تشريح ، المعالجة النسيجية ، وتحليل التعبير الجيني للأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة

أثار الانتشار المتزايد للسمنة في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم اهتماما كبيرا بفهم مسبباتها وتحديد العلاجات المحتملة ^1,2. تلعب الأنسجة الدهنية دورا حيويا في عملية التمثيل الغذائي ، ويمكن أن يؤدي عدم تنظيم الأنسجة الدهنية إلى تطور السمنة. بشكل عام ، هناك نوعان من الأنسجة الدهنية ، الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية. في حين أن الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) يمكنها تخزين الطاقة الكيميائية وإفراز عوامل الغدد الصماء ، يمكن للأنسجة الدهنية البنية (BAT) استخدام الطاقة الكيميائية لتوليد الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الجسم في البرد ^3,4. بسبب هذه القدرة الفريدة ، يمكن أن يؤدي تنشيط BAT أيضا إلى زيادة نفقات الطاقة وتحسين حساسية الأنسولين⁵.

تمارس BAT وظيفتها من خلال توليد الحرارة غير المرتعش ، وهي عملية بوساطة فصل البروتين 1 (UCP1) ⁶. تمتلك الثدييات ، بما في ذلك الفئران والبشر ، كميات متفاوتة من BAT. وجهة النظر الكلاسيكية ل BAT هي أن هذه الأنسجة الدهنية أكثر وفرة في الفئران والرضع من البشر البالغين. iBAT ، الموجود في الجناح الظهري العلوي بين الكتف ، هو مستودع BAT الأكثر دراسة في الفئران. من خلال تطبيق التصوير بالنظائر المشعة واختبارات الخزعة ، حددت الدراسات الحديثة العديد من مستودعات BAT في البشر البالغين. بعضها ، بما في ذلك المستودعات الموجودة في الرقبة العميقة والمنطقة فوق الترقوة ، لم يتم تحديدها من قبل في الفئران أو غيرها من النموذجية^{7،8،9،10،11}. من بين مستودعات BAT هذه ، يعد scBAT هو المستودع الأكثر شيوعا في البشر البالغين. لفهم الأصل والمساهمة الجزيئية لهذه المستودعات التي تم العثور عليها حديثا في البشر بشكل أفضل ، من الضروري تحديد المستودعات المكافئة في الفئران التي تسمح للتلاعب الجيني والجزيئي بتتبع واختبار الدور الوظيفي لهذه المستودعات. وهكذا ، حددنا نحن وآخرون عددا قليلا من مستودعات BAT غير المعروفة سابقا في مواقع تشريحية مختلفة في الفئران ، بما في ذلك scBAT^12,13 ، BAT حول الأوعية الصدرية^14,15 ، BAT حول الكلى 16 ، و BAT¹⁷ حول الأبهر. يشبه الفأر scBAT تشريحيا scBAT البشري ويشبه شكليا iBAT الكلاسيكي ، معبرا عن مستويات عالية من UCP1¹².

على عكس iBAT للفأر ، والذي يمكن تشريحه بسهولة ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من عنق الفأر ، أسفل الغدد اللعابية وعلى طول الوريد الوداجي الخارجي. قد يكون عزل هذا المستودع للتحليلات النسيجية والجزيئية أمرا صعبا. هنا ، نصف بالتفصيل الإجراء الخاص بتشريح scBAT من الفئران بعد الولادة والبالغين ومعالجة هذا المستودع لتحليل الأنسجة والتعبير الجيني.

تمت الموافقة على إجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية بايلور للطب. تم تنفيذ جميع الإجراءات على الفئران الذكور C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 3 أسابيع و 3 أشهر من العمر. قبل التشريح ، تم القتل الرحيم لجميع الفئران باستخدام إجراء القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون القوارض المعتمد. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تشريح scBAT

1. ضع جثة الفأر على طاولة العمل ونظف المقص الجراحي والملقط النقطي الدقيق بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. رش الرقبة البطنية للفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول لتبليل الفراء وتقليل تلوث الفراء.
3. قم بعمل شق ثنائي ، حوالي 1.5 سم ، على طول الترقوة.
4. من نهايات الشق السابق ، قطع طوليا نحو الأذنين ، بطول حوالي 1 سم. سيشكل هذا شقا مربعا على شكل حرف U حول الرقبة (الشكل 1 أ ، ب).
