يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

يناير 5, 2024

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.

الملخص

يتم التعرف على Acinetobacter baumannii كممرض صعب سالبة الجرام بسبب مقاومته الواسعة للمضادات الحيوية. من الأهمية بمكان فهم الآليات الكامنة وراء هذه المقاومة لتصميم خيارات علاجية جديدة وفعالة. لسوء الحظ ، فإن قدرتنا على التحقيق في هذه الآليات في A. baumannii يعوقها ندرة أدوات التلاعب الجيني المناسبة. هنا ، نصف طرق استخدام نظام قائم على الكروموسومات المصغرة Tn7 لتحقيق التعبير الجيني أحادي النسخة في سلالة A. baumannii التي تفتقر إلى آليات التدفق الوظيفية من نوع RND. يعد إدخال نسخة واحدة وتعبير مضخة التدفق المستحث مفيدا جدا ، حيث أن وجود operons تدفق RND على البلازميدات ذات العدد العالي غالبا ما تتحمله الخلايا البكتيرية بشكل سيئ. علاوة على ذلك ، فإن دمج متجهات التعبير الصغيرة Tn7 المؤتلفة في كروموسوم مضيف بديل A. baumannii مع زيادة حساسية التدفق يساعد على التحايل على التداخل من مضخات التدفق الأخرى. هذا النظام ذو قيمة ليس فقط للتحقيق في مضخات التدفق البكتيري غير المميزة ولكن أيضا لتقييم فعالية المثبطات المحتملة التي تستهدف هذه المضخات.

المقدمة

Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض ذات الأولوية القصوى لمنظمة الصحة العالمية نظرا لمقاومته الشاملة لجميع فئات المضادات الحيوية1. إنه ممرض انتهازي يؤثر في الغالب على الأشخاص في المستشفى أو المصابين أو الذين يعانون من نقص المناعة. A. baumannii يتهرب إلى حد كبير من المضادات الحيوية عن طريق مضخات التدفق ، وأكثرها صلة هي عائلة مصدري قسم المقاومة (RND)2. إن فهم كيفية عمل مضخات التدفق هذه ميكانيكيا سيسمح للمرء بتطوير خيارات علاجية مستهدفة.

إحدى الطرق الشائعة التي يمكن من خلالها تمييز العمليات الخلوية على وجه التحديد هي من خلال التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن الأدوات المتاحة للدراسات الجينية A. baumannii محدودة ، ولزيادة إرباك التصميم التجريبي ، غالبا ما تكون العزلات السريرية مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل روتيني للاختيار في التلاعب الجيني3. العقبة الثانية التي تمت مواجهتها عند دراسة مضخات التدفق على وجه التحديد هي أنها منظمة بشكل صارم - غالبا بعوامل غير معروفة - مما يجعل من الصعب عزل الوظيفة بدقة وعزوها إلى مضخة واحدة4. نظرا لهذه الحاجة إلى توسيع صندوق أدوات البحث ، قمنا بتطوير نظام تعبير قابل للحث قائم على TN7 ، وإدراج نسخة واحدة ، يشتمل على كاسيت هدف Flp recombinase (FRT) ، والذي يسمح بإزالة علامة التحديد5،6،7 (الشكل 1). تم إنشاء نظام الاستنساخ والتعبير الأنيق هذا لأول مرة ل Pseudomonas8،9،10 ، وقد تم استخدامه لتوليد مكملات مضخة تدفق أحادية النسخة في سلالة تعاني من نقص مضخة تدفق RND من A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK ، ΔadeFGH ، ΔadeAB: يشار إليها فيما يلي باسم A. baumannii AB258) التي أنشأناها11. القدرة على دراسة مضخة تدفق واحدة في كل مرة وعدم إرباك الخلايا البكتيرية بتعبير عالي النسخ (كما هو موضح عموما مع أنظمة التعبير القائمة على البلازميد) ، يمكن للمرء أن يتعلم بشكل أفضل عن الجوانب الفسيولوجية الحرجة لكل مضخة تدفق مع الحد الأدنى من التداخل وتقليل المضاعفات.

