيح الموجود على اللوحة تماما (عندما يتغير لون ورق الترشيح تماما) ، ضع عدة أوراق من المنشفة الورقية في الأعلى واجعلها تتلامس مع ورق الترشيح لإزالة الرطوبة الزائدة. قم بإزالة المنشفة الورقية عندما تمتص الماء ويتغير لونها. كرر هذه العملية مرتين أو ثلاث مرات.
  3. التقط حواف ورق الترشيح بملاقط ، وقشره من اللوحة بسرعة ، واغمره في النيتروجين السائل ، وقم بتجميده. في حالة عدم توفر النيتروجين السائل ، ضع ورق الترشيح على صينية بلاستيكية بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى وضعه على الفور في الفريزر (-20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية) ليتجمد تماما.
  4. قم بإزالة ورق الترشيح المجمد وضعه ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على منشفة ورقية جافة لإذابة. بعد الذوبان مباشرة ، ضع ورق الترشيح ، بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، على ورق ترشيح آخر تم وضعه على صينية بلاستيكية أو حاوية قابلة للغلق ومنقوع بمخزن Z (60 mMNa 2HPO4 ، 40 mM NaH2PO4 ، 10 mM KCl ، و 1 mM MgSO4 ، pH 7.0) يحتوي على X-gal (5-برومو-5-كلورو-3-إندوليل-β-D-galactoside) و 2-ميركابتوإيثانول9 (انظر جدول المواد). احرص على عدم السماح بتكوين فقاعات هواء بين أوراق الترشيح العلوية والسفلية.
  5. قم بتغطية الدرج البلاستيكي الذي يحتوي على ورق الترشيح وضعه في حاوية محكمة الإغلاق أو كيس بلاستيكي. أغلق الحاوية محكمة الإغلاق أو الكيس البلاستيكي واحتضنها عند 37 درجة مئوية حتى يظهر اللون الأزرق.
  6. عندما يظهر لون أزرق ، ضع ورق الترشيح مع وضع جانب المستعمرة لأعلى على حوالي 500 ميكرولتر من محلول التوقف (1 M Na2CO3) موضوعا على صينية بلاستيكية نظيفة. توقف عن نقع المحلول بسرعة ؛ لذلك ، قم بإزالة الفلتر على الفور ، وضعه على منشفة ورقية جديدة بحيث يكون جانب المستعمرة لأعلى ، واتركه حتى يجف.
  7. بعد استبدال المنشفة الورقية وجفاف الفلتر بدرجة كافية، استخدم ماسحا ضوئيا أو جهازا آخر لالتقاط البيانات.

4. استعادة وتأكيد المستنسخة المرشحة

  1. حدد النسخ المستنسخة البيضاء و KanR المرشحة من اللوحة الأصلية للنسخة المتماثلة (أو اللوحة المنسوخة غير المستخدمة لمقايسة اللون). الأمثلة موضحة في الشكل 1C. تأكد من أن المستنسخة المرشحة بيضاء و KanR عن طريق إعادة تخطيطها كرقعة صغيرة على وسط SC-LW يحتوي على كاناميسين واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. اصنع مجموعتين على الأقل أو قم بعمل نسخ متماثلة في اليوم التالي.
    ملاحظة: يجب اختيار المستعمرات البيضاء لأن المستعمرات الزرقاء الباهتة قد تحتفظ بالتفاعل.
  2. بمجرد إعادة نمو المستنسخة المرشحة جيدا ، كرر مقايسة اللون مع إنشاء لوحة واحدة على الأقل في الخطوة 4.1 كما هو موضح في الخطوة 3 وتأكد من أنها تظل بيضاء ولا تتحول إلى اللون الأزرق (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: عند إعادة خطوط المرشحين ، لا تحمل كميات كبيرة من الخلايا. الكثير من الخلايا تجعل من المستحيل التمييز بين استنساخ KanR و KanS .
  3. خذ المستنسخة التي لا تزال بيضاء و KanR المتولدة في الخطوة 4.2 من بقايا اللوحة وقم بزراعتها بشكل مستقل في 1 مل من وسط الاختيار (SC-L أو SC-W ، اعتمادا على المتجه المستخدم في بناء المكتبة) طوال الليل عند 30 درجة مئوية.
  4. نقل الثقافة إلى microtube وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (~ 15000 × غرام ، لمدة 10-30 ثانية في درجة حرارة الغرفة). عزل الحمض النووي كله من بيليه الخلية على النحو التالي.
  5. قم بتعليق حبيبات الخلية في 400 ميكرولتر من محلول التحلل (2٪ Triton X-100 ، 1٪ SDS ، 100 mM NaCl ، 10 mM Tris-Cl (8.0) ، و 1 mM EDTA) تحتوي على 1 ميكرولتر لكل من 2-mercaptoethanol و 20 mg / mL Zymolyase 100T (انظر جدول المواد) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم جدران الخلايا. في هذا الوقت ، تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب كل 5-10 دقائق.
  6. عندما يصبح تعليق الخلية معتما أو شفافا ، أضف حجما متساويا من خليط من كحول الفينول والكلوروفورم والأيزوميل (25:24:1) واخلطه جيدا عن طريق الدوامة بسرعة معتدلة لمدة 10-20 ثانية.
  7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب الدقيقة في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) واستعادة المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي في أنبوب دقيق جديد. أضف 0.8 حجم الأيزوبروبانول واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب.
  8. اترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق ثم استخدم جهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 4-5 دقائق بأقصى سرعة (~ 15000 × جم ، في درجة حرارة الغرفة) لترسيب الحمض النووي.
  9. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الراسب بحوالي 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. إزالة الإيثانول تماما وتجفيف راسب لفترة وجيزة.
  10. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-Cl (8.0) و 1 mM EDTA) إلى الراسب ، واخلطه لفترة وجيزة ، واترك الأنبوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإذابة الراسب.
    ملاحظة: إذا كان المستخدمون في عجلة من أمرهم ، فاحتفظ بالأنابيب عند 37-50 درجة مئوية. يذوب راسب الحمض النووي (DNA) في غضون ساعات قليلة.
  11. بمجرد إذابة الحبيبات تماما ، قم بتحويل الإشريكية القولونية بكمية صغيرة من محلول الحمض النووي هذا.
    ملاحظة: حوالي 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي كافية إذا تم استخدام الإشريكية القولونية ذات كفاءة التحويل العالية.
  12. عندما تظهر مستعمرات الإشريكية القولونية ، اختر العديد من المستعمرات المستقلة ، واستزرعها ، واستعد البلازميدات بالطرق القياسية ، مثل التحلل القلوي.
  13. أدخل الحمض النووي البلازميد الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.12 في الخلايا المضيفة Y2H التي تؤوي بلازميد الطعم. عندما تظهر المحولات ، تحقق منها من خلال فحص اللون (يجب أن تظهر بيضاء) والنشاف الغربي4 (يجب أن تعبر عن بروتين بالحجم المطلوب).
    ملاحظة: طريقة ما بعد القلوية12 هي طريقة سهلة وسريعة لتحضير مستخلص خلية كاملة من الخميرة.
  14. إذا تم استيفاء المعيارين المذكورين أعلاه ، فحدد موقع طفرة المستنسخة عن طريق تسلسل النوكليوتيدات4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الآونة الأخيرة ، وجد أن النصف الطرفي C من بروتين Pol2 (Pol2-C) يتفاعل مع Mcm10. كلا البروتينين ضروريان لبدء تكرار الحمض النووي ، وبالتالي لنمو الخلايا في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae13،14،15. للمساعدة في فهم الأهمية البيولوجية لهذا التفاعل ، تم عزل طفرات Pol2-C التي ليس لها تفاعل / متناقص مع Mcm10 باستخدام الطريقة الموضحة هنا.