   ملاحظة: يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة. تتعرض الطبقة السطحية ، المكونة من الجلد والأنسجة الدهنية تحت الجلد والغدد اللعابية ، خلال هذه الخطوة. تحتوي الطبقة الوسيطة ، جنبا إلى جنب مع scBAT ، على الأوردة الوداجية وعضلات الرقبة. يتم الكشف عن الطبقة العميقة من الرقبة ، التي تحتوي على BAT عميق للرقبة والشريان والأوردة الوداجية ، عن طريق إزالة العضلات الهيكلية.
5. ضع الماوس تحت مجهر تشريح وركز على الرقبة المكشوفة (الشكل 1C).
   ملاحظة: هذه الخطوة المضافة تزيد بشكل كبير من دقة جمع الأنسجة ، وهو أمر ضروري نظرا لصغر حجم scBAT.
6. كشف الغدد اللعابية بالكامل عن طريق رفع أقسام الجلد المقطوعة بعيدا بالملقط.
7. باستخدام المقص الجراحي والملقط ، افصل الأنسجة التي تربط الغدد اللعابية بالأنسجة المحيطة بالترقوة وببعضها البعض.
8. فضح مستودعات scBAT عن طريق رفع الغدد اللعابية. ابحث عن BAT على طول الوريد الوداجي الخارجي وربما متصل بالجانب السفلي من الغدد اللعابية. تعرفه على لونه البرتقالي ، الذي يبرز ضد الأنسجة المحيطة.
9. امسك الأنسجة الدهنية المستهدفة بالملقط وقشرها برفق بعيدا عن الغدد اللعابية.
10. بمجرد فصله عن الغدد اللعابية ، استمر في فصل scBAT عن الوريد الوداجي الخارجي وعضلات الرقبة حتى يمكن إزالة المستودعات الموجودة على جانبي الرقبة بالكامل.
11. افحص كل عينة من عينات scBAT المشرحة تحت مجهر التشريح (الشكل 1D ، E) ، باستخدام ملقط لإزالة أي نسيج ضام متبقي.
12. ضع كل عينة في قنينة تلألؤ زجاجية تحتوي على 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأخرج الماوس من تحت المجهر.

2. معالجة وتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ل scBAT (موضح في الشكل 2 أ)

1. استبدل PBS (الخطوة 1.12) ب 10 مل من بارافورمالدهايد البارد 4٪ (PFA) وضع القارورة على نوتور ، وتأرجح عند 4 درجات مئوية طوال الليل لإصلاح scBAT.
   ملاحظة: يمكن تطبيق تثبيت التروية في مرحلة ما بعد الولادة ، وخاصة الفئران البالغة ، عند الحاجة إلى مزيد من المعالجة لتحليل الكيمياء الهيستولوجية المناعية.
2. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول PFA من القارورة باستخدام ماصة نقل معقمة واستبدلها ب 10-15 مل من PBS. ضع القارورة على نوتور وصخرة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استبدل PBS بمحلول ملحي 0.85٪ واستمر في التأرجح لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: المحلول الملحي هو 0.85٪ محلول ملحي (NaCl) بدون وزن / فولت في المياه المعالجة ب DEPC (خالية من RNase). يمكن استبدال PBS بالمحلول الملحي في هذه الخطوة والخطوة التالية.
3. قم بإزالة محلول ملحي 0.85٪ باستخدام ماصة نقل وأضف 10 مل من 70٪ إيثانول / 0.85٪ محلول ملحي إلى القارورة. خزن القارورة في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل أو حتى تصبح جاهزة لتضمين البارافين.
   ملاحظة: يمكن استخدام PBS في حالة عدم توفر 0.85٪ محلول ملحي. يجب معالجة scBAT في أقرب وقت ممكن لتسهيل التقسيم والحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة بشكل أفضل.
4. قبل تضمين البارافين ، قم بتجفيف scBAT من خلال سلسلة من عمليات تبادل الإيثانول لإزالة الماء من الأنسجة.
   1. للبدء ، قم بإزالة 70٪ إيثانول / 0.85٪ محلول ملحي من القارورة باستخدام ماصة نقل وأضف 10-15 مل من 95٪ كحول مجفف ، مع هز القارورة على مغذي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
      ملاحظة: يمكن استخدام الإيثانول بدلا من محاليل الكحول المجففة.
