مقالة منهجية

العزل السريع للبويضات المرحلة الأولى في الزرد الخالية من الخلايا الحبيبية

DOI:

10.3791/66458

⸱

يوليو 26, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery and Laboratory of Pediatric Surgery, West China Hospital / West China School of Medicine, Sichuan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إجراء معدلا لعزل بويضات المرحلة الأولى النظيفة بسرعة في الزرد الخالي من الخلايا الحبيبية ، وبالتالي توفير طريقة ملائمة للبحث الخاص بالبويضات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة تطور البويضة لها آثار كبيرة في علم الأحياء التنموي. تم استخدام الزرد (Danio rerio) على نطاق واسع ككائن نموذجي للتحقيق في عمليات النمو المبكرة من البويضة إلى الجنين. في الزرد ، تحاط البويضات بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية الجسدية. ومع ذلك ، فإن فصل الخلايا الحبيبية عن البويضات يشكل تحديا ، حيث أن تحقيق البويضات النقية أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. على الرغم من اقتراح طرق مختلفة لعزل بويضات الزرد في مراحل نمو مختلفة ، إلا أن التقنيات الحالية تقصر في إزالة الخلايا الحبيبية تماما ، مما يحد من دقة تحليل الجينوم الذي يركز فقط على البويضات. في هذه الدراسة ، نجحنا في تطوير عملية سريعة وفعالة لعزل البويضات النقية في المرحلة الأولى في الزرد مع القضاء على تلوث الخلايا الحبيبية. تسهل هذه التقنية التحليل الكيميائي الحيوي والجزيئي ، لا سيما في استكشاف جوانب البنية اللاجينية والجينوم الخاصة بالبويضات. والجدير بالذكر أن الطريقة سهلة الاستخدام ، وتقلل من تلف البويضات ، وتوفر حلا عمليا للبحث والتحليل اللاحق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزرد هو من بين أهم النظم النموذجية في علم الأحياء التنموي. في السنوات الأخيرة ، استخدمت العديد من الدراسات الزرد كنموذج لدراسة الأحداث البيولوجية الهامة والعمليات التنظيمية من البويضة إلى الجنين. وتشمل هذه العمليات المعقدة لتطور البويضةونضجها 1 ، ووظائف جينات الأم2 ، وتنظيم التحولات بين الأم والزيجوت3 ، وتحليلات omics الشاملة4.

تلعب الخلايا الحبيبية ، وهي الخلايا الجسدية التي تغلف وتغذي البويضة النامية داخل جريب المبيض 5,6 ، دورا محوريا في هذه العملية التنموية. عندما تتطور الخلايا الجرثومية البدائية (PGCs) إلى oogonia ، فإنها تصبح محاطة بطبقة أحادية من الخلايا الحبيبية7. جنبا إلى جنب مع الخلايا thecal الخارجية ، تشكل البويضة والخلايا الحبيبية المحيطة بها جريبا ناضجا8. بالنظر إلى التمييز الأساسي بين الخلايا الجرثومية والخلايا الجسدية ، فإن الحصول على عينة بويضة نقية أمر حتمي ، خاصة بالنسبة للتحليلات المتعلقة بالجينوم.

داخل البنية الجرابية لسمك الزرد ، تظهر الخلايا الحبيبية عادة قطرا يبلغ بضعة ميكرونات فقط8 ، مما يؤكد على الترابط الحميم بين الخلايا الحبيبية والبويضات9. يمثل هذا الارتباط الوثيق تحديا في تحقيق الفصل الكامل بسبب الاختلاف الكبير في كل من عدد وحجم الخلايا الحبيبية مقابل البويضات (مئات الخلايا الحبيبية مقارنة بخلية بيضة واحدة)10,11. حتى الحد الأدنى من التلوث بخلية حبيبية واحدة يمكن أن يعيق التحليلات النهائية التي تستهدف البويضات على وجه التحديد. لذلك ، بالنسبة للدراسات التي تركز على الخصائص الجينومية واللاجينية ، فإن القضاء على الخلايا الحبيبية أمر ضروري.

