مقالة منهجية

آلات نانوية قائمة على DNAzyme 10-23 للتعرف على الحمض النووي

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

فبراير 9, 2024

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

في هذه المقالة

ملخص

يمكن استخدام الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي للكشف الانتقائي والحساس للغاية عن الأحماض النووية. توضح هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتصميم آلات النانو القائمة على الحمض النووي مع نواة 10-23 باستخدام البرامج المجانية وتطبيقها في الكشف عن جزء فيروس إبشتاين بار كمثال.

الملخص

الآلات النانوية القائمة على الحمض النووي (DNM) للكشف عن تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي (التحليلات) هي هياكل متعددة الوظائف مصنوعة من قليل النيوكليوتيدات. تشمل وظائفها الربط المحكم للتحليل ، والتعرف على التحليل الانتقائي للغاية ، وتضخيم إشارة الفلورسنت عن طريق انشقاقات تحفيزية متعددة لركيزة مراسل فلورية ، وجذب الركيزة الفلورية لزيادة استجابة المستشعر. يتم إرفاق الوحدات الوظيفية بسقالة الحمض النووي الشائعة لعملها التعاوني. تتميز DNMs التي تشق الحمض النووي الريبي 10-23 بحساسية محسنة مقارنة بمجسات التهجين غير التحفيزية. يتم توفير استقرار DNM وزيادة فرص التعرف على الركيزة من خلال جزء DNA مزدوج تقطعت بهم السبل ، بلاط. يمكن ل DNM التمييز بين تحليلين مع اختلاف نيوكليوتيد واحد في الحمض النووي الريبي المطوي والحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل واكتشاف التحليلات بتركيزات ~ 1000 مرة أقل من مجسات التهجين الأخرى الخالية من البروتين. تقدم هذه المقالة المفهوم الكامن وراء الإمكانات التشخيصية لنشاط آلة الحمض النووي النانوية وتلقي نظرة عامة على تصميم DNM وتجميعه وتطبيقه في فحوصات الكشف عن الحمض النووي.

المقدمة

واحدة من أقدم الطرق للكشف عن الحمض النووي هي الارتباط التكميلي لقليل النيوكليوتيدات الانتقائية بتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الذي تم تحليله. تستخدم هذه الطريقة شظايا الحمض النووي (المجسات) التي يمكن أن تشكل أزواج قاعدة واتسون-كريك مع تحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبيالمستهدف 1. ثم يتم تمييز المركب عن المادة المراد تحليلها والمسبار غير المنضم من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات. تعتمد بعض الطرق ، مثل النشاف الشمالي ، أو التهجين في الموقع ، أو qPCR ، على ظاهرة الربطالتكميلي 2. تحتوي مجسات التهجين الأكثر شيوعا على عيبين مهمين: حساسية منخفضة (يمكن أن تصل إلى مستويات ميكرومولار إلى نانومولية) بالإضافة إلى انتقائية منخفضة لاختلافات النوكليوتيدات المفردة (SNV) ، بما في ذلك الطفرات النقطية. تتطلب القضية نهجا متطورا لأن حلول هذه العيوب تتعارض مع بعضها البعض3. لتوفير أفضل انتقائية ، يجب أن يظل قليل النوكليوتيد المكتشف قصيرا بما يكفي لتشكيل هجين غير مستقر مع تحليلات غير متطابقة. هذه oligonucleotides القصيرة غير قادرة على ربط الأحماض النووية المستهدفة بإحكام وفك هياكلها الثانوية ، وبالتالي غالبا ما تفشل في توفير إشارة يمكن اكتشافها. من الصعب بشكل خاص اكتشاف الشظايا الغنية ب CG في الحمض النووي الريبي البيولوجي ، أو الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsDNA). من ناحية أخرى ، فإن المجسات الطويلة غير حساسة ل SNV3. لكسر الجمود ، تم تطوير مفهوم المسبار الثنائي4.