   2. بعد ذلك ، استبدل 95٪ كحول مجفف ب 10-15 مل من الكحول المجفف بنسبة 100٪ واستمر في التأرجح على مغذي لمدة 1 ساعة. أعد ملء الكحول المجفف الجديد بنسبة 100٪ واستمر في الصخور لعدة ساعات أو طوال الليل ، اعتمادا على كمية scBAT في القارورة.
5. لإزالة scBAT للتضمين ، أضف 10 مل من التولوين إلى القارورة واستمر في التأرجح على المغذي حتى يصبح scBAT شفافا ، حوالي 6-8 ساعات.
   ملاحظة: تعتمد المدة الزمنية اللازمة لتحقيق المقاصة المرضية على حجم scBAT. يوصى بالبدء في التطهير فورا في الصباح حتى يمكن التسلل والتضمين في فترة ما بعد الظهر.
6. لتضمين scBAT في شمع البارافين ، قم بإزالة التولوين وإضافة 10 مل من شمع البارافين المذاب إلى القارورة. ضع القارورة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مع الشمع الجديد.
   ملاحظة: ابدأ في إذابة كريات الشمع في الفرن طوال الليل قبل أن يبدأ التضمين للتأكد من أن الشمع سائل بالكامل.
7. استبدل شمع البارافين التسلل بشمع البارافين المضمن وضع القارورة في نفس درجة الحرارة لمدة 1 ساعة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
   ملاحظة: يمكن مقاطعة مرحلة التسلل ومتابعتها لاحقا. أخرج القارورة من الفرن واحفظها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
8. قم بتضمين الأنسجة عن طريق وضعها أولا في قالب تضمين الأنسجة ، وإضافة شمع التضمين المذاب إلى القالب ، وإعادة توجيه الأنسجة تحت المجهر المجسم. بعد ذلك ، ضع شريط تضمين أعلى الشمع واستمر في صب شمع التضمين فوقه حتى يمتلئ ويتم تثبيت غطاء التضمين على كتلة الشمع. انقل الكتلة إلى ثلاجة 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح للشمع بالتصلب والانكماش قبل إزالة القالب المعدني.
9. قسم scBAT بميكروتوم بسمك 5-6 ميكرومتر¹⁸ ، ثلاثة إلى أربعة أقسام لكل شريحة مجهر ، وضعه في حمام طفو قسم البارافين الدافئ عند ~ 42 °C للسماح لأقسام الأنسجة بالتنعيم.
10. انقل الأقسام إلى الشرائح وضع الشرائح في وضع مستقيم مقابل حمام الطفو للسماح للماء بالتنقيط من الشرائح.
11. انقل الشرائح إلى رف تلطيخ غير قابل للصدأ وضع الرف على مقعد تجفيف منزلق حتى يجف طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن تخزين شرائح البارافين على المدى الطويل في درجة حرارة الغرفة قبل تحقيق مزيد من المعالجة.
12. أداء تلطيخ H& E¹⁹. للبدء ، ضع الشرائح في رف تلطيخ ، ثم ضع الرف في جرة تلطيخ مع الزيلين لمدة 40 ثانية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    ملاحظة: إذا كان البارافين لا يزال مرئيا بعد المرحلتين ، فانتظر حتى يذوب تماما قبل المتابعة.
13. لإعادة ترطيب الأنسجة ، ضع رف الشرائح في وعاء ملطخ مملوء بالكحول المجفف بنسبة 100٪ لمدة مرحلتين مدة كل منهما 20 ثانية ، تليها مرحلة 15 ثانية في 95٪ كحول مجفف ، وشطف نهائي لمدة 15 ثانية في ddH₂O.
14. ضع الشرائح في طبق تلطيخ مملوء بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 75 ثانية لتحقيق تلطيخ نووي ، ثم اشطف الشرائح في طبق تلطيخ مع ddH₂O لمدة 45 ثانية.
    ملاحظة: يمكن ضبط الوقت حسب لون البقعة المطلوب.
