توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة

Summary

وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.

Abstract

يتم التعرف على Acinetobacter baumannii كممرض صعب سالبة الجرام بسبب مقاومته الواسعة للمضادات الحيوية. من الأهمية بمكان فهم الآليات الكامنة وراء هذه المقاومة لتصميم خيارات علاجية جديدة وفعالة. لسوء الحظ ، فإن قدرتنا على التحقيق في هذه الآليات في A. baumannii يعوقها ندرة أدوات التلاعب الجيني المناسبة. هنا ، نصف طرق استخدام نظام قائم على الكروموسومات المصغرة Tn7 لتحقيق التعبير الجيني أحادي النسخة في سلالة A. baumannii التي تفتقر إلى آليات التدفق الوظيفية من نوع RND. يعد إدخال نسخة واحدة وتعبير مضخة التدفق المستحث مفيدا جدا ، حيث أن وجود operons تدفق RND على البلازميدات ذات العدد العالي غالبا ما تتحمله الخلايا البكتيرية بشكل سيئ. علاوة على ذلك ، فإن دمج متجهات التعبير الصغيرة Tn7 المؤتلفة في كروموسوم مضيف بديل A. baumannii مع زيادة حساسية التدفق يساعد على التحايل على التداخل من مضخات التدفق الأخرى. هذا النظام ذو قيمة ليس فقط للتحقيق في مضخات التدفق البكتيري غير المميزة ولكن أيضا لتقييم فعالية المثبطات المحتملة التي تستهدف هذه المضخات.

Introduction

Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض ذات الأولوية القصوى لمنظمة الصحة العالمية نظرا لمقاومته الشاملة لجميع فئات المضادات الحيوية¹. إنه ممرض انتهازي يؤثر في الغالب على الأشخاص في المستشفى أو المصابين أو الذين يعانون من نقص المناعة. A. baumannii يتهرب إلى حد كبير من المضادات الحيوية عن طريق مضخات التدفق ، وأكثرها صلة هي عائلة مصدري قسم المقاومة (RND)². إن فهم كيفية عمل مضخات التدفق هذه ميكانيكيا سيسمح للمرء بتطوير خيارات علاجية مستهدفة.

إحدى الطرق الشائعة التي يمكن من خلالها تمييز العمليات الخلوية على وجه التحديد هي من خلال التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن الأدوات المتاحة للدراسات الجينية A. baumannii محدودة ، ولزيادة إرباك التصميم التجريبي ، غالبا ما تكون العزلات السريرية مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة بشكل روتيني للاختيار في التلاعب الجيني³. العقبة الثانية التي تمت مواجهتها عند دراسة مضخات التدفق على وجه التحديد هي أنها منظمة بشكل صارم - غالبا بعوامل غير معروفة - مما يجعل من الصعب عزل الوظيفة بدقة وعزوها إلى مضخة واحدة⁴. نظرا لهذه الحاجة إلى توسيع صندوق أدوات البحث ، قمنا بتطوير نظام تعبير قابل للحث قائم على TN7 ، وإدراج نسخة واحدة ، يشتمل على كاسيت هدف Flp recombinase (FRT) ، والذي يسمح بإزالة علامة التحديد^5،6،7 (الشكل 1). تم إنشاء نظام الاستنساخ والتعبير الأنيق هذا لأول مرة ل Pseudomonas^8،9،10 ، وقد تم استخدامه لتوليد مكملات مضخة تدفق أحادية النسخة في سلالة تعاني من نقص مضخة تدفق RND من A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK ، ΔadeFGH ، ΔadeAB: يشار إليها فيما يلي باسم A. baumannii AB258) التي أنشأناها¹¹. القدرة على دراسة مضخة تدفق واحدة في كل مرة وعدم إرباك الخلايا البكتيرية بتعبير عالي النسخ (كما هو موضح عموما مع أنظمة التعبير القائمة على البلازميد) ، يمكن للمرء أن يتعلم بشكل أفضل عن الجوانب الفسيولوجية الحرجة لكل مضخة تدفق مع الحد الأدنى من التداخل وتقليل المضاعفات.

توضح هذه المقالة كيفية استخدام نظام mini-Tn7 لاستكمال جين محذوف من الأهمية ، مضخة تدفق RND adeIJK ، في كروموسوم A. baumannii AB258 من خلال سلسلة من الخطوات غير المعقدة التي يتم إجراؤها على مدار 9 أيام⁷. تعيد المجموعة الأولى من الخطوات إدخال جينات مضخة التدفق المحذوفة المستنسخة في بلازميد الإدخال المصغر القائم على Tn7 (الشكل 2A) في موقع إدخال attTn7 الفردي في اتجاه مجرى جين glmS المحفوظ جيدا (الشكل 3A). يتم تسهيل هذه العملية من خلال بلازميد مساعد غير متماثل (الشكل 2 ب) يشفر جينات الترانسبوزاز اللازمة للإدخال المدفوع ب Tn7. تستخدم المجموعة الثانية من الخطوات بلازميد الاستئصال (الشكل 2C) لإزالة جين الجنتاميسين بوساطة Flp المجاور بمواقع FRT (الشكل 3B) لإنشاء سلالة غير مميزة. على الرغم من أن هذا النظام يستخدم لتوضيح الأدوار الأساسية والمثبطات المحتملة لمضخات تدفق RND فيما يتعلق بمقاومة المضادات الحيوية ، إلا أنه يمكن استخدامه للتحقيق في أي جين مهم.

