ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

Isabella Cattani-Cavalieri; Jordyn Margolis; Camelia Anicolaesei; Francisco J. Nuñez; Rennolds S. Ostrom

doi:10.3791/66451

Method Article

ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

DOI:

10.3791/66451

⸱

March 22nd, 2024

Isabella Cattani-Cavalieri¹ , Jordyn Margolis¹ , Camelia Anicolaesei¹ , Francisco J. Nuñez¹ , Rennolds S. Ostrom¹

¹Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Chapman University School of Pharmacy

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول المقدم في هذه الدراسة فعالية كاشف الفرق cAMP في الموقع في قياس cAMP من خلال طريقتين. تستخدم إحدى الطرق مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا مع خلايا HEK-293. توضح الطريقة الأخرى خلايا HASM الفردية تحت مجهر الفلورسنت.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كاشف الفرق cAMP في الموقع (cADDis) هو مستشعر حيوي جديد يسمح بالقياس المستمر لمستويات cAMP في الخلايا الحية. يتم إنشاء المستشعر الحيوي من بروتين فلوري دائري مرتبط بمنطقة المفصلات في Epac2. يؤدي هذا إلى إنشاء مستشعر حيوي فلوروفور واحد يعرض إما زيادة أو نقصان التألق عند ربط cAMP. يوجد المستشعر الحيوي في إصدارات تصاعدية حمراء وخضراء ، بالإضافة إلى إصدارات خضراء هابطة ، والعديد من الإصدارات الحمراء والخضراء التي تستهدف المواقع دون الخلوية. لتوضيح فعالية المستشعر الحيوي ، تم استخدام النسخة الخضراء الهابطة ، والتي تتناقص في التألق عند ربط cAMP. تم عرض بروتوكولين يستخدمان هذا المستشعر: أحدهما يستخدم مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح ذات 96 بئرا المتوافق مع الفحص عالي الإنتاجية والآخر يستخدم التصوير أحادي الخلية على مجهر الفلورسنت. على قارئ اللوحة ، تم تحفيز خلايا HEK-293 المزروعة في 96 لوحة جيدة باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول ، مما أدى إلى انخفاض سريع وكبير في التألق في النسخة الخضراء الهابطة. تم استخدام المستشعر الحيوي لقياس مستويات cAMP في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري (HASM) التي تتم مراقبتها تحت مجهر الفلورسنت. أظهر المستشعر الحيوي الأخضر الهابط استجابات مماثلة لمجموعات الخلايا عند تحفيزه باستخدام فورسكولين أو إيزوبروتيرينول. يسمح هذا الفحص أحادي الخلية بتصور موقع المستشعر الحيوي بتكبير 20x و 40x. وبالتالي ، فإن هذا المستشعر الحيوي cAMP حساس ومرن ، مما يسمح بقياس cAMP في الوقت الفعلي في كل من الخلايا الخالدة والأولية ، ومع الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا. هذه السمات تجعل cADDis أداة قيمة لدراسة ديناميكيات إشارات cAMP في الخلايا الحية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأدينوزين 3 ′ ، 5 ′ أحادي الفوسفات الدوري ، cAMP ، يلعب دورا مركزيا في الاتصالات الخلوية وتنسيق العمليات الفسيولوجية المختلفة. يعمل cAMP كرسول ثان ، ينقل الإشارات الخارجية من الهرمونات أو الناقلات العصبية أو الجزيئات الأخرى خارج الخلية لبدء سلسلة من الأحداث داخل الخلايا¹. علاوة على ذلك ، يشارك cAMP بشكل معقد في مسارات الإشارات المختلفة ، بما في ذلك تلك المرتبطة بمستقبلات البروتين G (GPCRs) وسيكلاز الأدينيل. يعد فهم دور cAMP في الإشارات الخلوية أمرا أساسيا لكشف الآليات المعقدة التي تكمن وراء الوظائف الخلوية الطبيعية وتطوير العلاجات المحتملة لمجموعة واسعة من الحالات الطبية².

في الماضي ، تم استخدام طرق مختلفة لقياس cAMP بشكل مباشر أو غير مباشر. وشمل ذلك وضع العلامات الإشعاعية لتجمعات ATP الخلوية متبوعة بتنقية العمود ، HPLC ، المقايسات المناعية الإشعاعية ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم ^1,2. هذه المقايسات القديمة محدودة بحقيقة أنها مقاييس نقطة النهاية ، وتتطلب عددا كبيرا من العينات لبناء استجابات تعتمد على الوقت. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مستشعرات نقل الطاقة بالرنين الفلوري (FRET) لإنشاء مقايسات في الخلايا الحية ، وإنتاج بيانات ديناميكية في الوقت الفعلي والسماح باستهداف أجهزة الاستشعار في مواقع تحت خلوية مختلفة³. تستفيد FRET من اثنين من الفلوروفورات ، ومانح فلوري واحد ، ومستقبل فلوري واحد عندما يكون على مقربة ، فإن الفلوروفور المتقبل سيكون متحمسا لناتج الفلورسنت المانح. الفلوروفوران الأكثر استخداما هما بروتين الفلورسنت السماوي (CFP) والبروتين الفلوري الأصفر (YFP) نظرا لأن لهما خصائص إثارة وانبعاث متوافقة. بالإضافة إلى CFP و YFP ، يشيع استخدام البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) لأجهزة الاستشعار الحيوية FRET. تعمل المستشعرات الحيوية cAMP FRET من خلال وجود متبرع ومتقبل على طرفي نقيض من بروتين ربط Epac2 cAMP. يغير ربط cAMP تأكيد Epac ويزيد المسافة بين الفلوروفورات المانحة والمستقبلة ^3,4. يتم الكشف عن هذا التغيير المطابق عن طريق فقدان FRET ، أي إثارة الفلوروفور المستقبلة بواسطة الطاقة المنقولة من قطرات الفلوروفور المانحة³. في حين أنها عملية تبدو بسيطة ، إلا أن هناك وفرة من القيود والمشكلات المتعلقة بالمستشعر الحيوي FRET لأبحاث cAMP⁵. أحدها هو اختيار البروتينات الفلورية ، على سبيل المثال ، GFP ، والتي يمكن أن تخفي بشكل طبيعي ، وبالتالي تقليل الحساسية⁶. تم استهداف أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP القائمة على FRET إلى مجالات دقيقة^{محددة 7} ، ولكن قد تكون هناك قيود بسبب الحجم الكبير للبناء مع اثنين من الفلوروفورات⁶. وثمة مسألة هامة أخرى تتمثل في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإشارات FRET الناتجة عن التداخل بين إثارة وانبعاث الفلوروفور ، مما يؤدي إلى ارتفاع وتيرة أخذ العينات وتعقيد تحليل النتائج ^4,5.