توضح هذه المقالة كيفية استخدام نظام mini-Tn7 لاستكمال جين محذوف من الأهمية ، مضخة تدفق RND adeIJK ، في كروموسوم A. baumannii AB258 من خلال سلسلة من الخطوات غير المعقدة التي يتم إجراؤها على مدار 9 أيام7. تعيد المجموعة الأولى من الخطوات إدخال جينات مضخة التدفق المحذوفة المستنسخة في بلازميد الإدخال المصغر القائم على Tn7 (الشكل 2A) في موقع إدخال attTn7 الفردي في اتجاه مجرى جين glmS المحفوظ جيدا (الشكل 3A). يتم تسهيل هذه العملية من خلال بلازميد مساعد غير متماثل (الشكل 2 ب) يشفر جينات الترانسبوزاز اللازمة للإدخال المدفوع ب Tn7. تستخدم المجموعة الثانية من الخطوات بلازميد الاستئصال (الشكل 2C) لإزالة جين الجنتاميسين بوساطة Flp المجاور بمواقع FRT (الشكل 3B) لإنشاء سلالة غير مميزة. على الرغم من أن هذا النظام يستخدم لتوضيح الأدوار الأساسية والمثبطات المحتملة لمضخات تدفق RND فيما يتعلق بمقاومة المضادات الحيوية ، إلا أنه يمكن استخدامه للتحقيق في أي جين مهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التحضير التجريبي

  1. تنقية البلازميد pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (إدخال البلازميد ، الشكل 2A) مع الجين محل الاهتمام.
    ملاحظة: هنا ، الجين محل الاهتمام هو adeIJK. يجب أن يكون تركيز البلازميد النهائي ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. تنقية البلازميد المساعد (pTNS2)9 وبلازميد الاستئصال (pFLP2ab)6 (الشكل 2B ، C ، على التوالي) ، من الناحية المثالية إلى تركيز الحمض النووي البلازميد النهائي من ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
  3. تحضير 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء و 25 مل من مرق LB المعقم (Lennox) (انظر جدول المواد).
  4. قم بإعداد ما لا يقل عن 10 ألواح أجار رطل ، ولكل منها الإضافات التالية: عادي (بدون إضافات) ، جنتاميسين (جرام) عند 50 ميكروغرام / مل ، كاربينيسيلين (Cb) عند 200 ميكروغرام / مل (للاختيار عبر جين مقاومة الأمبيسلين) ، وسكروز 5٪ (انظر جدول المواد).
  5. قم بإخراج السلالة المراد استخدامها للإدخال على أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. هنا ، يتم استخدام A. baumannii AB258.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذا البروتوكول في بيئة معقمة قدر الإمكان باستخدام موقد بنسن على المقعد أو خزانة السلامة البيولوجية. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية (أطراف الماصة ، وحلقات التلقيح ، وأنابيب microfuge ، وما إلى ذلك) معقمة.

2. إعداد الثقافة

  1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من A. baumannii AB258 إلى 4 مل من مرق LB في أنبوب استزراع معقم سعة 13 مل باستخدام حلقة تلقيح معقمة أو عصا تلقيح خشبية معقمة.
    ملاحظة: يتم استخدام مزرعة واحدة سعة 4 مل لعينة واحدة وعنصر تحكم واحد. زيادة عدد الثقافات اعتمادا على عدد العينات المطلوبة.
  2. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الهز (250 دورة في الدقيقة).
  3. ضع زجاجة من الماء المقطر المعقم (25-50 مل) على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامها في الخطوة 3.