Protocol

1. التحضير التجريبي

1. تنقية البلازميد pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (إدخال البلازميد ، الشكل 2A) مع الجين محل الاهتمام.
   ملاحظة: هنا ، الجين محل الاهتمام هو adeIJK. يجب أن يكون تركيز البلازميد النهائي ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
2. تنقية البلازميد المساعد (pTNS2)⁹ وبلازميد الاستئصال (pFLP2^ab)⁶ (الشكل 2B ، C ، على التوالي) ، من الناحية المثالية إلى تركيز الحمض النووي البلازميد النهائي من ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
3. تحضير 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء و 25 مل من مرق LB المعقم (Lennox) (انظر جدول المواد).
4. قم بإعداد ما لا يقل عن 10 ألواح أجار رطل ، ولكل منها الإضافات التالية: عادي (بدون إضافات) ، جنتاميسين (جرام) عند 50 ميكروغرام / مل ، كاربينيسيلين (Cb) عند 200 ميكروغرام / مل (للاختيار عبر جين مقاومة الأمبيسلين) ، وسكروز 5٪ (انظر جدول المواد).
5. قم بإخراج السلالة المراد استخدامها للإدخال على أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. هنا ، يتم استخدام A. baumannii AB258.
   ملاحظة: يجب تنفيذ هذا البروتوكول في بيئة معقمة قدر الإمكان باستخدام موقد بنسن على المقعد أو خزانة السلامة البيولوجية. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية (أطراف الماصة ، وحلقات التلقيح ، وأنابيب microfuge ، وما إلى ذلك) معقمة.

2. إعداد الثقافة

1. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من A. baumannii AB258 إلى 4 مل من مرق LB في أنبوب استزراع معقم سعة 13 مل باستخدام حلقة تلقيح معقمة أو عصا تلقيح خشبية معقمة.
   ملاحظة: يتم استخدام مزرعة واحدة سعة 4 مل لعينة واحدة وعنصر تحكم واحد. زيادة عدد الثقافات اعتمادا على عدد العينات المطلوبة.
2. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الهز (250 دورة في الدقيقة).
3. ضع زجاجة من الماء المقطر المعقم (25-50 مل) على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل لاستخدامها في الخطوة 3.

3. إعداد الخلايا الكهربائية

1. ضع جميع أنابيب الميكروفوج المعقمة سعة 1.5 مل (اثنان لكل مزرعة) وأنابيب التثقيب الكهربائي المعقمة (اثنان لكل مستزرع) على الجليد (انظر جدول المواد). احتفظ بالعينات على الثلج قدر الإمكان طوال العملية.
2. ضع زجاجة الماء المعقم التي تم تخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية على الثلج.
3. انقل 1.5 مل من المستزرع البكتيري الليلي إلى أحد أنابيب الميكروفوج سعة 1.5 مل.
4. أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
   ملاحظة: من الأفضل إجراء الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، لكن الطرد المركزي في درجة الحرارة المحيطة مقبول وليس ضارا.
5. باستخدام ماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة كل المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
6. أضف 1.5 مل أخرى من المستنبتة البكتيرية إلى نفس أنبوب الميكروفوج (microfuge). أجهزة الطرد المركزي في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة ، ثم إزالة كل من طاف .
7. كرر الخطوة 3.6 مرة أخيرة مع 1 مل المتبقية من الثقافة.
8. أضف 1 مل من الماء المعقم المثلج إلى حبيبات الخلية وأعد تعليقها بسحب لطيف حتى تختفي الحبيبات في قاع أنبوب الميكروفوج .
9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المعاد تعليقها عند 13000 × جم لمدة 2 دقيقة.
10. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة سعة 1 مل. لا تصب المادة الطافية ، خاصة في خطوات الغسيل اللاحقة عندما تميل الخلايا إلى تكوين كريات أقل إحكاما.
11. كرر خطوة الغسيل هذه بالماء المعقم المثلج ، الخطوات 3.8 إلى الخطوة 3.10 ، مرتين أخريين.
12. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية برفق في 200 ميكرولتر من الماء المعقم المثلج.
13. نقل 100 ميكرولتر من معلق الخلية النهائي إلى أنبوب الميكروفوج الثاني المثلج سعة 1.5 مل. ستصبح هذه القسمة الثانية هي التحكم السلبي في التثقيب الكهربائي. احتفظ بعينات الخلايا على الجليد.