في الآونة الأخيرة ، قام المستشعر الحيوي الجديد (كاشف فرق cAMP في الموقع) ، cADDis بحل هذه القيود وغيرها عندما يتعلق الأمر بدراسة تنظيم إشارات cAMP⁸. أحد التحسينات المهمة هو الاعتماد على فلوروفور واحد. وهذا يسمح بإشارة سريعة وفعالة مع نطاق ديناميكي أوسع ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. نتيجة لذلك ، يمكن أن يكون هناك المزيد من الدقة نظرا لوجود نطاق أقل اتساعا من الأطوال الموجية للتمشيط من^{خلال 8}. مثل مجسات FRET ، تم استهداف المستشعر الحيوي للمواقع تحت الخلوية ، مما يسمح بالبحث في نظرية التقسيم والاستكشاف في الطوافات الدهنية وغير الطوافات ، وغيرها من المجالات تحت الخلوية⁹. ولعل الأهم من ذلك هو مدى ملاءمة جهاز استشعار حيوي فلوروفور واحد للفحص عالي الإنتاجية ، مما أدى إلى تحسين الحساسية والتكاثر على أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET. يتم تعبئة المستشعر الحيوي في ناقل BacMam لسهولة نقل مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتحكم الدقيق في تعبير البروتين.

يمكن أن يكون التحكم في التعبير عبر ناقل BacMam مفيدا بشكل خاص في المقايسات باستخدام تقويم GPCR من أنواع مختلفة لتسهيل تفسير البيانات من الدراسات على. علاوة على ذلك ، فإن التحكم في تعبير المستقبلات أمر بالغ الأهمية لقياس الدرجات المختلفة لفعالية الدواء (على سبيل المثال ، الناهضات العكسية والناهضات الجزئية) ، والمستويات المنخفضة من تعبير المستقبلات مفيدة لتقليد المستويات المنخفضة الموجودة في الأنسجة الحيوانية. BacMam هو ناقل للفيروس البقعي تم تعديله لتحويل خلايا الثدييات مثل مزارع الخلايا الأولية وخطوط HEK-293¹⁰. تسمح العلامات المهيمنة القابلة للاختيار ل BacMam بتوفير مزيد من الاستقرار مقارنة بعدوى البلازميد التقليدية¹¹. تسمح هذه المروجين الانتقائيين بتوصيل الجينات والتعبير عنها بشكل أكثر كفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إضافة الترايكوستاتين A (مثبط هيستون ديسيتيلاز) يعزز مستويات البروتين المراسل¹¹. يمكن التحكم في مستويات التعبير عن طريق عيار فيروس BacMam المستخدم ويجب تحسينه لكل نوع خلية. في حالة هذا المستشعر الحيوي ، يرتبط بروتين الفلورسنت الأحمر أو الأخضر ب Epac في N- و C-termini. عندما يرتبط cAMP ، يؤدي التغيير المطابق في المستشعر الحيوي إلى تحريك الأحماض الأمينية المجاورة للبروتين الفلوري. مثل هذا التحول ينقل الامتصاص من الحالة الأنيونية إلى الحالة المحايدة عند 400 نانومتر ، وبالتالي يقلل من التألق.

هناك 90-120 GPCRs يتم التعبير عنها في خلية واحدة تستجيب لمجموعة واسعة من الإشارات العصبية^{العضلية 12}. لذلك ، يمكن افتراض أن ما لا يقل عن عدة عشرات من GPCRs لكل خلية يمكن أن تحفز أو تمنع cAMP من خلال اقتران Gs أو Gi ، على التوالي. بينما كان هناك تقدم في مراقبة هذا الرسول الثاني في الوقت الفعلي ، مثل FRET ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة. يتم عرض منهجية مراقبة توليف وتدهور إشارات cAMP باستخدام cADDis في الوقت الفعلي هنا. يمكن مراقبة التغير في التألق في الوقت الفعلي باستخدام قارئ لوحة مضان للمقايسات عالية الإنتاجية أو باستخدام مجهر الفلورسنت لفحوصات الخلية الواحدة. هذه الطرق مفيدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بإشارات GPCR عبر cAMP.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة عالي الإنتاجية