تقوم المستشعرات الثنائية بتقسيم مسبار الكشف الواحد إلى قطعتين وتخصيص شظاياه ، مع إبقاء إحداهما طويلة لفك دبابيس الشعر أو غزو dsDNA. يبقى جزء المسبار الثنائي الثاني قصيرا ليكون حساسا لقاعدة غير متطابقة ، وبالتالي يوفر وسيلة للكشف عن SNV. سيتم إنتاج الإشارة إذا تم ربط جزأي المستشعر الثنائي معا4. يمكن تصور المجمع الكامل عبر FRET5 ، أو مسبار المنارة الجزيئي 6,7 ، أو G-quadruplexes مع نشاط يشبه البيروكسيديز 8,9,10 ، أو شق الحمض النووي الريبي 11,12,13 DNAzyme. تم وصف المستشعرات الثنائية ذات النواة 10-23 DNAzyme بإسهاب. لقد تم تكييفها للكشف عن شظايا الحمض النووي التي تقطعت بها السبل والتي تم إنشاؤها صناعيا11 ، أو منتجات التضخيم أحادية الشريط14,15. من الممكن أيضا الكشف بدون تضخيم ، على سبيل المثال ، في حالة 16S rRNA المستخرجة من ثقافة الخلية ، لأن هذا الجزيء وفير في الخلايا12,16. يمكن أيضا تكييف المستشعرات الثنائية ذات النواة 10-23 DNAzyme للكشف عن الحمض النووي غير النووي ، مثل أيونات الرصاص17. ومع ذلك ، لا تزال الحساسية المنخفضة تعتبر أحد العيوب الرئيسية لأجهزة استشعار الحمض النووي الثنائية 10-23 ، وقد تم تطوير نهج مختلفة ، بما في ذلك Cascades18 أو طرق بديلة لتعزيز الإشارة19 ، لمعالجة هذه المشكلة. لسوء الحظ ، فإن التقنيات المذكورة أعلاه تزيد بشكل كبير من تكلفة وعدم استقرار مكونات المستشعر ، وبالتالي لم تدخل حيز التنفيذ.

تستخدم التجربة الموصوفة في هذا العمل 10-23 مستشعرا نانويا للحمض النووي قائما على الحمض النووي يشار إليه باسم آلات الحمض النووي النانوية (DNM)20,21. تتضمن هذه الهياكل مستشعرات ثنائية وأيضا (1) ميسري الحمض النووي الذين يحيطون بالمسبار الثنائي ، ويفككون المناطق المهيكلة ويغزون الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، و (2) بلاط الحمض النووي الذي يربط جميع أجزاء DNM معا على مقربة ويزيد من فرص تكوين الإشارة (الشكل 1). إجمالا ، تقلل DNMs القائمة على 10-23 DNAzyme من حد الكشف (LOD) وصولا إلى النطاق البيكومولار21 ؛ يمكن استخدامها للكشف عن 16rRNA في الخليةالمحللة 22 أو الإبلاغ عن وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي دون تضخيم23,24. في الوقت نفسه ، تظل DNMs حساسة ل SNV ويمكن حتى استخدامها في النمط الجيني للأليلات في الكائنات غير المتجانسة25. يمكن استخدام طريقة DNM كتقنية تكميلية لأي نوع تضخيم لتصور المنتج أو تحديد المنتج في خليط معقد بانتقائية عالية. لا تتطلب DNMs ، على عكس TaqMan التقليدية ومجسات المنارة ، تسخين العينة وبالتالي يمكن استخدامها في بروتوكولات الكشف عن نقطة النهاية ، مما يجعل الكشف الإجمالي فعالا من حيث التكلفة.

توضح هذه المقالة تطوير السيليكو ل DNM وتوضح إجراءات التجميع والتوصيف الوظيفي ل DNM. تم تنفيذ العمل باستخدام جزء اصطناعي من فيروس إبشتاين بار (EBV) المقابل للمواضع 13972-14154 من الحمض النووي الفيروسي (OR652423.1) (انظر جدول المواد).