4. التثقيب الكهربائي

1. قم بالتسخين المسبق 1 مل من مرق LB وطبق أجار LB + Gm⁵⁰ (محضر في الخطوة 1.4) لكل عينة والتحكم في حاضنة ثابتة مضبوطة على 37 درجة مئوية.
2. في حجم مجمع يبلغ 5 ميكرولتر أو أقل ، أضف 100-200 نانوغرام لكل من البلازميد المساعد pTNS2 وبلازميد إدخال pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK إلى حصة من الخلايا المختصة كهربائيا.
3. امزجه بنقرة لطيفة بأطراف الأصابع لضمان الخلط الكامل للبلازميدات مع الخلايا المختصة كهربائيا دون إدخال فقاعات.
4. أضف حجما مكافئا من الماء المقطر المعقم إلى قسمة خلية التحكم السلبية واخلطها برفق على النحو الوارد أعلاه.
5. احتضان العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة.
6. انقل عينة الخلية بأكملها إلى كوفيت التثقيب الكهربائي المثلج ، ثم ضع الكوفيت مرة أخرى على الثلج. كرر لعينة خلية التحكم السالبة.
7. إلكتروبور عينة الخلية.
   1. قم بتشغيل جهاز الحفر الكهربائي واضبطه على 2.0 كيلو فولت (25 μF ، 200 Ω) (انظر جدول المواد).
   2. امسح سطح الكوفيت بمنديل رخو لإزالة أي ثلج أو رطوبة ملتصقة.
   3. أدخل الكوفيت في جهاز الحفر الكهربائي وقم بتوصيل الصدمة الكهربائية.
   4. أضف على الفور 0.9 مل من مرق LB المسخن مسبقا إلى الخلايا الموجودة في الكوفيت وماصة بلطف لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا مع الوسائط.
   5. انقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب معطل دقيق جديد سعة 1.5 مل (درجة حرارة الغرفة).
   6. تحقق من قيمة الوقت الثابت على الكهربائي ؛ للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن تكون هذه القيمة بين 4 و 6.
8. كرر إجراء التثقيب الكهربائي (الخطوات 4.7.1 إلى 4.7.6) لعينة خلية التحكم السالبة.
9. احتضان العينات الكهربائية عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة عند 250 دورة في الدقيقة للسماح باستعادة الخلايا.
10. باستخدام موزع التلقيح ، انشر 100 ميكرولتر من كل عينة خلية كهربائية على لوحة أجار LB + Gm⁵⁰ تم تسخينها مسبقا.
    1. أجهزة الطرد المركزي العينات المتبقية في 13000 × غرام لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.
    2. بعد إزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من مرق LB.
    3. انشر كل عينة كاملة على ألواح أجار فردية LB + Gm⁵⁰ تم تسخينها مسبقا.
       ملاحظة: يمكن أن تعتمد كفاءة التثقيب الكهربائي على الإجهاد. عند التفريغ الكهربائي لسلالة لأول مرة ، قد يكون من المفيد إخراج أحجام مختلفة ، أو حتى تخفيفات ، من عينة التثقيب الكهربائي للتأكد من أن الألواح الناتجة لها مستعمرات معزولة.
11. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

5. اختيار المستعمرات المحولة للفحص القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل

1. تحقق من لوحات التثقيب الكهربائي. يجب ألا يكون للسيطرة السلبية مستعمرات. يجب أن تحتوي العينة على مستعمرات متميزة.
   ملاحظة: يمكن تخزين الألواح ذات المستعمرات ، في هذه الخطوة وفي جميع الخطوات اللاحقة حيث يتم إنتاج ألواح أجار ذات مستعمرات أو بقع ، عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل المتابعة.
2. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، التقط ما يصل إلى 10 مستعمرات مفردة من ألواح أجار LB + Gm⁵⁰ وقم بتصحيحها على لوحة أجار LB + Gm⁵⁰ جديدة.
3. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.

6. التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR

1. قم بإزالة ألواح أجار LB + Gm⁵⁰ التي تحتوي على المستعمرات المرقعة من الحاضنة.
2. باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة معقم ، قم بإزالة جزء صغير (بحجم مستعمرة كبيرة) من رقعة إلى 20 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم في أنبوب PCR سعة 0.2 مل ؛ تخلط جيدا. يجب أن تصبح عينة الماء غائمة بشكل واضح حيث يتم إطلاق الخلايا من المسواك. قم بإعداد أي عدد من العينات التي تحتاج إلى فحص ، ولكن يجب أن تكون 6 كافية.
3. احتضان أنبوب PCR الذي يحتوي على المعلق البكتيري عند 100 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
4. باستخدام جهاز طرد مركزي صغير (انظر جدول المواد) ، قم بتدوير العينة بالسرعة القصوى الثابتة لمدة 2 دقيقة لحبيبات الحطام الخلوي.
5. انقل المادة الطافية إلى أنبوب PCR جديد سعة 0.2 مل وضعه على الثلج. تحتوي هذه العينة على قالب الحمض النووي لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
   ملاحظة: يمكن تخزين هذا القالب DNA عند -20 درجة مئوية قبل متابعة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
6. تحضير خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 1x بوليميراز المخزن المؤقت ، 200 μM dNTPs ، 0.18 μM ABglmS2_F_New التمهيدي الأمامي ، 0.18 μM Tn7R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. قم بإعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) ، بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي (انظر جدول المواد).
7. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 49 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
8. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 2٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 382 bp. يجب ألا يكون للمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.
9. تحديد العينات التي أنتجت منتج PCR المتوقع. قم بإعداد لوحة خط على ألواح أجار LB + Gm⁵⁰ من أي من بقع PCR الإيجابية ؛ احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. الهدف هو إنشاء صفيحة ذات مستعمرات مفردة لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة المميزة وكنقطة انطلاق لإنشاء سلالة غير مميزة (موصوفة أدناه).