15. قم بتمييز التلوين عن طريق غمس الشرائح في طبق تلطيخ مملوء بمحلول HCl-ethanol لمدة 15 ثانية ، ثم انقل الشرائح إلى شطف ddH₂O آخر لمدة 15 ثانية.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول حمض الهيدروكلوريك والإيثانول وفقا للطريقة المنشورة¹⁹.
16. للتلطيخ السيتوبلازمي ، ضع الشريحة في محلول Eosin Y لمدة 15 ثانية.
17. قم بتجفيف الأنسجة عن طريق غمس الشرائح لمدة 15 ثانية لكل منها في ثلاث مراحل متتالية من محلول الكحول المجفف بنسبة 95٪ ، ثم حمامين متتاليين من الكحول المجفف بنسبة 100٪ - الأول لمدة 15 ثانية والثاني لمدة 45 ثانية - لإنهاء الجفاف.
18. أخيرا ، انقل الشرائح إلى حمام الزيلين لمدة 45 ثانية لإعادة تأقلم الأنسجة مع المذيبات العضوية. بعد هذه الخطوة ، يتم الانتهاء من تلطيخ. إزالة الأنسجة من الحل.
19. ضع وسيط التثبيت على كل شريحة وقم بتغطيتها داخل غطاء دخان كيميائي. جفف طوال الليل قبل التصوير. تظهر نتائج التصوير في الشكل 2 ب.

3. تحليل التعبير الجيني ل scBAT

1. جمع الأنسجة (طحن)
   1. بعد تشريح scBAT ، ضع الأنسجة على الفور في أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بعمل ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب بإبرة معقمة ، وقم بتجميده في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: الخطوات الرئيسية للبروتوكول الموضحة هنا موضحة في الشكل 3A. يؤدي إحداث ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب قبل إسقاطه في النيتروجين السائل إلى منع الأنبوب من الانفجار بسبب تغير الضغط المفاجئ.
   2. املأ دورق بلاستيكي بالنيتروجين السائل واترك ملعقة مدقة ورقيقة لينقع.
      ملاحظة: من المهم الحفاظ على درجة حرارة جميع الأدوات وعينات الأنسجة باردة قدر الإمكان ، بالقرب من درجة حرارة النيتروجين السائل ، أثناء الإجراء بأكمله لمنع ذوبان الأنسجة. الأنسجة الدهنية المذابة شديدة الالتصاق وتجعل المسحوق أكثر صعوبة. قم فقط بإزالة الأدوات والعينات من حمامات النيتروجين السائل مباشرة قبل الاستخدام.
   3. خذ عينة واحدة من الأنسجة المجمدة في كل مرة واسكبها من أنبوب الطرد المركزي الدقيق في الهاون.
   4. أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل إلى الهاون ، ثم استخدم المدقة لطحن الأنسجة المجمدة حتى يتم سحقها تماما.
      ملاحظة: إذا بدأت الأنسجة تصبح ناعمة أو لزجة في أي وقت ، فهي تذوب. صب المزيد من النيتروجين السائل في الهاون.
   5. استخدم الملعقة الرفيعة لكشط الأنسجة المسحوقة ونقلها بعناية إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. صب النيتروجين السائل في الهاون أثناء الكشط لجمع أجزاء الأنسجة المتبقية قبل نقلها باستخدام ملعقة. كرر خطوات النقل حتى تتم إزالة جميع الأنسجة من الهاون.
   6. نظف الملاط باستخدام ممسحة مناديل خفيفة و 70٪ إيثانول قبل تفريغ العينة التالية للطحن. قم بتخزين المناديل المسحوقة في فريزر -80 درجة مئوية على المدى الطويل.
2. عزل الحمض النووي الريبي الكلي
   1. اعداد
      1. نظف طاولة العمل والماصات وحوامل الأطراف ورفوف الأنابيب باستخدام كل من الإيثانول بنسبة 70٪ ومطهر السطح لإزالة RNase.
      2. قم بتشغيل آلة الطرد المركزي للوصول إلى 4 درجات مئوية.
      3. قم بتسخين محلول الشطف إلى 70 درجة مئوية.
      4. قم بتخفيف DNase I عن طريق خلط 5 ميكرولتر من DNase I المعاد تكوينه مع 75 ميكرولتر من محلول تخفيف DNase لكل عينة. ضع محلول DNase I على الثلج حتى الاستخدام.