البروتوكول

1. تصميم DNM

  1. حدد منطقة فريدة داخل الجينوم محل الاهتمام.
    ملاحظة: يستخدم هذا العمل منطقة من جينوم فيروس إبشتاين بار (EBV) في المواضع 13972-14154 (OR652423.1).
  2. قم بإنشاء مجموعة تمهيدية لتضخيم الجزء المحدد ، على سبيل المثال ، عبر أداة Primer3 المضمنة في Ugene26.
  3. افتح أداة الويبUNAFold 27 (انظر جدول المواد) وأدخل المنطقة المحددة. قم بتغيير درجة حرارة الطي إلى 55 درجة مئوية ، والظروف الأيونية إلى 250 مللي متر من الأيونات أحادية التكافؤ ، و 200 مللي متر من المغنيسيوم2+.
    1. افتح البنية الثانوية الناتجة لجزء ssDNA وحدد دبوس شعر ثابت. حدد موقع ارتباط آلات الحمض النووي النانوية في المناطق غير المهيكلة أو ، بدلا من ذلك ، على حلقات هياكل دبوس الشعر لتحقيق ارتباط أقوى للهدف.
  4. إذا كان موقع التحليل المستهدف مطويا في بنية حلقة جذعية ، فضع الذراع 1 و 2 على النحو التالي: تأكد من أن الذراع 2 يربط جانبا واحدا من الجذع والحلقة و 3-5 nt من جانب الجذع الثاني ؛ الذراع 1 يربط جزءا من الجانب الجذعي الثاني.
  5. افتح أداة DinaMelt28 (انظر جدول المواد) وقم بتحليل تسلسل الأذرع وتسلسلات تكميلها العكسي. استخدم أداة DinaMelt للتأكد من أن Tm of Arms 2 و 3 أعلى من 65 درجة مئوية: على الأقل 10 درجات مئوية فوق درجة حرارة الفحص (55 درجة مئوية).
    1. حافظ على Tm من الذراع 1 على الأقل 1-3 درجة مئوية فوق درجة حرارة التفاعل (55 درجة مئوية) إذا كان سيتم تحقيق انتقائية التعرف العالية29.
  6. اجمع بين تسلسلات Arms 1 و 2 مع نصفي نواة DNAzyme وشظايا الربط F-sub13.
  7. تحليل البنية الثانوية لخيوط الحمض النووي المصممة باستخدام UNAFold27.
    ملاحظة: 55 درجة مئوية (درجة حرارة الفحص) ، 200 مللي متر Mg2+ ، 250 مللي متر أيونات أحادية التكافؤ (HEPES ، Na + ، K +).
    1. استخدم التصميم فقط إذا كان ΔG القابل للطي أقل من - 4 كيلو كالوري / مول. حاول تجنب التسلسلات الطويلة الغنية ب CG. إذا كان الهيكل الثانوي مستقرا جدا ، فقم بإدخال طفرة في الذراع لزيادة الطي ΔG30. بدلا من ذلك ، يعد وضع Arm 3 2-3 nt بعيدا عن Arm 2 استراتيجية أخرى لتغيير تسلسل Arm 3 لتجنب الهياكل المستقرة بين الجزيئات.
  8. قم بإنشاء تسلسل عشوائي لجزء بلاط DNA طالما Arm 3. اجمع تسلسل Arm 3 مع تسلسل بلاط الحمض النووي عبر (dT) 4-6 أو جلايكول الإيثيلين (على سبيل المثال ، ثلاثي إيثيلين جلايكول (TEG) أو سداسي إيثيلين جلايكول (HEG)). يستخدم إصدار DNM المقدم في التجربة (dT)6.
  9. ربط الذراع 2 بالتسلسل المكمل لجزء تجانب الحمض النووي المحدد في الخطوة 1.8 عبر رابط.
  10. تحليل البنية الثانوية لخيوط الحمض النووي المصممة باستخدام تطبيق الويب UNAFold. تأكد من أن طاقة الطي لكل شريط DNA أعلى من 4 كيلو جول / مول عند 55 درجة مئوية ، وتجنب التسلسلات الطويلة المخصبة ب CG. على نحو مفضل ، قم بتغيير تسلسل بلاط الحمض النووي.
  11. ارسم الهيكل باستخدام أي برنامج رسومات متجه متاح. تستخدم هذه المقالة Biorender و Pixelmator Pro للتصور (انظر جدول المواد). تحقق من الدقة في الاتجاهات 5'->3' لكل خصلة.
    ملاحظة: الحصول على التسلسلات من بائع تجاري موثوق به.