7. إزالة علامة Gm^R باستخدام pFLP2^ab

1. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 2: إعداد الثقافة. العينة المستخدمة لإعداد الاستزراع الليلي هي مستعمرة واحدة من ألواح أجار LB + Gm⁵⁰ معدة لتوليد مستعمرات منفصلة في الخطوة 6.9.
2. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 3: تحضير الخلايا الكهربية. تحضير الخلايا من الثقافة بين عشية وضحاها للتثقيب الكهربائي.
3. اتبع الإجراء المذكور في الخطوة 4: التثقيب الكهربائي. هنا ، البلازميد الذي يجب إدخاله إلى الخلايا هو pFLP2^ab (100-200 نانوغرام) ، والذي سيزيل جين مقاومة الجنتاميسين ، ويحيط بالجين الذي تم إدخاله في الكروموسومات محل الاهتمام.
4. بعد تعافي الخلايا لمدة ساعة واحدة (الخطوة 4.9) ، انشر 100 ميكرولتر من عينة الخلية الكهربائية على صفيحة أجار LB + Cb²⁰⁰ تم تسخينها مسبقا (محضرة في الخطوة 1.4). يضمن هذا الضغط الانتقائي أن الخلايا التي تؤوي بلازميد^{استئصال} pFLP2 ab فقط هي التي تنمو.
5. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
6. تحقق من لوحة المستعمرات. يجب ألا تحتوي لوحة التحكم السلبية على مستعمرات ؛ يجب أن تحتوي لوحة عينة أجار LB + Cb²⁰⁰ على مستعمرات متميزة.
7. باستخدام أعواد أسنان معقمة ، قم بتصحيح ما يصل إلى 20 مستعمرة معزولة على صفيحة أجار LB + Cb²⁰⁰ وصفيحة أجار LB + Gm⁵⁰ .
8. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
9. تحقق من اللوحات بحثا عن بقع. المستنسخة التي تنمو على صفيحة أجار LB + Cb²⁰⁰ ولكن ليس صفيحة أجار LB + Gm⁵⁰ تمت إزالة جين مقاومة الجنتاميسين من الإدخال الأصلي.
10. حدد البقع المقاومة للكاربينيسيلين والجنتاميسين المعرضة للخطوط على ألواح أجار LB الفردية المكملة ب 5٪ (وزن / حجم) من السكروز ، مما يفرض طرد بلازميد pFLP2^ab من البكتيريا. اختر ما يصل إلى 10 مستعمرات.
11. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
12. تحقق من لوحات المستعمرات.
13. كتأكيد نهائي لفقدان البلازميد pFLP2^ab ، عبر التصحيح 4-6 مستعمرات معزولة من ألواح السكروز 5٪ على صفيحة أجار LB + Cb²⁰⁰ وصفيحة أجار LB.
14. احتضان الألواح لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
15. اختر نسخة تنمو على صفيحة أجار LB ، وهي حساسة للكاربينيسيلين لإعداد مخزون الجلسرين للحفاظ على هذه السلالة غير المميزة.
    1. يمكن إجراء التحقق الجيني من السلالة غير المميزة باستخدام مستعمرة PCR (الخطوة 6: التحقق من إدخال الكروموسومات بواسطة مستعمرة PCR) باستخدام البادئات التي تستهدف جين مقاومة الجنتاميسين.
    2. تحضير خليط تفاعل تفاعل تفاعل PCR يحتوي على 1x بوليميراز عازلة ، 200 ميكرومتر dNTPs ، 0.18 ميكرومتر Gm_F التمهيدي الأمامي ، 0.18 ميكرومتر Gm_R التمهيدي العكسي (الجدول 1) ، 1 U من Taq DNA polymerase ، و 1 μL من DNA القالب المحضر بحجم إجمالي 25 ميكرولتر. إعداد عنصر تحكم بدون قالب (NTC) بما في ذلك كل ما عدا قالب الحمض النووي ، والتحكم الإيجابي باستخدام الحمض النووي من السلالة الملحوظة.
    3. أدخل ظروف التفاعل في دورة حرارية: 95 °C لمدة 2 دقيقة ؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية لما مجموعه 35 دورة ؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ؛ عقد 12 درجة مئوية. قم بتشغيل العينات.
    4. بعد إضافة صبغة تحميل الحمض النووي إلى تركيز نهائي قدره 1x ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام أغاروز 1٪ وقم بتشغيله عند 80 فولت لمدة 40 دقيقة. حجم amplicon المتوقع لهذا الزوج التمهيدي هو 525 نقطة أساس. يجب أن يكون للتحكم الإيجابي نطاق واحد ؛ يجب ألا يكون للعينات والمجلس الوطني الانتقالي نطاقات.

Results

يستغرق إجراء إدخال الكروموسومات 2 ساعة فقط إجمالا خلال 3 أيام لرؤية مستعمرات النتيجة تنمو على صفيحة أجار انتقائية (الشكل 1A-C). يعتمد العدد المتوقع للمستعمرات على لوحة التحويل على الإجهاد: يمكن للمرء أن يرى 20-30 أو حتى مئات المستعمرات حيث أن إدخال Tn7 في مواقع attTn7 محدد وفعال⁹. يحافظ ترقيع مستعمرات صفيحة التحويل على وسائط انتقائية (الشكل 4 أ) على السلالة المحولة ويوفر مادة أولية لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة (الشكل 1E والشكل 4 ب). يمكن الاحتفاظ بفحص المستعمرات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى الحد الأدنى - لا ينبغي معالجة أكثر من 10 مستعمرات ، ويجب أن يسفر معظمها عن نتيجة إيجابية للإدخال. منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لبادئات الفحص ، ABglmS2_F_New و Tn7R (الجدول 1) ، هو 382 نقطة أساس (الشكل 4B حارة 4) ؛ تشمل الضوابط السلبية للتفاعل النوع البري A. baumannii ATCC 17978 (الشكل 4B حارة 2) ، AB258 (الشكل 4B حارة 3) ، ولا يوجد قالب (الشكل 4B حارة 5). تمثل المستعمرات الإيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل سلالات مكملة وملحوظة.