3. إعداد الخلايا الكهربائية

  1. ضع جميع أنابيب الميكروفوج المعقمة سعة 1.5 مل (اثنان لكل مزرعة) وأنابيب التثقيب الكهربائي المعقمة (اثنان لكل مستزرع) على الجليد (انظر جدول المواد). احتفظ بالعينات على الثلج قدر الإمكان طوال العملية.
  2. ضع زجاجة الماء المعقم التي تم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية على الثلج.
  3. انقل 1.5 مل من المستزرع البكتيري الليلي إلى أحد أنابيب الميكروفوج سعة 1.5 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
    ملاحظة: من الأفضل إجراء الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، لكن الطرد المركزي في درجة الحرارة المحيطة مقبول وليس ضارا.
  5. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة كل المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
  6. أضف 1.5 مل أخرى من المستنبتة البكتيرية إلى نفس أنبوب الميكروفوج (microfuge). أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة كل من طاف .
  7. كرر الخطوة 3.6 مرة أخيرة مع 1 مل المتبقية من الثقافة.
  8. أضف 1 مل من الماء المعقم المثلج إلى حبيبات الخلية وأعد تعليقها بسحب لطيف حتى تختفي الحبيبات في قاع أنبوب الميكروفوج .
  9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المعاد تعليقها عند 13000 × جم لمدة 2 دقيقة.
  10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل. لا تصب المادة الطافية ، خاصة في خطوات الغسيل اللاحقة عندما تميل الخلايا إلى تكوين كريات أقل إحكاما.
  11. كرر خطوة الغسيل هذه بالماء المعقم المثلج ، الخطوات 3.8 إلى الخطوة 3.10 ، مرتين أخريين.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية برفق في 200 ميكرولتر من الماء المعقم المثلج.
  13. نقل 100 ميكرولتر من معلق الخلية النهائي إلى أنبوب الميكروفوج الثاني المثلج سعة 1.5 مل. ستصبح هذه القسمة الثانية هي التحكم السلبي في التثقيب الكهربائي. احتفظ بعينات الخلايا على الجليد.

4. التثقيب الكهربائي

  1. قم بالتسخين المسبق 1 مل من مرق LB وطبق أجار LB + Gm50 (محضر في الخطوة 1.4) لكل عينة والتحكم في حاضنة ثابتة مضبوطة على 37 درجة مئوية.
  2. في حجم مجمع يبلغ 5 ميكرولتر أو أقل ، أضف 100-200 نانوغرام لكل من البلازميد المساعد pTNS2 وبلازميد إدخال pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK إلى حصة من الخلايا المختصة كهربائيا.
  3. امزجه بنقرة لطيفة بأطراف الأصابع لضمان الخلط الكامل للبلازميدات مع الخلايا المختصة كهربائيا دون إدخال فقاعات.
  4. أضف حجما مكافئا من الماء المقطر المعقم إلى قسمة خلية التحكم السلبية واخلطها برفق على النحو الوارد أعلاه.
  5. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  6. انقل عينة الخلية بأكملها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المثلج ، ثم ضع الكوفيت مرة أخرى على الثلج. كرر لعينة خلية التحكم السالبة.
  7. إلكتروبور عينة الخلية.
    1. قم بتشغيل جهاز الحفر الكهربائي واضبطه على 2.0 كيلو فولت (25 μF ، 200 Ω) (انظر جدول المواد).
    2. امسح سطح الكوفيت بمنديل رخو لإزالة أي ثلج أو رطوبة ملتصقة.
    3. أدخل الكوفيت في جهاز الحفر الكهربائي وقم بتوصيل الصدمة الكهربائية.
    4. أضف على الفور 0.9 مل من مرق LB المسخن مسبقا إلى الخلايا الموجودة في الكوفيت وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا مع الوسائط.
    5. انقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب معطل دقيق جديد سعة 1.5 مل (درجة حرارة الغرفة).
    6. تحقق من قيمة الوقت الثابت على الكهربائي ؛ للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون هذه القيمة بين 4 و 6.
  8. كرر إجراء التثقيب الكهربائي (الخطوات 4.7.1 إلى 4.7.6) لعينة خلية التحكم السالبة.
  9. احتضان العينات الكهربائية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة للسماح باستعادة الخلايا.
  10. باستخدام موزع التلقيح ، انشر 100 ميكرولتر من كل عينة خلية كهربائية على لوحة أجار LB + Gm50 تم تسخينها مسبقا.
    1. أجهزة الطرد المركزي العينات المتبقية في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
    2. بعد إزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مرق LB.
    3. انشر كل عينة كاملة على ألواح أجار فردية LB + Gm50 تم تسخينها مسبقا.
      ملاحظة: يمكن أن تعتمد كفاءة التثقيب الكهربائي على الإجهاد. عند التفريغ الكهربائي لسلالة لأول مرة ، قد يكون من المفيد إخراج أحجام مختلفة ، أو حتى تخفيفات ، من عينة التثقيب الكهربائي للتأكد من أن الألواح الناتجة لها مستعمرات معزولة.
  11. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