2. اختبار وظيفي ل DNM

  1. إعداد العازلة والكواشف
    1. تحضير مخزن التفاعل المؤقت المكون من 50 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5-7.8) ، 50 mM NaCl ، 150 mM KCl ، و 200 mM MgCl2. املأ بالماء منزوع الأيونات حتى 50 مل.
    2. تحضير حصص 10 ميكرومتر من قليل النوكليوتيدات Dzb-Tile و Tile-Arm3. تحضير محلول 1 ميكرومتر من Dza ، و 100 ميكرومتر F-sub ، و 1 نانومتر ، 10 نانومتر ، 100 نانومتر في RNase / الماء الحر أو الماء منزوع الأيونات المعقم. يتم توفير تفاصيل تسلسل قليل النوكليوتيد في جدول المواد.
  2. تجميع DNM
    1. قم بإذابة محاليل قليل النوكليوتيد تماما قبل الاستخدام. مزيج بلطف عن طريق النقر (لا دوامة مكثفة). تدور (بسرعة ، لبضع ثوان) الحل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير.
    2. امزج 1 ميكرومتر لكل من Dzb-Tile و Tile-Arm3 في 200 ميكرولتر من مخزن التفاعل المؤقت في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل.
    3. امزج الأنبوب برفق وقم بتدوير المحلول.
    4. لف غطاء الأنبوب المغلق بفيلم البارافين. بدلا من ذلك ، استخدم أنابيب الغطاء اللولبي.
    5. احتضن الأنبوب في دورق سعة 500 مل بالماء المغلي لمدة 2 دقيقة ، ثم أطفئ السخان واترك درجة الحرارة تبرد بشكل سلبي طوال الليل.
    6. قم بإعداد الصفحة الأصلية بنسبة 12٪: امزج 1 مل من 10х TBE buffer ، و 3 مل من 40٪ AA: BA ، وماء منزوع الأيونات حتى 10 مل ، و 50 ميكرولتر من APS ، و 5 ميكرولتر من TEMED (انظر جدول المواد). انقل الخليط إلى كاسيت الجل واتركه يتبلمر.
    7. امزج 1 ميكرولتر من كل عينة ، وهي DNM المجمعة و Dzb-Tile و Tile-arm3 ، مع 1 ميكرولتر من صبغة التحميل 4x وقم بتحميلها في الجل.
    8. ضع الكاسيت في الحجرة ، واملأه بمخزن مؤقت 1x TBE ، واترك الجل يعمل لمدة 90 دقيقة عند 80 فولت.
    9. صبغ الجل ببروميد الإيثيديوم وتصوره باستخدام نظام توثيق الهلام (انظر جدول المواد).
  3. مقايسة LOD
    1. تحضير 160 ميكرولتر من 200 نانومتر F-sub في المخزن المؤقت للتفاعل. يتم ذلك لتقييم الخلفية الأساسية لاستقرار الركيزة.
    2. تحضير 7 حصص من 160 ميكرولتر من DNM و F-sub و Dza المجمعة مسبقا بتركيزات 20 نانومتر من DNM و Dza و 200 نانومتر من F-sub في مخزن التفاعل. من بين الأنابيب السبعة ، احتفظ بالأنبوب # 1 كخلفية فارغة لتقييم التجميع التلقائي لنواة DNAzyme.
    3. أضف المادة المراد تحليلها إلى الأنابيب # 2-7 عند التركيزات النهائية 1 pM و 10 pM و 100 pM و 200 pM و 500 pM و 1000 pM.
    4. امزج الأنابيب برفق ، وقم بتدويرها لأسفل ، وصنف المحاليل إلى ثلاثة أجزاء سعة 50 ميكرولتر في لوحة سوداء ذات 96 بئرا. ختم اللوحة مع فيلم شفاف بصريا.
    5. احتضان اللوحة في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تدور أسفل لوحة.
    6. قياس مضان عند 525 نانومتر (λex = 495 نانومتر). احسب المتوسط والانحراف المعياري لكل نقطة.
    7. احسب نسبة الفراغ إلى القاعدية بقسمة إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub و DNM على إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub فقط. تأكد من أن النسبة ضمن النطاق 1.1-1.5.
    8. احسب نسبة الإشارة إلى الفراغ بقسمة إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub وDNM والمادة المراد تحليلها على إشارة الأنبوب الذي يحتوي على F-sub وDNM فقط. اعتبر الإشارة موجبة حقيقية إذا كانت أعلى من متوسط الخلفية بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية.
    9. كرر التجربة مرتين وتأكد من أن الانحراف المعياري بين التكرارات التحليلية أقل من 0.5.