   2. إجراء
      1. لكل عينة ، قم بتسمية أنبوبي طرد مركزي دقيق ، وأنبوبين ممسكين بالعمود (أنبوبان للطرد المركزي متدرج بدون غطاء) ، وعمود صغير ملزم واحد.
      2. أضف 500 ميكرولتر من محلول عزل الحمض النووي الريبي إلى كل عينة وصوتنة باستخدام محرك مدقة الحبيبات لمدة 30 ثانية.
      3. احصل على حقنة لكل عينة وماصة لأعلى ولأسفل 10x لمزيد من تحلل الأنسجة. تأكد من عدم ظهور أي مواد صلبة بعد الحقن.
      4. أضف 250 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة من حين لآخر أثناء الانتظار لمدة 5 دقائق حتى يتم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة.
      5. جهاز طرد مركزي عند 21000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      6. انقل الجزء المائي العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف كمية مكافئة من الإيثانول بنسبة 70٪ (~ 500 ميكرولتر).
         ملاحظة: يجب أن يكون الجزء المائي العلوي واضحا ، ويجب أن يكون الجزء السفلي هو محلول عزل الحمض النووي الريبي الأحمر ، وبين الطبقتين يجب أن تكون بعض المواد الصلبة غير المرغوب فيها.
      7. نقل 500 ميكرولتر من المحللة الجديدة إلى عمود الربط. جهاز طرد مركزي عند 18000 × جم لمدة 60 ثانية ثم تخلص من المرشح.
      8. كرر الخطوة السابقة مع المحللة المتبقية للحصول على كل الحمض النووي الريبي في عمود الربط.
      9. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل منخفض الصلابة إلى عمود الربط ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية ، وتخلص من الترشيح.
      10. أضف 80 ميكرولتر من DNase I المخفف إلى كل عمود ربط. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      11. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل عالي الصرامة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية ، وتخلص من الترشيح.
      12. أضف 700 ميكرولتر من الغسيل منخفض الصلابة ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 ثانية ، وتخلص من المرشح.
      13. انقل أعمدة الربط إلى الأنبوب الثاني الجديد القابض للعمود بدون غطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقتين لضمان إزالة جميع السوائل من عمود الربط.
      14. انقل أعمدة الربط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف 30 ميكرولتر من محلول الشطف الدافئ. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
      15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة لجمع الحمض النووي الريبي الملتوي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      16. قياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
          ملاحظة: إذا كان إجمالي نقاء الحمض النووي الريبي منخفضا ، يشار إليه بقيمة 260/280 أقل من 2.0 أو 260/230 قيمة أقل من 1.8 ، ثم بعد الخطوة 3.2.2.12 ، يمكن غسل العينات مرة أخرى بغسل منخفض الصرامة متبوعا بغسلها بنسبة 80٪ من الإيثانول قبل الاستمرار في الخطوة 3.2.2.13.
      17. قم بتخزين الحمض النووي الريبي في فريزر -80 درجة مئوية.
   3. النسخ العكسي (RT)
      1. في شريط أنبوب PCR ، أضف 0.5-1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي المخفف في المياه المعالجة ب DEPC إلى ما مجموعه 8 ميكرولتر لكل عينة RNA إلى بئر مختلف.
         ملاحظة: يمكن زيادة أو تقليل كمية الحمض النووي الريبي المستخدمة في النسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      2. أضف 1 ميكرولتر Oligo dT و 1 ميكرولتر من dNTPs إلى كل عينة في أنبوب PCR. تأكد من أن الحجم الإجمالي هو 10 ميكرولتر لكل عينة.
      3. ضع شريط أنبوب PCR في جهاز تدوير حراري واضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعا ب 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      4. بعد 5 دقائق عند 65 درجة مئوية ، أخرج شريط أنبوب PCR وضع الأنبوب على الثلج لمدة 2 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة على الجليد ، أضف خمسة كواشف: 4 ميكرولتر من 5x العازلة First-Strand ، 2 ميكرولتر من 25 mM MgCl₂ ، 2 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي لكل عينة. تأكد من أن الحجم الإجمالي الآن 20 ميكرولتر لكل عينة.
      5. ضع شريط أنبوب PCR مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري واضبط البرنامج على 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة ، ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      6. بمجرد وصول البرنامج إلى 4 درجات مئوية ، أخرج الشريط وأضف 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز H (RNase H).