تستغرق إزالة جين مقاومة الجنتاميسين (غير العلامات) أقل من 3 ساعات ، وتمتد 6 أيام حيث يجب اختيار الخلايا التي تتحول مع بلازميد الاستئصال من خلال الطلاء الانتقائي ، ومن ثم يحتاج بلازميد الاستئصال إلى الشفاء من البكتيريا (الشكل 1F). الاستئصال القائم على إعادة التركيب Flp-FRT دقيق وفعال ويجب أن يؤدي إلى ≥20 مستعمرة على لوحة التحويل. يجب أن تكون المستعمرات التي يتم ترقيعها على الكربينيسيلين (اختيار مقاومة β لاكتام التي يمنحها بلازميد الختان) والجنتاميسين (تبحث عن فقدان مقاومة الجنتاميسين) مقاومة للكاربينيسيلين وحساسة للجنتاميسين ، على التوالي. يتم إجبار بلازميد الاستئصال على الخروج من البكتيريا عن طريق النمو على ألواح أجار السكروز بنسبة 5٪. النمو على السكروز يجبر الخلايا على القضاء على pFLP2^ab لأن جين sacB على البلازميد يعزز تحويل السكروز إلى ليفان ، وهو عديد السكاريد السام للبكتيريا^12,13. يجب أن تنمو جميع المستعمرات التي تنمو على وسائط السكروز بنسبة 5٪ فقط على ألواح أجار LB عادية ؛ يجب ألا يكون هناك نمو على ألواح أجار كاربينيسيلين. تمثل المستعمرات التي تنمو على صفائح أجار LB العادية سلالات غير مميزة. يمكن تحقيق تأكيد فقدان علامة الجنتاميسين عن طريق مستعمرة PCR باستخدام Gm_F وبادئات Gm_R (الجدول 1 والشكل 5). ينتج هذا الزوج التمهيدي amplicon من 525 bp فقط في السيطرة الإيجابية (سلالة ملحوظ تم إنشاؤها في البداية ، الشكل 5 حارة 4) ؛ يجب ألا يظهر ATCC 17978 من النوع البري (الشكل 5 حارة 2) ، AB258 (الشكل 5 حارة 3) ، أي مستعمرة تم اختبارها (الشكل 5 حارة 5) ، وعنصر التحكم بدون قالب (الشكل 5 حارة 6) تضخيما.

بمجرد تأكيد السلالة غير المميزة ، يمكن أن يبدأ الاختبار الوظيفي بمقايسات النمط الظاهري. هنا ، الخيار الأول الواضح هو تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لمجموعة من المضادات الحيوية: سيبروفلوكساسين هو ركيزة معروفة من AdeIJK ، ويمكن إزالة التتراسيكلين بواسطة AdeIJK (مضخة التدفق الرئيسية هي AdeAB) ، والكاناميسين له تأثير طفيف نسبيا على A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. باستخدام طريقة التخفيف الدقيق للمرق وفقا لإرشادات CLSI¹⁵ ، تم تحدي السلالة غير المميزة المتممة AB258::adeIJK مع كل مضاد حيوي في غياب ووجود 50 ميكرومتر IPTG. تم تضمين السلالة البرية ATCC 17978 والسلالة التي تعاني من نقص تدفق RND AB258 كضوابط (الجدول 2). بشكل عام ، يخبرنا الاتجاه الذي شوهد في قيم MIC بانخفاض حساسية القصة المتوقعة ل AB258::adeIJK للسيبروفلوكساسين والتتراسيكلين مع التعبير المستحث لمضخة التدفق ، مما يؤكد أن إدخال adeIJK كان ناجحا.