بالاستفادة من المعايير المورفولوجية المميزة جيدا ، يمكن تمييز البويضات في كل مرحلة بناء على القطر11. يتم تصنيف عملية تكوين البويضة في الزرد إلى خمس مراحل وفقا للمورفولوجيا والنمط النووي11. المرحلة الأولى من البويضات (قطرها 7-140 ميكرومتر) تشمل البويضات من بداية الانقسام الاختزالي إلى المرحلة المبكرة من الانقسام الاختزالي I. بشكل حاسم ، هذه البويضات شفافة ، مما يسمح بمراقبة النواة المركزية من خلال الضوء المرسل (الشكل 1Ai). المرحلة الثانية من البويضات (قطرها 140-340 ميكرومتر) تصبح تدريجيا رغوية وشفافة. مع تضخم البصيلات وانتشار الحويصلات القشرية ، يصبح من الصعب تمييز الحويصلات الجرثومية في المركز12 (الشكل 1Aii). تتراكم البويضات في المرحلة الثالثة (قطرها 340-690 ميكرومتر) تدريجيا فيتلوجينين ، وتصبح البصيلات الطازجة معتمة بشكل متزايد (الشكل 1Aiii). يستمر الانقسام الاختزالي في المرحلة الرابعة من البويضات (قطرها 690-730 ميكرومتر) حيث تدخل الكروموسومات منتصف الانقسام الميوزي الثاني ، حيث تتجمد (الشكل 1Aiv). نضجت بويضات المرحلة الخامسة (قطرها 730-750 ميكرومتر) وجاهزة للإباضة 7,11 (الشكل 1Av).

بناء على الخصائص الفريدة لكل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه ، تم اقتراح طريقة لعزل البويضات من المراحل الأولى إلى الثالثة عن طريق هضم مبيض الزرد باستخدام محلول هضمي يحتوي على كولاجيناز I وكولاجيناز II وهيالورونيداز ، يليه الترشيح من خلال مصفاة خلية محددة الحجم13. ومع ذلك ، في حين أن هذه الطريقة تسمح بالحصول على البويضات في مراحل النمو المختلفة ، إلا أنها تفشل في فصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما. اقترح باحثون آخرون أيضا طرقا لفصل الخلايا الحبيبية عن البويضات. ومع ذلك ، تعتمد هذه الطرق في المقام الأول على الأساليب الميكانيكية ، والتي يمكن أن تسبب تلف البويضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وهي غير كافية للحصول على عدد كبير من البويضات للتحليل14،15.

نظرا لقيود الأساليب الحالية ومتطلبات البحث المحددة ، تهدف هذه الدراسة إلى وضع إجراء لفصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما والحصول على عدد كاف من بويضات المرحلة الأولى النظيفة للتحليل. بالتوسع في الطريقةالمشار إليها 13 ، نستخدم عازلا محسنا للهضم (انظر جدول المواد) ألطف ويسهل تشتت البويضات وتفكك الخلايا الحبيبية. بعد ذلك ، يتم تمرير البويضات من خلال مصفاة الخلية ، تليها الغسيل والمزيد من الاختيار المجهري ، مما يتيح الحصول على عدد كبير من البويضات النظيفة في المرحلة الأولى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعامل مع جميع أسماك الزرد باتباع إرشادات صارمة لرعاية حددتها هيئات رعاية الوطنية و / أو المحلية ذات الصلة. حصلت صيانة الأسماك ومناولتها على موافقة كل من السلطات المحلية ولجنة أخلاقيات في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان (الموافقة رقم 20220422003). تحتوي مبيض الزرد على خليط من البويضات متعددة المراحل ، مع وجود كل مرحلة من مراحل النمو في مبيض الزرد البالغ. ومع ذلك ، تم اختيار الزرد اليافع لهذه الدراسة بسبب هيمنة البويضات في المرحلة المتأخرة (المرحلة الثانية والثالثة) في مبيض الأسماك البالغة ، وهي كبيرة وغير شفافة. في المقابل ، لدى الأحداث مبايض مسطحة وممدودة تتكون بشكل أساسي من بويضات المرحلة الأولى (الشكل 1 ب) (الشكل 1 ب). أظهرت الأبحاث السابقة أن السمات المورفولوجية لتكوين البويضة المبكرة في أسماك الزرد البالغة واليافعة متسقة للغاية ، مما يدعم جدوى استخدام صغار الزرد13. توفر الإجراءات الموضحة أدناه ، الموضحة في الشكل 2 ، وصفا تفصيليا لعملية العزل ، من التشريح إلى الحصول على بويضات نظيفة من المرحلة الأولى. لمزيد من المراجع ، يتم سرد الكواشف والمخازن المؤقتة والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تشريح المبيض