بذر خلايا HEK-293 باستخدام ناقل cADDis BacMam في صفيحة 96 بئرا (اليوم 1)
1. انقسام وإصابة الخلايا في غطاء فيروسي.
  1. وسائط HEK الدافئة (الجدول 1) و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. قم بتطهير الغطاء والمواد عن طريق مسحها بمناديل مبللة ب EtOH.
  3. قم بإزالة وسائط HEK وتجاهلها من القارورة باستخدام ماصة مصلية.
  4. أضف 5 مل من Mg²⁺ و Ca²⁺ خالية من DPBS (37 درجة مئوية) مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة ذهابا وإيابا لغسل الجزء السفلي باستخدام DPBS. إزالة وتجاهل DPBS مع ماصة مصلية.
  5. التربسين الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من التربسين-EDTA تحسنت 0.25 ٪ مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة للتأكد من أن الكاشف يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. ضع الغطاء على القارورة واترك الكاشف يجلس لمدة 3-5 دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن القارورة.
    ملاحظة: تم تحسين هذه التجربة لقارورة 75 سم² ؛ قد يلزم إجراء تعديلات على حجم الكواشف إذا تم استخدام جهاز استزراع مختلف الحجم.
  6. ارسم 5 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على مضادات حيوية. طرد ورسم حجم القارورة لغسل جدران القارورة وفصل الخلايا فعليا.
  7. اجمع الحجم الكلي للقارورة (8 مل) وأجهزة الطرد المركزي (25 درجة مئوية) في أنبوب سعة 15 مل عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، واحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
  9. لغسل الخلايا دون إزعاج الحبيبات ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS بدون Mg²⁺ و Ca²⁺ DPBS إلى جانب أنبوب 15 مل. بعد إضافة DPBS برفق ، قم بإزالة وتجاهل أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزعاج الحبيبات. كرر مرة أخرى.
  10. عد الخلايا واضبطها على كثافة خلية تبلغ 250000 خلية / خلية مل.
  11. اصنع مزيجا رئيسيا بناء على أحجام الكاشف المطلوبة لكل بئر من صفيحة 96 بئرا سوداء شفافة القاع. يشار إلى هذا باسم "صفيحة الأنسجة". انظر المجلدات أدناه:
    ملاحظة: مثال على بئر واحد (الحجم الإجمالي 200 ميكرولتر): 40 ميكرولتر من ناقل BacMam للمستشعر الحيوي (مخزون 2 × 10¹⁰ جينات فيروسية / مل) ، 2 ميكرولتر تريكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ؛ التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 158 ميكرولتر من 250000 خلية / مل كثافة الخلايا. مثال على 10 آبار (الحجم الإجمالي 2 مل): 400 ميكرولتر من ناقل BacMam الحيوي (مخزون 2 × 10¹⁰ جينات فيروسية / مل) ، 20 ميكرولتر من الترايكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر) ، وسائط 1,580 ميكرولتر مع كثافة خلية 250,000 خلية / مل.
  12. أضف 200 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في حاضنة لمدة 24 ساعة قبل تشغيلها على مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة.
يعمل على قارئ لوحة
1. على سطح الطاولة ، قم بإزالة جميع الوسائط بعناية في كل بئر واستبدلها ب 180 ميكرولتر من DPBS مع Mg²⁺ و Ca²⁺ عند 37 درجة مئوية.
2. افحص الخلايا على المجهر للتأكد من صحة الخلية.
3. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -1 ساعة.
4. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الأدوية للقراءة عند تخفيف 1:10 (وتسمى أيضا 10 أضعاف) للجرعة النهائية المطلوبة. وبالتالي ، إعداد 100 ميكرومتر فورسكولين و 100 نانومتر الأيزوبروتيرينول.
5. أضف 60 ميكرولتر من كل دواء بطريقة عمودية إلى صفيحة شفافة من 96 بئرا (يشار إليها باسم "لوحة الدواء").
  ملاحظة: مع التخفيف المناسب للدواء ولتحسين القراءة ، تتم إضافة الأدوية إلى لوحة 96 بئرا واضحة ، يشار إليها باسم "لوحة الدواء" ، ليتم نقلها في وقت القراءة إلى "لوحة الأنسجة" باستخدام 96-multi pipettor ، مما يسمح بإضافة الدواء إلى جميع الآبار في وقت واحد وقراءته بسرعة بواسطة مقياس الطيف الضوئي الفلوري.
إعداد قارئ لوحة مضان
1. اضبط إعدادات قارئ اللوحة الفلورية.
  1. وضع القراءة: مضان. نوع القراءة: حركي. قراءة الأطوال الموجية: 494 نانومتر و 522 نانومتر.
  2. وقت القراءة: أدخل 3 دقائق لقراءة الفلورسنت الأساسية و 7 دقائق لإضافة ما بعد الدواء ". الفاصل الزمني" ك 00:00:30 لمدة 30 ثانية بين كل قراءة.
    ملاحظة: يمكن تحسين وقت القراءة وزيادته بناء على الوقت المطلوب.
الحصول على البيانات
1. قم بإزالة لوحة الأنسجة من الحاضنة ، وقم بإزالة رقائق الألومنيوم وغطاء اللوحة ، وضع لوحة الأنسجة في قارئ اللوحة. أغلق درج القارئ للسماح للوحة المناديل بالراحة والتوازن مع درجة حرارة القارئ (37 درجة مئوية).
2. ضع الصفيحة الشفافة المكونة من 96 بئرا (لوحة الدواء) مع تخفيفات الدواء تحت ماصة 96 متعددة وتدرب على سحب 20 ميكرولتر من الآبار. تأكد من وجود كمية متساوية من الدواء المسحوب في أطراف الماصة.
3. بدء تشغيل قياس "خط الأساس".
  ملاحظة: 40 RFU أو أعلى تعتبر بيانات قابلة للتطبيق. إذا كانت البيانات أقل من هذه القيمة ، فيجب إيقاف التجربة وتجاهلها.
4. ستخرج لوحة الأنسجة من القارئ في نهاية تشغيل خط الأساس. أضف بسرعة وبعناية 20 ميكرولتر من لوحة الدواء الشفافة إلى لوحة الأنسجة السوداء. ثم ، ابدأ بسرعة تشغيل "العلاج". يجب ألا تكون لوحة الأنسجة خارج القارئ لأكثر من 30 ثانية بعد إضافة الأدوية.
  ملاحظة: إذا تمت إضافة الدواء بسرعة كبيرة ، تنفصل الخلايا عن لوحة الأنسجة ، مما يخلق تجربة غير صالحة للاستعمال. بالإضافة إلى ذلك ، تصاب الخلايا ببروتين فلوري أخضر حساس للضوء. وبالتالي ، فإن إضافة الأدوية بسرعة وسرعة وبدء القراءة الثانية أمر حتمي لتجنب تفويت الجزء المبكر من الاستجابة.
5. بمجرد اكتمال القراءة الثانية ، تأكد من إخراج لوحة الأنسجة من القارئ والانتهاء من جمع البيانات.
  ملاحظة: قبل التخلص من صفيحة الأنسجة ، من أفضل الممارسات التحقق من أن الخلايا لا تزال متصلة باللوحة. مراقبة الخلايا تحت المجهر. إذا انفصلت الخلايا ، تكون النتائج غير صالحة ويجب التخلص منها. سوف تحتاج إلى تكرار التجربة.
6. تصدير البيانات الناتجة كملف Excel.
7. افتح بيانات Excel القابلة للقراءة التي تم تصديرها من قارئ اللوحة وانسخ المعلومات ذات الصلة والصقها في قالب تحويل Excel. ستتحول البيانات من قارئ اللوحة الذي تم إعداده إلى بئر واحد ، وقراءات الأعمدة على يمين البيانات المنسوخة.
  ملاحظة: يتم سرد أعمدة التألق لبئر بمرور الوقت في RFUs (بعنوان تحويل العمود) وكتغيير عشري بالنسبة لقراءة RFU في القراءة الأولية (t₀ بعنوان Delta F). في قالب Excel، يتم تعيين جدول Delta F إلى آخر قراءة أساسية قبل إضافة الدواء. هذه هي نقطة^{جمع البيانات 6} .
8. بعد تحويل البيانات ، انسخ البيانات من Delta F والصقها في برنامج تحليل البيانات على شكل اضمحلال أو اضمحلال نسبي في التألق بمرور الوقت.
9. قم بتغيير عنوان X إلى "الوقت (الأوقات)" والعنوان Y إلى "ΔF / F₀" للقيم العشرية النسبية.