الشكل 1: نظرة عامة على الإجراء. (أ) يتم تحضير مزرعة ليلية لسلالة A. baumannii لاستكمالها. (ب) تغسل خلايا مزرعة الليل بالماء 3 مرات عن طريق الطرد المركزي وتحفظ على الجليد. (ج) تضاف بلازميدات التوصيل والبلازميدات المساعدة إلى الخلايا وتحتضن على الجليد لمدة 20 دقيقة. يتم حفر العينة بالكهرباء ، وتتم إضافة وسائط LB ، ويسمح للخلايا بالتعافي لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. يتم نشر حصة 100 ميكرولتر من الخلايا على ألواح أجار LB + Gm⁵⁰ ويتم حضنها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. (د) يتم ترقيع المستعمرات من لوحة التحويل على صفيحة أجار LB + Gm⁵⁰ وتنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية. (ه) يتم تحضير المستعمرات المرقعة لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل لفحص وجود منتج تضخيم يمتد عبر موقع إدخال الكروموسومات. يتم تصور تضخيم PCR بواسطة الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز. تمثل العينات الإيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل الإدخال الناجح للجين محل الاهتمام في الكروموسوم وإنشاء سلالة ملحوظة. (F) يتم تحضير مستعمرة موجبة للجنتاميسين كما في الخطوات (A-C) ، مع التثقيب الكهربائي لبلازميد pLFP2^ab لإزالة كاسيت الجنتاميسين من إدخال الكروموسومات. الطلاء الانتقائي على LB + Cb²⁰⁰ أجار يؤكد امتصاص البلازميد. يكشف الترقيع المكرر على ألواح أجار LB + Cb²⁰⁰ و LB + Gm⁵⁰ عن مستعمرات Cb^R و Gm^S تؤكد فقدان كاسيت الجنتاميسين من الإدراج. نمو مستعمرات Cb^R المختارة على 5٪ سكروز يعالج بلازميد pLFP2^ab من الخلايا. يتم ترقيع المستعمرات من صفيحة السكروز بنسبة 5٪ على LB + Cb²⁰⁰ agar و LB agar للكشف عن مستعمرات Cb^S و Gm^S المرغوبة وتأكيد إنشاء السلالة غير المميزة. جم⁵⁰ ، جنتاميسين عند 50 ميكروغرام / مل ؛ Cb²⁰⁰ ، كاربينيسيلين عند 200 ميكروغرام / مل ؛ ^R ، مقاومة. ^S ، حساسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: البلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول. خرائط البلازميد العامة ل (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (بلازميد الإدراج) ، (B) pTNS2 (البلازميد المساعد) ، و (C) pFLP2^ab (بلازميد الختان). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: رسم تخطيطي للإدراج وإلغاء العلامات. (أ) الإدراج. يقع موقع إدخال Tn7 الفردي في كروموسوم A. baumannii على بعد 24 نقطة أساس من نهاية جين glmS2 . يسمح التثقيب الكهربائي المشترك لبلازميد الإدخال والبلازميد المساعد باستكمال الجين محل الاهتمام (الجين المدرج ، الأرجواني) جنبا إلى جنب مع بقية شريط الإدخال (مواقع FRT لاستئصال العلامة ، الأصفر ؛ جين accC1 لمقاومة الجنتاميسين ، أخضر ؛ lacIq الجين للتعبير المستحث ، الأزرق) في الكروموسوم. (ب) رفع العلامات. يسهل التثقيب الكهربائي لسلالة الإدخال التكميلية والملحوظة مع بلازميد استئصال pFLP2^ab إزالة جين مقاومة الجنتاميسين (accC1 ، الأخضر) عبر إعادة تركيب Flp-FRT (مواقع FRT ، صفراء) ، مما يخلق سلالة غير مميزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأكيد التحويل والترقيع والإدراج بواسطة مستعمرة PCR. نتيجة تمثيلية ل (أ) نمو مستعمرات التحول بعد الترقيع ، و (ب) تضخيم مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع ABglmS_F_New (رمادي) و Tn7R (برتقالي) بادئات لتأكيد إدخال الكروموسومات. الحارة 1: سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ؛ حارة 2: ATCC 179798 ؛ حارة 3: AB258 ؛ حارة 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; الحارة 5: التحكم بدون قالب. تم تصنيف النطاق المتوقع البالغ 382 نقطة أساس. لاحظ أنه يمكن أيضا استخدام البادئات الخاصة بالجنتاميسين (Gm_F و Gm_R ، الأخضر) لتأكيد إدخال الكروموسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تأكيد فقدان العلامة بواسطة مستعمرة PCR. نتيجة تمثيلية لتضخيم PCR للمستعمرة باستخدام مواد أولية خاصة بالجنتاميسين (Gm_F و Gm_R) لتأكيد فقدان علامة المضادات الحيوية عن طريق الاستئصال القائم على^{pFLP ab}. الحارة 1: سلم الحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي ؛ حارة 2: ATCC 179798 ؛ حارة 3: AB258 ؛ حارة 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; حارة 5: AB258::adeIJK ؛ الحارة 6: التحكم بدون قالب. تم تصنيف النطاق المتوقع البالغ 525 نقطة أساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السلالات والبلازميدات والبادئات	الخصائص ذات الصلة	مرجع
وصمه عار
أ. بوماني ATCC 17978	سلالة النوع	أتش تيه تي سي
أ. بوماني ATCC 17978 AB258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
البلازميدات
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	جي إمآر ، أمبيرآر	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	جي إمآر ، أمبيرآر ، أديجك	هذه الدراسة
pTNS2	أمبيرص	9
pFLP2أب	pWH1266 الأصل أو النسخ المتماثل ، sacB ، AmpR	7
الاشعال	التسلسل (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Tn7R	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	هذه الدراسة
Gm_R	TGTTAGGTGGCGGTACTTGG	هذه الدراسة

الجدول 1: السلالات البكتيرية والبلازميدات والبادئات المستخدمة في هذا البروتوكول. جنرال موتورز ، جنتاميسين. أمبير ، الأمبيسلين. ^R ، مقاومة.

	سيبروفلوكساسين		التتراسيكلين		كاناميسين
إيبتج	−	+	−	+	−	+
ATCC 17978	0.250	الثانية	0.500	الثانية	1.5	الثانية
AB258	0.031	الثانية	0.063	الثانية	4	الثانية
AB258 :: أديجك	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
أضعاف التغيير		4.01		4.03		0.25

الجدول 2: اختبار وظائف الجينات المدرجة عن طريق الحساسية للمضادات الحيوية. مقارنة قيم الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) ل A. baumannii ATCC 17978 و AB258 غير المستحث :: adeIJK و AB258::adeIJK الناجم عن IPTG مقابل سيبروفلوكساسين والتتراسيكلين والكاناميسين. تغيير الطي = المستحث (+ IPTG) / غير المستحث (- IPTG) ؛ الثانية = غير محدد.

Discussion

على الرغم من أن هذا الإجراء الخاص بالإدخال الكروموسومي لنظام التعبير الجيني أحادي النسخة القابل للحث في A. baumannii واضح تقنيا وليس كثيف العمالة ، إلا أن هناك بعض الخطوات المهمة التي يجب التأكيد عليها. أولا ، يجب أن يتم تحضير الخلايا المختصة على الجليد قدر الإمكان حيث تصبح الخلايا هشة أثناء استبدال الوسائط بالماء المثلج. من الناحية المثالية ، يتم تنفيذ خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، ولكن الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة مقبول. نظرا للهشاشة المتزايدة للخلايا أثناء غسل الماء ، فإن السحب اللطيف أمر بالغ الأهمية أيضا. ثانيا ، التثقيب الكهربائي حساس لوجود الأيونات. يضمن غسل الخلايا بجولات متعددة من التكوير وتعليقها في الماء إزالة الوسائط بالكامل. أيضا ، يجب تنقية البلازميدات حديثا ويمكن استخلاصها في مخازن شطف المجموعة القياسية (عادة عازلة TE) طالما أن تركيز الحمض النووي للبلازميد مرتفع بدرجة كافية. نهدف إلى إضافة <5 ميكرولتر من البلازميد إلى 100 ميكرولتر من معلق الخلية للحفاظ على القوة الأيونية للعينة منخفضة جدا ، على الرغم من أنه يجب تحمل ما يصل إلى 10 ميكرولتر. ثالثا ، يجب تحضير ألواح الآجار الانتقائية حسب الحاجة لضمان فعالية المضاد الحيوي المضاف. لاحظ أنه تم استخدام carbenicillin بدلا من الأمبيسلين المعتاد للاختيار أثناء تحويل بلازميد الاستئصال ، pFLP2^ab. A. baumannii مقاوم جوهريا للأمينوبينيسيلين (الأمبيسلين)¹⁶ ؛ يسمح استبدال كربوكسي بنسلين (كاربينيسيلين) بالانتقاء المستمر باستخدام β-lactamase المشفر بالبلازميد.