5. اختيار المستعمرات المحولة للفحص القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل

  1. تحقق من لوحات التثقيب الكهربائي. يجب ألا يكون للسيطرة السلبية مستعمرات. يجب أن تحتوي العينة على مستعمرات متميزة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الألواح ذات المستعمرات ، في هذه الخطوة وفي جميع الخطوات اللاحقة حيث يتم إنتاج ألواح أجار ذات مستعمرات أو بقع ، عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل المتابعة.
  2. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، التقط ما يصل إلى 10 مستعمرات مفردة من ألواح أجار LB + Gm50 وقم بتصحيحها على لوحة أجار LB + Gm50 جديدة.
  3. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

6. التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR

  1. قم بإزالة ألواح أجار LB + Gm50 التي تحتوي على المستعمرات المرقعة من الحاضنة.
  2. باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة معقم ، قم بإزالة جزء صغير (بحجم مستعمرة كبيرة) من رقعة إلى 20 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم في أنبوب PCR سعة 0.2 مل ؛ تخلط جيدا. يجب أن تصبح عينة الماء غائمة بشكل واضح حيث يتم إطلاق الخلايا من المسواك. قم بإعداد أي عدد من العينات التي تحتاج إلى فحص ، ولكن يجب أن تكون 6 كافية.
  3. احتضان أنبوب PCR الذي يحتوي على المعلق البكتيري عند 100 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
  4. باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (انظر جدول المواد) ، قم بتدوير العينة بالسرعة القصوى الثابتة لمدة 2 دقيقة لحبيبات الحطام الخلوي.
  5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد سعة 0.2 مل وضعه على الثلج. تحتوي هذه العينة على قالب الحمض النووي لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذا القالب DNA عند -20 درجة مئوية قبل متابعة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  6. تحضير خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 1x بوليميراز المخزن المؤقت ، 200 μM dNTPs ، 0.18 μM ABglmS2_F_New التمهيدي الأمامي ، 0.18 μM Tn7R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) ، بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي (انظر جدول المواد).
  7. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 49 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
  8. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 2٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 382 bp. يجب ألا يكون للمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.
  9. تحديد العينات التي أنتجت منتج PCR المتوقع. قم بإعداد لوحة خط على ألواح أجار LB + Gm50 من أي من بقع PCR الإيجابية ؛ احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. الهدف هو إنشاء صفيحة ذات مستعمرات مفردة لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة المميزة وكنقطة انطلاق لإنشاء سلالة غير مميزة (موصوفة أدناه).