2. مقايسة أحادية الخلية باستخدام مجهر فلوري مقلوب

خلايا البذر (HASM) باستخدام ناقل cADDis BacMam في طبق 35 مم (اليوم 1)
1. انقسام وإصابة الخلايا في غطاء فيروسي.
  1. وسائط HASM الدافئة (الجدول 1) ، 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. قم بتطهير الغطاء والمواد وامسح الغطاء بمناديل مبللة ب EtOH.
  3. قم بإزالة وسائط HASM والتخلص منها من القارورة باستخدام ماصة مصلية.
  4. أضف 5 مل من Mg²⁺ و Ca²⁺ DPBS مجانا (37 درجة مئوية) مع ماصة مصلية جديدة وقم بإمالة القارورة لغسل القاع باستخدام DPBS.
  5. التربسين الخلايا عن طريق إضافة 3 مل من التربسين-EDTA تحسنت 0.25 ٪ مع ماصة مصلية. قم بإمالة القارورة للتأكد من أن الكاشف يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. دع الكاشف يجلس لمدة 3-5 دقائق للسماح للخلايا بالانفصال عن القارورة.
  6. ارسم 5 مل من الوسائط الطازجة التي تحتوي على مضادات حيوية واطرد الماصة لإزالة الخلايا من قاع القارورة.
  7. اجمع الحجم الكلي لجهاز الطرد المركزي القارورة (8 مل) في أنبوب طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية ، واحرص على عدم إزعاج الحبيبات.
  9. دون إزعاج الحبيبات ، أضف 500 ميكرولتر من DPBS بدون Mg²⁺ و Ca²⁺ DPBS إلى جانب أنبوب الطرد المركزي. قم بإزالة وتجاهل أكبر قدر ممكن من السوائل وكرر مرة أخرى.
    ملاحظة: تم تحسين هذه التجربة لقارورة 75 سم² ؛ قد يلزم إجراء تعديلات على حجم الكواشف إذا تم استخدام جهاز استزراع مختلف الحجم.
  10. عد الخلايا واضبطها على 40000 خلية / مل كثافة الخلايا.
  11. اصنع مزيجا رئيسيا بناء على حجم الكاشف المطلوب لكل بئر في طبق 35 مم. انظر المجلدات أدناه:
    ملاحظة: مثال على بئر واحد (الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر): 20 ميكرولتر من ناقل BacMam للمستشعر الحيوي (مخزون 2 × 10¹⁰ جينات فيروسية / مل) ، 5 ميكرولتر تريكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 500 ميكرولتر من 40000 خلية / مل كثافة الخلية. مثال ل 4 آبار (الحجم الكلي 2 مل): 80 ميكرولتر من ناقل BacMam الحيوي (مخزون الجينات الفيروسية / مل) ، 20 ميكرولتر من الترايكوستاتين A (مخزون 100 ميكرومتر ، التركيز النهائي 1 ميكرومتر) ، 2000 ميكرولتر وسائط 40000 خلية / مل كثافة الخلية.
  12. أضف 500 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة قبل متابعة التجربة.
    ملاحظة: قد يختلف رقم الخلية وفقا لخط الخلية. لتجنب تداخل الخلايا للتحليل، استخدم أرقام خلايا منخفضة.
تحضير العوامل الدوائية (اليوم 2)
1. قم بإزالة الوسائط بعناية في كل بئر واستبدلها ب 450 ميكرولتر من DPBS مع Mg²⁺ و Ca²⁺ عند 37 درجة مئوية.
2. لف اللوحة بورق الألمنيوم واحتضن القرص مقاس 35 مم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة -1 ساعة.
3. افحص الخلايا على المجهر للتأكد من صحة الخلية.
4. في غضون ذلك ، قم بإعداد الأدوية لقراءة وحدة سجل 1 فوق التركيز النهائي المطلوب (أكبر 10 أضعاف). وبالتالي ، إعداد 100 ميكرومتر فورسكولين و 100 نانومتر الأيزوبروتيرينول.
5. بالنسبة لعيار جرعة السجل ، قم بإعداد الدواء عند 10 mM واستخدم التخفيفات التسلسلية لتحقيق 100 ميكرومتر من فورسكولين و 100 نانومتر من الأيزوبروتيرينول.
الحصول على البيانات
ملاحظة: الإعدادات التالية خاصة بالمجهر المقلوب الفلوري. يمكن أن يختلف البرنامج المصاحب لكل مجهر. يتم وصف الإعدادات العامة المستخدمة في البروتوكول الحالي هنا.
1. قم بتشغيل المحور المركزي ، ثم مجهر الفلورسنت المقلوب.
2. افتح البرنامج الذي سيتم استخدامه للالتقاط واختر خيار التقاط الفاصل الزمني .
3. ضع حامل عينة طبق 35 مم في مرحلة المجهر.
4. اضبط العدسة الموضوعية على x20.
5. استخدم التركيز البؤري التلقائي واحصل على صورة واضحة قدر الإمكان. إذا كان من الصعب العثور على خلايا فردية ، فابدأ بهدف 4x ، ثم انتقل إلى 20x. ركز العينة يدويا إذا كان المجهر يفتقر إلى ميزة التركيز البؤري التلقائي.