يعد تحسين البروتوكول التجريبي أكثر دقة وسيختلف بين الأنواع المختلفة من Acinetobacter (أو حتى السلالات التي تم التلاعب بها وراثيا داخل نفس النوع) وربما الكواشف المعينة المستخدمة في المختبر. على سبيل المثال ، يمكن أن يتراوح الجهد المستخدم في التثقيب الكهربائي بين 1.8 و 2.5 كيلو فولت ، وقد تحتاج ظروف التدوير الحراري إلى تغيير طفيف اعتمادا على بوليميراز الحمض النووي المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. تتضمن التلميحات المفيدة التي يجب مراعاتها فيما إذا كانت الخلايا تنمو بشكل سيئ بعد التثقيب الكهربائي تقليل تركيز الجنتاميسين في ألواح الآجار من 50 ميكروغرام / مل إلى 30 ميكروغرام / مل و / أو تمديد وقت حضانة ألواح الآجار إلى ≥24 ساعة. فيما يتعلق بخطوات إزالة كاسيت الجنتاميسين ، يمكن تحقيق نجاح أفضل باستخدام ألواح أجار LB مع 10٪ سكروز و / أو حضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ≥24 ساعة إذا استمرت مقاومة الكاربينيسيلين.

يمكن العثور على العديد من طرق تحضير خلايا A. baumannii للاستخدام مع التثقيب الكهربائي في الأدبيات ، ولكنها غالبا ما تتضمن خطوة تثاقف فرعية بعد الثقافة الأولية بين عشية وضحاها ثم مرحلة نمو طويلة إلى كثافة بصرية محددة. لقد وجدنا أنه يمكن استخدام ثقافة بسيطة بين عشية وضحاها بنفس الفعالية. تم وصف التثقيب الكهربائي ل A. baumannii بشكل جيد ، ويمكن للقراء اكتساب مزيد من التبصر في هذا الجانب المحدد من البروتوكول هنا^17,18. تتمثل المزايا الرئيسية لنظام تكملة الجينات الكروموسومية mini-Tn7 مقارنة بنظام التكملة القائم على البلازميد في القدرة على تنظيم مستوى التعبير عن الجين المكمل من خلال نظام قمع lacI^q الذي يمكن التحكم فيه بواسطة IPTG واختيار إزالة علامة الجنتاميسين (جين aacC1) عبر مواقع FRT المرافقة. وقد لوحظ أن تحمل الخلايا للتعبير عن مضخات التدفق يمكن أن يختلف اعتمادا على المضخة المدخلة. على سبيل المثال ، تكون الخلايا أكثر حساسية للتعبير عن AdeIJK مقارنة ب AdeABC أو AdeFGH ؛ ويمكن معالجة ذلك عن طريق تعديل تركيز IPTG في ظروف الاستزراع. تقلل إزالة علامة المضادات الحيوية من خطر الطفرات على السلالة بسبب ضغط الاختيار المستمر وتسمح أيضا بإجراء فحوصات غير مقيدة لحساسية المضادات الحيوية³.

تم استخدام نظام mini-Tn7 هذا بنجاح مع أنواع Pseudomonas^9،10 و Yersinia⁹ و Burkholderia¹⁹ و Xanthomonas²⁰ و Acinetobacter^5،6،21،22 ، ومع ذلك ، توجد بعض القيود. على سبيل المثال ، في A. baumannii ، يوجد موقع إدخال وظيفي واحد فقط attTn7 في الجينوم⁵ ، لذلك يمكن إنشاء سلالة بعمليات حذف متعددة ، ولكن يمكن استكمال جين واحد فقط في كل مرة. أيضا ، لم يثبت هذا النظام فعاليته بعد للبكتيريا إيجابية الجرام¹⁰.

مضخات تدفق RND هي ميسرات مهمة لمقاومة المضادات الحيوية في A. baumannii. ما يجعلها قوية للغاية هو هيكلها المكون من ثلاثة أجزاء يمتد عبر الأغشية الداخلية والخارجية ، مما يسمح بإزالة المضادات الحيوية من المحيط إلى خارج الخلية. لقد ثبت أن مضخات RND الأكثر دراسة وانتشارا - AdeABC و AdeFGH و AdeIJK - تقضي على المضادات الحيوية التي تشمل جميع الفئات. سيوفر توضيح وظيفة مضخة التدفق بالتفصيل نقطة انطلاق جيدة لتصميم خيارات علاجية جديدة ضد السلالات المقاومة للأدوية المتعددة. يسمح استخدام سلالة حذف مضخة RND الثلاثية AB258 واستكمال مضخة واحدة في كل مرة بدراسة كل مضخة بشكل مستقل عن المضخات الأخرى ، وتمييز كل منها ملامح الركيزة الفريدة والمثبطات الأكثر فعالية. بالطبع ، تلعب مضخات التدفق أيضا دورا "يوميا" في الوظيفة الطبيعية للبكتيريا. إن فهم هذه الأدوار يمكن أن يؤدي إلى شلل غير مباشر للمضخات، الأمر الذي من شأنه بدوره أن يوقف تدفق المضادات الحيوية، وربما يجعل البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة عرضة للمضادات الحيوية شائعة الاستخدام مرة أخرى. بشكل عام ، يمكن استخدام نظام mini-Tn7 لإدخال أي جين مهم للدراسة التفصيلية أو العلامات المفيدة ، على سبيل المثال ، البروتينات الفلورية للتصوير المجهري⁶.