النتائج

كان الهدف من التجربة الأولى هو توضيح تجميع DNM قبل الجزء الاصطناعي من المادة المراد تحليلها. أضيفت جميع خيوط DNM المكونة إلى المخزن المؤقت للتفاعل وتم تجميعها في الكأس الزجاجية. تم تقييم مركب DNM المجمع لحجمه الصحيح وتجانسه بواسطة PAGE الأصلي. تظهر الصفحة الأصلية DNM المجمع مع المادة المراد تحليلها في الحارة 1 وشريطي DNM في الممرات 2 و 4. إذا لم يتم تجميع آلة الحمض النووي النانوية ، فسيكون 2 أو 3 نطاقات منفصلة مرئية بدلا من نطاق واحد منخفض الحركة (الممر 2 في الشكل 2A).

يتضمن الجزء الثاني من البروتوكول التوصيف الوظيفي لأداء DNM والكشف عن الأحماض النووية المستهدفة. في هذه الدراسة ، تم استخدام الجزء الاصطناعي من EBV 13972-14154. لهذا الغرض ، تم تحضين شظايا DNMs المجمعة مسبقا ، جنبا إلى جنب مع Dza ، بتركيزات مختلفة من المادة المراد تحليلها لمدة 1 ساعة عند 55 درجة مئوية. تم قياس قيمتين لإشارة الفلورسنت للتحكم لشظايا DNMs المجمعة مسبقا و Dzb بدون المادة المراد تحليلها (فارغة) ، وقيمة الخلفية من F-sub (الأساسية). تم إجراء ثلاثة قياسات فنية. ولأغراض الإحصاءات، أجريت ثلاث تجارب مستقلة أيضا. من الجدير بالذكر أن تركيز المغنيسيوم في هذه الدراسة أعلى مما يمكن العثور عليه في الأدب30. تزيد المستويات العالية من أيونات المغنيسيوم من الإشارة في جميع أنابيب الاختبار ، لأنها تعزز الانقسام التلقائي F-sub31. لقد قمنا بتحسين تكوين المخزن المؤقت للتفاعل خلال المراحل الأولية لتطوير التكنولوجيا ولم نكرر هذه العملية مع كل دراسة تم إجراؤها.

بعد حضانة 1 ساعة ، تم قياس مضان العينة باستخدام مقياس الطيف (انظر جدول المواد). لتأكيد اكتشاف الحمض النووي الذي تم تحليله بواسطة DNM ، قارنا إشارة الفلورسنت للمستشعر المجمع مع الحمض النووي الذي تم تحليله وإشارة التحكم السلبي ، والتي لا تحتوي على أي مادة مضافة. يجب ألا تقل نسبة الإشارة إلى الفراغ (نسبة بين متوسط وحدات التألق النسبية للآبار التي تحتوي على المادة المراد تحليلها والآبار التي لا تحتوي على مادة تحليلية) عن 1.5 لتأكيد الكشف الناجح32. يجب أن تكون النسبة الفارغة إلى الأساسية (مضان استجابة المستشعر في حالة عدم وجود مادة مقسومة على نسبة التحكم F-sub فقط) في نطاق 1.1-1.5 ؛ يمكن تعديل هذه النسبة عن طريق تغيير تركيزات DNM و Dzb (نطاق التركيز النموذجي لكل منهما هو 5-20 نانومتر). في ممارستنا ، يتم تحديد LOD كميا على أنه تقاطع خط الاتجاه وثلاثة انحرافات معيارية فوق متوسط الفراغ (الشكل 2B). يكون DNM فعالا إذا كان LOD <100 pM33. يجب إعادة تصميم DNM إذا كان LOD أعلى من 100 pM.