  ملاحظة: يمكن استخدام تكبير 40x إذا كانت هناك حاجة إلى تفاصيل مورفولوجية أكثر أهمية للخلية.
6. اضبط الإعدادات التالية للحصول على الحصول على البيانات الأمثل: السطوع التلقائي (التعرض) ، الطول الموجي للإثارة ، توازن اللون الأسود (لتقليل ضوضاء الخلفية) ، التركيز التلقائي.
7. بعد العثور على منطقة رؤية بها العديد من خلايا الفلورة السيتوبلازمية ، احصل على البيانات باستخدام التقاط الفاصل الزمني لمدة 20 دقيقة كل 30 ثانية.
8. انقر فوق Go لبدء القراءة.
9. اركض لمدة 3 دقائق لجمع خط الأساس. بمجرد أخذ التقاط 3 دقائق ، أضف بلطف 50 ميكرولتر من الدواء إلى البئر المناسب. عند إضافة الأدوية ، سيكون التركيز النهائي على الطبق 10 ميكرومتر فورسكولين و 10 نانومتر من الأيزوبروتيرينول.
  ملاحظة: يجب إضافة الدواء بعناية. لا تلمس اللوحة بطرف الماصة ، لأن هذا قد يحرك مجال الرؤية الذي تم إنشاؤه ويجعل العينة غير قابلة للتحليل.
10. اترك التجربة ليتم تشغيلها لمدة 17 دقيقة أخرى مع التقاط البيانات كل 30 ثانية.
11. بمجرد اكتمال الاختبار ، تأكد من أن البيانات جاهزة للتحليل.
  ملاحظة: على الرغم من أن البروتوكول الحالي لا يتضمن عنصر تحكم للانحراف البؤري ، فقد يكون من المفيد تضمين واحد في التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن يساعد استخدام الأصباغ النووية في إدارة الانجراف البؤري أثناء تحليل المجهر ، خاصة عند التقاط صور للخلايا الحية على مدى فترات طويلة. عادة ما يتم توزيع المستشعرات الحيوية cADDis على نطاق واسع داخل الخلية ، مما يجعل المستوى البؤري الواسع هو الالتقاط الأكثر فعالية ويقلل من الحاجة إلى التحكم في الانجراف البؤري⁹.
تحليل البيانات
ملاحظة: يمكن أن يختلف البرنامج المصاحب لكل مجهر ، لذلك يتم وصف الإعدادات العامة التي يجب استخدامها لتحليل الصور الملتقطة هنا.
1. افتح ملفات الصور التي تم التقاطها أثناء التجربة.
2. استخدم أداة المضلع أو الدائرة لتحديد منطقة اهتمام كل خلية لإجراء التحليل. يجب أن يعطي التحليل سطوع كل خلية في كل نقطة زمنية.
  ملاحظة: أفضل ممارسة هي تحديد خلايا فردية وليس الخلايا التي تلامس جدار الطبق أو الخلايا الأخرى. هذا يضمن أفضل جمع ممكن للبيانات. حدد ما لا يقل عن 5 خلايا للتحليل داخل كل شرط ، وقم بتكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
3. بعد تحليل البيانات ، افتح البيانات في ورقة Excel واحسب متوسط السطوع لكل حالة في كل صورة ، بدءا من الصورة قبل إضافة العوامل الدوائية أو السيارة. في هذا المثال ، عند علامة 3 دقائق^{أو الصورة السادسة} التي تم التقاطها على المجهر ، حيث يتم التقاط كل صورة كل 30 ثانية.
4. احسب ΔF / F₀لكل متوسط قيمة في كل حالة.
5. قم بالتحميل في برنامج التحليل الإحصائي وارسم ΔF / F₀مقابل الوقت في s.
  ملاحظة: يقدم الشكل 1 لمحة عامة تخطيطية عن الخطوات الرئيسية للبروتوكولات.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثبتت الدراسة الحالية صحة المستشعر الحيوي الخلوي في كل من قارئ الألواح ومقايسات المجهر. بمجرد أن تعبر الخلايا عن المستشعر الحيوي ، يتم تحفيزها إما باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين (منشط مباشر لأدينيل سيكلاز) ، أو 10 نانومتر إيزوبروتيرينول (ناهض عند ß₁AR و ß₂AR) ، أو مركبة (الشكل 1). تم التقاط التغييرات اللاحقة في التألق ، التي تدل على إنتاج cAMP ، كل 30 ثانية.

تم تحويل البيانات كتغير في التألق من التألق الأولي (ΔF / F₀). تم تطبيق نموذج اضمحلال موقع واحد على بيانات التألق لتحديد التغيرات الزمنية في مستويات cAMP عبر الظروف المختلفة (الشكل 2 والشكل 3). يمكن استخدام معلمات منحنيات الاضمحلال هذه لتحديد الاستجابة لتركيز معين من الدواء. تم استخدام حاصل ضرب معدل الاضمحلال (k) والهضبة كقيمة واحدة تحدد استجابة الدواء ، وتم استخدامها لإنشاء منحنيات استجابة التركيز عند تطبيق تركيزات متعددة من نفس الدواء¹³.