إن الانتشار المتزايد للبكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة هو مصدر قلق لنا جميعا. إن فهم آليات الحماية التي توفرها مضخات التدفق في مسببات الأمراض مثل A. baumannii أمر بالغ الأهمية لمكافحة العدوى الخطيرة. يعد نظام التعبير الجيني أحادي النسخة الكروموسومي هذا أداة قوية للدراسات الميكانيكية وكذلك لتحديد مثبطات إحباط وظيفة مضخة التدفق.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 مل أنبوب PCR	VWR	20170-012	لمستحضرات غليان المستعمرة وتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل
1.5 مل أنابيب الطرد الدقيق	Sarstedt	72-690-301	الاستخدام العام
13 مل أنابيب الاستزراع ، Pyrex	Fisher	14-957K	أوعية استزراع السوائل
6x DNA تحميل العازلة	Froggabio	LD010	Agarose هلام الرحلان الكهربائي لعينة تحميل صبغة
الخليك حمض ، فيشر جليدي		351271-212	هلام الاغاروز تشغيل مكون عازلة
Agar	Bioshop	AGR003	وسائط نمو صلبة
Agarose	BioBasic	D0012	الفصل الكهربائي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ تستخدم بتركيز 0.8 & ndash ؛ 2٪
وحدة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز	فيشر	29-237-54	الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. فصل منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
Carbenicillin	Fisher	50841231	إغلاق أنبوب ثقافة الوسائط الانتقائية
	فيشر	13-684-138	إغلاق من الفولاذ المقاوم للصدأ لأنابيب الثقافة سعة 13 مل مجموعة
ثلاثي الفوسفات ديوكسي نوكليوتيد (dNTP)	Biobasic	DD0058	مكون تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ؛ يتم توفيرها ك 100 ملي مولار لكل dATP و dCTP و dGTP و dTTP ؛ مختلطة ومخففة لمدة 10 ملي متر لكل dNTP
حمام جاف / سخان كتلة	فيشر	88860023	Isotemp حمام جاف رقمي لمستحضرات الغليان
كوفيت التثقيب الكهربائي	VWR	89047-208	2 مم كوفيت التثقيب الكهربائي مع غطاء دائري
المثقب الكهربائي	كول بارمر	940000009	110 فولت تيار متردد ، 60 هرتز المثقور الكهربائي
بروميد الإيثيديوم	فيشر	BP102-1	تصور منتجات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامة الحمض النووي في هلام الاغاروز
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) VWR		CA-EM4050	هلام الاغاروز يعمل مكون عازل
Gentamicin	Biobasic	GB0217	لتحضير الوسائط الانتقائية
Glycerol	Fisher	G33	تحضير مخزون البكتيريا للتخزين طويل الأجل في حاضنة مجمدة منخفضة
للغاية (اهتزاز)	نيو برونزويك Scientific	M1352-0000	Excella E24 حاضنة شاكر لنمو الثقافة السائلة
حاضنة (ثابتة)	فيشر	11-690-550D	فرن حاضنة Isotemp نموذج 550D لنمو الثقافة الصلبة (LB agar)
حلقة التلقيح	Sarstedt	86.1562.050	المستعمرات المخططة على ألواح أجار موزع
التلقيح	Sarstedt	86.1569.005	انتشار الثقافة على ألواح أجار مرق
Lysogeny (LB) مرق ، Lennox	Fisher	BP1427	وسائط نمو السائل (20 جم / لتر: 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر مستخلص الخميرة)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 للطرد المركزي للعينات
أجهزة الطرد المركزي المصغرة	فيشر	S67601B	الطرد المركزي لأنابيب PCR 0.2 مل أطباق
بتري	SPL علوم الحياة	10090	لوسائط النمو الصلبة (ألواح الأجار): 90 × 15 مم
ماصات	ماصات Mandel	المختلفة	أحادية القناة Gilson (P10 ، P20 ، P200 ، P1000)
مزود الطاقة	Biorad	1645050	PowerPac مصدر الطاقة الأساسي لمكون تفاعل الرحلان الكهربائي
البادئات	IDT	NA	PCR ؛ خاص بالجين ذي الأهمية ؛ أعدت في 100 & mu ؛ M حسب التوجيهات الواردة في ورقة مواصفات المنتج
السكروز	BioBasic	SB0498	لإعداد وسائط مضادة لإزالة البلازميد pFLP2ab< / sup> من A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR مكون تفاعل PCR ؛ البوليميراز المزود بمخزن مؤقت 10x
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 ل PCR
المسواك	فيشر	S24559	لترقيع المستعمرات على ألواح أجار قاعدة
Trizma	Sigma	T1503	هلام الاغاروز تشغيل مكون عازلة
المياه فائقة النقاء	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ نظام تنقية المياه: مياه نقية للغاية لتحضير الوسائط والمحلول ، وغسل الخلايا
علامة الحمض النووي واسعة النطاق	Biobasic	M103R-2	تحديد حجم منتجات PCR على هلام الاغاروز
عصي تلقيح خشبية	فيشر	29-801-02	الثقافات بمستعمرات من ألواح أجار