7. إزالة علامة GmR باستخدام pFLP2ab

  1. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 2: إعداد الثقافة. العينة المستخدمة لإعداد الاستزراع الليلي هي مستعمرة واحدة من ألواح أجار LB + Gm50 معدة لتوليد مستعمرات منفصلة في الخطوة 6.9.
  2. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 3: تحضير الخلايا الكهربية. تحضير الخلايا من الثقافة بين عشية وضحاها للتثقيب الكهربائي.
  3. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 4: التثقيب الكهربائي. هنا ، البلازميد الذي يجب إدخاله إلى الخلايا هو pFLP2ab (100-200 نانوغرام) ، والذي سيزيل جين مقاومة الجنتاميسين ، ويحيط بالجين الذي تم إدخاله في الكروموسومات محل الاهتمام.
  4. بعد تعافي الخلايا لمدة ساعة واحدة (الخطوة 4.9) ، انشر 100 ميكرولتر من عينة الخلية الكهربائية على صفيحة أجار LB + Cb200 تم تسخينها مسبقا (محضرة في الخطوة 1.4). يضمن هذا الضغط الانتقائي أن الخلايا التي تؤوي بلازميداستئصال pFLP2 ab فقط هي التي تنمو.
  5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  6. تحقق من لوحة المستعمرات. يجب ألا تحتوي لوحة التحكم السلبية على مستعمرات ؛ يجب أن تحتوي لوحة عينة أجار LB + Cb200 على مستعمرات متميزة.
  7. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، قم بتصحيح ما يصل إلى 20 مستعمرة معزولة على صفيحة أجار LB + Cb200 وصفيحة أجار LB + Gm50 .
  8. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  9. تحقق من اللوحات بحثا عن بقع. المستنسخة التي تنمو على صفيحة أجار LB + Cb200 ولكن ليس صفيحة أجار LB + Gm50 تمت إزالة جين مقاومة الجنتاميسين من الإدخال الأصلي.
  10. حدد البقع المقاومة للكاربينيسيلين والجنتاميسين المعرضة للخطوط على ألواح أجار LB الفردية المكملة ب 5٪ (وزن / حجم) من السكروز ، مما يفرض طرد بلازميد pFLP2ab من البكتيريا. اختر ما يصل إلى 10 مستعمرات.
  11. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  12. تحقق من لوحات المستعمرات.
  13. كتأكيد نهائي لفقدان البلازميد pFLP2ab ، عبر التصحيح 4-6 مستعمرات معزولة من ألواح السكروز 5٪ على صفيحة أجار LB + Cb200 وصفيحة أجار LB.
  14. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  15. اختر نسخة تنمو على صفيحة أجار LB ، وهي حساسة للكاربينيسيلين لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة غير المميزة.
    1. يمكن إجراء التحقق الجيني من السلالة غير المميزة باستخدام مستعمرة PCR (الخطوة 6: التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR) باستخدام البادئات التي تستهدف جين مقاومة الجنتاميسين.
    2. تحضير خليط تفاعل تفاعل تفاعل PCR يحتوي على 1x بوليميراز عازلة ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 0.18 ميكرومتر Gm_F التمهيدي الأمامي ، 0.18 ميكرومتر Gm_R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. إعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي ، والتحكم الإيجابي باستخدام الحمض النووي من السلالة الملحوظة.
    3. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
    4. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 1٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 525 نقطة أساس. يجب أن يكون للتحكم الإيجابي نطاق واحد ؛ يجب ألا يكون للعينات والمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يستغرق إجراء إدخال الكروموسومات 2 ساعة فقط إجمالا خلال 3 أيام لرؤية مستعمرات النتيجة تنمو على صفيحة أجار انتقائية (الشكل 1A-C). يعتمد العدد المتوقع للمستعمرات على لوحة التحويل على الإجهاد: يمكن للمرء أن يرى 20-30 أو حتى مئات المستعمرات حيث أن إدخال Tn7 في مواقع attTn7 محدد وفعال9. يحافظ ترقيع مستعمرات صفيحة التحويل على وسائط انتقائية (الشكل 4 أ) على السلالة المحولة ويوفر مادة أولية لفحص تفاعل الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