على قارئ اللوحة ، عند التحفيز باستخدام 10 ميكرومتر فورسكولين ، أظهر المستشعر الخلوي انخفاضا كبيرا في شدة التألق في غضون ثوان وتقدم على مدى عدة دقائق (من خط الأساس 0 ΔF / F_o عند 200 ثانية إلى -0.7 ΔF / F_o عند 600 ثانية) في خلايا HEK-293 (الشكل 2A). بالنظر إلى تصميم المستشعر الأخضر ، يشير الانخفاض في التألق إلى زيادة في إنتاج cAMP ، مما يشير إلى أن فورسكولين تسبب في زيادة موحدة في مستويات cAMP في العصارة الخلوية. أدى تحفيز خلايا HEK-293 بتركيز دون الحد الأقصى من الأيزوبروتيرينول (10 نانومتر) إلى انخفاضات سريعة ولكن أصغر في مضان المستشعر الحيوي (-0.3 ΔF / F_o عند 600 ثانية ، الشكل 2 أ). عندما تم فحص هذه التركيزات المنخفضة من الأيزوبروتيرينول (10 نانومتر و 100 نانومتر) في بئر واحد من الخلايا بمرور الوقت ، لوحظت تذبذبات مستويات cAMP في خلايا HEK-293 (الشكل 2B). كانت دورية هذه التذبذبات باستمرار حوالي 200 ثانية. يتضمن تحليل البيانات الروتيني ملاءمة الاستجابة لنموذج اضمحلال موقع واحد ، والذي يقوم بحساب متوسط هذه التذبذبات (انظر خط الاتصال). عادة ما أدى حساب متوسط التجارب المتعددة معا إلى حجب هذه التذبذبات في البيانات. ومع ذلك ، يعرض المستشعر الحيوي حساسية وحركية سريعة تسمح بمراقبة تذبذبات cAMP.

يمكن أيضا قياس cADDis باستخدام مجهر مضان. يسمح هذا النهج بمراقبة cAMP في خلايا مفردة ويمكن أيضا تكييفه لتصور أجهزة الاستشعار الحيوية التي تستهدف مواقع تحت خلوية مختلفة. في هذه الدراسة ، تم استخدام المستشعر الحيوي في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولي (HASM). يؤدي تحفيز HASM بأي من المركبات ، أو 10 ميكرومتر فورسكولين ، أو 10 نانومتر من الأيزوبروتيرينول إلى انخفاض ملحوظ في شدة التألق بمرور الوقت (من خط الأساس 0 ΔF / F_o عند 120 ثانية إلى -0.9 ΔF / F_o عند 410 ثانية) (الشكل 3) (الفيديو 1 والفيديو 2 والفيديو 3). يتم توزيع التألق بالتساوي في جميع أنحاء السيتوسول للخلايا ويستبعد النواة (انظر مقاطع فيديو الفاصل الزمني). وهكذا ، أنتج فورسكولين وأيزوبروتيرينول انخفاضا سريعا وكبيرا مماثلا في خلايا HASM الفلورية. توضح هذه البيانات القدرة على استخدام المستشعر الحيوي في مزارع الخلايا الأولية.

figure-results-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لخطوات بروتوكول المستشعر الحيوي. في البداية ، يتم تقسيم خلايا المزرعة وإعادة تعليقها بوسائط جديدة ، ثم تصاب بفيروس BacMam الذي يحمل مستشعرات cADDis. يتم تحفيز خلايا ما بعد النقل بعوامل دوائية تحفز المسارات الخلوية التي تغير cAMP. يتم التقاط التغييرات في شدة التألق استجابة لتركيز cAMP المتغير باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقراءة الألواح (A) أو مجهر التألق (B) ، مما يوفر تقديرا كميا في الوقت الفعلي لديناميكيات cAMP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: المراقبة في الوقت الفعلي ل cAMP في خلايا HEK-293 الحية على مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة. تم قياس مضان خلايا HEK-293 على 96 لوحة بئر تعبر عن المستشعر الحيوي بمرور الوقت. بعد إنشاء مضان خط الأساس ، تم رصد اضمحلال التألق لمدة 7 دقائق. (أ) تم رسم اضمحلال التألق بعد إضافة إما 10 ميكرومتر فورسكولين أو 10 نانومتر من الأيزوبروتيرينول كمتوسط ± SEM من 10-15 تجربة. (ب) تظهر تذبذبات اضمحلال التألق برسم تجربة واحدة بعد إضافة 10 نانومتر أو 100 nM من الأيزوبروتيرينول. البيانات في كلا الرسمين البيانيين مناسبة لنموذج اضمحلال موقع واحد (خط اتصال). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: المراقبة في الوقت الحقيقي ل cAMP في خلايا HASM الحية على مجهر مضان. تم قياس مضان خلايا HASM على أطباق مطلية مقاس 35 مم تعبر عن المستشعر الحيوي بمرور الوقت. بعد تحديد قيم خط الأساس ، تم قياس اضمحلال التألق كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة. تمت إضافة العامل المشار إليه عند 120 ثانية (سهم). ينحني اضمحلال مضان المستشعر الحيوي استجابة لأي من المركبات ، 10 ميكرومتر فورسكولين ، أو 10 نانومتر أيزوبروتيرينول. يتم عرض البيانات من تجربة واحدة بخط اتصال. يتم تضمين مقاطع فيديو الفاصل الزمني للخلايا المعالجة بالمركبة (التحكم) أو فورسكولين أو الأيزوبروتيرينول لتوفير تمثيل مرئي للاستجابات الفلورية للمستشعر الحيوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: فيديو بفاصل زمني للمراقبة في الوقت الفعلي ل cAMP في خلايا HASM الحية استجابة للمركبة. منحنيات اضمحلال التألق للمستشعر الحيوي استجابة للمركبة (التحكم). تم التقاط كل إطار كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة. شريط الميزان: 40 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الفيديو 2: فيديو بفاصل زمني للمراقبة في الوقت الفعلي ل cAMP في خلايا HASM الحية استجابة ل 10 ميكرومتر فورسكولين. منحنيات اضمحلال التألق للمستشعر الحيوي استجابة ل 10 ميكرومتر فورسكولين. تم التقاط كل إطار كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة. شريط الميزان: 40 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 3: فيديو بفاصل زمني للمراقبة في الوقت الفعلي ل cAMP في خلايا HASM الحية استجابة لأيزوبروتيرينول 10 نانومتر. منحنيات اضمحلال الفلورة للمستشعر الحيوي استجابة لأيزوبروتيرينول 10 نانومتر. تم التقاط كل إطار كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة. شريط الميزان: 40 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