         ملاحظة: يستخدم RNase H لإزالة أي قالب RNA متبقي في تفاعل RT ؛ من خلال هذه الخطوة ، يجب بالفعل تحويل الحمض النووي الريبي المطلوب إلى cDNA.
      7. ضع الشريط مرة أخرى في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيله 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ثم 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
      8. اكتمل النسخ العكسي ؛ قياس تركيز cDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي
      9. تمييع cDNA إلى 250 نانوغرام / ميكرولتر ؛ قم بتخزين cDNA إما في الفريزر -80 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية.
   4. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
      1. قم بعمل جدول بيانات لتنظيم موضع كل برايمر وعينة على لوحة qPCR ذات 96 بئرا.
         ملاحظة: يجب أن يكون أحد البادئات جينا مرجعيا لتطبيع التعبير عن جميع الجينات الأخرى ذات الأهمية ، مثل 36B4.
      2. اصنع مزيجا رئيسيا من التمهيدي لكل مجموعة "التمهيدي + العينة". لكل تفاعل qPCR جيدا ، أضف 3 ميكرولتر من الماء بدرجة البيولوجيا الجزيئية ، و 5 ميكرولتر من الخليط الرئيسي لإنزيم qPCR ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي ، و 0.5 ميكرولتر من التمهيدي العكسي ، مما يضيف ما يصل إلى 9 ميكرولتر لكل تفاعل. أضف 1 ميكرولتر من cDNA لكل تفاعل لتكوين إجمالي 10 ميكرولتر لكل تفاعل جيد.
         ملاحظة: المعيار هو أن يكون لديك ثلاث نسخ مكررة تقنية لكل مجموعة "التمهيدي + العينة" ، لذلك يجب أن يكون كل مزيج رئيسي 4x من الكميات المذكورة أعلاه.
      3. أضف 1 ميكرولتر من cDNA لكل نسخة مكررة إلى كل مزيج رئيسي من التمهيدي. إذا كان كل مزيج رئيسي هو 4x ، فقم بسحب 4 ميكرولتر من كل عينة cDNA في الأنبوب المسمى الخاص بها.
      4. أخيرا ، يتم خلط ماصة 10 ميكرولتر من كل تفاعل في لوحة qPCR المكونة من 96 بئرا في المواضع التي يحددها جدول البيانات.
      5. قم بإغلاق اللوحة بختم لاصق سميك ، ثم قم بطرد لوحة 96 بئرا عند 450 × جم عند 20 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
         ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تكون اللوحة محكمة الغلق تماما لتجنب تبخر العينات أثناء الدورة الحرارية. استخدم مساحات مناديل خفيفة للضغط على الختم لأسفل على اللوحة ، وخاصة الحواف.
      6. قم بتشغيل اللوحة في أداة PCR في الوقت الفعلي. قم ببرمجة تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة: دقيقتان عند 50 درجة مئوية ، تليها دقيقتان أخريان عند 95 درجة مئوية ، وأخيرا 40 دورة من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 30 ثانية عند 60 درجة مئوية. تظهر نتائج تحليل التعبير الجيني qPCR في الشكل 3B.