  1. حدد عدة إناث من أسماك الزرد بطول قياسي (SL) يتراوح من 10 مم إلى 15 مم.
    ملاحظة: يعمل SL ، المقاس من الخطم إلى قاعدة الذيل بالمليمترات ، كمعيار موثوق لاختيار الأسماك المناسبة. يوصى باستخدام الأسماك الصغيرة بين 5 و 7 أسابيع بعد الإخصاب (wpf) مع SL يتراوح من 10 مم إلى 15 مم لهذا الإجراء. تشغل البويضات المبكرة في الغالب مبيض الزرد اليافع ، مما يوفر الظروف المثلى للحصول بسهولة على بويضات المرحلة الأولى (الشكل 1 ب).
  2. القتل الرحيم لإناث الأسماك اليافعة بوضعها في ماء مثلج (0-4 درجة مئوية).
    ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية لضمان القتل الرحيم وتقليل الألم الذي يعاني منه الزرد أثناء القتل الرحيم: تأكد من أن درجة حرارة الماء المثلج تقع في نطاق 0-4 درجة مئوية باستخدام مقياس حرارة ، نقل الزرد بسرعة إلى الماء المثلج ، والحفاظ عليها في الماء المثلج لمدة 10 دقائق على الأقل بعد توقف الحركة الدائرية16 ، 17,18.
  3. جفف الماء الزائد على سطح السمك باستخدام ورق ماص.
  4. تشريح الزرد تحت المجهر المجسم باتباع الخطوات التالية:
    1. قطع الرأس باستخدام مقص صغير على طول الهامش الخلفي للغطاء الخيشومي ؛ قطع الذيل على طول عباءة. انقل الجذع الأوسط إلى طبق 35 مم يحتوي على 2 مل من وسط L-15 (مع L-glutamine).
    2. تشريح الجذع الأوسط في وسط L-15. قطع على طول المحور المركزي للبطن وإزالة الأحشاء والمثانة السباحة.
      ملاحظة: أحشاء الزرد متصلة. لذلك ، قرصة الأمعاء الخلفية بالقرب من منطقة الشرج ورفعها لإزالة الكتلة الحشوية بأكملها بسهولة.
    3. افصل المبايض الثنائية عن البطن باستخدام الملقط. قم بإزالة الأنسجة الدهنية والقشور وأنسجة الجسم الأخرى المرتبطة بالمبيض.
      ملاحظة: المبايض مغطاة بأنسجة دهنية. لذلك ، من الأفضل إزالتها معا لتجنب التلف الميكانيكي للبويضات.
      تنبيه: تعامل مع الملقط بعناية لتجنب الإصابة.

2. الهضم

  1. انقلي المبايض إلى طبق من 6 آبار يحتوي على 2 مل من محلول تفكك خلايا كينجر واحتضانه لمدة 2-3 ساعات عند 28.5 درجة مئوية. رج الطبق المكون من 6 آبار كل 30 دقيقة لتعزيز التشتت.
    ملاحظة: استخدم الملقط لفصل المبيضين إلى كتل أنسجة صغيرة لتعزيز فعالية الهضم. وقت الهضم متغير. مراقبة العملية وإنهائها بانتظام عندما ينتشر عدد كبير من بويضات المرحلة الأولى تحت المجهر المجسم. حل تفكك الخلايا في Kinger هو الحل العملي ويمكن استخدامه مباشرة. يمكن تخزينه بثبات عند -20 درجة مئوية بعد التعبئة وإذابته عند درجة حرارة منخفضة (4 درجات مئوية) قبل الاستخدام.
  2. يضاف L-15 متوسط محمى على حرارة 28.5 درجة مئوية إلى محلول الهضم لإيقاف الهضم.