على الرغم من أن هذا الإجراء الخاص بالإدخال الكروموسومي لنظام التعبير الجيني أحادي النسخة القابل للحث في A. baumannii واضح تقنيا وليس كثيف العمالة ، إلا أن هناك بعض الخطوات المهمة التي يجب التأكيد عليها. أولا ، يجب أن يتم تحضير الخلايا المختصة على الجليد قدر الإمكان حيث تصبح الخلايا هشة أثناء استبدال الوسائط بالماء المثلج. من الناحية المثالية ، يتم تنفيذ خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، ولكن الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة مقبول. نظرا للهشاشة المتزايدة للخلايا أثناء غسل الماء ، فإن السحب اللطيف أمر بالغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة في كندا إلى AK. يتم إنشاء المخططات المستخدمة في الأشكال باستخدام BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 مل أنبوب PCRVWR20170-012لمستحضرات غليان المستعمرة وتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل
1.5 مل أنابيب الطرد الدقيقSarstedt72-690-301الاستخدام العام
13 مل أنابيب الاستزراع ، PyrexFisher14-957Kأوعية استزراع السوائل
6x DNA تحميل العازلةFroggabioLD010Agarose هلام الرحلان الكهربائي لعينة تحميل صبغة
الخليك حمض ، فيشر جليدي351271-212هلام الاغاروز تشغيل مكون عازلة
AgarBioshopAGR003وسائط نمو صلبة
AgaroseBioBasicD0012الفصل الكهربائي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ تستخدم بتركيز 0.8 & ndash ؛ 2٪
وحدة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروزفيشر29-237-54الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. فصل منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
CarbenicillinFisher50841231إغلاق أنبوب ثقافة الوسائط الانتقائية
فيشر13-684-138إغلاق من الفولاذ المقاوم للصدأ لأنابيب الثقافة سعة 13 مل مجموعة
ثلاثي الفوسفات ديوكسي نوكليوتيد (dNTP)BiobasicDD0058مكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ يتم توفيرها ك 100 ملي مولار لكل dATP و dCTP و dGTP و dTTP ؛ مختلطة ومخففة لمدة 10 ملي متر لكل dNTP
حمام جاف / سخان كتلةفيشر88860023Isotemp حمام جاف رقمي لمستحضرات الغليان
كوفيت التثقيب الكهربائيVWR89047-2082 مم كوفيت التثقيب الكهربائي مع غطاء دائري
المثقب الكهربائيكول بارمر940000009110 فولت تيار متردد ، 60 هرتز المثقور الكهربائي
بروميد الإيثيديومفيشرBP102-1تصور منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامة الحمض النووي في هلام الاغاروز
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) VWRCA-EM4050هلام الاغاروز يعمل مكون عازل
GentamicinBiobasicGB0217لتحضير الوسائط الانتقائية
GlycerolFisherG33تحضير مخزون البكتيريا للتخزين طويل الأجل في حاضنة مجمدة منخفضة
للغاية (اهتزاز)نيو برونزويك ScientificM1352-0000Excella E24 حاضنة شاكر لنمو الثقافة السائلة
حاضنة (ثابتة)فيشر11-690-550Dفرن حاضنة Isotemp نموذج 550D لنمو الثقافة الصلبة (LB agar)
حلقة التلقيحSarstedt86.1562.050المستعمرات المخططة على ألواح أجار موزع
التلقيحSarstedt86.1569.005انتشار الثقافة على ألواح أجار مرق
Lysogeny (LB) مرق ، LennoxFisherBP1427وسائط نمو السائل (20 جم / لتر: 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر مستخلص الخميرة)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 للطرد المركزي للعينات
أجهزة الطرد المركزي المصغرةفيشرS67601Bالطرد المركزي لأنابيب PCR 0.2 مل أطباق
بتريSPL علوم الحياة10090لوسائط النمو الصلبة (ألواح الأجار): 90 × 15 مم
ماصات  ماصات Mandelالمختلفةأحادية القناة Gilson (P10 ، P20 ، P200 ، P1000)
مزود الطاقةBiorad1645050PowerPac مصدر الطاقة الأساسي لمكون تفاعل الرحلان الكهربائي
البادئاتIDTNAPCR ؛ خاص بالجين ذي الأهمية ؛ أعدت في 100 & mu ؛ M حسب التوجيهات الواردة في ورقة مواصفات المنتج
السكروزBioBasicSB0498لإعداد وسائط مضادة لإزالة البلازميد pFLP2ab< / sup> من A. baumannii
Taq DNA polymeraseFroggaBioT-500PCR مكون تفاعل PCR ؛ البوليميراز المزود بمخزن مؤقت 10x
Thermal cyclerBiorad1861096Model T100 ل PCR
المسواكفيشرS24559لترقيع المستعمرات على ألواح أجار قاعدة
TrizmaSigmaT1503هلام الاغاروز تشغيل مكون عازلة
المياه فائقة النقاءMillipore SigmaZLXLSD51040MilliQ نظام تنقية المياه: مياه نقية للغاية لتحضير الوسائط والمحلول ، وغسل الخلايا
علامة الحمض النووي واسعة النطاقBiobasicM103R-2تحديد حجم منتجات PCR على هلام الاغاروز
عصي تلقيح خشبيةفيشر29-801-02الثقافات بمستعمرات من ألواح أجار
تلقيح

المراجع

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تعبير مضخات التدفقنظام Mini-Tn7 الكروموسوميآليات تدفق RNDالخلايا ذات الكفاءة الكهربائيةفحص PCR للمستعمراتمقاومة المضادات الحيويةإدراج الجينات
توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.