figure-results-1
الشكل 1: الذراع الثلاثة DNM المستخدمة في هذه الدراسة. تم تمييز ثلاثة قليل النوكليوتيدات ، Dza و Dzb-Tile و Tile-Arm3 ، باللون الأخضر والأزرق والأرجواني على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: توصيف DNM. (أ) تجميع DNM عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي في 12٪ بولي أكريلاميد جل ، 80 فولت ، 1 ساعة ، باستخدام سلم DNA 50 bp +. (ب) حد الكشف عن الحمض النووي الاصطناعي بعد 60 دقيقة حضانة عند 55 درجة مئوية. الخط الأفقي يرمز إلى العتبة ، والخط الرأسي هو LOD. يتم تقديم متوسط قيم ثلاثة قياسات مستقلة بانحراف معياري واحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تصميم آلات الحمض النووي واضح ومباشر ولكنه يتطلب بعض الخبرة في تصميم مجسات التهجين أو الهياكل النانوية الوظيفية للحمض النووي. من المناسب إبقاء الجزء المراد تحليله قصيرا قدر الإمكان لتقليل عدد الهياكل الثانوية الممكنة وتبسيط غزو DNM إلى الهيكل الثانوي. يفضل أن يكون محتوى CG أقل من 60٪ لتجنب الهياكل المستقرة داخل الجزيئات. يتم تحقيق التجميع الناجح ل DNM بمعدلات تبريد بطيئة. في بعض الحالات ، يمكن تجميع DNMs تلقائيا في الأنبوب ، ويمكن التخلص من خطوة التلدين. يمكن إجراء تجميع DNM في دورة حرارية مع 0.1-0.3 °C / دقيقة أو بكميات كبيرة من مياه التبريد. في حالة تجميع DNM غير الصحيح ، نقترح إبطاء تغير درجة الحرارة أثناء خطوة التلدين.

لقياس LOD ، هناك حاجة إلى سبع نقاط تركيز تحليلية على الأقل: تركيز التحليل 0 pM ، وهو F-sub + DNM ، وستة تركيزات مختلفة من المواد التحليلية ، على سبيل المثال ، في نطاق 1 نانومتر إلى 1 pM لمراقبة الاعتماد الخطي (الشكل 2B). في كثير من الأحيان ، تم استخدام أكثر من سبع نقاط تركيز للحصول على دقة أعلى. لكل نقطة تركيز ، يجب إجراء ثلاث تجارب فنية (50 ميكرولتر لكل منها). لذلك ، كان الحجم الكلي لكل تركيز 160 ميكرولتر (10 ميكرولتر زائد ، مع الأخذ في الاعتبار خطأ الماصة).

تقدم تقنية DNM حساسية أعلى ل SNVs مقارنة بالأنظمة الأخرى القائمة على التهجين. يمكن أن تكون الانتقائية العالية ل SNV ذات صلة بأهداف معينة ، مثل تحديد الطفرات النقطية المرتبطة بالتنميط الجينيالبكتيري 22 أو اختيار الزيجوتات غير المتجانسة في النباتات25. تتطلب التحليلات غير المتخصصة نفس الإجراء التجريبي. لتجنب أي سوء فهم ل SNV إلى تركيز منخفض من المادة المراد تحليلها ، نقترح مقارنة إشارة المادة المراد تحليلها التجريبية مجهولة بإشارة مادة تحليلية متكاملة معروفة تماما لها نفس التركيز.

يمكن تطبيق الطريقة بنجاح على ssDNA أو miRNA أو RNA المطوي أو مضخمات dsDNA. قد تتطلب شظايا الحمض النووي الريبي الطويل أو dsDNA ، وخاصة الغنية ب CG ، DNM مزودا ب 4-6 أذرع ملزمة للتحليل ، في حين أن ذراعين ملزمين للتحليل كافيان للتحليلات التي تقطعت بها السبل ذات البنية الثانوية غير المستقرة (ΔG قابلة للطي فوق -10 كيلو كالوري / مول). يمكن تطبيق الطريقة للكشف عن مضخمات PCR أو SDA أو LAMP. يمكن استخدام DNM للكشف الخالي من التضخيم عن rRNA في عينات مسلوقة من الثقافة البكتيرية دون عزل إجمالي الحمض النووي الريبي22،34،35. قد لا تعمل هذه التقنية بشكل جيد مع تركيزات منخفضة مثل مستوى الفيمتومولار ومع شظايا dsDNA ، التي يكون محتواها من CG في المناطق المحيطة أعلى من 65٪. يمكن تقدير محتوى CG ، على سبيل المثال ، باستخدام حاسبة محتوى BiologicsCG 36. نقترح إضافة أجزاء الخطاف37 إلى تصميمات DNM لزيادة الحساسية أو تحويل dsDNA إلى ssDNA في حالات المحتوى العالي من CG. هناك قيد آخر لهذه الطريقة وهو أن DNMs حساسة لجودة العينات ، وبالتالي فإن الأحماض النووية يجب تنقيتها بعناية. الأمر نفسه ينطبق على جودة تسلسل قليل النوكليوتيد من DNMs. لذلك ، يقترح التحقق من استقرار ونقاء كل إمدادات قليل النوكليوتيد. بالمقارنة مع تقنيات التضخيم التقليدية ، يتطلب تصميم DNMs مهارات ، وبحلول تاريخ إصدار المقالة ، يكون يدويا بالكامل تقريبا. تحتاج DNMs إلى بعض الاختبارات الأولية على الشظايا الاصطناعية قبل إخضاعها لعينات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الفعلية ، وبالتالي زيادة المدة الإجمالية لتطوير نظام الاختبار.