3. الترشيح

  1. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر في بئر آخر من لوحة 6 آبار ، وأضف وسط L-15 ، وتأكد من أن المستوى المتوسط أعلى من الفلتر.
    ملاحظة: القطر النظري لبويضات المرحلة الأولى أقل من 140 ميكرومتر. ومع ذلك ، قد تستمر البويضات ذات الأقطار الأكبر في المرور عبر مصفاة الخلية. لذلك ، تم اختيار مصفاة خلية بقطر أصغر من الهدف في هذه الخطوة. يمكن تعديل أحجام الشبكات حسب الاحتياجات التجريبية المحددة.
  2. ارسم الوسط الهضمي من خلال مصفاة الخلية باستخدام ماصة. انتظر 1-2 دقيقة حتى تمر جميع البويضات في المرحلة الأولى عبر المصفاة ، ثم قم بإزالتها. تأكد من بقاء البويضات في السائل طوال عملية النقل.
    ملاحظة: يساعد الحفاظ على البويضات في الوسط في الحفاظ على سلامتها وحالتها المثلى. إذا تعرضت البويضات للهواء لفترة طويلة ، فقد تجف وتتلف ، مما يؤثر على كفاءة الفصل النهائي. احتفظ بالماصة تحت سطح السائل عند نقل البويضات عبر مصفاة الخلية بدلا من إضافتها بطريقة معلقة.

4. الغسيل

  1. إزالة الوسط الزائد باستخدام ماصة. أضف 4 مل من وسط L-15 الطازج وأعد تعليق البويضات برفق. انتظر 1-2 دقيقة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    ملاحظة: استخدم أدوات ذات خصائص التصاق منخفضة لمنع تلف البويضات.
  2. كرر الخطوة 4.1 5-6 مرات حتى لا توجد شوائب أخرى.
    ملاحظة: التعامل اللطيف أثناء عملية الغسيل أمر بالغ الأهمية لتجنب تلف البويضة. على الرغم من الحصول على وفرة من بويضات المرحلة الأولى (حوالي 200-400 بويضة من المرحلة الأولى من سمكة زرد واحدة) بعد خطوات الغسيل السابقة ، قد لا يزال من الممكن خلط البويضات بشظايا الخلايا أو البويضات من مراحل أخرى أو حبيبات صغيرة تتكون من البويضات المكسورة في المرحلة المتأخرة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تظل بعض الخلايا الحبيبية تلتصق بسطح العديد من البويضات بسبب الهضم غير الكامل للإنزيم. لذلك ، بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب مستوى أعلى من النقاء ، مثل تسلسل الجينوم ، من الضروري اتخاذ خطوات إضافية لاختيار بويضات نظيفة تماما. لمعالجة هذا الأمر، انتقل إلى الخطوتين 5 و6.

5. اختيار لمراقبة الجودة

  1. انقل بويضات المرحلة الأولى المغسولة إلى طبق 35 مم يحتوي على وسط L-15 طازج.
  2. تحت المجهر بتكبير يساوي أو يتجاوز 10x ، قم بإزالة شظايا الخلايا والبويضات في المرحلة الأخرى وبويضات المرحلة الأولى التي تلتصق بها الخلايا الحبيبية باستخدام أداة يمكن التلاعب بها بدقة ، مثل إبرة الحقن غير الحادة.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة الصبر من المجرب ، ولكنها تضمن عزل البويضات النظيفة والسليمة.
    تنبيه: تعامل مع إبر الحقن بعناية لتجنب الإصابة.