على عكس iBAT ، الذي يقع في الطبقة تحت الجلد من الظهر بين كتفين ، يقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة ، ويمتد بعمق بين طبقات العضلات الهيكلية والغدة اللعابية أثناء نموها على طول الوريد الوداجي الخارجي (الشكل 1 أ). تشريح scBAT ليس سهلا مثل iBAT. هنا ، نقدم إجراء مفصلا بما في ذلك الخطوات الحاسمة لتشريح scBAT السليم من الفئران بعد الولادة والبالغين (الشكل 1B ، C). بعد فتح الرقبة باستخدام البروتوكول المقدم ، يمكن تحديد طبقة رقيقة من scBAT تحت مجهر تشريح وتقشيرها من الغدة اللعابية المتصلة والوريد الوداجي الخارجي باستخدام زوج من الملقط (الشكل 1D ، E). لتقييم مورفولوجيا المستودع ، تمت معالجة scBAT المعزولة حديثا باستخدام إجراء المعالجة المقدم جنبا إلى جنب مع إجراء تلطيخ H& E المنشورمسبقا 19 (الشكل 2A). كما هو موضح في الشكل 2 ب ، يمتلك scBAT تراكيب الأنسجة النموذجية لمستودعات BAT ويتكون من العديد من الخلايا الشحمية الصغيرة متعددة الخلايا في الفئران السليمة بعد الولادة والبالغين. لتقييم مستويات التعبير الجيني في scBAT ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من مستودعات scBAT المعزولة باستخدام الإجراءات المقدمة (الشكل 3A). يمكن بعد ذلك تقييم مستويات التعبير عن الجينات ذات الأهمية بواسطة طرق RT-qPCR القياسية (الشكل 3A). كما هو موضح في الشكل 3B ، مستويات التعبير التفاضلي للجينات المشاركة في التوسط في وظيفة scBAT ، بما في ذلك Pparg ، المنظم الرئيسي لتطوير BAT ؛ Fabp4 و Glut4 ، وهما ناقلان للمغذيات ؛ و Ucp1 و Ppargc1a ، وهما جينان مشاركان في توليد الحرارة ، يمكن تحديدهما بسهولة. للمقارنة ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من iBAT المعزول ، وتم تقييم التعبير عن الجينات المذكورة أعلاه باستخدام الإجراءات المقدمة أيضا (الشكل 3 أ). مستويات التعبير عن هذه الجينات متشابهة نسبيا بين هذين المستودعين. (الشكل 3 ب).

الشكل 1: الموقع التشريحي ل scBAT وعملية تشريحه. (أ) موقع scBAT في الطبقة المتوسطة من الرقبة. ب: الطبقة السطحية من الرقبة قبل إزالة الجلد وبعده. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. تحدد الخطوط الصفراء المنقطة المنطقة التي يجب كشفها بعد إجراء شق على شكل حرف U. (ج) صورة لجثة فأر موضوعة تحت مجهر تشريح لزيادة الوضوح البصري أثناء التشريح. (د، ه) تتم إزالة الصور التمثيلية للطبقة المتوسطة من الرقبة قبل وبعد scBAT من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 3 أسابيع و 3 أشهر. شريط المقياس = 250 ميكرومتر. الخطوط الصفراء المنقطة تحدد مستودعات scBAT الثنائية المكشوفة. ن = 2. الاختصارات: scBAT = الأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة. SFI = طبقة سطحية ؛ sg = الغدة اللعابية. tr = القصبة الهوائية. jv = الوريد الوداجي الخارجي ؛ sm = العضلات الهيكلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: معالجة scBAT لتلطيخ H& E (أ) مخطط انسيابي يوضح الخطوات الرئيسية لمعالجة scBAT لتلطيخ H& E. بعد تشريح الأنسجة ، يتم تثبيتها بالتتابع ، وتجفيفها ، وتضمينها ، وتقسيمها ، وتلطيخها. (ب) صور تمثيلية ل scBAT الملطخة ب H& E من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 3 أسابيع و 3 أشهر ؛ n = 3 لكل مرحلة تنموية ؛ شريط المقياس = 250 ميكرومتر لصور التكبير المنخفضة ؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر للحصول على صور تكبير أعلى. الاختصارات: scBAT = الأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة. PFA = بارافورمالدهيد ؛ H&E = الهيماتوكسيلين ويوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحضير الحمض النووي الريبوزي (RNA) من scBAT لتحليل التعبير الجيني. (أ) مخطط انسيابي يوضح مراحل عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-qPCR للتعبير الجيني ل scBAT. نظرا لصغر حجمه وملمسه الناعم ، فإن التجميد المفاجئ لمستودع scBAT وطحنه في النيتروجين السائل أمر بالغ الأهمية لعزل الحمض النووي الريبي بنجاح. (ب) التعبير النسبي لجينات الواسمات ، بما في ذلك Pparg و Fabp4 و Glut4 و Ucp1 و Ppargc1a ، في scBAT و iBAT المعزولة من ذكور الفئران التي تتراوح أعمارها بين 3 أشهر ، ن = 5. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. تم استخدام 36B4 كجين تدبير منزلي للتطبيع. الاختصارات: scBAT = الأنسجة الدهنية البنية فوق الترقوة. RT-qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي ؛ LN2 = النيتروجين السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.