تم إنشاء مكتبة طفرات باتباع الطريقة الموضحة في الخط...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة كيفية عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة باستخدام مقايسة Y2H. هذه المسوخ هي أدوات قوية لتحليل وظيفة البروتين محل الاهتمام. لعزل هذه الطفرات ، تم تطوير فحوصات rY2H سابقا عن طريق تعديل سلالة مضيف Y2H 2,3. ومع ذلك ، فإنها لم تقلل بشكل كبير من كمية العمل. على النقيض من ذلك ، يمكن عزل الطفرات بهذه الطريقة دون قدر كبير من العمل. في هذه الطريقة ، يضمن تعديل متجهات Y2H أن جميع المرشحين هم طفرات من النوع البري أو غير المنطقي ، من الناحية النظرية. بالإضاف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قام Y. Tanaka بإجراء التحسين التقني ل Y2H. يتم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 ومعهد التخمير ، أوساكا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10٪ SDS SolutionFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoethanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-بروبانولكيشيدا الكيميائية المحدودة110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
أجارفورميديومAGR60
أمبيسلين الصوديومفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كورب.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT   الطبية و شركة المختبرات البيولوجية المحدودةM180-7
الحمض النووي من خصيتين السلمونMerck KGaA.D1626
الإيثانولMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
ورق ترشيح لرفع المستعمرة (الصف 50)Whatman، Cytiva1450-090
ورق ترشيح لرفع المستعمرة (رقم 4A)Advantec Toyo Kaisha، Ltd.01411090
ورق ترشيح للنسخ المتماثل (رقم 1)Advantec Toyo Kaisha ، Ltd.00011150
G-418 كبريتاتفوجي فيلم واكو شركة بيور كيميكال كورب.075-05962
حمض الهيدروكلوريككيشيدا الكيميائية المحدودة230-37585
KClفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كورب.163-03545
ليثيوم أسيتات ثنائي هيدراتناكالاي تيسك20604-22
MgSO4 & 7H2Oفوجي فيلم واكو شركة بيور كيميكال كورب.131-00405
Na2HPO4• 12H2Oشركة Nacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4• 2H2Oشركة Nacalai Tesque Inc.31717-25
منشفة ورقيةAS ONE Corp.7-6200-02
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل 25: 24: 1شركة Nacalai Tesque Inc.25970-56
الحمض النووي للبلازميدالمشروع الوطني للموارد الحيوية - الخميرة (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
مجموعة عزل البلازميدNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
البولي إيثيلين جلايكول # 4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC مزيج التسرب المزدوج -Leu -TrpFormediumDSCK172
مجموعة الاستنساخ غير الملحومة (تجميع In-Fusion)Takara Bio Inc.# 639648
مسحوق الحليب الخالي من الدسمفوجي فيلم واكو بيور كيماويكال كورب.190-12865
كبريتات الستربتومايسينفوجي فيلم واكو بيور كيميكال كورب.3810-74-0
تاك بوليميراز (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانفورميدTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
شركة تريبتونثيرموفيشر العلمية211705
توين 20شركة Nacalai Tesque Inc.35624-15
مستخلص الخميرةThermoFisher العلمية Inc.212750
قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55
شركة شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions. Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).
  3. Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).
  4. Tanaka, S. An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique. Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).
  5. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  8. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  9. Bartel, P. L., Fields, S. Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system. Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).
  10. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  11. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  12. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  13. Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation. EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).
  14. Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins. Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).
  15. Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer. EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Yeast Two HybridProtein Protein InteractionInteraction Null MutantsMutant ScreeningMutation LibrarySeamless CloningPolymerase Chain ReactionCell Cycle RegulationCyclin Dependent KinasesDNA Replication

مقالات ذات صلة