6. التأكيد عن طريق تلطيخ نووي

ملاحظة: لمزيد من التحسين للبويضات المعزولة ، تم استخدام تلطيخ مع Hoechst 33342 لتحديد وإزالة البويضات الفردية الملتصقة بالخلايا الحبيبية التي ربما تم تفويتها في الخطوة السابقة.

  1. أضف تركيزا نهائيا قدره 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 إلى وسط L-15 واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. راقب مضان Hoechst من خلال مجهر مضان تحت إثارة الليزر بالأشعة فوق البنفسجية.
    ملاحظة: عادة ما يكون Hoechst متحمسا في منطقة الأشعة فوق البنفسجية ، عادة بأطوال موجية تتراوح بين 310 و 360 نانومتر. يوصى باستخدام تكبير بين 80x و 100x أثناء هذه العملية. استخدم وضع التعرض التلقائي. يمكن تعديل الطول الموجي للإثارة ووقت التعرض بناء على نموذج المجهر المحدد والمتطلبات الفردية.
  3. باستخدام إبرة ، اختر بعناية البويضات التي لا تفي بالمعايير المطلوبة.
    ملاحظة: عند تصور الخلايا ، يوجد كروماتين نووي كبير في وسط البويضة. إذا تم التصاق الخلايا الحبيبية بالبويضة ، فستكون النوى الصغيرة والمشرقة مرئية ، وتتشبث بحافة البويضة (الشكل 3). التقطهم تحت المجهر.
  4. غسل البويضات جيدا وبشكل متكرر مع L-15 لإزالة Hoechst الزائدة.
  5. استخدم بويضات المرحلة الأولى المحددة مباشرة للاستخراج اللاحق أو قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية بعد التجميد السريع في النيتروجين السائل.
    تنبيه: ارتد قناعا واقيا للوجه وقفازات مبردة عند التعامل مع النيتروجين السائل والمجمدات ذات درجة الحرارة المنخفضة للغاية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 مورفولوجيا المبيض التي لوحظت في كل من أسماك الزرد البالغة واليافعة، ويعرض البويضات في مراحل النمو المختلفة لتكون بمثابة مرجع. يقدم الشكل 1 أ تمثيلا بيانيا لمورفولوجيا البويضة وحجمها في كل مرحلة من مراحل النمو ، بدءا من مرحلة النمو الأولية (المرحلة الأولى) وتنتهي ببويضة التبويض (المرحلة الخامسة). توضح الأشكال 1Ai-v الأقطار المقابلة للمراحل من الأول إلى الخامس من البويضات. يعرض الشكل 1B (اللوحة اليسرى) صور المبيض في الأسماك اليافعة (6 wpf مع SL = 1.5 سم). والجدير بالذكر أن المبيض اليافع يظهر مظهرا مفصصا مميزا ، يتميز في المقام الأول بوفرة من بويضات المرحلة الأولى الشفافة ، مصحوبة بعدد أقل من البويضات في المرحلة الثانية. هذا الانتشار للبويضات المرحلة الأولى يسهل إلى حد كبير ملاحظتها واسترجاعها. تصور اللوحة اليمنى مورفولوجيا مبيض الأسماك البالغ (6 أشهر) ، حيث يمكن ملاحظة البويضات في مراحل النمو المختلفة. ومع ذلك ، فإن البويضات غير الشفافة في المرحلة المتأخرة (المرحلة الثانية والثالثة) هي السائدة في المبيض.

يوضح الشكل 2 العمليات التمثيلية من التشريح إلى الحصول على بويضات المرحلة الأولى النظيفة. يعرض الشكل 3 بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها باستخدام كل من الطريقة المرجعية والطريقة المعدلة. بعد تلطيخ Hoechst ، أظهرت نوى الخلايا البيضية والحبيبية مضان أزرق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. في الصور التي تم الحصول عليها باستخدام الطريقة المرجعية (الشكل 3 أ) ، كان سطح البويضات محاطا بكثافة بالعديد من نوى الخلايا الحبيبية الملطخة. في المقابل ، تظهر البويضات في المرحلة الأولى مفصولة بالطريقة المعدلة (الشكل 3 ب) تعرضا ونظافة كاملين ، مع عدم وجود تلطيخ لنوى الخلايا الحبيبية.