صياغة وسائل الإعلام
حسم المتوسطة
اسم	حجم
هام F-12K	419.65 مل
إف بي إس	50 مل
هيبس (1 متر)	12.5 مل
محلول هيدروكسيد الصوديوم	6 مل
إل-جلوتامين 200 مللي متر (100X)	5 مل
كلوريد الكالسيوم (1 م)	0.850 مل
مضاد حيوي مضاد حيوي (100X)	5 مل
بريموسين	1 مل
هيك المتوسطة
اسم	حجم
دميم (1x)	444 مل
إف بي إس	50 مل
مضاد حيوي مضاد حيوي (100X)	5 مل
بريموسين	1 مل

الجدول 1: الصياغة الإعلامية لوسط HASM ووسط HEK.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد القياس الدقيق والحساس ل cAMP أمرا بالغ الأهمية لفهم دوره في العمليات الخلوية المختلفة ولدراسة نشاط مسارات الإشارات المعتمدة على cAMP. هناك العديد من الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس مستويات cAMP ، بما في ذلك ELISA ، والمقايسة المناعية الإشعاعية ، وأجهزة الاستشعار الحيوية FRET ، ومقايسة GloSensor cAMP¹⁴^،¹⁵^،¹⁶^،¹⁷^،¹⁸. كل فحص cAMP له نقاط قوة وضعف. يسمح البروتوكول بالكشف والمراقبة في الوقت الفعلي ، بدءا من دقائق إلى ساعات ، وقياس ديناميكيات cAMP داخل الخلايا الحية دون الحاجة إلى تضمين مثبطات الفوسفوديستراز. هذه النقطة الأخيرة مهمة للباحثين المهتمين بدراسة دور أشكال نظائر الفوسفوديستراز في تنظيم إشارات cAMP¹⁹. يتوفر المستشعر الحيوي تجاريا (انظر جدول المواد) في إصدارات متعددة: فلوروفور أخضر يقلل من التألق عند ربط cAMP ، وفلوروفور أحمر يظهر زيادة مضان عند ربط cAMP ، وفلوروفور أخضر يظهر زيادة مضان عند ربط cAMP. تعد النسخة الهابطة من المستشعر الحيوي مفيدة للغاية نظرا لأن العامل المحدد الرئيسي هو مستوى التعبير عن المستشعر الحيوي ، وسيعرض هذا الإصدار أقصى مضان عند خط الأساس قبل بدء التجربة ، مما يخفف من الحاجة إلى تقييم تعبير المستشعر الحيوي عن طريق إضافة أقصى تحفيز cAMP. يتوفر المستشعر الحيوي أيضا في الإصدارات التي تستهدف المجالات الدقيقة الغشائية أو الأهداب الأولية أو النواة. تتيح هذه الإصدارات المختلفة قياسات cAMP في وقت واحد في المقصورات الخلوية والأغشية / الهدبية داخل نفس الخلية. هذه الأدوات الجديدة بارعة بشكل فريد في تصور وقياس ديناميكيات cAMP عبر المكونات الخلوية المختلفة ، وهو مجال سريع التطور ومهم للدراسة²⁰.

توفر المستشعرات الحيوية طريقة مباشرة لمراقبة ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي بشكل فعال ، مما يمكن الباحثين من مراقبة التغيرات السريعة في مستويات cAMP بدقة زمنية استثنائية. تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية للمستشعر الحيوي في حساسيته العالية ، والتي تسمح باكتشاف كل من الاختلافات الدقيقة والهامة في تركيزات cAMP⁸. ويلاحظ مثال على ذلك في تذبذبات cAMP عند مستويات منخفضة من تحفيز الأيزوبروتيرينول في خلايا HEK-293 مع عدم وجود مثبط فوسفوديستراز (الشكل 2B). هذا السلوك التذبذبي غير مفهوم ويبدو فريدا لهذه الخلايا ، لكن الحساسية والحركية السريعة للمستشعر الحيوي تمكن من اكتشافها. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن المستشعر الحيوي يمكن أن يكون مشبعا بسهولة ، لذلك يمكن أن يكون هذا المستشعر الحيوي محدودا في تحديد الاختلافات بين إشارات cAMP المتوسطة والكبيرة. هذه الميزة المحددة ذات أهمية خاصة عند استخدام مثبطات الفوسفوديستراز التي تسبب زيادات عالمية في مستويات cAMP عند وجود محفز مستقبلات أيضا. بينما نقدم عدوى HASM في هذه الدراسة ، من المهم الاعتراف بالتحدي المرتبط بإصابة الخلايا الأولية باستخدام ناقل BacMam. يجب تحسين الظروف لأنواع الخلايا الفردية من أجل تحقيق تعبير كاف عن المستشعر الحيوي. ومع ذلك ، فإن حساسية المستشعر الحيوي وقابليته للتطوير تجعله مناسبا تماما للمقايسات عالية الإنتاجية.

تحسين آخر لاستخدام هذا المستشعر الحيوي على أجهزة الاستشعار القائمة على FRET هو تقليل التبييض الضوئي. تخضع العديد من المستشعرات الحيوية الفلورية للتبييض الضوئي بعد الإثارة المطولة والمتكررة. تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا استثارات قصيرة المدة متباعدة بمقدار 30 ثانية. كما أن المستشعر الحيوي ساطع للغاية ، مما يحد من التبييض الضوئي المحتمل لهذا النوع من التحليل. وسيلاحظ التبييض الضوئي أثناء قراءة خط الأساس الأولي على أنه انجراف. إذا حدث انحراف خط الأساس ، يمكن للمرء أن يطرح خط الأساس المنحرف من البيانات قبل تركيب المنحنى أو زيادة فترة أخذ العينات لتقليل تكرار الإثارة.