هذه الطريقة متعددة الاستخدامات ويمكن أن تتبنى أنواعا مختلفة من تحقيقات المراسلين. يمكن مضاعفة38 ، ويمكن تحويل التقنية إلى نسخة لونية إذا تم استبدال F-sub بركيزة G-quadruplex39. يرتبط وجود البلمرة بأخطاء في نمو الخصلة. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة مفيدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي في الوقت الفعلي وتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالإضافة إلى التقنيات الأخرى المعتمدة على النيوكلياز ، مثل SHERLOCK و DETECTR ، بسبب نقص إنزيمات البروتين القابلة للتلف وإجراء الكشف القوي والمباشر40,41.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا Ekaterina V. Nikitina على التكرم بتقديم gDNA ل EBV. يشكر مهند عطية وماريا ي. بيريزوفسكايا وماريا س. روبل وزارة التعليم والعلوم في الاتحاد الروسي (المنحة رقم FSER-2022-0009) وبرنامج الأولوية 2030.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب 1.5 ملBiofilCFT011015
100 نقطة أساس + سلم الحمض النوويEvrogenNL002
100-1000 & micro ؛ ماصة LKirgenKG-Pro1000
10-100 & micro; L ماصةKirgenKG-Pro100
1-10 & micro; ماصة LKirgenKG-Pro10
20-200 & micro; ماصة LKirgenKG-Pro200
2-20 & micro; L ماصةKirgenKG-Pro20
4x هلام تحميل صبغEvrogenPB020
أكريلاميد 4KAppliChemA1090،0500
بيرسولفات الأمونيومكارل روث2809447
BiorenderBiorender Biorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
حمض البوريكنظام التصوير BioRad
12003153
Costar 96-Well Black PolystereneCorningCOS3915
DinaMeltRNAInstitute http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
بروميد الإيثيديومBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
كلوريد المغنيسيومAppliChem131396
خلية ثلاثية البروتينالصغيرة BioRad1658001EDU
ماصة 10 & نصائح Lماصة KirgenKG1111-L
1000 & نصائح Lماصة KirgenKG1636
200 & L نصائحKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
كلوريد البوتاسيومكارل روث1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse / DNAse ماء خالمن Invitrogen10977049
الختم لألواح PCRSovtechP-502
كلوريد الصوديومVektonHCh (0،1)
قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع SparkTecanSpark- 10M
T100 مكبرللصوت BioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris (hydroxymethyl) aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldمعهد الحمض النووي الريبيhttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGGG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3: < / strong>Evrogenالنظام المباشر ، تنقية تحلية المياه القياسية
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
<قوي>Dzb-البلاط: < / قوي> AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogenالترتيب المباشر ، تنقية تحلية المياه القياسية
<قوية>Dza: < / قوي> TGCCCAGGGAGGCTAGCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogenالطلب المباشر ، تنقية
تحلية المياه القياسية<قوي > قليل النوكليوتيد الفرعي: < / قوي> AAGGTT (FAM) TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezالنظام المباشر ، تنقية HPLC
تقنية Plate فيلم حمام مائي LOIP LB-140<قوي>Oligos مستخدم< / قوي > <قوي> تحليل: < / قوي > Evrogen النظام المباشر ، تنقية تحلية المياه القياسية

المراجع

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNAzyme DNAzyme RNA DNA Native PAGE
آلات نانوية قائمة على DNAzyme 10-23 للتعرف على الحمض النووي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.