أظهرت النتائج التي توصلنا إليها فعالية الطريقة المقترحة لعزل بويضات المرحلة الأولى. تظهر العملية التنموية للبويضات في أسماك teleost العديد من الخصائص المشتركة7. ولتقييم إمكانية تطبيقه عبر الأنواع، أجريت تحليلات أخرى على أنواع الأسماك الأخرى. تم الحصول على إناث أحواض البركة من السوق المحلية ، وتم عزل البويضات في المراحل المبكرة (قطرها <100 ميكرومتر) باتباع نفس الإجراء. أظهر تكوين المبيض لوتش البركة أيضا مزيجا من البويضات في مراحل نمو متعددة ، تتميز بتشابه مذهل في مورفولوجيا البويضات وحجمها مع سمك الزرد خلال نفس المرحلة. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، سيطرت على مبيض أنثى البركة البالغة خلايا بيضية متأخرة غير شفافة تتخللها بويضات مبكرة شفافة. لوحظت طبقة أحادية واضحة من الخلايا الحبيبية على سطح البويضات. تمشيا مع ملاحظاتنا في الزرد ، فإن بويضات لوتش التي يقل قطرها عن 100 ميكرومتر تتوافق مع المرحلة السابقة لمرحلة ثنائي بلوتين. يصور الشكل 4B بويضات البركة النظيفة (Misgurnus anguillicaudatus) التي تم الحصول عليها بالطريقة المعدلة. بالمقارنة مع مبيض الزرد ، فإن مبيض لوتش البركة أكثر صعوبة في الانفصال. بعد 6-7 ساعات من الهضم ، تنفصل المزيد من البويضات في المراحل المبكرة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج المعدل أسفر عن البويضات النظيفة والعارية المطلوبة. تنتمي أسماك الزرد إلى عائلة Cyprinidae ، في حين يتم تصنيف لوشات البركة ضمن عائلة Cobitidae. تظهر هاتان العائلتان علاقة تصنيفية بعيدة ، لكن مرحلة تطور المبيض والتشكل متشابهان بشكل ملحوظ ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه الطريقة بشكل عام لتحليل البويضات من أنواع الأسماك المختلفة.

figure-results-1
الشكل 1: صور تمثيلية لمبيض الزرد وبويضاته في مراحل مختلفة. أ: مورفولوجيا وحجم البويضات في كل مرحلة من مراحل النمو (St). يمثل i-v صور وقطر البويضات من المرحلة الأولى إلى الخامسة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) مورفولوجيا المبيض لأسماك الزرد البالغة واليافعة. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية لإجراء العزل، من التشريح إلى اكتساب بويضات المرحلة الأولى النظيفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها من خلال الطريقتين. (أ) المرحلة (St) الخلايا البيضية المعزولة بالطريقة المشار إليها. ب: المرحلة الأولى من البويضات المعزولة بالطريقة المعدلة. كانت نوى البويضات والخلايا الحبيبية ملطخة ب Hoechst ومتحمسة بالأشعة فوق البنفسجية. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. BF = حقل مشرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: بويضات في مراحلها المبكرة من لوتش البركة تم الحصول عليها بالطريقة المعدلة. (أ) صور تمثيلية للمبيض والبويضات في لوتش البركة. يمثل الأول والثاني مبايض لوشات البركة تحت تكبيرات مختلفة ، ويمثل الثالث والرابع بويضات المرحلة المبكرة من لوتشات البركة. قضبان المقياس: i (500 ميكرومتر) ؛ الثاني (200 ميكرومتر) ؛ الثالث والرابع (100 ميكرومتر). ب: الخلايا البيضية في مراحلها المبكرة المعزولة من لوتش البركة. كانت البويضات ونوى الخلايا الحبيبية ملطخة ب Hoechst ومتحمسة بضوء الأشعة فوق البنفسجية. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. BF = حقل مشرق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، طورنا طريقة لعزل بويضات المرحلة الأولى النقية والنظيفة ، باستثناء الخلايا الحبيبية ، لتحليل المصب (خاصة التحليلات الجينومية). بمقارنة هذه الطريقة المعدلة مع الطريقةالمشار إليها 13 ، فإن بويضات المرحلة الأولى التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة سليمة شكليا وكافية في العدد وخالية من التلوث بالخلايا الجسدية الأخرى ، مما يجعلها مناسبة لمختلف الدراسات والتحليلات اللاحقة. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع طرق الفصل الميكانيكية الأخرى14,15 ، فإن الطريقة المحسنة أبسط في التشغيل ، وتسهل الحصول على عدد أكبر من البويضات ، وتمنع تلف البويضات.

علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى عزل بويضات الزرد في المرحلة الأولى بشكل فعال ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على لوتش البركة ، مما يشير إلى إمكانية تطبيقها على نطاق واسع بين مجموعة متنوعة من أنواع الأسماك. للتحقيق في تأثير تلوث الخلايا الحبيبية على التعبير الجيني والتحليل اللاجيني ، أجرينا تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) وتحليل CUT &Tag على البويضات التي تم الحصول عليها باستخدام الطرق المرجعية والمعدلة. على الرغم من أنه تم تحديد عدد قليل من الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي بواسطة RNA-seq ، إلا أن بعض الجينات التي تم التعبير عنها على وجه التحديد في الخلايا الحبيبية لا تزال محددة (البيانات غير معروضة). كشف التحليل أيضا عن اختلافات جوهرية في تعديلات الهستون بين البويضات المعزولة بطرق مختلفة (البيانات غير معروضة). تؤكد هذه النتائج على أهمية هذه الطريقة في فصل البويضات والخلايا الحبيبية تماما للتعبير الجيني الدقيق والتحليل اللاجيني.

هناك عدة جوانب تتطلب الاهتمام عند تنفيذ الطريقة المقترحة: (1) اختيار الحجم المناسب من الزرد أمر بالغ الأهمية. هذا يضمن الحصول على ما يكفي من البويضات ويقلل من خطوات الغسيل اللاحقة. لا توفر مبايض الزرد ذات SL <10 مم بويضات كافية ، مما يتطلب عددا أكبر من الأسماك لتلبية متطلبات أخذ العينات وزيادة ضغط التكاثر. على العكس من ذلك ، فإن الزرد مع SL أكبر من 15 ملم يظهر التكوين التدريجي للبويضات المرحلة الثانية والثالثة ، والتي يتم كسر أغشيتها بسهولة أثناء تفاعل الهضم. (2) عند استخدام الأسماك الكبيرة ، قد يؤدي تسرب محتويات الخلية الناتجة عن البويضات التالفة إلى التلوث ، وبالتالي تثبيط تفاعل الهضم إلى حد ما. في مثل هذه الحالات ، يوصى بإزالة المخزن المؤقت القديم ، وغسله باستخدام L-15 ، ثم إضافة محلول تفكك خلايا Kinger جديد لمزيد من الهضم. (3) إذا توفرت المعدات المناسبة ، فإن الاهتزاز أثناء الهضم يمكن أن يعزز الانفصال.

في الخطوة 3.1 ، قد تصاحب الخلايا الحبيبية الأصغر البويضات عبر مصفاة الخلية. ومع ذلك ، تشير الملاحظات العملية إلى أن عينة البويضات النهائية التي تم جمعها لا تحتوي على خلايا حبيبية. باستثناء الحالات التي أدى فيها الهضم غير المكتمل إلى وجود خلايا حبيبية متبقية في بعض البويضات ، لم يتم اكتشاف أي خلايا حبيبية أخرى تحمل علامة Hoechst في النظام. هنا ، افترضنا أن الخلايا الحبيبية ، كونها أصغر حجما وأخف وزنا ، قد تظل معلقة في وسط الاستزراع وتمت إزالتها لاحقا أثناء خطوات الغسيل المتعددة. كما تم قياس كفاءة العزل عن طريق حساب نسبة البويضات ذات ارتباط الخلايا الحبيبية والبويضات النظيفة بعد تلطيخ Hoechst. لوحظت معدلات بويضات نظيفة تصل إلى 98٪ في عينات تحتوي على 1000 بويضة.

وعلى الرغم من المزايا العديدة للنهج المقترح، فإنه ينطوي أيضا على بعض القيود الجديرة بالملاحظة. أولا ، تم التحقق من صحة هذه الطريقة لاستخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، والتسلسل ، والكشف الفوري عن الخلايا الحية السليمة ، ولكن لم يتم التحقق بعد من جدوى وموثوقية التوسع إلى مناطق الفحص الأخرى. هناك قيد آخر وهو أنه لا يمكن تطبيق الطريقة المقترحة إلا لعزل بويضات المرحلة الأولى ، حيث أن كفاءة العزل للمراحل الأخرى غير مرضية. ولذلك، يلزم بذل جهود إضافية لتحسين كفاءة الطريقة المقترحة وإمكانية تطبيقها. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على استكشاف ما إذا كان يمكن تطبيق الطريقة المقترحة لعزل البويضات بكفاءة عن المراحل الأخرى ، وبالتالي توسيع نطاق تطبيقها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170813 و 31871449) وقسم العلوم والتكنولوجيا في سيتشوان (2024NSFSC0651) ، ومشروع 1 · 3 · 5 لتخصصات التميز - صندوق البحوث السريرية ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان (2024HXFH035). يود المؤلفون أن يشكروا Zhao Wang و Yanqiu Gao من مختبر جراحة الأطفال على تربية الزرد المرتبط بهذا العمل. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا جميع المراجعين الذين شاركوا في المراجعة ، وكذلك MJEditor (www.mjeditor.com) لتقديم خدمات تحرير اللغة الإنجليزية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
يمكن تخزين محلول تفكك الخلايا من KingerPlantChemMedPC-33689عند -20 درجة ؛ C بعد التعبئة ويمكن استخدامها بعد الذوبان في درجة حرارة منخفضة (4 درجة ؛ ج). يمكن استخدامه مباشرة لفصل مبيض الزرد. درجة الحرارة المثلى هي 28.5 درجة ؛ C ، لمدة 2-3 ساعات تقريبا. يمكن تعديل المدة وفقا لظروف التفكك المحددة ، إما تقصير أو ممتدة (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
مصافي الخلايا (100 مو ؛ م)Falcon352360
المجهر الفلوريZeissAxio Zoom.V16
ملقطDumont# 5
إبرة شعريةزجاجية //مخدومة عن طريق الاحتراق بأخف
وزنا HoechstYesen40732ES03
أطراف ماصة منخفضة الامتزاز (10 & mu ؛ ل)LabsellectT-0010-LR-R-S
Leibovitz s L-15 متوسط متوسط (مع L-glutamine)HycloneSH30525.01
دلو ثلج//يستخدم الماء المثلج للقتل الرحيم
لحاضنةالزرد WIGGENSWH-01
الأسماك الصغيرة//5 & ndash ؛ 6 أسابيع بعد الإخصاب ، الطول القياسي [SL] من 10 &ndash ؛ طبق بلاستيكي 15 مم
(35 مم)SORFA230101
مجهرمجسم MoticSMZ-161
لوحة زراعة الأنسجة (6 آبار)
VannasFine Science Toosl# 15000-00
بثبات أسماك مقص زنبركي SORFA 0110006

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
  2. Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
  3. Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
  4. Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
  5. Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
  6. Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  7. Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
  8. Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
  9. Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
  10. Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
  11. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
  12. Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
  13. Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
  14. Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
  15. Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
  16. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  17. Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

L 15

مقالات ذات صلة