مثل أجهزة الاستشعار الحيوية cAMP الأخرى ، يتمتع هذا المستشعر الحيوي بخصوصية عالية للربط ب cAMP. وبالتالي ، فإن الإشارات الناتجة عن هذا الفحص ترتبط ارتباطا مباشرا بمستويات cAMP ، مما يقلل بشكل كبير من التداخل المحتمل من المكونات الخلوية الأخرى ويوفر نتائج موثوقة. علاوة على ذلك ، فإن تعدد استخدامات المستشعر الحيوي يستحق تسليط الضوء عليه. بينما يستخدم اختبار GloSensor على نطاق واسع في هذا المجال ، إلا أنه يحتوي على قيود معينة. على سبيل المثال ، قد يؤدي الاعتماد على النقل العابر إلى عدم الكفاءة في أنواع معينة من الخلايا ، ويمثل تحليل المعلمات أو العمليات المتعددة داخل نفس الخلية تحديا. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد الفحص على إنزيمات لوسيفيراز التي يمكن أن تتأثر بمركبات معينة ، مما قد يؤدي إلى ضعف دقة النتيجة²¹. من ناحية أخرى ، يمكن استخدام المستشعر الحيوي في أنواع مختلفة من الخلايا والأنظمة التجريبية ، بما في ذلك الخلايا الملتصقة والمعلقة. يسمح توافقه مع السياقات الخلوية المتنوعة للباحثين بالتحقيق في ديناميكيات cAMP عبر الأنظمة البيولوجية المختلفة²²^،²³^،²⁴. إن دمج مقايسة المستشعر الحيوي هذه مع الفحص المجهري الفلوري يعزز فائدته بشكل أكبر حيث يمكن أيضا جمع المعلومات المورفولوجية للخلية²⁵^،²⁶^،²⁷.

يوفر هذا الفحص للباحثين مرونة كبيرة في التصميم التجريبي ، مما يتيح مجموعة واسعة من التحقيقات المتعلقة بإشارات cAMP. إنه يخدم أغراضا متعددة ، مما يسمح بقياس مستويات cAMP القاعدية ، ودراسة تقلبات cAMP استجابة للمحفزات أو العلاجات المتنوعة ، واستكشاف ديناميكيات cAMP في مختلف الحالات الفسيولوجية أو المرضية. تتمثل إحدى نقاط القوة الرئيسية للفحص في توافقه مع التقنيات الأخرى ، مما يسمح بفهم أكثر شمولا لإشارات cAMP. من خلال الجمع بين المستشعر الحيوي وطرق مثل تلطيخ التألق المناعي أو التلاعب الجيني¹⁰ ، يمكن للباحثين اكتساب رؤى أعمق حول التنظيم المكاني والزماني الدقيق ل cAMP داخل مقصورات خلوية محددة أو مسارات إشارة. من خلال هذا التكامل ، يمكن للباحثين التحقيق في الوظائف المتنوعة ل cAMP في سياقات مختلفة ، مما يؤدي إلى رؤى قيمة حول تعقيدات العمليات الخلوية بوساطة cAMP. يسمح استخدام هذه التقنيات للباحثين بتصور وقياس مستويات cAMP على مستوى الخلية الفردية والسكان ، مما يوفر فهما شاملا لتوزيعها داخل الخلية ، بما في ذلك تحديد تجمعات cAMP. نتيجة لذلك ، يتيح الجمع بين هذه الأساليب الحصول على بيانات دقيقة ، مما يساهم بشكل كبير في معرفتنا بإشارات cAMP.

في حين أن الطرق التقليدية كانت ذات قيمة لتحليل cAMP ، فإن إدخال cADDis يمثل تقدما واعدا في هذا المجال. إن خصوصيتها وحساسيتها وقدراتها في الوقت الفعلي تجعلها إضافة قيمة إلى مجموعة أدوات الباحث ، لا سيما بسبب توافقها مع الخلايا الحية. مع القدرة على مراقبة مستويات cAMP في الوقت الفعلي وحساسيتها العالية ، يوفر المستشعر الحيوي ميزة كبيرة في الإعدادات التجريبية المختلفة. يساهم هذا التقدم في فهم أعمق للطبيعة الديناميكية لإشارات cAMP وآثارها الوظيفية في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) (HL169522).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
96 بئر لوحة (واضحة)	Fisherbrand	21-377-203
35 مم طبق	Greiner Bio-One	627870	أطباق ثقافة الخلية مع قاع زجاجي
96 بئر لوحة	كورنينج	3904	أسود مع قاع مسطح شفاف
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x)	15240062	Gibco	لوسائط HEK و HASM
مجهر مضان BZ-X	Keyence
كلوريد الكالسيوم (IM) Quality	Biological Inc	E506	لأنبوب الطرد المركزي لوسائط HASM
(15 مل)	339651		العلمي
الحراري DMEM ( 1x)	Gibco	11965092	HEK وسائل الإعلام
DPBS مع Mg²⁺ و Ca²⁺	Gibco	14040-133
DPBS بدون Mg < sup>2 + < / sup> و Ca^{2 + < / sup>}	Corning	14040-133
مصل الأبقار الجنينية (FBS)	R & D أنظمة	S11195	لوسائط HEK و HASM
Forskolin	Millipore	344270	المخدرات
الأخضر أسفل cADDis cAMP فحص كيت	مونتانا الجزيئي	#D0200G	كاشف
هام F-12K & nbsp;		جيبكو 21127022	لوسائط HASM
HEPES (1M)	Gibco	15630080	لوسائط HASM
Isoproterenol	Sigma	I6504	Drug
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	لوسائط HASM
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (2 مل)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	مضاد حيوي لوسائط HASM
RNAse بعيدا	كاشف 700511 علمي حراري
محلول هيدروكسيد الصوديوم	Sigma	S2770	لوسائط
HASM قارئ لوحة Spectrmax M5	الأجهزة الجزيئية
Trichostatin A	TCI America	T2477	كاشف
التربسين EDTA	Gibco	25200-056	كاشف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769(2020).
Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332(2018).
Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646(2022).
Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).
Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

ديناميكيات cAMP في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام كاشف فرق cAMP الفلوري في الموقع

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles